Summary
We hebben onlangs een nieuwe Drosophila circadiane output, temperatuurvoorkeursritme (TPR) geïdentificeerd, waarbij de voorkeurstemperatuur bij vliegen overdag stijgt en 's nachts daalt. TPR wordt onafhankelijk van een andere circadiane output, motorische activiteit gereguleerd. Hier beschrijven we het ontwerp en de analyse van TPR in Drosophila.
Abstract
De circadiane klok reguleert vele aspecten van het leven, waaronder slaap, motorische activiteit en lichaamstemperatuur (BTR) ritmes1,2. We hebben onlangs een nieuwe Drosophila circadiane output geïdentificeerd, genaamd het temperatuurvoorkeursritme (TPR), waarbij de voorkeurstemperatuur bij vliegen overdag stijgt en 's nachts daalt 3. Verrassend genoeg worden de TPR en motorische activiteit gecontroleerd door verschillende circadiane neuronen3. Drosophila locomotorische activiteit is een bekende circadiane gedragsoutput en heeft sterke bijdragen geleverd aan de ontdekking van veel geconserveerde circadiaanse circadiaanse klokgenen en mechanismen van zoogdieren4. Daarom zal het begrijpen van TPR leiden tot de identificatie van tot nu toe onbekende moleculaire en cellulaire circadiane mechanismen. Hier beschrijven we hoe u de TPR-test uitvoert en analyseert. Deze techniek maakt het niet alleen mogelijk om de moleculaire en neurale mechanismen van TPR te ontleden, maar biedt ook nieuwe inzichten in de fundamentele mechanismen van de hersenfuncties die verschillende omgevingssignalen integreren en diergedrag reguleren. Bovendien suggereren onze onlangs gepubliceerde gegevens dat de vlieg TPR functies deelt met de zoogdier BTR3. Drosophila zijn ectothermen, waarbij de lichaamstemperatuur meestal gedragsmatig wordt gereguleerd. Daarom is TPR een strategie die wordt gebruikt om een ritmische lichaamstemperatuur te genereren bij deze vliegen5-8. Wij zijn van mening dat verdere verkenning van Drosophila TPR de karakterisering van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de beheersing van de lichaamstemperatuur bij dieren zal vergemakkelijken.
Introduction
Temperatuur is een alomtegenwoordige omgevingsinvloed. Dieren vertonen een verscheidenheid aan gedragingen om schadelijke temperaturen te voorkomen en comfortabele te zoeken. Drosophila vertonen een robuust temperatuurvoorkeursgedrag6,7. Wanneer vliegen worden vrijgegeven in een temperatuurgradiënt van 18-32 °C, vermijden de vliegen zowel warme als koude temperaturen en kiezen ze uiteindelijk een voorkeurstemperatuur van 25 °C in de ochtend3. De warme temperatuursensoren zijn een set thermosensorische neuronen, AC-neuronen, die het Drosophila transient receptor potential (TPR)-kanaal uitdrukken, TRPA16,9. De koude temperatuursensoren bevinden zich in de 3e antennesegmenten, omdat het ablating van de 3e antennesegmenten het gebrek aan koude temperatuurvermijdingveroorzaakt 6. Onlangs werd het TRPP-eiwit Brivido (Brv) geïdentificeerd10. Aangezien Brv wordt uitgedrukt in de 3e antennesegmenten en koudedetectie bemiddelt, is Brv een mogelijk kouddetectiemolecuul, dat van cruciaal belang is voor het temperatuurvoorkeursgedrag. Kortom, de vliegen gebruiken deze twee temperatuursensoren om de warme en koude temperaturen te vermijden en een voorkeurstemperatuur te vinden.
Terwijl zoogdieren warmte genereren om hun lichaamstemperatuur te reguleren, passen ectothermen hun lichaamstemperatuur over het algemeen aan de omgevingstemperatuuraan 11. Van sommige ectothermen is bekend dat ze een dagelijks TPR-gedrag vertonen waarvan wordt aangenomen dat het een strategie is voor de ectothermen om hun BTR12te reguleren . Om te bepalen of de vliegen TPR vertoonden, herhaalden we de gedragsanalyse van de temperatuurvoorkeur op verschillende punten gedurende een periode van 24 uur. We ontdekten dat Drosophila een dagelijkse TPR vertoont, die 's ochtends laag en 's avonds hoog is en een patroon volgt dat vergelijkbaar is met dat van BTR bij mensen13.
In Drosophilazijn er ~150 klokneuronen in de hersenen. De klokneuronen die de motorische activiteit reguleren, worden M- en E-oscillatoren genoemd. Interessant is echter dat M- en E-oscillatoren TPR niet reguleren, in plaats daarvan hebben we laten zien dat DN2-klokneuronen in de hersenen TPR reguleren, maar geen motorische activiteit. Deze gegevens geven aan dat TPR onafhankelijk van de motorische activiteit wordt gereguleerd. Met name zoogdier BTR is ook onafhankelijk gereguleerd van motorische activiteit. Ablatiestudies bij ratten tonen aan dat BTR wordt gecontroleerd door specifieke SCN-neuronen die zich richten op een andere subset van subparaventriculaire zoneneuronen dan die welke de motorische activiteit controleren14. Daarom beschouwen onze gegevens de mogelijkheid dat de BTR van zoogdieren en de vlieg TPR evolutionair worden geconserveerd3, omdat zowel vlieg-TPR als zoogdier BTR circadiaanse klokafhankelijke temperatuurritmes vertonen, die onafhankelijk worden gereguleerd door motorische activiteit.
Hier beschrijven we de details van het analyseren van de TPR-gedragstest in Drosophila. Deze methode maakt het mogelijk om niet alleen het moleculaire mechanisme en neurale circuits van TPR te onderzoeken, maar ook hoe de hersenen verschillende omgevingssignalen en innerlijke biologische klokken integreren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van vliegen
- Licht donker (LD) Experimenten
- Verhoog vliegen in incubators (25 °C/40-60% relatieve vochtigheid (RH)) bij lichte cycli van 12 uur/donker 12 uur (LD). De lichtintensiteit van de incubators is ~500-1.000 lux.
- Twee incubators zijn nodig om de gedragstesten over een periode van 24 uur te voltooien. Beide incubators moeten een programmeerbaar licht hebben met ON OFF-functies. Ze moeten ook solide deuren hebben die niet doorlatend zijn voor licht(d.w.z. geen glas of plexiglas).
Opmerking: Een incubator moet worden aangeduid als een "dag"-incubator en worden ingesteld op een LD-cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. De tweede incubator moet worden aangeduid als een "nacht"-incubator en worden ingesteld op de inverse van de eerste met 12 uur donker gevolgd door 12 uur licht. De nachtincubator moet in de kamer worden geplaatst die in het donker toegankelijk is, op een zodanige manier dat vliegen die nachtomstandigheden ervaren gemakkelijk toegankelijk zijn voor de experimenten. - Plaats de vliegenflacons in couveuses overdag of 's nachts. Verzamel nieuw uitgekomen vliegen in een verse flacon, 20-30 per test en bewaar 2-3 dagen in dezelfde incubator.
- Gebruik na 2-3 dagen vliegen voor de gedragstest van de temperatuurvoorkeur.
- Verzamel voor dag (Zeitgeber tijd (ZT) 0-12) experimenten vliegen uit de dag incubator.
- Vlak voor de gedragsexperimenten, haal de verzamelde vliegenflacons uit de dagincubator.
- Verzamel voor nachtelijke (ZT 13-24) experimenten vliegen uit de nachtincubator.
- Vlak voor de gedragsexperimenten, haal de verzamelde vliegenflacons uit de nachtincubator, wikkel met aluminiumfolie en plaats in een doos in de donkere kamer onder een rode lamp.
Opmerking: Aangezien de gedragstest van de temperatuurvoorkeur onder duisternis wordt uitgevoerd voor de nachtexperimenten, moet blootstelling aan licht aan de vliegen worden voorkomen tot het einde van de gedragsexperimenten.
Opmerking: De vliegen mogen niet worden blootgesteld aan kooldioxide op de dag dat de experimenten plaatsvinden.
- Constant Darkness (DD) Experimenten
-
DD-dag
- Een extra incubator is nodig voor DD-dagexperimenten, die we voor de rest van het manuscript een "transitie"-incubator noemen. De overgangsincubator moet in de ruimte worden geplaatst die in het donker toegankelijk is, op een zodanige manier dat vliegen die DD-omstandigheden ervaren gemakkelijk toegankelijk zijn voor de experimenten. Een voorbeeld lichtschema voor een overgangsincubator zou het licht aan hebben van 13.00-19.00 uur en het licht UIT om 19.00-13.00 uur (figuur 1).
- Verzamel de vliegen die zijn grootgebracht in de dagincubator. Plaats de vliegenflacons tussen 13.00 en 19.00 uur in de overgangsincubator, wanneer het licht aan is. Op deze manier worden de vliegen goed blootgesteld aan licht tot 19.00 uur, waarna het licht wordt uitgeschakeld.
- Haal de volgende dag, voor 13.00 uur, onder donkere omstandigheden de vliegenflacons uit de overgangsincubator, wikkel ze in aluminiumfolie en plaats ze in een doos. Bewaar de doos nog een dag in een incubator.
-
DD Nacht
- Verzamel de vliegen die in de nachtincubator in het donker onder een rode lamp zijn grootgebracht. Of verzamel bovendien de vliegen wanneer het licht van de nachtincubator aan is.
- Wikkel verzamelde flacons met aluminiumfolie in het donker wanneer de lichten uit zijn en plaats de flacons in een doos. Bewaar de doos nog twee dagen in een incubator (figuur 1B).
Opmerking: Aangezien de gedragstest van de temperatuurvoorkeur onder duisternis wordt uitgevoerd voor de nachtexperimenten, moet blootstelling aan licht aan de vliegen worden voorkomen tot het einde van de gedragsexperimenten.
-
DD-dag
- Constant Licht (LL) Experimenten
-
LL-dag
- Een extra incubator is nodig voor LL-dagexperimenten. Deze incubator behoudt de LL conditie (25 °C, 800 lux), waarbij het licht continu aan staat.
- Verzamel vliegen die zijn grootgebracht in de dagincubator. Plaats de vliegenflacons op elk moment van hun "dag" in de LL-incubator.
-
LL Nacht
- Verzamel vliegen die zijn grootgebracht in de nachtincubator. Breng de vliegenflacons over van de nachtincubator naar de LL-incubator gedurende de tijd dat het licht in de nachtincubator aan is.
Opmerking: Het licht gaat bijvoorbeeld uit om 07:00 uur in de nachtincubator. Breng de vliegenflacons voor 07.00 uur over van de nachtincubator naar de LL-incubator en bewaar de flacons nog 4 dagen in de LL-incubator.
Opmerking: Op dag 4 in LL-omstandigheden wordt de oscillatie van de motorische activiteit afgeschaft15,16, terwijl de TPR nog steeds wordt gehandhaafd 3.
- Verzamel vliegen die zijn grootgebracht in de nachtincubator. Breng de vliegenflacons over van de nachtincubator naar de LL-incubator gedurende de tijd dat het licht in de nachtincubator aan is.
-
LL-dag
2. Het apparaat voor de gedragstest van de temperatuurvoorkeur
- Plaats een plexiglas hoes (29 cm x 19,2 cm) (figuur 4) op een aluminium plaat.
- Controleer de luchttemperatuur tussen de plaat en het deksel. Zes temperatuursensoren zijn bevestigd op verschillende posities aan de binnenkant van het deksel binnen een van de rijstroken (figuur 2).
Opmerking: Zorg ervoor dat de sondes de aluminium plaat of de plexiglasafdekking niet raken. De luchttemperatuur moet worden ingesteld op een helling van 18-32 °C. - Plaats het apparaat in een omgevingsruimte die op 25 °C/65-75% RV staat. Deze kamer moet worden afgesloten van buitenlicht. Een omgevingsruimte is normaal gesproken uitgerust met ventilatoren om een bepaalde temperatuur en vochtigheid te behouden.
Opmerking: De lucht van de ventilator verstoort waarschijnlijk een stabiele temperatuurgradiënt op het apparaat. Om dit te voorkomen gebruiken we een transparant vel dat het gebied rondom het apparaat bedekt. - Bereid een thermometer en hygrometer voor om de temperatuur en vochtigheid in de omgevingsruimte te controleren.
Opmerking: Licht beïnvloedt de temperatuurvoorkeur van Drosophila3. Dezelfde lichtintensiteit moet gelijkmatig op het apparaat worden geleverd. De intensiteit van onze omgeving kamer lichten is ~ 800 lux.
Opmerking: Wanneer de gedragsexperimenten zijn uitgevoerd, plaatst u een buis die is aangesloten op de CO2-tank of toevoer in de buurt van het gat van de bovenkant van het apparaat om de vliegen te verdoven en te verwijderen.
3. Bereiding van apparaten voor gebruik
- Schakel het apparaat minstens 30 minuten in om de temperatuurgradiënt op het oppervlak van de plaat goed vast te stellen (afbeelding 3).
- Bedek de hoes van het gedragsapparaat met waterafstotend om te voorkomen dat vliegen de muren of het plafond van de hoes beklimmen. Veeg het overtollige waterafstotende middel af en laat het deksel 25-30 minuten drogen.
- Verwijder condensatie op de aluminium plaat. Plaats het plexiglas deksel op de aluminium plaat en zet deze vast met zes C-klemmen (Afbeelding 2).
Opmerking: Het is erg belangrijk dat de hoes goed is afgesloten, indien nodig kan dubbele plakband worden gebruikt. - Laat het deksel minstens 15 minuten staan. De luchttemperatuurgradiënt tussen de aluminium plaat en de afdekking wordt gemaakt van 18-32 °C.
4. Temperatuur voorkeur gedrag Assay
- Laad de vliegen in de ruimte tussen de aluminium plaat en de plexiglasafdekking van het apparaat door kleine gaatjes in het midden van elke rijstrook van de afdekking (figuren 2 en 4). Bedek de gaten met afdekslips om te voorkomen dat de vliegen ontsnappen.
- Doe voor de donkere omstandigheden alle lichten in de omgevingsruimte uit. Een rode lamp kan worden gebruikt wanneer de vliegen in het apparaat worden geplaatst. Zorg ervoor dat de vliegen niet worden blootgesteld aan lichten behalve een rode lamp totdat de gedragsexperimenten zijn gedaan.
- Gebruik voor elke proef 20-25 volwassen vliegen, die niet opnieuw mogen worden gebruikt in volgende proeven. De gedragstest wordt gedurende 30 minuten uitgevoerd. Maak een paar foto's met of zonder flits. Pas op dat u tijdens de experimenten niet veel lawaai of plotselinge bewegingen maakt.
- Noteer de temperatuur van alle zes sondes op het apparaat. Let op de kamertemperatuur en de luchtvochtigheid.
- Verdoof de vliegen in het apparaat met kooldioxidegas, maak de klemmen los, verwijder het plexiglasdeksel en verwijder de vliegen van de plaat. Na elk experiment worden de vliegen weggegooid. Veeg condensatie of vocht van de plaat. Plaats het deksel op de plaat terug en draai het vast met de klemmen ter voorbereiding op het volgende experiment.
- Om de temperatuurvoorkeur gedurende de hele dag te kunnen aangeven, is de periode van 24 uur verdeeld in acht tijdzones, vier overdag en vier 's nachts. We gebruiken bijvoorbeeld deze ZT of CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 en 22-24.
Opmerking: Aangezien fenotypevariaties veroorzaakt door maskeringseffecten worden verwacht direct nadat het licht is ingeschakeld (ZT0) of UIT (ZT12), onderzoeken we het temperatuurvoorkeursgedrag tijdens deze tijden niet (ZT of CT 0-1, 11.5-13 en 23.5-24). In elke tijdzone moeten ten minste vijf proeven worden uitgevoerd om de resultaten statistisch gezond te laten zijn.
5. Gegevensanalyse
- Bereken de temperatuurgradiënt als volgt: Bepaal waar de temperatuursensoren worden geplaatst op basis van de twee linialen die aan de boven- en onderkant van het plexiglas deksel langs de randen worden geplaatst (Figuur 2A).
- De temperatuurgradiënt tussen de temperatuursensoren wordt geschat op lineair. Teken lijnen die elke temperatuurgraad in de juiste positie op de foto's weergeven op basis van de locaties van de temperatuursondes en de bijbehorende geregistreerde temperaturen. Tel het aantal vliegen in elk graadinterval. Sluit vliegen op de muren of het plafond van de hoes uit.
- Bereken het percentage vliegen in elk temperatuurbereik van elke rijstrook. Een gemiddelde voorkeurstemperatuur wordt berekend door de producten van het percentage vliegen en temperatuur van elk interval op te sommen, zoals hieronder weergegeven:
% vliegen x 18,5 °C + % vliegen x 19,5 °C + % vliegen x 20,5 °C ....+ % vliegen x 31,5 °C + % vliegen x 32,5 °C. - Bereken de gemiddelde voorkeurstemperatuur in elke tijdzone: Het voorkeursgedrag van de temperatuur wordt >5 keer uitgevoerd in elke tijdzone (ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 en 22-24). Om de gemiddelde voorkeurstemperatuur in elke tijdzone te berekenen, wordt de gemiddelde voorkeurstemperatuur van elke proef samen gemiddeld. De s.e.m. foutbalken zijn gelijk aan de fout tussen de proeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van het temperatuurvoorkeursritme is weergegeven in figuur 5. Als de gedragsprocedure met succes wordt uitgevoerd, moeten de vliegen een TPR vertonen waarin ze de voorkeur geven aan een lage temperatuur in de ochtend en een hogere temperatuur in de avond. De ~1-1,5 °C toename overdag in temperatuurvoorkeur moet in de loop van de dag worden waargenomen, ongeacht de genetische achtergrond, omdat we hebben laten zien dat w1118, yw en Kanton S vliegen overdag een vergelijkbare temperatuurvoorkeur vertonen3.
Figuur 1. Een schema van de vliegvoorbereiding in DD-dag. (A) Een voorbeeld van een DD-dagexperiment. Het licht is AAN van 13.00-19.00 uur en het licht is UIT van 19.00-13.00 uur in de overgangsincubator. Verzamel de vliegen die zijn grootgebracht in de dagincubator. Plaats de vliegenflacons ergens tussen 13.00 en 19.00 uur in de overgangsincubator. Haal de volgende dag voor 13.00 uur de vliegenflacons in het donker uit de overgangsincubator, wikkel ze in aluminiumfolie en plaats ze in een doos. (B) Een voorbeeld van een DD nachtexperiment. Verzamel de vliegen die zijn grootgebracht in de nachtincubator, hetzij in het donker tussen 07:00 en 19:00 uur of in het licht tijdens 19:00 tot 07:00 uur. Haal de vliegenflacons uit de nachtincubator in het donker tussen 07.00 en 19.00 uur, wikkel ze in aluminiumfolie en plaats ze in een doos
Figuur 2. Temperatuurvoorkeur gedragsapparatuur. (A) Bovenaanzicht. De plexiglas hoes wordt met zes C-klemmen op de aluminium plaat geplaatst. Zes temperatuursondes zijn bevestigd op verschillende posities aan de binnenkant van de afdekking binnen een van de rijstroken. Twee linialen worden aan de boven- en onderkant van de plexiglasafdekking langs de randen geplaatst om de temperatuurgradiënt te bepalen. (B) Zijaanzicht. Vier Peltier apparaten worden onder een aluminium plaat geplaatst (44 cm x 22 cm). Elk Peltier-apparaat is aangesloten op de temperatuurregelaars die koude of warme temperaturen genereren. Om oververhitting van de Peltiers te voorkomen, is het computerkoelsysteem aangesloten op waterbuizen, luchtkoelventilatoren en voedingen. Temperatuursondes zijn ingebed in de rand van de aluminium plaat en zijn aangesloten op de temperatuurregelaars om de temperaturen op de aluminium plaat direct te regelen. Voor ons huidige apparaat zijn de koude en warme zijden ingesteld op respectievelijk 12 °C en 36 °C.
Figuur 3. Een diagram van het apparaat. De temperatuursondes worden gebruikt als een feedbackregeling die de temperatuur op de aluminium plaat afleest. De Peltier apparaten zijn aangesloten op de temperatuurregelaars. Om oververhitting van de Peltiers te voorkomen, worden de vloeistofkoelers direct onder de Peltiers geplaatst. De vier vloeistofkoelers worden verbonden door waterbuizen die aansluiten op de pomp en de radiator. De radiator heeft twee ventilatoren die de temperatuur van het water afkoelen. De pomp en radiator zijn aangesloten op de voeding.
Figuur 4. Het plan van de plexiglas hoes. Dit is het plan voor de hoes die gemaakt is van plexiglas. De afdekking heeft vier rijstroken gedeeld door drie 0,2 cm dikke verdelers en een gat met een diameter van 0,7 cm bevindt zich in het midden van het bovenpaneel op elke rijstrook (figuur 2A).
Figuur 5. Een voorbeeld van de TPR-gedragsgegevens. TPR van w1118 vliegt meer dan 24 uur. Voorkeurstemperaturen werden berekend met behulp van de verdeling van vliegen in de experimenten met temperatuurvoorkeursgedrag. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde voorkeurstemperatuur in elke tijdzone. Getallen vertegenwoordigen het aantal assays. ANOVA, P < 0,0001. Tukey-Kramer test t.o.v. ZT1-3, ***P < 0,001, **P < 0,01 of *P < 0,05. Dit cijfer van het TPR-fenotype is aangepast van Kaneko et al. 3 met toestemming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier illustreren we de details van het temperatuurvoorkeursgedragsapparaat en de analyse van het TPR-gedrag. Drosophila vertoont de opvallende, robuuste en reproduceerbare kenmerken van klokgestuurde TPR. Onze gegevens suggereren echter dat ten minste twee factoren, omgevingslicht en leeftijd, de TPR-gedragsfenotypes aanzienlijk verstoren.
We merken op dat licht de temperatuurvoorkeur bij Drosophilaaanzienlijk beïnvloedt. Het is consistent met het feit dat w1118-vliegen die in LD worden gehouden, overdag de voorkeur geven aan hogere temperaturen dan die in DD, hoewel de ritmische veranderingen van de voorkeurstemperatuur nog steeds worden gehandhaafd onder LD en DD3. Daarom beïnvloedt licht de temperatuurvoorkeur van de vlieg onafhankelijk van de circadiane klok. Omdat het niet duidelijk is hoeveel lichtintensiteit nodig is en welke mechanismen deze lichtafhankelijke temperatuurvoorkeur reguleren, gebruiken we dezelfde lichtintensiteit (~ 500-1.000 lux) tijdens de experimenten om reproduceerbare resultaten te verkrijgen.
De leeftijd van de vliegen heeft ook invloed op de temperatuurvoorkeur. We vermijden het gebruik van dag 1 vliegen omdat de TPR fenotypes van de dag 1 vliegen (een dag na het uitkomen) variabel zijn. Hoewel dag 4 en oudere vliegen constant TPR-gedrag vertonen, geven ze de voorkeur aan lagere temperaturen dan 2 of 3 dagen oude vliegen. Daarom is het erg belangrijk om niet brede oude vliegen te mengen. We gebruiken de dag 2-3 vliegen of de dag 4-5 vliegen groep indien nodig.
In onze huidige TPR-gedragsmethode onderzoeken we slechts 30 minuten het gedrag van temperatuurvoorkeur. De reden hiervoor is dat de vliegen > 1 uur in de temperatuurgradiënt hebben de neiging om de voorkeur te geven aan een lagere temperatuur. Dit misschien vanwege het gebrek aan voedsel en water in het apparaat. Daarom gooien we de vliegen weg na elk gedragsexperiment van 30 minuten. Het zou een enorm voordeel zijn als het TPR-gedrag ten minste 24 uur continu kon worden gemeten, idealiter ~ 15 dagen. In dit geval zou de TPR-gedragstest gemakkelijk worden uitgevoerd zonder de vliegenflacons naar de verschillende incubators over te brengen. Wat nog belangrijker is, TPR fenotypes zou efficiënter zijn in vergelijking met andere circadiane gedragingen zoals motorische activiteit.
Dieren zijn erg gevoelig voor kleine veranderingen in de omgeving. We toonden aan dat het voorkeursgedrag van de vliegentemperatuur niet alleen door de klok wordt gereguleerd, maar ook sterk wordt beïnvloed door licht. TPR kan een gedragsuitvoer zijn die is geïntegreerd door alle omgevingssignalen en interne toestanden. Drosophila is een geavanceerd modelsysteem om fundamentele mechanismen van hersenfuncties te ontleden met behulp van de verscheidenheid aan genetische hulpmiddelen, relatief eenvoudige hersenstructuur en veelzijdige gedragstesten. Daarom kan het bestuderen van temperatuurvoorkeursgedragstesten licht werpen op de fundamentele mechanismen van hoe de hersenen verschillende informatie integreren om optimaal gedrag te produceren.
Bovendien suggereren onze onlangs gepubliceerde gegevens dat de vlieg TPR functies deelt met de zoogdier BTR3. Omdat de mechanismen die de slaap in vliegen regelen analoog zijn aan die welke de slaap van zoogdierencontroleren 17-20, geloven we dat verdere verkenning van Drosophila TPR zal bijdragen aan een beter begrip van circadiaans ritme en slaapgedrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er valt niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn Drs. Aravinthan Samuel en Marc Gershow dankbaar die hebben geholpen bij het ontwikkelen van de eerste versie van het gedragsapparaat en Matthew Batie die het gedragsapparaat heeft aangepast. Dit onderzoek werd ondersteund door Trustee Grant van Cincinnati Children's Hospital, JST/PRESTO, March of Dimes en NIH R01 GM107582 aan F.N.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bright Lab Jr. Safelight | Amazon | #B00013J8UY | Red light for dark rooms |
| Rain X | SOPUS products | Water repellent: Apply the plexiglass cover | |
| C-Clamp | Home Depot | ||
| Temperature/hygrometer | Fisher | 15-077-963 | |
| Peltier devices | TE Technology, Inc. | HP-127-1.4-1.15-71P | |
| Thermometer | Fluke | Fluke 52II | |
| Bench top controller | Oven Industries | 5R6-570-15R and 5R6-570-24R | |
| Temperature sensor probe | Oven Industries | TR67-32 | |
| Generic 480 Watt ATX power supply | computer cooling system | ||
| MCR220-QP-RES Dual 120 mm Radiator with reservoir | Swiftech | computer cooling system | |
| MCP350 In-Line 12V DC pump | Swiftech | computer cooling system | |
| MCW50 graphics Card liquid cooler | Swiftech | computer cooling system | |
| Scythe Kaze-Jyuni SY1225SL12SH fan | Crazy PC | computer cooling system |
References
- Krauchi, K. The thermophysiological cascade leading to sleep initiation in relation to phase of entrainment. Sleep Med. Rev. 11, 439-451 (2007).
- Krauchi, K. The human sleep-wake cycle reconsidered from a thermoregulatory point of view. Physiol. Behav. 90, 236-245 (2007).
- Kaneko, H., et al. Circadian Rhythm of Temperature Preference and Its Neural Control in Drosophila. Curr. Biol. 22, 1851-1857 (2012).
- Allada, R., Chung, B. Y. Circadian organization of behavior and physiology in Drosophila. Annu. Rev. Physiol. 72, 605-624 (2010).
- Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis in C. elegans and Drosophila. Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Hong, S. T., et al. cAMP signalling in mushroom bodies modulates temperature preference behaviour in Drosophila. Nature. 454, 771-775 (2008).
- Dillon, M. E., Wang, G., Garrity, P. A., Huey, R. B.
- Viswanath, V., et al.
- Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144, 614-624 (2011).
- Stevenson, R. D. The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms. Am. Nat. 126 (3), (1985).
- Refinetti, R., Menaker, M. The circadian rhythm of body temperature. Physiol. Behav. 51, 613-637 (1992).
- Duffy, J. F., Dijk, D. J., Klerman, E. B., Czeisler, C. A. Later endogenous circadian temperature nadir relative to an earlier wake time in older people. Am. J. Physiol. 275, 1478-1487 (1998).
- Saper, C. B., Lu, J., Chou, T. C., Gooley, J. The hypothalamic integrator for circadian rhythms. Trends Neurosci. 28, 152-157 (2005).
- Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behaviour associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
- Qiu, J., Hardin, P. E. per mRNA cycling is locked to lights-off under photoperiodic conditions that support circadian feedback loop function. Mol. Cell Biol. 16, 4182-4188 (1996).
- Crocker, A., Sehgal, A.
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
- Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287, 1834-1837 (2000).
- Parisky, K. M., et al. PDF cells are a GABA-responsive wake-promoting component of the Drosophila sleep circuit. Neuron. 60, 672-682 (2008).
