Summary
כאן אנו מתארים את דרך להביע את פני השטח אנטיגנים וירוס שפעת בצורה נכונה מקופלים ופונקציונליים הנגזרים מנגיף H7N9 הרומן הסיני בתאי חרקים. הטכניקה יכולה להיות מותאמת להביע ectodomains של כל משטח חלבונים נגיפיים או סלולריים.
Abstract
מערכת ביטוי baculovirus היא כלי רב עוצמה לביטוי של חלבונים רקומביננטיים. כאן אנו משתמשים בו כדי לייצר גרסאות בצורה נכונה מקופלות ומסוכרות של שפעת גליקופרוטאינים משטח וירוס - hemagglutinin (HA) וneuraminidase (NA). כדוגמא, בחרנו חלבוני HA ו NA לידי ביטוי על ידי נגיף H7N9 הרומן שהתפתח לאחרונה בסין. עם זאת הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות לחלבוני HA ו NA לידי ביטוי בכל שפעת אחרת וזני B וירוס. חלבונים רקומביננטיים HA (RHA) וNA (RNA) הם חומרים כימיים חשובים למבחנים חיסוניים כגון ELISPOT וELISA, וגם בשימוש רחב לסטנדרטיזציה חיסון, גילוי נוגדנים, בידוד ואפיון. יתר על כן, ניתן להשתמש במולקולות NA רקומביננטי למסך למעכבי מולקולה קטנות ושימושיים לאפיון של הפונקציה האנזימטית של NA, כמו גם רגישותו לתרופות אנטי. חלבוני HA רקומביננטי גם being נבדק כחיסונים ניסיוניים במודלים של בעלי חיים, וחיסון המבוסס על HA רקומביננטי היה מורשה לאחרונה על ידי ה-FDA לשימוש בבני אדם. השיטה שאנו מתארים כאן כדי לייצר את המולקולות הללו היא ישר קדימה ויכולה להקל על מחקר במעבדות שפעת, שכן הוא מאפשר לייצור כמויות הגדולות של חלבונים במהירות ובעלות נמוכה. למרות שכאן אנחנו מתמקדים בגליקופרוטאינים משטח וירוס שפעת, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לייצר חלבונים נגיפיים משטח וסלולריים אחרים.
Introduction
כתגובה ראשונה להופעתה האחרונה של זן רומן H7N9 שפעת וירוס בסין, רכשנו פלסמידים הנושאים את רצפי הגנום לhemagglutinin (HA) וneuraminidase (NA) הגנים של שני הבידודים הראשונים. שימוש בפלסמידים אלה היינו יכול לבנות במהירות וקטורי ביטוי baculoviral לייצור של HA רקומביננטי ו NA בתאי חרקים. מערכת ביטוי זה מבוסס היטב במעבדה שלנו והוכיחה מרכזי לרבים מהפרויקטים של המחקר המתמשך שלנו 1-8. תאי חרקים יכולים לקפל בצורה נכונה ושלאחר translationally לשנות חלבונים מורכבים. שינויים אלה כוללים glycosylation N צמוד, וזה חשוב עבור רבים גליקופרוטאינים נגיפיים. ככזה, אין זה מפתיע כי מערכת baculovirus היא די הוקמו להבעת פני השטח אנטיגנים נגיף שפעת. למעשה, רבים של מבני גבישי HA ו NA היה לפתור באמצעות חלבוני תא הביע חרקים 9-11. יתרון נוסף שלמערכת נמצאת בתשואות גבוהה החלבון אמין שלה של עד 30 מ"ג של תרבית תאי HA / L (המבוססת על הניסיון שלנו עם יותר מ -50 חלבונים שונים HA) - תוצאה של ביטוי זיהום בנגיף מונע מאמרגן polyhedrin החזק.
הסרת הטרנסממברני וendodomain של חלבוני HA ו NA מאפשרת ביטוי של גרסאות secretable, מסיסה של החלבונים ובכך מאוד מקל על תהליך הטיהור. בנוסף, ectodomains אלה hexahistidine מתויג ולכן יכול להיות מטוהר באמצעות כרומטוגרפיה זיקה באמצעות Ni 2 + שרף. תחומים הטרנסממברני של חלבוני HA ו NA לתרום לhomotrimer והיווצרות homotetramer, בהתאמה. על מנת לשמר oligomerizations אלה, אנו להוסיף תחום trimerization טרמינל C-לHA-, ותחום tetramerization N-המסוף לNA הבונה (איור 1). יש לנו הראינו בוודאות כי תחום כגון trimerization מייצב פונקציונליות, ותוצאותrved אפיטופים קונפורמציה על גבעול תחום של 1 HA. Tetramerization הנכון של NA עשוי גם לתרום לתיקון מתקפל וNA פונקציה 10. ניתן לבקש רצפים ווקטורי baculo העברת מחסה תחומים trimerization או tetramerization מהמחברים או ממעבדות אחרות בתחום, 9,10,12.
נושא חשוב נוסף לביטוי של חלבונים מופרשים בתאי חרקים הוא הבחירה של שורת התאים תקין. בעוד frugiperda Spodoptera נגזר תאי Sf9 לתמוך שכפול baculovirus טוב מאוד ומשמשים בדרך כלל להצלת וירוס והתפשטות, יש להם היכולת להפריש כמויות גדולות של חלבון מוגבל. Trichoplusia ni נגזר BTI-TN-5B1-4 תאים (הידוע בהכינוי גבוה חמש) יש יכולת הפרשה גבוהה יותר ונמצא שורת התאים של בחירה לביטוי בפרוטוקול זה 13,14. יתר על כן, כדאי להפחית או אפילו להסיר את סרום שור העובר (FBS) מתרבויות ביטוי. לפיכך, אנו משתמשים במדיה עם מופחת (3%) תוכן FBS לגידול המניות עובדות וירוס, ואנו מבצעים את ביטוי החלבון בתקשורת חופשית בסרום.
חלבוני HA ו NA רקומביננטי משמשים עבור רבים טכניקות החיסוניות. אולי אחד הנפוץ ביותר הוא במבחני ELISA למדידת המרה בסרום על חיסון בבני אדם או בעלי חיים 4,6,7,15. יש וNAS משמשים גם במבחני ELISPOT כשתי מולקולות של גירוי וריאגנטים לזיהוי תאי מפרישי נוגדנים 16. השימוש בם כפיתיונות מולקולריים מאפשר במיוחד כדי למיין עבור plasmablasts או סוגים אחרים של B-תאים שלאחר מכן ניתן להשתמש כדי לבודד נוגדנים (טיפוליים) חד שבטיים (מבז). מולקולות HA ו NA רקומביננטי משמשות עוד באפיון של בז אלה 8. דוגמאות אחרות כוללות ללמוד את יציבות pH או סגוליות של קולט הביע ידי מבודד וירוס שונה, או אנזימטי NA ספציפי כמותית הערכהפעילות או התנגדות למעכבים. יתר על כן, רקומביננטי, HA מטוהר יכול לשמש כדי לתקנן תוכן HA של חיסוני נגיף שפעת מומתים.
חשוב לציין, RHA (ובמידה מסוימת NA) מועמדי חיסון נמצאים כעת נבדקו במודלים של בעלי חיים וניסויים קליניים בבני אדם עם חיסון מועמד אחד שמורשה על ידי ה-FDA בשנת 2013 2,17-19. היתרון של חיסונים אלה רומן הוא כי, בשל האופי רקומביננטי של חלבונים אלו, ניתן למנוע את תהליך העבודה האינטנסיבית של יצירת של וירוסי reassortant צמיחה גבוהים. אולי אפילו יותר רלוונטי היא העובדה שתשואת HA שלהם היא גבוהה ולשעתק מזן לזן. כמו כן, מאחר חיסונים אלה מיוצרים במערכת חופשית ביצה, הם אינם מכילים חומרים מזהמים חלבון זה הם בעייתיים עבור אנשים עם אלרגיות לביצה.
כאן בחרנו להביע את חלבוני HA ו NA משני בידודים של נגיף הרומן הסיני H7N9 השפעת, / Anhui/1/13 וA/Shanghai/1/13 20,21. אלו הן דוגמאות בזמן, אבל הפרוטוקול המתואר יכול לשמש לביטוי של כל שפעת וחלבונים B HA או NA וניתן להתאים להביע כל חלבונים נגיפיים או סלולריים מופרשים אחרים. ניתן לשכפל חלבונים הטרנסממברני trimeric או tetrameric לקלטות ביטוי המשמשות לHA ו NA, בהתאמה. עם זאת, חלבונים תאיים מופרשים המסיסים ביותר, כמו האינטרפרונים לדוגמא, לא צריכים תחום נוסף לייצוב ויכולים לבוא לידי ביטוי אך ורק עם תג hexahistidine C-מסוף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. לדור של רקומביננטי baculovirus
- שיבוט להעברה-פלסמידים baculovirus
- שיבוט H7 HA ו NA ectodomain N9 (או כל גן HA או NA אחר) לתוך פלסמידים העברת pFastBac שונה (ראה מבוא). וקטורים לHA המכיל תחום trimerization C-מסוף ותג hexahistidine, כמו גם עבור NA המכיל תחום tetramerization N-מסוף ותג hexahistidine, תוארו 1,10,11,22 (איור 1) וניתן לבקש מ המחברים.
הערה הסבר: ectodomains HA הביע ללא תחום trimerization יהיה מקופל בצורה לא נכונה, שמוביל לאובדן של אפיטופים נטרול קונפורמציה, במיוחד בתחום הגבעול. כמו כן, הפונקציה האנזימטית NA מסתמכת על tetramerization הראוי. - לדור של bacmids
להפוך העברה-פלסמידים baculovirus המכילים גנים HA ו NA לחיידקי DH10Bac לפי שימוש ביטוי baculovirusמערכת לפי הוראות יצרן. בודד ולטהר bacmids באמצעות ערכת Midiprep על פי הוראות יצרן (איור 2).
- שיבוט H7 HA ו NA ectodomain N9 (או כל גן HA או NA אחר) לתוך פלסמידים העברת pFastBac שונה (ראה מבוא). וקטורים לHA המכיל תחום trimerization C-מסוף ותג hexahistidine, כמו גם עבור NA המכיל תחום tetramerization N-מסוף ותג hexahistidine, תוארו 1,10,11,22 (איור 1) וניתן לבקש מ המחברים.
- הצלה של baculovirus ואימות רקומביננטי של ביטוי חלבון
הערה הסבר: בשלבים הבאים צריכים להתבצע על סביבה נקיה מחיידקים בזרימה למינרית. לבצע הליך זה באופן עצמאי עבור HA ו NA (או כל גן אחר של ריבית). תאי חרקים גדלים בדרך כלל ב28 ° C ללא CO 2. תאי Sf9 עבור פרוטוקול זה גדלים בתקשורת תא חרק המלאה TNM-FH בתוספת 10% FBS, 1% העט סטרפטוקוקוס * ו0.1% פתרון F68 Pluronic, אם לא צוינו אחרת, וpassaged 01:04 פעמיים בשבוע. חמישה תאים גבוהים גדלים בתקשורת בסרום חופשי SFX וpassaged 1:15 פעמיים בשבוע.
* תוספת של אנטיביוטיקה צריכה להיחשב אופציונלית לאורך כל הפרוטוקול והותאמה על פי הנהלים בשימוש בכל מעבדה.- פלייט תאי חרקים Sf9 6 צלחות גם בצפיפות של 2 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר ולתת לשבת במשך 20 דקות בחממה 28 מעלות צלזיוס (ללא CO 2).
- מערבבים 2 מיקרוגרם (conc. 0.5-2 מיקרוגרם / ul) של bacmid רקומביננטי עם של מדיום TNM-FH (סרום חופשי, 1% העט סטרפטוקוקוס) 100 μl. מערבבים 6 μl של סוכן transfection עם של מדיום TNM-FH (סרום חופשי, עט סטרפטוקוקוס) 100 μl. לשלב את שני כרכים, מערבב בעדינות ולתת לשבת במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר (תערובת transfection). כולל חיקוי transfection אחד כשליטה (איור 3).
- הסר supernatant מתאי Sf9 מצופה (תאים כעת להיצמד לצלחת) ולהחליף עם 2 מיליליטר של מדיום סרום ללא TNM-FH מכיל עט סטרפטוקוקוס (1%). הוסף את הכרך השלם של תערובת transfection (מצעד 1.2.2) ולטלטל את צלחת 6 היטב בקפידה במשך 5 שניות. דגירה בחממה 28 ° C ללא CO 2 למשך 6 שעות (איור 3).
- החלף wi תקשורתתקשורת ה טרי מלאה TNM-FH (מכיל 10% FBS, 1% העט סטרפטוקוקוס ו0.1% F68 Pluronic). דגירה בחממה 28 ° C ללא CO 2 למשך 6 ימים. בדקו מדי פעם תאים תחת מיקרוסקופ. תאים נגועים מופיעים בדרך כלל גדולים יותר, עגול יותר, מוגדלים גרעינים, ולהתחיל לנתק (איור 4).
- קציר של תאים ואישור של ביטוי חלבון
- קציר תאי הודעה 6 ימים transfection ידי צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. Supernatant מכיל baculovirus רקומביננטי - זה ישמש להפקת מייד מניות עובדות, או יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שנים.
- כדי לבדוק את ביטוי חלבון לאסוף כדורים וגלולים ב500 μl של PBS. מערבבים 50 μl של ההשעיה עם 50 μl של חיץ טעינה-SDS (המכיל סוכן צמצום). הפעל SDS-PAGE ולבצע ניתוח כתם מערבי עם נוגדן אנטי hexahistidine כדי לאשר ביטוי גנים. כוללים תאים ממדומיםtransfection כפקדים שליליים (איור 3).
- הכנה של מניות עובדות
- צלחת 5 x 10 5 Sf9 תאים / 2 סנטימטר בבקבוק סנטימטר T175 2 ולתת לשבת במשך 20 דקות לאפשר להם לצרף למנה. החלף תקשורת TNM-FH להשלים עם תקשורת TNM-FH המכילה 3% FBS (1% העט סטרפטוקוקוס, 0.1% F68 Pluronic).
- להדביק תאים עם של supernatant ההצלה 100 μl. דגירה בחממה 28 ° C ללא CO 2 למשך 6 ימים ולבדוק מדי פעם אם תאים מקבלים נגועים (כמתואר בשלב 1.2.5.).
- ספין ב2,000 XG בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולאסוף supernatant. זהו עכשיו מניית P2 שלך. מלאי זה יכול להיות מאוחסן ללא הגבלת זמן ב 4 ° C. חזור על תהליך ההדבקה באמצעות של מניית P2 100 μl להדביק תאים. המניה שנוצרה נקראת P3 או מניות עובדות, אשר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס או להשתמש בם ישירות לביטוי חלבון. מניית P3 מכילה בדרך כלל 10 <sup> 7 -10 9 פלאק ויצר יחידות / מיליליטר.
2. ביטוי חלבון וטיהור
הערה הסבר: תאי Sf9 לתמוך בצמיחה של baculovirus טוב מאוד. עם זאת, היכולת שלהם להפריש כמויות גדולות של חלבון רקומביננטי היא מוגבלת. לכן אנו משתמשים בקו אחר חרקים תא, חמישה תאים גבוהים, לביטוי של חלבונים רקומביננטיים מופרשים. תאים אלה אינם תומכים בשכפול baculovirus לכותרות גבוהות מאוד 13 אבל יש להם יכולת הפרשה גבוהה.
- גדל חמישה תאים גבוהים
לגדול חמישה תאים גבוהים במדיום תרבית תאי חרקים SFX בס"מ T175 2 צלוחיות. מעבר בכל יום אחר 1:3. לתרבות 200 ביטוי מיליליטר תצטרך לגדול 5 צלוחיות ומחוברות. - קצירת והדבקה של חמישה תאים גבוהים
- ניתוק חמישה תאים גבוהים מ -5 ס"מ T175 2 צלוחיות על ידי הקשה על צלוחיות עם היד שלך. לאסוף suspe התאnsion ולהעביר לתוך צינורות 50 צנטריפוגה מיליליטר.
- ספין ב1,200 XG במשך 7 דקות בטמפרטורת חדר. הסר supernatant באמצעות אחסון ולאחד את כדורים על ידי resuspending ב15 מיליליטר של מניית P3.
- בואו לשבת במשך 15 דקות במכסת מנוע הזרימה (איור 5).
- העבר 200 מיליליטר של מדיום תרבות Hyclone SFX לתוך בקבוק נקי, סטרילי 1,000 מיליליטר ייקר (ללא buffles, אטום עם רדיד אלומיניום לפני מעוקר, לא צריך היה בשימוש במשך תרבויות חיידקים לפני).
- מעביר את ההשעיה P3/cell לתוך הבקבוק שייקר. לאטום עם רדיד אלומיניום סטרילי ובקבוק העברה לתוך שייקר. לנער ב70 סל"ד ב28 מעלות צלזיוס במשך 72-96 שעה.
- קצירת חלבון רקומביננטי מsupernatants ביטוי תא גבוה חמש
- 72-96 supernatants שעות שלאחר זיהום העברת התרבות ל500 דליי מיליליטר צנטריפוגה. ספין ב5,500 XG עבור 20 דקות ב 4 ° C. בינתיים לשטוף את צלוחיות שייקר 3x עם מים מזוקקים פעמיים(DDH 2 O).
- העברת 3 מיליליטר תרחיף Ni-שרף לתוך צינור 50 מיליליטר עם 45 מיליליטר של PBS (אחד זקוק לתרבות מיליליטר 200). לנער היטב ולהסתובב ב3,000 XG בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. למזוג את PBS ולשמור את הכדור. מערבבים את supernatant תא החרק עם גלולה Ni-השרף ולהעביר לתוך צלוחיות שייקר כבר נשטפו. לדגור על C ° 4 ל2-4 שעות, ואילו רועד (איור 6).
- הר 10 עמודת פוליפרופילן מיליליטר במהדק בעמדת תמיכה. הסר את שני כובעים, ולמקם את כוס מתחת לעמודה לאסוף זרימה דרך (פסולת). קח הבקבוק שייקר מתוך ייקרתי ולהתחיל להעביר את תערובת supernatant / תרחיף על הטור, זה יהיה לשמור על Ni-השרף ורק את supernatant יזרום דרך. להעביר את כל הנפח מעל העמודה (איור 7).
- שטוף את 4x השרף עם 15 מיליליטר של חיץ כביסה (50 מ"מ Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, imidazole 20 מ"מ, pH 8). בואו כל ניקוז הכביסה החיץמהעמודה ולסגור אותו עם הכובע (צד תחתון).
- הוסף 2 מיליליטר של חיץ elution (50 מ"מ Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, 300 imidazole מ"מ, pH 8) ולתת לשבת במשך 5 דקות. פתח עמודה ולאסוף את eluate. חזור על פעולה 3 פעמים נוספות (עם סך של 8 מיליליטר של חיץ elution). Eluate המכיל ריכוזים גבוהים של חלבון בדרך כלל תערוכות קצף כאשר מזועזע (איור 7). שמור eluate על קרח רטוב בכל הזדמנות אפשרית.
- חילופי חיץ וריכוז
- יחידות Prespin 15 מיליליטר אולטרה צנטריפוגה (30 kDa חתוכים לHA / NA, אך עשויות להשתנות בהתאם לגודל החלבון מטוהר) עם PBS (pH 7.4-7.6) ב3,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. זורק לזרום וeluate עומס על טור הספין. מלא עם 5 מיליליטר של קור סטרילי, קרח PBS וספין ל60 דקות ב 3,000 XG ב 4 ° C.
- זרימת פריקה דרך שוב, למלא עם 15 מיליליטר של PBS הקר כקרח וספין ל60 דקות ב 3,000 XG ב 4 ° C. חזור על פעולה זו proceדורה עוד פעם אחת.
- קח את טור הספין מתוך צנטריפוגה ולאסוף להתרכז החיץ החליף (בדרך כלל 200 μl). זה מרוכז מאוד חלבון רקומביננטי. יש לשטוף את טור הספין עם 400 μl של קרח הקר סטרילי PBS ולהוסיף את זה לתרכיז. שמור את התרכיז על קרח בכל העת.
3. אפיון ובקרת איכות
- מדידת ריכוז חלבון
קח aliquot של התרכיז ולמדוד אותו על ידי שימוש בשיטת כימות החלבון שלך של בחירה. הגדר ריכוז חלבון עד 1 מ"ג / מיליליטר על ידי הוספת PBS ולהקפיא aliquots קטנים ל-80 ° C. מחזורי הפשרת הקפאה יפגעו במבנה החלבון ויכולים להוביל לצבירה. - SDS-PAGE והכתמת Coomassie
הפעל 500 ng של החלבון שלך על SDS-PAGE ולבצע מכתים Coomassie. עבור מכתים מהיר ונוח להשתמש מגיב Coomassie בשילוב עם פרוטוקול מיקרוגל. חלבוני HA מופיעים בדרך כלל ב64kDa אילו חלבוני NA צריכים לרוץ בגודל של כ 56 kDa (8A דמויות ו-B). באמצעות הפרוטוקול תאר אתה לא צריך לראות את כל מוצרים פגומים. אם השפלה מתרחשת זה בדרך כלל סימן לזיהום שמרים / פטריות בביטוי. במקרה זה לחזור על התהליך ולוודא כדי לשמור על הכל סטרילי. - כתם מערבי / ELISA
על מנת לאמת את זהות חלבון אנו ממליצים לעשות כדי כתם מערבי או assay ELISA עם נוגדנים ספציפיים. באופן אידיאלי, מבחני ELISA מבוצעים עם נוגדן אשר נקשר לאפיטופים קונפורמציה (נוגדני גבעול אנטי HA למשל 1). באמצעות נוגדן כזה הקיפול הנכון של החלבון יכול להיות אישר (איור 8C). - מדידת NA פעילות
קיפול נכון של NA הנגיפי גם יכול להיקבע על ידי מדידת פעילות NA. אנו ממליצים לבצע בדיקה זו באמצעות assay NA * STAR זמין המסחרית (פשוט בצעו את הנחיות המשתמש).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מולקולות HA מA/Shanghai/1/13 וA/Anhui/1/13 הביעו היטב עם תשואות של כ 20 תרבות מ"ג / ליטר. מולקולות NA של שני הזנים הראו רמות ביטוי מתונות החל מתרבות מ"ג / ליטר 0.2 לA/Shanghai/1/13 ל0.7 מ"ג / ליטר לA/Anhui/1/13. היו כל ארבע הכנות החלבון מעט מאוד כדי לא זיהומים (8A דמויות ו-B) עם יש להיות של טוהר גבוה יותר מאשר NAS אשר יכול להיות מוסברת על ידי רמת הביטוי. A/Shanghai/1/13 HA נותח נוסף באמצעות ELISA עם אדם הגבעול-reactive מנטרל הרחב מב CR9114 23. זה מב נקשר לאפיטופ קונפורמציה רגיש בתחום הגבעול ומשמש כאן כחללית לקיפול נכון של תחום זה. נוגדן תערוכות טוב מחייב אשר נותן ביטחון כי HA הוא אכן שילב בצורה נכונה (איור 8C). ELISA שני עם סרום polyclonal העכבר אנטי H7 בוצע כדי לאשר את זהותו של החלבון מתקבל כממוצא H7 (8D איור).
איור 1. סכמטי של מבני ביטוי HA ו NA. הביטוי לבנות לHA () מכיל פפטיד אות N-מסוף ואחרי ectodomain HA, אתר מחשוף תרומבין, תחום trimerization T4 ותג hexahistidine. מבנה NA הביטוי (B) מכיל פפטיד אות N-מסוף ואחריו תג hexahistidine, phosphoprotein vasodilator גירוי (VASP) תחום tetramerization וectodomain NA. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 2. תכנית של generat bacmidיון (כמתואר בשלב 1.1.2). וקטור baculovirus העברה המכיל גנים HA או NA הופך לחיידקי DH10Bac. רקומבינציה לתוך הגנום baculovirus שחיידקים אלה נושאים מייצרת פנוטיפ מושבה לבן על צלחות סלקציה. מושבה לבנה היא הרים ושוב את הפסים. מושבה אחת מהצלחת שוב את הפסים משמשת לחסן תרבות midiprep.
איור 3. תכנית הצלת baculovirus ודור המניה עובד (כפי שמתוארים בצעדים 1.2.1-6). Bacmid רקומביננטי ומגיב transfection הם מדוללים במדיום TNM-FH סרום בחינם. שני הפתרונות משולבים, התמהיל הוא טופח במשך 20 דקות ולאחר מכן מועברים על גבי תאי Sf9. שש שעות שלאחר transfection תקשורת transfection הוא הוחלף על ידי תקשורת TNM-FH מלא. שישה ימים לאחר transfection supernatant שנקטפו והתא גלולה הוא אנאליyzed לביטוי של חלבונים רקומביננטיים.
איור 4. תאי תאי Sf9 בריאים ונגועים. Sf9 ב (א) הם בריאים ונגועים. הם מחוברים לצלחת התרבות, נראים באופן חלקי פולימורפיות וקטנה יחסית. תאים ב( ב ') נגועים בbaculovirus, מנותק ממנת התרבות, הם גדולים ועגולים ומוגדלים גרעינים. הגרעין גם מראה מראה פרטני.
איור 5. זיהום של חמישה תאים גבוהים עם baculovirus רקומביננטי (עובדים במניות, כמתואר בשלב 2.2). חמש צלוחיות T175 מחוברות עם חמישה תאים גבוהים נקצרים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ושילוב עם 15 מיליליטר של מניית baculovirus P3. לאחר 15 דקות של בcubation תערובת תא / וירוס מועברת לתוך 1,000 מיליליטר צלוחיות שייקר עם 200 מיליליטר של תקשורת SFX.
איור 6. קציר של תא supernatant 72-96 הודעה hr זיהום ודגירה עם שרף Ni-נ.ת. ע (כמתואר בשלב 2.3). השעיות תא נגועות נקצרים על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה. supernatants תרבות מעורבב עם Ni-שרף equilibrated-PBS וטופחו במשך שעה 2-4 ואילו רועד.
איור 7. הליך טיהור (כפי שמתואר ב2.3 ו2.4) ובקרת איכות (כפי שמתואר בצעדים 3.1.1-4). לאחר דגירה כל תערובת supernatant / השרף נטען על עמודי פוליפרופילן. השרף שמורה בידי העמודות ולאחר מכן שטף ארבע פעמים עם buf הכביסהfer וחלבון רקומביננטי הוא eluted עם 8 מיליליטר של חיץ elution מיושם ב 2 שלבי מיליליטר. Eluate מכן החליף חיץ ומרוכז עם טור ספין אולטרה סינון, aliquoted וקפוא. מבחני בקרת איכות כוללים-SDS, כתם מערבי, ELISA ומדידה של פעילות NA NA של רקומביננטי.
איור 8. נציג תוצאות. HA (א) ו NA (ב) חלבונים של A/Anhui/1/13 וA/Shanghai/1/13 נותחו באמצעות SDS-PAGE והכתמת Coomassie. שלמות מבנית של HA של A/Shanghai/1/13 הוערכה באמצעות CR9114 מנטרל הרחב אדם הגבעול-reactive הנוגדן אשר נקשר לאפיטופ קונפורמציה רגיש (C). זהותו של אותו HA אושרה על ידי סרום עכבר אנטי H7 polyclonal (ד ').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות שהביטוי של חלבוני HA ו NA נגיף שפעת בתאי חרקים באמצעות מערכת ביטוי baculovirus הוא ישר קדימה, בדרך כלל, יש כמה נקודות חשובים שיש לשקול. זה חשוב, כפי שציין בהקדמה, שectodomains של HA ו NA באים לידי ביטוי בשילוב עם תחומים trimerization או tetramerization, בהתאמה. תחומים אלה מבטיחים קיפול נכון של המולקולות בדרך כלל נעזרות בתחום הטרנסממברני, שאינו נוכח אם רק ectodomain באו לידי ביטוי. לדוגמא, הביטוי של ectodomain HA ללא תחום trimerization מוביל לoligomerization והתערערות אפיטופים נטרול חשובים בתחום 1 הגבעול. יתר על כן, את היציבות של החלבונים היא ירד והשפלה על ידי תאי חרקים ופרוטאזות baculovirus מתרחשת. הבחירה של תחום trimerization או tetramerization היא פחות חשובה, מספרם נע בין תחומים רוכסן לאוצין 22לfoldons הפאג T4 11 נבדקו עד כה, וכולם הראו תוצאה מספקת. חשוב לזכור כי כפי שהם מתרחשים במבודד פתוגניים מאוד 24 H5N1 או H7N7 25 (אך לא בH7N9) יש אתרי מחשוף multibasic שיש להסירו לפני הביטוי שכן הם ביקע ידי furin כמו פרוטאזות אשר נמצאות בכל העת ב 1,12 מערכת ביטוי baculovirus.
סיבה אפשרית נוספת למוצרי degradational היא זיהום עם שמרים או עובש. זה יכול לקרות כבר במהלך דור המניה עובד ויכול נעלם מעיניו במהלך האחסון של מניות ב 4 ° C. רבים שמרים ועובש מעדיפים טמפרטורות שבין 20-30 מעלות צלזיוס לצמיחה אופטימלית ולמעשה עכבות על 37 מעלות צלזיוס, שהיא טמפרטורת תרבות המשותפת לתאי יונקים. מאחר שרוב האנטיביוטיקה הנמצאת בשימוש בתרבית תאים אינן יעילה נגד אורגניזמים אוקריוטים כמו שמרים ועובש, ותרבית תאי חרקים הוא performe ד בתנאי גידול אופטימליים של חיידקים אלה טיפול נוסף יש לקחת במונחים של טיפול בסביבה נקיה מחיידקים של תרבויות. בנוסף לovergrowing תאי חרקים וacidifying תקשורת, תבניות ושמרים להביע רבות פרוטאזות מסיסה ולכן יכולים להשפיל חלבונים רקומביננטיים לחלוטין.
בעיה שמתרחשת לעתים היא ממטרים במאגר elution. הדבר בא לידי הביטוי רק לעתים נדירות ופחות או יותר ספציפי מתח (למשל A/Vietnam/1203/04 H5 HA נוטה לזרז), אך ניתן למנוע על ידי החלפת חיץ מהירה ושלמה לPBS. אחסון של חלבונים במאגר elution המכיל imidazole אינו מומלץ. הליך הטיהור ממסיק להקפאת aliquots ל-80 ° C צריך להתבצע בתוך יש להימנע יום אחד עובד ואחסון של חלבונים מטוהרים בטמפרטורה אחרת מאשר -80 מעלות צלזיוס. כמו כן, להקפיא להפשיר מחזורים חוזרים ונשנים הוכחו להשפיע לרעה על יציבות של אפיטופים מסוימים 1.
_content "> צריכים להיות צפויות תשואות להיות בטווח של .2-30 תרבות מ"ג / ליטר. רבים יש לבטא בטווח העליון ואילו NAS נוטה להביע ברמות נמוכות יותר. כמו כן, נראה שיש רמות ביטוי לכדי לתאם הפוך עם המספר אתרי glycosylation. יש מH3N2 העונתי האנושי וH1N1 prepandemic העונתי מבודד בדרך כלל להראות רמות ביטוי נמוכות, ואילו רוב יש ממוצא נגיף שפעת עופות יש רמות ביטוי גבוהות. כדי לשפר את הביטוי מומלץ להגדיל את צפיפות התאים בבקבוק או לנסות להשתמש בפחות או מניות יותר עובדות לביטוי. גידול של פי 10 או ירידה של המניה עובדת יכול להשפיע בצורה חיובית על רמות ביטוי. גורם נוסף שיכול להשפיע על רמות ביטוי הוא הזמן שבין זיהום וקציר. 96 שעה הן אידיאלית עבור יש ורוב NAS אבל פעמים דגירה קצרות יותר עשוי למעשה להגדיל את התשואות של חלבונים מסוימים.תאי חרקים הם מסוגלים לבצע שינויי posttranslational בכמעט יונקיםאופן כמו-n והם מסוגלים לקפל מבנים חלבוניים מורכבים מאוד עם יעילות דומה לזו של תאי יונקים (אך ייצור תשואות גבוהות יותר). במונחים של glycosylation, הם מפגינים דפוס שהוא מעט שונה מתאי יונקים וכולל N-glycans בעיקר paucimannosidic שאין שינויי חומצת sialic 19. עם זאת, שורות תאי חרקים ששונו כדי לייצר יונקים כמו glycosylation (כולל חומצת sialic מסוף) זמינות 14 מסחרי.
מערכת ביטוי baculovirus היא כלי מאוד שימושי לביטוי של גליקופרוטאינים משטח שפעת רקומביננטי - HA ו NA. חלבונים רקומביננטיים אלה משמשים עבור רבים מבחני חיסוניים וביוכימיים, כמו גם עבור סטנדרטיזציה של תוכן אנטיגן של חיסונים וכמו אנטיגן לניסויי חיסון במודלים של בעלי חיים. Baculovirus הביע HA ו NA תערוכת פונקציה ביולוגית מלאה וקיפול נכון אם באו לידי ביטוי במסגרת עם trimerizatiובתחומי tetramerization בהתאמה. זה מבדיל אותם מחיידקים הביעו יש, כי הם אינם מסוכרים וחוסר אפיטופים תפקודיים בתחום הגבעול. יתר על כן, את מוצגי מערכת ביטוי baculovirus תשואות חלבון גבוהים יותר באופן משמעותי ממערכות יונקים תא 26 וטיפול וupscaling קלים יותר. לסיכום אנו מתארים פרוטוקול קל ויעיל לביטוי כמויות גדולות של מולקולות HA ו NA וירוס שפעת רקומביננטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לפטריק ג וילסון לCR9114 נוגדן חד שבטי. אנו מודים גם ג'ניפר Debeauchamp וריצ'רד Webby לפלסמידים A/Anhui/1/13 המקוריים. תמיכה חלקית עבור עבודה זו סופקה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות במימון תכנית פרויקט גרנט AI097092-01A1 וCEIRS (מרכזים המצוינים למחקר שפעת ומעקבים, HHSN26620070010C). FK נתמכה על ידי מלגת ארווין שרדינגר (J 3232) מקרן המדע האוסטרית (FWF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
References
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7, e43603 (2012).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies. J. Virol. , (2013).
- Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador. Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).
- Margine, I., et al. H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice. J. Virol. , (2013).
- Miller, M. S., et al. 1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans. J. Infect. Dis. 652, (1976).
- Pica, N., et al. Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).
- Sangster, M. Y., et al. The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination. Clin. Vaccine Immunol. , (2013).
- Tan, G. S., et al. A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324, 246-251 (2009).
- Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase. J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).
- Stevens, J., et al. Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science. 303, 1866-1870 (2004).
- Wei, C. J., et al. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).
- Krammer, F., et al. Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines. Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).
- Palmberger, D., et al. Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative. J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).
- Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems. Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).
- Wrammert, J., et al. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).
- Treanor, J. J., et al. Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial. Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).
- Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase. J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).
- Krammer, F., Grabherr, R. Alternative influenza vaccines made by insect cells. Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).
- Gao, R., et al. Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus. N. Engl. J. Med. , (2013).
- Goff, P. H., et al. Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin. J. Virol. , (2013).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (2010).
- Dreyfus, C., et al. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science. 337, 1343-1348 (2012).
- Steel, J., et al. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza. J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).
- Fouchier, R. A., et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).
- Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
