Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

עיצוב וניתוח של התנהגות העדפת טמפרטורה והשעון הביולוגי שלה בדרוסופילה

Published: January 13, 2014 doi: 10.3791/51097
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1The Visual Systems Group, Division of Pediatric Ophthalmology, Cincinnati Childrens Hospital Medical Center, 2PRESTO, JST

Summary

לאחרונה זיהינו תפוקה צירקדית Drosophila הרומן, קצב העדפת טמפרטורה (TPR), שבו הטמפרטורה המועדפת זבובים עולה במהלך היום ויורד במהלך הלילה. TPR מוסדר באופן עצמאי מתפוקה צירקדית אחרת, פעילות לוקומוטורית. כאן אנו מתארים את העיצוב והניתוח של TPR בדרוסופילה.

Abstract

השעון הביולוגי מווסת היבטים רבים של החיים, כולל שינה, פעילות לוקומוטורית וטמפרטורת גוף (BTR) מקצבים1,2. לאחרונה זיהינו תפוקה צירקדית Drosophila הרומן, שנקרא קצב העדפת הטמפרטורה (TPR), שבו הטמפרטורה המועדפת זבובים עולה במהלך היום ויורד במהלך הלילה 3. באופן מפתיע, פעילות TPR ו לוקומוטור נשלטים באמצעות נוירונים צירקדיים מובהקים3. פעילות לוקומוטור Drosophila היא תפוקה התנהגותית צירקדית ידועה וסיפקה תרומות חזקות לגילוי גנים ומנגנוני שעון ביולוגיים שמורים רבים של יונקים4. לכן, הבנת TPR תוביל לזיהוי מנגנונים ביולוגיים מולקולריים ותאיים לא ידועים עד כה. כאן, אנו מתארים כיצד לבצע ולנתח את מבחני TPR. טכניקה זו לא רק מאפשרת לנתח את המנגנונים המולקולריים והנוירונים של TPR, אלא גם מספקת תובנות חדשות על המנגנונים הבסיסיים של תפקודי המוח המשלבים אותות סביבתיים שונים ומווסתים התנהגויות של בעלי חיים. יתר על כן, הנתונים שפורסמו לאחרונה שלנו מראים כי TPR לטוס מניות תכונות עם יונק BTR3. Drosophila הם ectotherms, שבו טמפרטורת הגוף מוסדר בדרך כלל התנהגותית. לכן, TPR היא אסטרטגיה המשמשת ליצירת טמפרטורת גוף קצבית בזבובים אלה5-8. אנו מאמינים כי חקירה נוספת של Drosophila TPR יקל על אפיון המנגנונים שבבסיס בקרת טמפרטורת הגוף בבעלי חיים.

Introduction

טמפרטורה היא רמז סביבתי בכל מקום. בעלי חיים מפגינים מגוון התנהגויות על מנת למנוע טמפרטורות מזיקות ולחפש טמפרטורות נוחות. Drosophila להפגין התנהגות העדפת טמפרטורה חזקה6,7. כאשר זבובים משתחררים לתוך שיפוע טמפרטורה מ 18-32 מעלות צלזיוס, הזבובים להימנע הן טמפרטורות חמות וקרות ולבסוף לבחור טמפרטורה מועדפת של 25 מעלות צלזיוס בבוקר3. חיישני הטמפרטורה החמים הם קבוצה של נוירונים תרמוסנסוריים, נוירונים AC, אשר מבטאים Drosophila פוטנציאל קולטן ארעי (TPR) ערוץ, TRPA16,9. חיישני הטמפרטורה הקרה ממוקמים בקטעי האנטנה השלישית, שכן בלימת מקטעי האנטנה השלישית גורמת לחוסר הימנעות טמפרטורה קרה6. לאחרונה, חלבון TRPP Brivido (Brv) זוהה10. מכיוון ש-Brv מתבטא בקטעי האנטנה השלישית ומתווך בזיהוי קר, Brv היא מולקולת חישה קרה אפשרית, שהיא קריטית להתנהגות העדפת הטמפרטורה. לסיכום, הזבובים משתמשים בשני חיישני טמפרטורה אלה כדי למנוע את הטמפרטורות החמות והקרות ולמצוא טמפרטורה מועדפת.

בעוד יונקים ליצור חום כדי לווסת את טמפרטורת הגוף שלהם, ectotherms בדרך כלל להתאים את טמפרטורות הגוף שלהם לטמפרטורתהסביבה 11. כמה ectotherms ידועים להפגין התנהגות TPR יומי אשר הוא האמין להיות אסטרטגיה עבור ectotherms לווסת BTR שלהם12. כדי לקבוע אם הזבובים הציגו TPR, חזרנו על ניתוח התנהגותי העדפת הטמפרטורה בנקודות שונות במהלך טווח של 24 שעות. מצאנו כי Drosophila התערוכה TPR יומי, אשר נמוך בבוקר וגבוה בערב ועוקב אחר דפוס דומה לזה של BTR בבני אדם13.

ב Drosophila, ישנם ~ 150 נוירונים שעון במוח. נוירוני השעון המווסתים את פעילות הלוקומוטור נקראים מתנדים M ו- E. עם זאת, מעניין, מתנדים M ו- E אינם מווסתים TPR, במקום זאת, הראינו כי נוירונים שעון DN2 במוח לווסת TPR אבל לא פעילות לוקומוטור. נתונים אלה מצביעים על כך ש- TPR מוסדר באופן עצמאי מפעילות לוקומוטור. יש לציין, BTR יונקים מוסדר גם באופן עצמאי מפעילות לוקומוטור. מחקרי אבלציה בחולדות מראים כי BTR נשלטת באמצעות נוירונים SCN ספציפיים כי היעד קבוצה שונה של נוירונים באזור subparaventricular מאלה השולטים פעילות לוקומוטור14. לכן, הנתונים שלנו בוחנים את האפשרות כי BTR יונקים TPR לטוס נשמרים מבחינה אבולוציונית3, שכן הן לטוס TPR ו BTR יונקים התערוכה ביולוגית שעונים תלויי טמפרטורה, אשר מוסדר באופן עצמאי מפעילות לוקומוטור.

כאן, אנו מתארים את הפרטים של איך לנתח את TPR מבחני התנהגות ב Drosophila. שיטה זו מאפשרת חקירה של לא רק המנגנון המולקולרי והמעגלים העצביים של TPR, אלא גם כיצד המוח משלב רמזים סביבתיים שונים ושעונים ביולוגיים פנימיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת זבובים

  1. ניסויים בחושך בהיר (LD)
    1. העלה זבובים באינקובטורים (25 °C/40-60% לחות יחסית (RH)) תחת אור 12 שעות / כהה 12 שעות (LD) מחזורים. עוצמת האור של האינקובטורים היא ~ 500-1,000 לוקס.
    2. שתי אינקובטורים נחוצים כדי להשלים את מבחני ההתנהגות על פני תקופה של 24 שעות. שתי האינקובטורים צריכים להיות אור לתכנות עם פונקציות ON OFF. הם צריכים גם דלתות מוצקות שאינן חדירות לאור(כלומר אין זכוכית או פרספקס).
      הערה: חממה אחת צריכה להיות מוגדרת חממה "יום" ולהגדיר מחזור LD של 12 שעות אור 12 שעות כהה. החממה השנייה צריכה להיות מוגדרת חממה "לילה" ולהגדיר את ההופכי של הראשון עם 12 שעות כהה ואחריו אור 12 שעות. חממת הלילה חייבת להיות ממוקמת בחדר הנגיש בחושך, באופן כזה זבובים חווים תנאי לילה ניתן לגשת בקלות לניסויים.
    3. מניחים את בקבוקוני הזבוב באינקובטורים ביום או בלילה. לאסוף זבובים שזה עתה בקעו בקבוקון טרי, 20-30 לכל מבחנה ולשמור באותה אינקובטור במשך 2-3 ימים.
    4. לאחר 2-3 ימים, יש להשתמש בזבובים לבדיקה התנהגותית של העדפת הטמפרטורה.
      1. לניסויי יום (זמן צייטגבר (ZT) 0-12), יש לאסוף זבובים מהחממה היומית.
      2. ממש לפני הניסויים ההתנהגותיים, הוציאו את בקבוקוני הזבוב שנאספו מהחממה היומית.
      3. לניסויים ליליים (ZT 13-24), יש לאסוף זבובים מהחממה הלילית.
      4. ממש לפני הניסויים ההתנהגותיים, מוציאים את בקבוקוני הזבוב שנאספו מהחממה הלילית, עוטפים בנייר אלומיניום ומניחים בקופסה בחדר החשוך מתחת למנורה אדומה.
        הערה: מכיוון שבדיקה התנהגותית של העדפת הטמפרטורה מתבצעת בחשיכה לניסויי הלילה, יש למנוע חשיפה לאור לזבובים עד לסיום הניסויים ההתנהגותיים.
        הערה: הזבובים לא צריכים להיחשף לפחמן דו חמצני ביום הניסויים הם להתקיים.
  2. ניסויי חושך מתמיד (DD)
    1. יום DD
      1. חממה נוספת נחוצה לניסויי יום DD, שאנו מכנים חממת "מעבר" לשאר כתב היד. חממת המעבר חייבת להיות ממוקמת בחדר הנגיש בחושך, באופן כזה זבובים חווים תנאי DD ניתן לגשת בקלות לניסויים. לוח זמנים קל לדוגמה עבור חממת מעבר ידליק את האור בין השעות 13:00-19:00 ואת האור כבוי בשעה 19:00-13:00(איור 1).
      2. לאסוף את הזבובים אשר גדלו באינקובטור היום. מניחים את בקבוקוני הזבוב באינקובטור המעבר בין 13:00-19:00, כאשר האור דולק. בדרך זו, הזבובים חשופים כראוי לאור עד השעה 19:00, אז האור נכבה.
      3. למחרת, לפני השעה 13:00, בתנאים כהים, מוציאים את בקבוקוני הזבוב מהחממה, עוטפים אותם בנייר אלומיניום ומניחים אותם בקופסה. שמור את הקופסה בכל אינקובטור לעוד יום אחד.
    2. לילה DD
      1. לאסוף את הזבובים אשר גדלו באינקובטור הלילה בחושך תחת מנורה אדומה. או בנוסף לאסוף את הזבובים כאשר אור החממה של הלילה דולק.
      2. לעטוף בקבוקונים שנאספו עם רדיד אלומיניום בחושך בכל פעם שהאורות כבויים ומניחים את הבקבוקונים בקופסה. שמור את התיבה בכל חממה למשך יומיים נוספים(איור 1B).
        הערה: מכיוון שבדיקה התנהגותית של העדפת הטמפרטורה מתבצעת בחשיכה לניסויי הלילה, יש למנוע חשיפה לאור לזבובים עד לסיום הניסויים ההתנהגותיים.
  3. ניסויי אור קבוע (LL)
    1. יום LL
      1. אינקובטור נוסף נחוץ לניסויי יום LL. חממה זו שומרת על מצב LL (25 °C (70 °F, 800 לוקס), עם האור על ברציפות.
      2. לאסוף זבובים אשר גדלו באינקובטור היום. מניחים את בקבוקוני הזבוב באינקובטור LL בכל עת במהלך "היום" שלהם.
    2. לילה LL
      1. לאסוף זבובים אשר גדלו באינקובטור הלילה. מעבירים את בקבוקוני הזבובים מהחממה הלילית לחממה LL בזמן שהאור באינקובטור הלילה דולק.
        הערה: לדוגמה, האור נכבה בשעה 7 בבוקר באינקובטור הלילה. מעבירים את בקבוקוני הזבובים מהחממה הלילית לחממה LL לפני השעה 07:00 ושומרים את הבקבוקונים באינקובטור LL למשך 4 ימים נוספים.
        הערה: ביום 4 בתנאי LL, התנודות של פעילות לוקומוטור מבוטלת15,16, בעוד TPR הוא עדיין מתמשך 3.

2. המנגנון לבדיקה התנהגותית העדפת טמפרטורה

  1. הניחו כיסוי פרספקס (29 ס"מ על 19.2 ס"מ) (איור 4)על לוח אלומיניום.
  2. לפקח על טמפרטורת האוויר בין הצלחת לבין הכיסוי. שש בדיקות טמפרטורה מחוברות בתנוחות שונות בחלק הפנימי של המכסה בתוך אחד הנתיבים(איור 2).
    הערה: ודא שהבדיקות אינן נוגעות בצלחת האלומיניום או בכיסוי הפלקסיגלס. טמפרטורת האוויר צריכה להיות מוגדרת שיפוע מ 18-32 מעלות צלזיוס.
  3. הנח את המנגנון בחדר סביבתי המתוחזק ב 25 °C (65 °F) - 75% RH. צריך לאטום את החדר הזה מכל אור חיצוני. חדר סביבתי מצויד בדרך כלל במאווררים כדי לשמור על טמפרטורה ולחות מסוימות.
    הערה: סביר להניח שהאוויר מהמאוורר מפריע לשיפוע טמפרטורה יציב במנגנון. כדי למנוע זאת, אנו משתמשים בגיליון שקוף המכסה את האזור המקיף את המנגנון.
  4. הכינו מדחום ומד לחות לבדיקת הטמפרטורה והלחות בחדר הסביבתי.
    הערה: אור משפיע על העדפת הטמפרטורה של Drosophila3. אותה עוצמת אור צריכה להיות מסופקת על המנגנון באופן אחיד. עוצמת אורות החדר הסביבתי שלנו היא ~ 800 לוקס.
    הערה: כאשר הניסויים ההתנהגותיים נעשים, למקם צינור מחובר ממיכל CO2 או לספק ליד החור של החלק העליון של המנגנון על מנת להרדים להיפטר הזבובים.

3. הכנת מנגנון לשימוש

  1. הפעל את המנגנון למשך 30 דקות לפחות כדי לקבוע את שיפוע הטמפרטורה כראוי על פני הצלחת (איור 3).
  2. מעיל את הכיסוי של מנגנון ההתנהגות עם דוחה מים כדי למנוע זבובים לטפס על הקירות או התקרה של הכיסוי. לנגב את עודף המים דוחה ולהשאיר את הכיסוי במשך 25-30 דקות לייבוש.
  3. הסר כל עיבוי על צלחת האלומיניום. מניחים את כיסוי הפלקסיגלס על לוח האלומיניום ומאובטחים בשישה מהדקי C(איור 2).
    הערה: חשוב מאוד שהכיסוי יהיה אטום היטב, במידת הצורך ניתן להשתמש בסרט הדבקה כפול.
  4. השאירו את הכיסוי לפחות 15 דקות. שיפוע טמפרטורת האוויר בין צלחת האלומיניום לכיסוי נוצר מ 18-32 מעלות צלזיוס.

4. בדיקת התנהגות העדפת טמפרטורה

  1. העמיסו את הזבובים לחלל שבין לוח האלומיניום לכיסוי הפלקסיגלס של המנגנון דרך חורים קטנים במרכז כל נתיב של העטיפה(איורים 2 ו-4). לכסות את החורים עם תלושי כיסוי כדי למנוע את הזבובים לברוח.
  2. לתנאים האפלים, כבו את כל האורות בחדר הסביבתי. מנורה אדומה יכולה לשמש כאשר הזבובים ממוקמים לתוך המנגנון. ודאו שהזבובים אינם חשופים לאורות מלבד מנורה אדומה עד לסיום הניסויים ההתנהגותיים.
  3. עבור כל ניסיון, השתמש 20-25 זבובים מבוגרים, אשר אין לעשות בהם שימוש חוזר בניסויים הבאים. ההסתעפות ההתנהגותית מבוצעת במשך 30 דקות. צלם כמה תמונות עם או בלי הבזק. היזהר לא לעשות הרבה רעש או כל תנועות פתאומיות במהלך הניסויים.
  4. רשום את הטמפרטורה של כל ששת הבדיקות במנגנון. שימו לב לטמפרטורת החדר, כמו גם ללחות.
  5. הרדמה את הזבובים במנגנון עם גז פחמן דו חמצני, לשחרר את המהדקים, להסיר את כיסוי plexiglass, ולהסיר את הזבובים מהצלחת. לאחר כל ניסוי, הזבובים מושלכים. לנגב כל עיבוי או לחות מהצלחת. החלף את הכיסוי על הצלחת והדק עם המהדקים כהכנה לניסוי הבא.
  6. על מנת לקבל ייצוג של העדפת הטמפרטורה לאורך כל היום, פרק הזמן של 24 שעות מחולק לשמונה אזורי זמן, ארבעה במהלך היום וארבעה בלילה. לדוגמה, אנו משתמשים ב- ZT או CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 ו- 22-24.
    הערה: מאחר ווריאציות פנוטיפ הנגרמות על-ידי אפקטי מיסוך צפויות מיד לאחר הפעלת האור (ZT0) או כבוי (ZT12), איננו בוחנים את התנהגות העדפת הטמפרטורה בזמנים אלה (ZT או CT 0-1, 11.5-13 ו- 23.5-24). לפחות חמישה ניסויים חייבים להיעשות בכל אזור זמן כדי שהתוצאות יהיו מבוססות סטטיסטית.

5. ניתוח נתונים

  1. חישוב מעבר הטמפרטורה באופן הבא: קבע היכן ממוקמות בדיקות הטמפרטורה בהתבסס על שני הסרגלים הממוקמים בצד העליון והתחתון של כיסוי הפלקסיגלס לאורך הקצוות (איור 2A).
  2. שיפוע הטמפרטורה בין בדיקות הטמפרטורה מוערך להיות ליניארי. בהתבסס על המיקומים של בדיקות הטמפרטורה, כמו גם הטמפרטורות המתועדות המתאימות שלהם, לצייר קווים המייצגים כל דרגה של טמפרטורה במיקום המתאים על התמונות. ספור את מספר הזבובים הממוקמים בכל מרווח מעלות. אל תכלול זבובים על הקירות או על תקרת המכסה.
  3. חשב את אחוז הזבובים בכל טווח טמפרטורות של כל נתיב. טמפרטורה מועדפת ממוצעת מחושבת על-ידי סיכום המוצרים של אחוז הזבובים והטמפרטורה של כל מרווח, כפי שמוצג להלן:
    % של זבובים x 18°C + % זבובים x 19°C + % של זבובים x 20 °C (70 °F) ....+ % של זבובים x 31 °C (69 °F + % של זבובים x 32 °C (69 °F).
  4. חישוב הטמפרטורה המועדפת הממוצעת בכל אזור זמן: התנהגות העדפת טמפרטורה מתבצעת >5 פעמים בכל אזור זמן (ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 ו- 22-24). כדי לחשב את הטמפרטורה המועדפת הממוצעת בכל אזור זמן, הטמפרטורה המועדפת הממוצעת של כל ניסיון ממוצעת יחד. קווי השגיאה של s.e.m. שווים לשגיאה בין הניסיונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דוגמה לקצב העדפת הטמפרטורה מוצגת באיור 5. אם הליך ההתנהגות נעשה בהצלחה, הזבובים צריכים להפגין TPR שבו הם מעדיפים טמפרטורה נמוכה בבוקר וטמפרטורה גבוהה יותר בערב. ~ 1-1.5 מעלות צלזיוס עלייה בשעות היום בהעדפת הטמפרטורה יש לצפות במהלך היום, ללא קשר לרקע הגנטי, שכן הראינו כי w1118, yw ו קנטון S זבובים להפגין העדפת טמפרטורה דומה בשעות היום3.

Figure 1
איור 1. סכמטי של הכנת זבוב ביום DD. (A) דוגמה לניסוי בשעות היום של DD. האור דולק בין השעות 13:00-19:00 והאור כבוי בין השעות 19:00-13:00 בחממת המעבר. לאסוף את הזבובים אשר גדלו באינקובטור היום. מניחים את בקבוקוני הזבוב באינקובטור המעבר מתישהו בין 13:00-19:00. למחרת לפני השעה 13:00, מוציאים את בקבוקוני הזבוב מהחממה בחושך, עוטפים אותם בנייר אלומיניום ומניחים אותם בקופסה. (B) דוגמה לניסוי לילי DD. לאסוף את הזבובים אשר הועלו באינקובטור הלילה או בחושך במהלך 7 בבוקר עד 7 בערב או באור במהלך 7 בערב עד 7 בבוקר. מוציאים את בקבוקוני הזבוב מהחממה הלילית בחושך בין 7 בבוקר ל-19:00, עוטפים אותם בנייר אלומיניום ומניחים אותם בקופסה

Figure 2
איור 2. מנגנון התנהגותי העדפת טמפרטורה. (A) תצוגה עליונה. כיסוי הפלקסיגלס ממוקם על צלחת האלומיניום עם שישה מלחציים C. שש בדיקות טמפרטורה מחוברות בתנוחות שונות בחלק הפנימי של הכיסוי בתוך אחד הנתיבים. שני סרגלים ממוקמים בחלק העליון והתחתון של פרספקס לכסות לאורך הקצוות כדי לקבוע את מעבר הטמפרטורה. (B) ( B) מבט צדדי. ארבעה מכשירי פלטייה ממוקמים מתחת ללוח אלומיניום (44 ס"מ x 22 ס"מ). כל מכשיר פלטייה מחובר לבקרי הטמפרטורה המייצרים טמפרטורות קרות או חמות. כדי למנוע התחממות יתר של הפלטיירס, מערכת קירור המחשב מחוברת לצינורות מים, מאווררי קירור אוויר וספקי כוח. בדיקות טמפרטורה מוטבעות בקצה צלחת האלומיניום ומחוברות לבקרי הטמפרטורה כדי לשלוט ישירות בטמפרטורות על לוח האלומיניום. עבור המנגנון הנוכחי שלנו, הצדדים הקרים והחמים מוגדרים על 12 °C (60 °F) ו 36 °C (69 °F), בהתאמה.

Figure 3
איור 3. תרשים של המנגנון. בדיקות הטמפרטורה משמשות כבקרת משוב הקוראת את הטמפרטורה על לוחית האלומיניום. התקני פלטייה מחוברים לבקרי הטמפרטורה. כדי למנוע התחממות יתר של Peltiers, מצננים נוזלי ממוקמים ישירות מתחת Peltiers. ארבעת הצידניות הנוזליות מחוברות באמצעות צינורות מים המתחברים למשאבה ורידיאטור. לרדיאטור יש שני מאווררים שמקררים את טמפרטורת המים. המשאבה והרדיאטור מחוברים לאספקת החשמל.

Figure 4
איור 4. התוכנית של כיסוי הפלקסיגלס. זו התוכנית לכיסוי שעשוי מפלקסיגלס. המכסה כולל ארבעה נתיבים המחולקים בשלושה חוצצים בעובי 0.2 ס"מ, וחור בקוטר 0.7 ס"מ ממוקם במרכז הלוח העליון בכל נתיב (איור 2A).

Figure 5
איור 5. דוגמה לנתוני ההתנהגות של TPR. TPR של w1118 טס מעל 24 שעות. טמפרטורות מועדפות חושבו באמצעות התפלגות זבובים בניסויי התנהגות העדפת טמפרטורה. הנתונים מוצגים כטמפרטורה המועדפת הממוצעת בכל אזור זמן. מספרים מייצגים את מספר מבחני ההסתעפות. ANOVA, P < 0.0001. מבחן Tukey-Kramer לעומת ZT1-3, ***P < 0.001, **P < 0.01 או *P < 0.05. נתון זה של פנוטיפ TPR מותאם מ Kaneko ואח '. שלוש ברשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו ממחישים את הפרטים של מנגנון התנהגות העדפת הטמפרטורה וניתוח של התנהגות TPR. דרוזופילה מציגה את המאפיינים הבולטים, החזקים והניתנים לשחזור של TPR הנשלט על ידי השעון. עם זאת, הנתונים שלנו מראים כי לפחות שני גורמים, אור הסביבה וגיל, להפריע באופן משמעותי פנוטיפים התנהגותיים TPR.

אנו מבחינים כי אור משפיע באופן משמעותי על העדפת הטמפרטורה ב Drosophila. זה עולה בקנה אחד עם העובדה כי w1118 זבובים כל הזמן LD מעדיפים טמפרטורות גבוהות יותר בשעות היום מאלה נשמרים DD, אם כי השינויים הקצביים של הטמפרטורה המועדפת עדיין נשמרים תחת LD ו- DD3. לכן, האור משפיע על העדפת הטמפרטורה של הזבוב ללא תלות בשעון הביולוגי. מכיוון שלא ברור כמה עוצמת אור נדרשת ואיזה מנגנונים מווסתים את העדפת הטמפרטורה תלוית האור הזו, אנו משתמשים באותה עוצמת אור (~ 500-1,000 לוקס) במהלך הניסויים כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור.

הגילאים של הזבובים משפיעים גם על העדפת הטמפרטורה. אנו נמנעים משימוש יום 1 זבובים כי פנוטיפים TPR של היום 1 זבובים (יום אחד לאחר הבקיעה) הם משתנים. למרות שזבובים בני יום 4 ומעלה מראים התנהגות TPR קבועה, הם מעדיפים טמפרטורות נמוכות יותר מאשר זבובים בני יומיים או שלושה ימים. לכן, חשוב מאוד לא לערבב זבובים מיושנים נרחבים. אנו משתמשים ביום 2-3 זבובים או היום 4-5 זבובים הקבוצה לפי הצורך.

בשיטת ההתנהגות הנוכחית שלנו TPR, אנו בוחנים התנהגויות העדפת טמפרטורה רק במשך 30 דקות. הסיבה לכך היא כי הזבובים שמרו על > שעה שיפוע הטמפרטורה נוטים להעדיף טמפרטורה נמוכה יותר. זה אולי בגלל המחסור במזון ובמים במנגנון. לכן, אנו משליכים את הזבובים לאחר כל ניסוי התנהגותי של 30 דקות. זה יהיה יתרון עצום אם התנהגות TPR ניתן למדוד ברציפות לפחות 24 שעות, באופן אידיאלי ~ 15 ימים. במקרה זה, מבחני ההתנהגות של TPR ייעשו בקלות מבלי להעביר את בקבוקוני הזבוב לאינקובטורים השונים. חשוב מכך, פנוטיפים TPR יהיה יעיל יותר בהשוואה להתנהגויות ביולוגיות אחרות כגון פעילות לוקומוטור.

בעלי חיים רגישים מאוד לשינויים קטנים בסביבה. הראינו שהתנהגות העדפת הטמפרטורה של הזבובים לא רק מוסדרת על ידי השעון אלא מושפעת מאוד מהאור. TPR עשוי להיות תפוקה התנהגותית המשולבת על ידי כל הרמזים הסביבתיים והמדינות הפנימיות. Drosophila היא מערכת מודל מתוחכמת לנתח מנגנונים בסיסיים של תפקודי המוח באמצעות מגוון של כלים גנטיים, מבנה מוח פשוט יחסית מבחנים התנהגותיים תכליתי. לכן, לימוד מבחני התנהגות העדפת טמפרטורה יכול לשפוך אור על המנגנונים הבסיסיים של איך המוח משלב מידע שונה כדי לייצר התנהגויות אופטימליות.

יתר על כן, הנתונים שפורסמו לאחרונה שלנו מראים כי TPR לטוס מניות תכונות עם יונק BTR3. מכיוון שהמנגנונים השולטים בשינה בזבובים מקבילים לאלה השולטים בשינה של יונקים17-20, אנו מאמינים כי חקירה נוספת של Drosophila TPR תתרום להבנה טובה יותר של שעון ביולוגי והתנהגות שינה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר ארווינתן סמואל ומארק גרשו שעזרו לפתח את הגרסה הראשונית של המנגנון ההתנהגותי ומתיו באטי ששינה את המנגנון ההתנהגותי. מחקר זה נתמך על ידי נאמן גרנט מבית החולים לילדים בסינסינטי, JST / PRESTO, מרץ של דימס ו NIH R01 GM107582 כדי F.N.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bright Lab Jr. Safelight Amazon #B00013J8UY Red light for dark rooms
Rain X SOPUS products Water repellent: Apply the plexiglass cover
C-Clamp Home Depot
Temperature/hygrometer Fisher 15-077-963
Peltier devices TE Technology, Inc. HP-127-1.4-1.15-71P
Thermometer Fluke Fluke 52II
Bench top controller Oven Industries 5R6-570-15R and 5R6-570-24R
Temperature sensor probe Oven Industries TR67-32
Generic 480 Watt ATX power supply computer cooling system
MCR220-QP-RES Dual 120 mm Radiator with reservoir  Swiftech computer cooling system
MCP350 In-Line 12V DC pump Swiftech computer cooling system
MCW50 graphics Card liquid cooler Swiftech computer cooling system
Scythe Kaze-Jyuni SY1225SL12SH fan Crazy PC computer cooling system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krauchi, K. The thermophysiological cascade leading to sleep initiation in relation to phase of entrainment. Sleep Med. Rev. 11, 439-451 (2007).
  2. Krauchi, K. The human sleep-wake cycle reconsidered from a thermoregulatory point of view. Physiol. Behav. 90, 236-245 (2007).
  3. Kaneko, H., et al. Circadian Rhythm of Temperature Preference and Its Neural Control in Drosophila. Curr. Biol. 22, 1851-1857 (2012).
  4. Allada, R., Chung, B. Y. Circadian organization of behavior and physiology in Drosophila. Annu. Rev. Physiol. 72, 605-624 (2010).
  5. Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis in C. elegans and Drosophila. Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).
  6. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
  7. Hong, S. T., et al. cAMP signalling in mushroom bodies modulates temperature preference behaviour in Drosophila. Nature. 454, 771-775 (2008).
  8. Dillon, M. E., Wang, G., Garrity, P. A., Huey, R. B. Review: Thermal preference in Drosophila. J. Therm. Biol. 34, 109-119 (2009).
  9. Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and. Nature. 423, 822-823 (2003).
  10. Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144, 614-624 (2011).
  11. Stevenson, R. D. The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms. Am. Nat. 126 (3), (1985).
  12. Refinetti, R., Menaker, M. The circadian rhythm of body temperature. Physiol. Behav. 51, 613-637 (1992).
  13. Duffy, J. F., Dijk, D. J., Klerman, E. B., Czeisler, C. A. Later endogenous circadian temperature nadir relative to an earlier wake time in older people. Am. J. Physiol. 275, 1478-1487 (1998).
  14. Saper, C. B., Lu, J., Chou, T. C., Gooley, J. The hypothalamic integrator for circadian rhythms. Trends Neurosci. 28, 152-157 (2005).
  15. Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behaviour associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
  16. Qiu, J., Hardin, P. E. per mRNA cycling is locked to lights-off under photoperiodic conditions that support circadian feedback loop function. Mol. Cell Biol. 16, 4182-4188 (1996).
  17. Crocker, A., Sehgal, A. Genetic analysis of sleep. Genes Dev. 24, 1220-1235 (1220).
  18. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
  19. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287, 1834-1837 (2000).
  20. Parisky, K. M., et al. PDF cells are a GABA-responsive wake-promoting component of the Drosophila sleep circuit. Neuron. 60, 672-682 (2008).

Tags

ביולוגיה גיליון 83 דרוזופילה שעון ביולוגי טמפרטורה קצב העדפת טמפרטורה פעילות לוקומוטורית מקצבי טמפרטורת גוף
עיצוב וניתוח של התנהגות העדפת טמפרטורה והשעון הביולוגי שלה <em>בדרוסופילה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goda, T., Leslie, J. R., Hamada, F.… More

Goda, T., Leslie, J. R., Hamada, F. N. Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila. J. Vis. Exp. (83), e51097, doi:10.3791/51097 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter