Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Drosophila'da Sıcaklık Tercih Davranışının ve Sirkadiyen Ritminin Tasarımı ve Analizi

Published: January 13, 2014 doi: 10.3791/51097
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1The Visual Systems Group, Division of Pediatric Ophthalmology, Cincinnati Childrens Hospital Medical Center, 2PRESTO, JST

Summary

Son zamanlarda, sineklerde tercih edilen sıcaklığın gündüz arttığı ve gece boyunca düştüğü drosophila sirkadiyen çıktısı, sıcaklık tercih ritmi (TPR) adlı bir roman belirledik. TPR, başka bir sirkadiyen çıkış olan lokomotor aktiviteden bağımsız olarak düzenlenir. Burada TPR'nin tasarımını ve analizini drosophila.

Abstract

Sirkadiyen saat, uyku, lokomotor aktivite ve vücut sıcaklığı (BTR) ritimleri1,2dahil olmak üzere yaşamın birçok yönünü düzenler. Son zamanlarda, sineklerde tercih edilen sıcaklığın gündüz arttığı ve gece boyunca düştüğü sıcaklık tercih ritmi (TPR) adı verilen bir Drosophila sirkadiyen çıktısı belirledik 3. Şaşırtıcı bir şekilde, TPR ve lokomotor aktivitesi farklı sirkadiyen nöronlar3ile kontrol edilir. Drosophila locomotor aktivitesi iyi bilinen bir sirkadiyen davranışsal çıktıdır ve birçok korunmuş memeli sirkadiyen saat genlerinin ve mekanizmalarının keşfine güçlü katkılar sağlamıştır4. Bu nedenle, TPR'yi anlamak bilinmeyen moleküler ve hücresel sirkadiyen mekanizmaların tanımlanmasına yol açacaktır. Burada, TPR testinin nasıl gerçekleştirildiğini ve analizini açıklıyoruz. Bu teknik sadece TPR'nin moleküler ve sinirsel mekanizmalarını parçalamaya izin verir, aynı zamanda farklı çevresel sinyalleri entegre eden ve hayvan davranışlarını düzenleyen beyin fonksiyonlarının temel mekanizmaları hakkında yeni içgörüler sağlar. Ayrıca, son yayınlanan verilerimiz sinek TPR'nin memeli BTR3ile özellikleri paylaştığını göstermektedir. Drosophila, vücut sıcaklığının tipik olarak davranışsal olarak düzenlendiği ektotermlerdir. Bu nedenle, TPR bu sineklerde ritmik bir vücut sıcaklığı oluşturmak için kullanılan bir stratejidir5-8. Drosophila TPR'nin daha fazla araştırılmasının, hayvanlarda vücut ısısı kontrolünün altında bulunan mekanizmaların karakterizeini kolaylaştıracağına inanıyoruz.

Introduction

Sıcaklık her yerde bulunan bir çevresel işarettir. Hayvanlar zararlı sıcaklıklardan kaçınmak ve rahat olanları aramak için çeşitli davranışlar sergilerler. Drosophila sağlam bir sıcaklık tercih davranışı sergiler6,7. Sinekler 18-32 ° C'den bir sıcaklık gradyanı içine salındığında, sinekler hem sıcak hem de soğuk sıcaklıklardan kaçınır ve son olarak sabah3'te25 ° C'lik tercih edilen bir sıcaklık seçer. Sıcak sıcaklık sensörleri, Drosophila geçici reseptör potansiyelini (TPR) ifade eden bir dizi termossensör nöron, AC nöronlarıdır, TRPA16,9. Soğuk sıcaklık sensörleri 3. anten segmentlerinde bulunur, çünkü 3. anten segmentlerinin kaldırılması soğuk sıcaklıktan kaçınma eksikliğine neden olur6. Son zamanlarda, TRPP proteini Brivido (Brv)10. Brv, 3. anten segmentlerinde ifade edildiğinden ve soğuk algılamaya aracılık edildiğinden, Brv sıcaklık tercih davranışı için kritik olan olası bir soğuk algılama molekülüdür. Özetle, sinekler sıcak ve soğuk sıcaklıkları önlemek ve tercih edilen sıcaklığı bulmak için bu iki sıcaklık sensörlerini kullanır.

Memeliler vücut sıcaklıklarını düzenlemek için ısı üretirken, ektotermler genellikle vücut sıcaklıklarını ortam sıcaklığına uyarlar11. Bazı ektotermlerin, ektotermlerin BTR12'lerinidüzenlemeleri için bir strateji olduğuna inanılan günlük bir TPR davranışı sergilediği bilinmektedir. Sineklerin TPR sergileyip sergilemediğini belirlemek için, 24 saat boyunca çeşitli noktalarda sıcaklık tercihi davranış analizini tekrarladık. Drosophila'nın sabahları düşük, akşamları yüksek olan ve insanlarda BTR'ninkine benzer bir desen izleyen günlük bir TPR sergilediğini bulduk13.

Drosophila'dabeyinde ~150 saat nöron vardır. Lokomotor aktivitesini düzenleyen saat nöronlarına M ve E osilatörleri denir. Bununla birlikte, ilginç bir şekilde, M ve E osilatörleri TPR'yi düzenlemez, bunun yerine beyindeki DN2 saat nöronlarının TPR'yi düzenlediğini ancak lokomotor aktivitesini düzenlemediğini gösterdik. Bu veriler, TPR'nin lokomotor aktivitesinden bağımsız olarak düzenlendiğini göstermektedir. Özellikle, memeli BTR de lokomotor aktivitesinden bağımsız olarak düzenlenir. Sıçanlarda yapılan ablasyon çalışmaları, BTR'nin, lokomotor aktivitesini kontrol edenlerden farklı bir altparaventriküler bölge nöronlarını hedefleyen spesifik SCN nöronları aracılığıyla kontrol olduğunu göstermektedir14. Bu nedenle, verilerimiz memeli BTR ve sinek TPR'nin evrimsel olarak korunmuş olma olasılığını göz önünde bulundurmaktadır3Hem sinek TPR hem de memeli BTR, lokomotor aktivitesinden bağımsız olarak düzenlenen sirkadiyen saate bağlı sıcaklık ritimleri sergiler.

Burada, TPR davranışsal testinin nasıl analiz edeceğine dair ayrıntıları açıklıyoruz Drosophila. Bu yöntem, sadece TPR'nin moleküler mekanizmasının ve sinir devrelerinin değil, aynı zamanda beynin farklı çevresel ipuçlarını ve iç biyolojik saatleri nasıl entegre ederek entegre olduğunun araştırılmasına izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sineklerin Hazırlanması

  1. Açık Koyu (LD) Deneyler
    1. Sinekleri açık 12 saat/karanlık 12 saat (LD) döngüler altında inkübatörlerde (%25 °C/40-%60 bağıl nem (RH)) yükseltin. İnkübatörlerin ışık yoğunluğu ~ 500-1.000 lükstür.
    2. 24 saat boyunca davranış testlerini tamamlamak için iki inkübatör gereklidir. Her iki inkübatör de AÇIK KAPASI işlevlerine sahip programlanabilir bir ışığa sahip olmalıdır. Ayrıca ışığa geçirgen olmayan sağlam kapılara da sahip olmalıdırlar(yani cam veya pleksiglas olmamalıdır).
      Not: Bir inkübatör "gün" inkübatörü olarak atanmalı ve 12 saat açık ve 12 saat karanlık bir LD döngüsüne ayarlanmalıdır. İkinci inkübatör bir "gece" inkübatörü olarak belirlenmeli ve 12 saat karanlık ve ardından 12 saat ışık ile ilkinin tersine ayarlanmalıdır. Gece inkübatörü karanlıkta erişilebilen odaya yerleştirilmelidir, böylece gece koşulları yaşayan sineklere deneyler için kolayca erişilebilir.
    3. Sinek şişelerini gündüz veya gece inkübatörlerine yerleştirin. Yeni yumurtadan çıkan sinekleri test başına 20-30 taze bir şişede toplayın ve aynı inkübatörde 2-3 gün saklayın.
    4. 2-3 gün sonra, sıcaklık tercihi davranışsal test için sinek kullanın.
      1. Gün için (Zeitgeber zamanı (ZT) 0-12) deneyleri için, gün inkübatöründen sinekleri toplayın.
      2. Davranış deneylerinden hemen önce, toplanan sinek şişelerini gün inkübatöründen çıkar.
      3. Gece (ZT 13-24) deneyleri için, gece inkübatöründen sinekleri toplayın.
      4. Davranış deneylerinden hemen önce, toplanan sinek şişelerini gece inkübatöründen alın, alüminyum folyo ile sarın ve karanlık odada kırmızı bir lambanın altındaki bir kutuya yerleştirin.
        Not: Gece deneyleri için sıcaklık tercihi davranışsal tahlili karanlık altında yapıldığı için, davranış deneylerinin sonuna kadar sineklere ışık maruziyeti önlenmelidir.
        Not: Sinekler, deneylerin gerçekleşileceği gün karbondioksite maruz kalmamalıdır.
  2. Sabit Karanlık (DD) Deneyleri
    1. DD Günü
      1. Makalenin geri kalanı için "geçiş" inkübatörü olarak adlandırdığımız DD günü deneyleri için ekstra bir inkübatör gereklidir. Geçiş inkübatörü karanlıkta erişilebilen odaya yerleştirilmelidir, böylece DD koşulları yaşayan sineklere deneyler için kolayca erişilebilir. Bir geçiş inkübatörü için örnek bir ışık zamanlaması, 13:00-19:00 arası ışık KAPI ve 19:00-19:00'da ışık KAPA OLACAKTIR (Şekil 1).
      2. Gün inkübatöründe yetiştirilen sinekleri toplayın. Sinek şişelerini, ışığın YANDIğı 13:00-19:00 saatleri arasında geçiş inkübatörüne yerleştirin. Bu şekilde, sinekler saat 19:00'a kadar ışığa uygun şekilde maruz kalır ve bu sırada ışık KAPANıR.
      3. Ertesi gün, saat 13:00'den önce, karanlık koşullar altında, sinek şişelerini geçiş inkübatöründen alın, alüminyum folyo ile sarın ve bir kutuya yerleştirin. Kutuyu bir gün daha kuvözde tut.
    2. DD Gecesi
      1. Gece inkübatöründe karanlıkta kırmızı bir lamba altında yetiştirilen sinekleri toplayın. Veya ayrıca gece inkübatörünün ışığı AÇIK olduğunda sinekleri toplayın.
      2. Toplanan şişeleri ışıklar KAPALı olduğunda karanlıkta alüminyum folyo ile sarın ve şişeleri bir kutuya yerleştirin. Kutuyu iki gün daha herhangi bir inkübatörde tutun (Şekil 1B).
        Not: Gece deneyleri için sıcaklık tercihi davranışsal tahlili karanlık altında yapıldığı için, davranış deneylerinin sonuna kadar sineklere ışık maruziyeti önlenmelidir.
  3. Sabit Işık (LL) Deneyleri
    1. LL Günü
      1. LL günü deneyleri için ekstra bir inkübatör gereklidir. Bu inkübatör, ışığı sürekli olarak AÇıK olan LL durumunu (25 °C, 800 lüks) korur.
      2. Gün inkübatöründe yetiştirilen sinekleri toplayın. Sinek şişelerini "gün" boyunca istediğiniz zaman LL inkübatörüne yerleştirin.
    2. LL Gecesi
      1. Gece inkübatöründe yetiştirilen sinekleri toplayın. Gece inkübatöründeki ışığın YANDIğı süre boyunca sinek şişelerini gece inkübatöründen LL inkübatörüne aktarın.
        Not: Örneğin, ışık gece inkübatöründe sabah 7'de KAPANIR. Sinek şişelerini gece inkübatöründen sabah 7'den önce LL inkübatörüne aktarın ve şişeleri 4 gün daha LL inkübatörde tutun.
        Not: LL koşullarında 4. günde, lokomotor aktivitesinin salınımı15,16, TPR hala devam ederken 3.

2. Sıcaklık Tercihi Davranışsal Test için Aparat

  1. Alüminyum bir plaka üzerine pleksiglas bir kapak (29 cm x 19,2 cm) (Şekil 4) yerleştirin.
  2. Plaka ve kapak arasındaki hava sıcaklığını izleyin. Şeritlerden biri içindeki kapağın iç kısmına çeşitli konumlarda altı sıcaklık probu tutturulur (Şekil 2).
    Not: Probların alüminyum plakaya veya pleksiglas kapağına temas etmediklerinden emin olun. Hava sıcaklığı 18-32 °C arasında bir gradyana ayarlanmalıdır.
  3. Cihazı % 25 °C/65-75 RH'de tutulan bir çevre odasına yerleştirin. Bu odanın dışarıdaki herhangi bir ışıktan kapatılması gerekiyor. Bir çevre odası normalde belirli bir sıcaklık ve nemi korumak için fanlarla donatılmıştır.
    Not: Fandan gelen hava muhtemelen cihazdaki sabit bir sıcaklık gradyanını rahatsız eder. Bunu önlemek için, cihazı çevreleyen alanı kapsayan şeffaf bir levha kullanıyoruz.
  4. Çevre odasındaki sıcaklık ve nemi kontrol etmek için bir termometre ve higrometre hazırlayın.
    Not: Işık Drosophila3sıcaklık tercihini etkiler. Aynı ışık yoğunluğu cihaza eşit olarak sağlanmalıdır. Çevre odası ışıklarımızın yoğunluğu ~ 800 lükstür.
    Not: Davranış deneyleri yapıldığında, sinekleri uyuşturmak ve kurtulmak için CO2 tankından bağlı bir tüp yerleştirin veya cihazın üst kısmının deliğinin yakınına tedarik edin.

3. Cihazın Kullanıma Hazırlanması

  1. Plakanın yüzeyinde sıcaklık gradyanını düzgün bir şekilde kurmak için cihazı en az 30 dakika açın (Şekil 3).
  2. Sineklerin kapağın duvarlarına veya tavanına tırmanmasını önlemek için davranış cihazının kapağını su itici ile kaplayın. Fazla su iticiyi silin ve kapağı kurumaya 25-30 dakika bekletin.
  3. Alüminyum plakadaki yoğuşmaları giderin. Pleksiglas kapağı alüminyum plakaya yerleştirin ve altı C kelepçesi ile sabitleyin (Şekil 2).
    Not: Kapağın iyi kapatılmış olması çok önemlidir, gerekirse çift çubuk bant kullanılabilir.
  4. Kapağı en az 15 dakika bekletin. Alüminyum plaka ile kapak arasındaki hava sıcaklığı gradyanı 18-32 °C'den oluşturulur.

4. Sıcaklık Tercih Davranışı Tahlil

  1. Sinekleri alüminyum plaka ile aparatın pleksiglas kapağı arasındaki boşluğa kapağın her şeridinin ortasındaki küçük deliklerden yükleyin (Şekil 2 ve 4). Sineklerin kaçmasını önlemek için delikleri kapak kaymalarıyla kapatın.
  2. Karanlık koşullar için, çevre odasındaki tüm ışıkları KAPATıN. Sinekler cihaza yerleştirildiğinde kırmızı bir lamba kullanılabilir. Davranış deneyleri yapılana kadar sineklerin kırmızı lamba dışında herhangi bir ışığın maruz kalmadığından emin olun.
  3. Her deneme için, sonraki denemelerde yeniden kullanılmayacak 20-25 yetişkin sinek kullanın. Davranışsal test 30 dakika boyunca gerçekleştirilir. Flaşlı veya flaşsız birkaç fotoğraf çekin. Deneyler sırasında çok fazla gürültü yapmamaya veya ani hareketler yapmamaya dikkat edin.
  4. Aparat üzerindeki altı sondanın da sıcaklığını kaydedin. Oda sıcaklığını ve nemi not alın.
  5. Cihazdaki sinekleri karbondioksit gazı ile uyuşturun, kelepçeleri gevşetin, pleksiglas kapağı çıkarın ve sinekleri plakadan çıkarın. Her deneyden sonra sinekler atılır. Plakadaki yoğuşma veya nemi silin. Plakadaki kapağı değiştirin ve bir sonraki deneye hazırlanmak için kelepçelerle sıkın.
  6. Tüm gün boyunca sıcaklık tercihinin bir temsiline sahip olmak için, 24 saat dilimi, dördü gündüz ve dördü gece olmak üzere sekiz saat dilimine ayrılır. Örneğin, bu ZT veya CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 ve 22-24 kullanıyoruz.
    Not: Işık AÇIK (ZT0) veya KAPA (ZT12) açıldıktan hemen sonra maskeleme etkilerinden kaynaklanan fenotip varyasyonları beklendiğinden, bu zamanlarda (ZT veya CT 0-1, 11.5-13 ve 23.5-24) sıcaklık tercih davranışını incelemeyiz. Sonuçların istatistiksel olarak sağlam olabilmesi için her saat diliminde en az beş deneme yapılmalıdır.

5. Veri Analizi

  1. Sıcaklık gradyanını aşağıdaki gibi hesaplayın: Pleksiglas kapağın kenarları boyunca üst ve alt tarafına yerleştirilen iki cetveli temel aarak sıcaklık problarının nereye yerleştirildiği belirleyin (Şekil 2A).
  2. Sıcaklık probları arasındaki sıcaklık gradyanı doğrusal olduğu tahmin edilmektedir. Sıcaklık problarının konumlarına ve ilgili kaydedilen sıcaklıklarına bağlı olarak, her sıcaklık derecesini resimlerde uygun konumda temsil eden çizgiler çizin. Her derece aralığında bulunan sinek sayısını sayın. Duvarlardaki veya kapağın tavanındaki sinekleri hariç tutun.
  3. Her şeridin her sıcaklık aralığındaki sineklerin yüzdesini hesaplayın. Ortalama bir tercih edilen sıcaklık, aşağıda gösterildiği gibi, her aralığın sinek ve sıcaklık yüzdesinin ürünlerinin toplandığı şekilde hesaplanır:
    Sineklerin % 18,5 °C + Sineklerin % 19,5 °C + Sineklerin % 20,5 °C ...+ Sineklerin % 31,5 °C + Sineklerin % 31,5 'i x 32,5 °C.
  4. Her saat diliminde ortalama tercih edilen sıcaklığı hesaplayın: Sıcaklık tercih davranışı her saat diliminde >5 kez gerçekleştirilir (ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 ve 22-24). Her saat diliminde ortalama tercih edilen sıcaklığı hesaplamak için, her denemenin ortalama tercih edilen sıcaklığı birlikte ortalamalanır. s.e.m. hata çubukları denemeler arasındaki hataya eşittir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sıcaklık tercih ritminin bir örneği Şekil 5'te gösterilmiştir. Davranış prosedürü başarıyla yapılırsa, sinekler sabahları düşük bir sıcaklık ve akşamları daha yüksek sıcaklık tercih ettikleri bir TPR sergilemelidir. Sıcaklık tercihinde gündüz ~1-1.5 °C artışı, genetik arka plandan bağımsız olarak gün boyunca gözlenmelidir, çünkü w1118, yw ve Canton S sineklerinin gündüz3sırasında benzer bir sıcaklık tercihi sergilediğini gösterdik.

Figure 1
Şekil 1. DD gününde sinek hazırlığının şeması. (A) DD gündüz deneyinin bir örneği. Işık 13:00-19:00 saatleri arasında, ışık ise geçiş inkübatöründe 19:00-13:00 saatleri arasında KAPISIZdir. Gün inkübatöründe yetiştirilen sinekleri toplayın. Sinek şişelerini 13:00-19:00 saatleri arasında geçiş inkübatörüne yerleştirin. Ertesi gün saat 13:00'den önce, sinek şişelerini karanlıkta geçiş inkübatöründen alın, alüminyum folyo ile sarın ve bir kutuya yerleştirin. (B) DD gece deneyi örneği. Gece inkübatöründe 07:00-19:00 veya 19:00-07:00 saatleri arasında ışıkta yetiştirilen sinekleri toplayın. Sinek şişelerini sabah 7 ile akşam 7 arasında karanlıkta gece inkübatöründen çıkar ve alüminyum folyo ile sarıp bir kutuya yerleştirin

Figure 2
Şekil 2. Sıcaklık tercihi davranış aygıtı. (A) Üst görünüm. Pleksiglas kapak, altı C kelepçeli alüminyum plaka üzerine yerleştirilir. Şeritlerden biri içindeki kapağın iç kısmına çeşitli konumlarda altı sıcaklık probu takılır. Sıcaklık gradyanını belirlemek için kenarlar boyunca pleksiglas kapağın üst ve alt kısmına iki cetvel yerleştirilir. (B) Yan görünüm. Alüminyum plakanın altına (44 cm x 22 cm) dört Peltier cihazı yerleştirilir. Her Peltier cihazı, soğuk veya sıcak sıcaklıklar üreten sıcaklık kontrolörlerine bağlıdır. Peltiers'ın aşırı ısınmasını önlemek için, bilgisayar soğutma sistemi su tüplerine, hava soğutma fanlarına ve güç kaynaklarına bağlıdır. Sıcaklık probları alüminyum plakanın kenarına gömülür ve alüminyum plakadaki sıcaklıkları doğrudan kontrol etmek için sıcaklık kontrolörlerine bağlanır. Mevcut cihazlarımız için soğuk ve sıcak yanlar sırasıyla 12 °C ve 36 °C olarak ayarlanmıştır.

Figure 3
Şekil 3. Aparatın bir diyagramı. Sıcaklık probları, alüminyum plakadaki sıcaklığı okuyan bir geri bildirim kontrolü olarak kullanılır. Peltier cihazları sıcaklık kontrolörlerine bağlıdır. Peltiers'ın aşırı ısınmasını önlemek için, sıvı soğutucular doğrudan Peltiers'in altına yerleştirilir. Dört sıvı soğutucu, pompaya ve radyatöre bağlanan su tüpleri ile bağlanır. Radyatörün su sıcaklığını soğutan iki fanı vardır. Pompa ve radyatör güç kaynağına bağlıdır.

Figure 4
Şekil 4. Pleksiglas kapağın planı. Pleksiglastan yapılmış kapağın planı budur. Kapak, üç adet 0,2 cm kalınlığında bölücüye bölünmüş dört şeride sahiptir ve her şeritteki üst panelin ortasına 0,7 cm çapında bir delik yerleştirilmiştir(Şekil 2A).

Figure 5
Şekil 5. TPR davranışsal verilerine bir örnek.  W1118'in TPR'si 24 saat boyunca uçuyor. Sıcaklık tercih davranışı deneylerinde sineklerin dağılımı kullanılarak tercih edilen sıcaklıklar hesaplanmıştır. Veriler, her saat diliminde ortalama tercih edilen sıcaklık olarak gösterilir. Sayılar tahlil sayısını temsil eder. ANOVA, P < 0.0001. ZT1-3 ile karşılaştırıldığında Tukey-Kramer testi, ***P < 0.001, **P < 0.01 veya *P < 0.05. TPR fenotipinin bu figürü Kaneko ve ark.'dan uyarlanmıştır. İzinli 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, sıcaklık tercihi davranışsal aparatının ayrıntılarını ve TPR davranışının analizini göstermektedir. Drosophila, saat kontrollü TPR'nin göze çarpan, sağlam ve tekrarlanabilir özelliklerini sergiler. Bununla birlikte, verilerimiz ortam ışığı ve yaş olmak üzere en az iki faktörün TPR davranışsal fenotiplerini önemli ölçüde rahatsız ettiğini göstermektedir.

Işığın Drosophila'dasıcaklık tercihini önemli ölçüde etkilediğini gözlemliyoruz. LD'de tutulan w1118 sineklerinin gündüz DD'de tutulanlara göre daha yüksek sıcaklıkları tercih ettiği gerçeğiyle tutarlıdır, ancak tercih edilen sıcaklığın ritmik değişimleri hala LD ve DD3altında tutulur. Bu nedenle ışık, sirkadiyen saatten bağımsız olarak sineğin sıcaklık tercihini etkiler. Ne kadar ışık yoğunluğunun gerekli olduğu ve bu ışığa bağımlı sıcaklık tercihini hangi mekanizmaların düzenlediği belli olmadığından, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için deneyler sırasında aynı ışık yoğunluğunu (~500-1.000 lüks) kullanıyoruz.

Sineklerin yaşları da sıcaklık tercihini etkiler. 1. gün sineklerini kullanmaktan kaçınırız, çünkü 1. 4. gün ve daha büyük sinekler sürekli TPR davranışı gösterse de, 2 veya 3 günlük sineklerden daha düşük sıcaklıkları tercih ederler. Bu nedenle, geniş kapsamlı yaşlı sinekleri karıştırmamak çok önemlidir. Günü 2-3 sinek veya gün 4-5 sinek grubunu gerektiği gibi kullanırız.

Mevcut TPR davranış yöntemimizde sıcaklık tercih davranışlarını sadece 30 dakika inceliyoruz. Bunun nedeni, sineklerin sıcaklık gradyanında >1 saat tutmasının daha düşük bir sıcaklığı tercih etme eğiliminde olmasıdır. Bu belki de aparattaki yiyecek ve suyun eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, her 30 dakikalık davranışsal deneyden sonra sinekleri atarız. TPR davranışının ideal olarak ~ 15 gün boyunca en az 24 saat boyunca sürekli olarak ölçülebilir olması büyük bir avantaj olacaktır. Bu durumda, TPR davranış tahlilleri sinek şişelerini farklı inkübatörlere aktarmadan kolayca yapılırdı. Daha da önemlisi, TPR fenotipleri lokomotor aktivite gibi diğer sirkadiyen davranışlara kıyasla daha verimli olacaktır.

Hayvanlar ortamdaki küçük değişikliklere karşı çok hassastır. Sinek sıcaklığı tercih davranışının sadece saat tarafından düzenlenmediğini, aynı zamanda ışıktan güçlü bir şekilde etkilendiğini gösterdik. TPR, tüm çevresel ipuçları ve iç durumlar tarafından entegre edilen bir davranışsal çıktı olabilir. Drosophila, çeşitli genetik araçları, nispeten basit beyin yapısını ve çok yönlü davranışsal tahlilleri kullanarak beyin fonksiyonlarının temel mekanizmalarını inceleyen sofistike bir model sistemidir. Bu nedenle, sıcaklık tercih davranışı testlerinin incelenmesi, beynin optimal davranışlar üretmek için farklı bilgileri nasıl entegre ettiğine dair temel mekanizmalara ışık tutabilir.

Ayrıca, son yayınlanan verilerimiz sinek TPR'nin memeli BTR3ile özellikleri paylaştığını göstermektedir. Sineklerde uykuyu kontrol eden mekanizmalar memeli uyku17-20'yikontrol edenlere benzer olduğundan, Drosophila TPR'nin daha fazla araştırılmasının sirkadiyen ritim ve uyku davranışının daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunacağına inanıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Açıklayacak bir şey yok.

Acknowledgments

Davranış aygıtının ilk versiyonunun geliştirilmesine yardımcı olan Dr. Aravinthan Samuel ve Marc Gershow'a ve davranış aygıtını değiştiren Matthew Batie'ye minnettarız. Bu araştırma Cincinnati Çocuk Hastanesi, JST/PRESTO, March of Dimes ve NIH R01 GM107582'den F.N.H.'ye mütevelli hibesi tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bright Lab Jr. Safelight Amazon #B00013J8UY Red light for dark rooms
Rain X SOPUS products Water repellent: Apply the plexiglass cover
C-Clamp Home Depot
Temperature/hygrometer Fisher 15-077-963
Peltier devices TE Technology, Inc. HP-127-1.4-1.15-71P
Thermometer Fluke Fluke 52II
Bench top controller Oven Industries 5R6-570-15R and 5R6-570-24R
Temperature sensor probe Oven Industries TR67-32
Generic 480 Watt ATX power supply computer cooling system
MCR220-QP-RES Dual 120 mm Radiator with reservoir  Swiftech computer cooling system
MCP350 In-Line 12V DC pump Swiftech computer cooling system
MCW50 graphics Card liquid cooler Swiftech computer cooling system
Scythe Kaze-Jyuni SY1225SL12SH fan Crazy PC computer cooling system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krauchi, K. The thermophysiological cascade leading to sleep initiation in relation to phase of entrainment. Sleep Med. Rev. 11, 439-451 (2007).
  2. Krauchi, K. The human sleep-wake cycle reconsidered from a thermoregulatory point of view. Physiol. Behav. 90, 236-245 (2007).
  3. Kaneko, H., et al. Circadian Rhythm of Temperature Preference and Its Neural Control in Drosophila. Curr. Biol. 22, 1851-1857 (2012).
  4. Allada, R., Chung, B. Y. Circadian organization of behavior and physiology in Drosophila. Annu. Rev. Physiol. 72, 605-624 (2010).
  5. Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis in C. elegans and Drosophila. Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).
  6. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
  7. Hong, S. T., et al. cAMP signalling in mushroom bodies modulates temperature preference behaviour in Drosophila. Nature. 454, 771-775 (2008).
  8. Dillon, M. E., Wang, G., Garrity, P. A., Huey, R. B. Review: Thermal preference in Drosophila. J. Therm. Biol. 34, 109-119 (2009).
  9. Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and. Nature. 423, 822-823 (2003).
  10. Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144, 614-624 (2011).
  11. Stevenson, R. D. The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms. Am. Nat. 126 (3), (1985).
  12. Refinetti, R., Menaker, M. The circadian rhythm of body temperature. Physiol. Behav. 51, 613-637 (1992).
  13. Duffy, J. F., Dijk, D. J., Klerman, E. B., Czeisler, C. A. Later endogenous circadian temperature nadir relative to an earlier wake time in older people. Am. J. Physiol. 275, 1478-1487 (1998).
  14. Saper, C. B., Lu, J., Chou, T. C., Gooley, J. The hypothalamic integrator for circadian rhythms. Trends Neurosci. 28, 152-157 (2005).
  15. Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behaviour associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
  16. Qiu, J., Hardin, P. E. per mRNA cycling is locked to lights-off under photoperiodic conditions that support circadian feedback loop function. Mol. Cell Biol. 16, 4182-4188 (1996).
  17. Crocker, A., Sehgal, A. Genetic analysis of sleep. Genes Dev. 24, 1220-1235 (1220).
  18. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
  19. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287, 1834-1837 (2000).
  20. Parisky, K. M., et al. PDF cells are a GABA-responsive wake-promoting component of the Drosophila sleep circuit. Neuron. 60, 672-682 (2008).

Tags

Biyoloji Sayı 83 Drosophila,sirkadiyen saat sıcaklık sıcaklık tercih ritmi lokomotor aktivitesi vücut ısısı ritimleri
<em>Drosophila'da</em> Sıcaklık Tercih Davranışının ve Sirkadiyen Ritminin Tasarımı ve Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goda, T., Leslie, J. R., Hamada, F.… More

Goda, T., Leslie, J. R., Hamada, F. N. Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila. J. Vis. Exp. (83), e51097, doi:10.3791/51097 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter