Ekspression af funktionelle Rekombinant hæmagglutinin og neuraminidase Proteiner fra Novel H7N9 influenza virus ved hjælp baculovirusekspressionssystemet

Summary

Her beskriver vi en måde at udtrykke foldede og funktionelle korrekt influenzavirus overfladeantigener afledt fra romanen kinesiske H7N9 virus i insektceller. Teknikken kan tilpasses til at udtrykke ektodomæner eventuelle virale eller cellulære overfladeproteiner.

Abstract

Baculovirusekspressionssystemet er et kraftfuldt værktøj til ekspression af rekombinante proteiner. Her bruger vi den til at producere foldede og glykosyleret korrekt versioner af influenza A-virus overfladeglycoproteiner - hæmagglutinin (HA) og neuraminidase (NA). Som et eksempel, vi valgte HA-og NA-proteiner udtrykt ved romanen H7N9-virus, der for nylig dukkede op i Kina. Men protokol kan let tilpasses til HA og NA-proteiner udtrykt ved enhver anden influenza A og B-virusstammer. Rekombinant HA (rHA) og NA (RNA) proteiner er vigtige reagenser til immunologiske assays, såsom ELISPOT og ELISA, og de er også i bred anvendelse for standardisering vaccine, antostofopdagelse, isolering og karakterisering. Endvidere kan rekombinante NA-molekyler anvendes til at screene for inhibitorer med små molekyler og er nyttige til karakterisering af den enzymatiske funktion af NA, samt dens følsomhed over for antivirale lægemidler. Rekombinante HA-proteiner er også being testet som eksperimentelle vacciner i dyremodeller, og en vaccine baseret på rekombinant HA for nylig blev godkendt af FDA til anvendelse i mennesker. Den metode, vi beskriver her til at producere disse molekyler er ligetil og kan lette forskning i laboratorier for influenza, da det giver mulighed for produktion af store mængder af proteiner hurtigt og til en lav pris. Selv her har vi fokus på influenzavirus overfladeglycoproteiner, kan denne metode også bruges til at fremstille andre virale og cellulære overfladeproteiner.

Introduction

Som en første reaktion på den seneste fremkomsten af ​​romanen H7N9 influenzavirus stamme i Kina, vi købte plasmider, der bærer de genomiske sekvenser for hæmagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) gener af de to første isolater. Ved hjælp af disse plasmider var vi i stand til hurtigt at konstruere baculovirale ekspressionsvektorer til produktion af rekombinant HA og NA i insektceller. Dette ekspressionssystem er veletableret i vores laboratorium og har vist sig afgørende for mange af vores igangværende forskningsprojekter ^1-8. Insektceller er i stand til at folde korrekt og posttranslationelt ændre komplekse proteiner. Disse modifikationer indbefatter N-bundet glycosylering, hvilket er vigtigt for mange virale glycoproteiner. Som sådan er det ikke overraskende, at baculovirussystemet helt er etableret for at udtrykke influenzavirus overfladeantigener. I virkeligheden har mange af HA og NA krystalstrukturer blevet løst ved hjælp af insektcellelinier udtrykte proteiner ^9-11. En anden fordel vedsystem ligger i dens pålidelige højt proteinindhold udbytter på op til 30 mg HA / L cellekultur (baseret på vores erfaring med mere end 50 forskellige HA-proteiner) - en konsekvens af virus-infektion drevet udtryk fra den stærke polyhedrinpromotor.

Fjernelse af de transmembrane og endodomain af HA og NA-proteiner giver mulighed for ekspression af sekreterbare opløselige versioner af proteiner, og dermed i høj grad letter rensningsprocessen. Desuden er disse ektodomæner hexahistidin mærkede og derfor kan oprenses ved hjælp af affinitetskromatografi under anvendelse af ^{Ni2 +-harpiks.} De transmembrane domæner af HA og NA proteiner bidrager til homotrimer og homotetramer dannelse, hhv. For at bevare disse oligomerizations, vi tilføje en C-terminal trimerisering domæne til HA-og en N-terminal tetrameriseringsdomæne domæne til NA-konstruktionerne (figur 1). Vi har påvist, at en sådan trimerisation domæne stabiliserer funktionel, konserved konformationelle epitoper på stilk-domæne af HA ^1.. Den korrekte tetrameriseringsdomæne af NA vil også kunne bidrage til at korrigere foldning og NA-funktion ^10. Sekvenser og Baculo-transfervektorer huser trimerisation eller tetrameriseringsdomæne domæner kan rekvireres fra forfatterne eller fra andre laboratorier i ^{området, 9,10,12.}

Et andet vigtigt problem for ekspression af secernerede proteiner i insektceller er valget af den rigtige cellelinie. Mens Spodoptera frugiperda afledte Sf9 celler understøtter baculovirus replikation meget godt og er generelt bruges til virus redning og formering, har de begrænset kapacitet til at udskille store mængder protein. Trichoplusia ni afledt BTI-TN-5B1-4-celler (almindeligvis kendt som High Five) har en højere udskillelse kapacitet og er cellelinien valg til ekspression i denne protokol ^13,14. Endvidere er det nyttigt at reducere eller endda fjerne kalvefosterserum (FBS) fra ekspressionssystemer kulturer. Vi bruger derfor medier med reduceret (3%) FBS indhold til dyrkning af de virus, der arbejder aktier, og vi udfører protein udtryk i serum frie medier.

Rekombinante HA og NA-proteiner anvendes til mange immunologiske teknikker. Måske den mest almindelige er i ELISA-assays til måling af serum konvertering ved vaccination hos mennesker eller dyr ^4,6,7,15. Har, og kontorer er også brugt i ELISPOT-analyser, da både stimulerende molekyler og detektionsreagenser for antistofsecernerende celler ^16. Deres anvendelse som molekylære lokkemad tillader specifikt sorterer plasmablasts eller andre typer af B-celler, som derefter kan anvendes til isolering (terapeutiske) monoklonale antistoffer (mAb'er). Rekombinante HA og NA molekyler er yderligere anvendt i karakteriseringen af disse mAb'erne ^8. Andre eksempler studere pH-stabilitet eller receptor specificitet har udtrykt af forskellige virusisolater, eller kvantitativt at vurdere specifikke NA enzymatiskeaktivitet eller resistens over for inhibitorer. Endvidere rekombinant, oprenset HA kan bruges til at standardisere HA indholdet af inaktiverede influenzavirus vacciner.

Vigtigere er det, rHA (og til en vis grad NA) vacciner bliver i øjeblikket testet i dyremodeller og humane kliniske forsøg med en vaccine kandidat bliver godkendt af FDA i 2013 ^2,17-19. Fordelen ved disse nye vacciner er, at på grund af den rekombinante karakter af disse proteiner kunne arbejdskrævende proces at generere høje vækst reassorterede virus undgås. Måske endnu mere relevant er det, at deres HA udbytte er høj og reproducerbar fra stamme til stamme. Også, da disse vacciner er produceret i et æg-fri-system, de ikke indeholder protein forurenende stoffer, der er problematiske for personer med æg allergi.

Her valgte vi at udtrykke HA og NA-proteiner fra to isolater af romanen kinesiske H7N9 influenzavirus, A / Anhui/1/13 og A/Shanghai/1/13 ^20,21. Disse er rettidige eksempler, men den beskrevne protokol kan anvendes til ekspression af influenza A-og B-HA eller NA-proteiner og kan tilpasses til at udtrykke andre secernerede virale eller cellulære proteiner. Trimere eller tetramere transmembrane proteiner kan klones ind ekspressionskassetterne anvendes til HA og NA, hhv. Men mest opløselige udskilte cellulære proteiner, som interferoner for eksempel ikke brug for et ekstra domæne til stabilisering og alene kan udtrykkes med en C-terminal hexahistidinmærke.

Protocol

1.. Fremstilling af rekombinant baculovirus

1. Kloning i baculovirus transfer-plasmider
   1. Clone H7 HA og N9 NA ektodomænet (eller enhver anden HA eller NA gen) ind modificerede pFastBac transferplasmider (se indledningen). Vektorer til HA indeholdende et C-terminalt trimerisation domæne og et hexahistidin-tag, samt NA indeholdende et N-terminalt tetrameriseringsdomæne domæne og hexahistidin-tag, er blevet beskrevet ^1,10,11,22 (figur 1) og kan rekvireres fra forfatterne.
      Forklarende note: HA ektodomæner udtrykt uden et trimerisation domæne vil blive foldet forkert, fører til tab af konformationelle neutraliserende epitoper, især i stilken domæne. Tilsvarende NA enzymatiske funktion er betinget af korrekt tetrameriseringsdomæne.
   2. Generering af bacmider
      Omdan baculovirus transfer-plasmider indeholdende HA og NA gener i DH10Bac bakterier efter brug af et Baculovirussystemsystemet ifølge producentens anvisninger. Isolere og oprense bacmider anvendelse af en Midiprep kit ifølge producentens instruktioner (figur 2).
2. Redning af rekombinant baculovirus og verifikation af proteinekspression
   Forklarende note: Følgende trin skal udføres aseptisk i en laminar flow hætte. Udfør denne procedure uafhængigt for HA og NA (eller enhver anden gen af ​​interesse). Insektceller dyrkes normalt ved 28 ° C uden _CO2. Sf9-celler til denne protokol dyrkes i fuld TNM-FH insektcellemembraner medier suppleret med 10% FBS, 1% Pen-Strep ^* og 0,1% Pluronic F68 opløsning, hvis ikke andet er anført, og passeret 1:04 to gange om ugen. High Five-celler dyrkes i SFX serum frie medier og passeret 1:15 to gange om ugen.
   ^* Tilføjelse af antibiotika bør overvejes frivillig hele protokollen og justeres i henhold til de fremgangsmåder, der anvendes i hvert laboratorium.
   1. Plate Sf9 insektceller i 6-brønds plader ved en densitet på 2 x 10 ⁵ celler / cm ² og lad det sidde i 20 minutter i en 28 ° C inkubator (uden CO _2).
   2. Bland 2 ug (konc. 0,5-2 ug / ul) rekombinant bacmid med 100 pi af TNM-FH-medium (serumfrit, 1% Pen-Strep). Bland 6 pi transfektion agent med 100 ul TNM-FH medium (serum fri, Pen-Strep). Kombiner de to volumener, bland forsigtigt og lad det sidde i 20 minutter ved stuetemperatur (transfektion blanding). Omfatter en mock-transfektion som kontrol (figur 3).
   3. Fjern supernatanten fra udpladede Sf9-celler (celler, vil nu holde på pladen), og udskift med 2 ml serumfrit TNM-FH-medium indeholdende Pen-Strep (1%). Tilsæt fuldstændige volumen af ​​transfektionsblandingen (fra trin 1.2.2) og rock 6-brønds pladen forsigtigt i 5 sek. Inkuberes i en 28 ° C inkubator uden CO ₂ til 6 timer (figur 3).
   4. Udskift medier with hele friske TNM-FH medium (indeholdende 10% FBS, 1% Pen-Strep og 0,1% Pluronic F68). Inkuberes i en 28 ° C inkubator uden CO ₂ til 6 dage. Tjek celler lejlighedsvis under et mikroskop. Inficerede celler normalt vises større, rundere, har udvidet kerner, og begynde at løsrive (Figur 4).
   5. Høst af celler og bekræftelse af proteinekspression
      1. Harvest celler 6 dage efter transfektion ved centrifugering ved 2.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten indeholder det rekombinante baculovirus - dette vil blive brugt til at generere arbejder lagre det samme, eller kan opbevares ved 4 ° C i årevis.
      2. For at kontrollere protein udtryk indsamle pellets og resuspender i 500 pi PBS. Bland 50 ul af suspensionen med 50 ul SDS-PAGE påsætningsbuffer (indeholdende et reduktionsmiddel). Kør SDS-PAGE og udføre en Western blot-analyse med et anti-hexahistidin-antistof for at bekræfte genekspression. Medtag celler fra mocktransfektion som negative kontroller (figur 3).
   6. Udarbejdelse af arbejds lagre
      1. Plate 5 x 10 ⁵ Sf9 celler / cm ² i en T175 ^cm2 kolbe og lad det sidde i 20 minutter give dem mulighed for at vedhæfte til fadet. Udskift den komplette TNM-FH medier med TNM-FH-medium indeholdende 3% FBS (og 1% Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68).
      2. Inficere celler med 100 pi af redning supernatanten. Inkuberes i en 28 ° C inkubator uden CO ₂ i 6 dage og kontrollere lejlighedsvis hvis celler får inficeret (som beskrevet i trin 1.2.5.).
      3. Spin ved 2.000 xg ved stuetemperatur i 5 min og indsamle supernatanten. Det er nu din P2 lager. Denne bestand kan opbevares på ubestemt tid ved 4 ° C. Gentag infektionsproceduren anvendelse af 100 ul af P2 lager til at inficere celler. Den resulterende lager kaldes P3 eller arbejder materiel, som kan opbevares ved 4 ° C eller anvendes direkte til proteinekspression. P3 lager indeholder sædvanligvis 10 <sup> 7 -10 ⁹ plakdannende enheder / ml.

2. Protein Expression and Purification

Forklarende note: Sf9 celler understøtter vækst af baculovirus meget godt. Men deres evne til at udskille store mængder af rekombinant protein er begrænset. Derfor bruger vi en anden insektcellelinie, High Five-celler til ekspression af secernerede rekombinante proteiner. Disse celler understøtter ikke baculovirus replikering til meget høje titre ^13, men har en høj sekretorisk kapacitet.

1. Vokser op High Five celler
   Grow High Five-celler i SFX insektcelle kulturmedium T175 ^cm2 kolber. Passage hver anden dag 1:3. For en 200 ml udtryk kultur vil du nødt til at vokse 5 sammenflydende kolber.
2. Høst og inficere High Five celler
   1. Frigør High Five celler fra 5 T175 cm ² kolber ved at trykke kolberne med hånden. Saml cellen suspension og overføres til 50 ml centrifugering rør.
   2. Spin ved 1200 x g i 7 min ved stuetemperatur. Fjern supernatanten ved dekantering og forene pillerne ved at resuspendere dem i 15 ml P3 lager.
   3. Lad sidde i 15 minutter i strømmen hætte (figur 5).
   4. Overfør 200 ml Hyclone SFX dyrkningsmedium i en ren, steril 1000 ml shaker kolbe (uden buffles, forseglet med alufolie før autoklavering, ikke skulle have været anvendt til bakteriekulturer før).
   5. Overfør P3/cell suspensionen i rystekolbe. Seal med folie steril aluminium og overførsel kolbe i en shaker. Ryst ved 70 rpm ved 28 ° C i 72-96 timer.
3. Høst rekombinant protein fra High Five celleekspressionsvektorer supernatanter
   1. 72-96 timer efter infektion transfer kultursupernatanter i 500 ml centri spande. Spin ved 5.500 xg i 20 minutter ved 4 ° C. I mellemtiden skylles rysteflasker 3x med dobbelt destilleret vand(Hedeselskabet ₂ O).
   2. Overfør 3 ml Ni-harpiksopslæmningen i et 50 ml rør med 45 ml PBS (en nødvendig per 200 ml kultur). Ryst godt og spin ved 3.000 xg ved stuetemperatur i 10 min. Dekanteres PBS og holde pillen. Bland insekt cellesupernatanten med Ni-harpiks pellet og overføre ind i de allerede skyllede rysteflasker. Inkuber ved 4 ° C i 2-4 timer under omrystning (figur 6).
   3. Mount 10 ml kolonne polypropylen på en klemme på et stativ. Fjern begge hætter og placere et bæger under kolonnen for at indsamle flow gennem (affald). Tag rystekolbe af rysteapparatet og begynde at overføre supernatanten / opslæmningsblandingen på søjlen, og det vil opretholde Ni-harpiksen, og kun supernatanten vil strømme gennem. Pass hele volumen over søjlen (figur 7).
   4. Vask harpiks 4x med 15 ml vaskepuffer (50 mM Na ₂ HCO _3, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8). Lad al vaskebuffer afløbetfra kolonnen og luk den med hætte (underside).
   5. Tilsæt 2 ml elueringspuffer (50 mM Na ₂ HCO _3, 300 mM NaCl, 300 mM imidazol, pH 8), og lad det sidde i 5 min. Åbn søjle, og eluatet opsamles. Gentag dette 3 gange mere (med i alt 8 ml elueringspuffer). Eluat, der indeholder høje koncentrationer af protein typisk viser skum, når den rystes (figur 7). Hold eluat på våd is når det er muligt.
4. Pufferudbytning og koncentration
   1. Prespin 15 ml ultrafiltrering centrifugering enheder (30 kDa cut-off for HA / NA, men kan variere afhængigt af det oprensede protein størrelse) med PBS (pH 7,4-7,6) ved 3.000 xg ved 4 ° C i 20 min. Discard flyde igennem og belastning eluatet på centrifugesøjle. Fyld op med 5 ml sterilt, iskold PBS og spin for 60 min ved 3.000 xg ved 4 ° C.
   2. Udledning flow igennem igen, refill med 15 ml iskold PBS og spin for 60 min ved 3.000 xg ved 4 ° C. Gentag denne procedureDure en gang mere.
   3. Tag spinkolonne ud af centrifugen og indsamle bufferudskiftet koncentrat (typisk 200 ul). Dette er meget koncentreret rekombinant protein. Skyl spinkolonne med 400 ul sterilt iskold PBS og tilføje dette til koncentratet. Hold koncentratet på is på alle tidspunkter.

3. Karakterisering og kvalitetskontrol

1. Måling proteinkoncentration
   Tag en portion af koncentrat og måle det ved hjælp af din protein kvantificering foretrukne metode. Indstil proteinkoncentration på 1 mg / ml ved tilsætning af PBS og fryse små portioner til -80 ° C. Fryse tø skade proteinstrukturen og kan føre til aggregering.
2. SDS-PAGE og Coomassie-farvning
   Kør 500 ng din protein på en SDS-PAGE og udføre en Coomassie farvning. Til hurtig og bekvem farvning bruge Coomassie reagens i kombination med en mikrobølgeovn protokol. HA-proteiner forekommer typisk på 64kDa henviser NA-proteiner skal køre med en størrelse på omkring 56 kDa (figur 8A og B). Brug af den beskrevne protokol bør du ikke se nogen nedbrydningsprodukter. Hvis der opstår nedbrydning er det som regel et tegn på gær / svampekontaminering under ekspression. I dette tilfælde skal du gentage proceduren og sørg for at holde alt steril.
3. Western blot / ELISA
   For at kontrollere protein identitet anbefaler vi gøre for at en Western blot eller ELISA assay med et specifikt antistof. Ideelt set ELISA-assays udført med et antistof, der binder til konformationelle epitoper (fx anti-HA antistoffer stilk ^1). Ved hjælp af et sådant antistof den korrekte foldning af proteinet kan bekræftes (figur 8C).
4. Måling NA aktivitet
   Korrekt foldning af det virale NA kan også bestemmes ved måling af NA-aktivitet. Vi anbefaler at udføre denne test ved hjælp af kommercielt tilgængelige NA * STAR assay (blot følge de retningslinjer brugeren).

Representative Results

HA-molekylerne fra A/Shanghai/1/13 og A/Anhui/1/13 udtrykt godt med udbytter på ca 20 mg / L kultur. NA molekyler af begge stammer udviste moderat udtryk niveauer fra 0,2 mg / L kultur for A/Shanghai/1/13 til 0,7 mg / L for A/Anhui/1/13. Alle fire præparater protein havde meget lidt at ingen urenheder (figur 8A og B) med, har værende af højere renhed end nationale kontorer, som kan forklares med udtrykket niveau. A/Shanghai/1/13 HA blev yderligere analyseret ved hjælp af ELISA med bredt neutraliserende stilk-reaktivt human mAb CR9114 ^23. Dette mAb binder til et følsomt konformationel epitop i stilken domæne og anvendes her som en probe til korrekt foldning af dette domæne. Antistoffet viser god binding, som giver tillid til, at HA faktisk er foldet korrekt (figur 8C). En anden ELISA med anti-H7 muse polyklonalt serum blev udført for at bekræfte identiteten af ​​det opnåede protein H7 oprindelse (Figur 8D).

Fig. 1. Skematisk af HA og NA ekspressionskonstruktioner. Ekspressionskonstruktionen for HA (A) indeholder et N-terminalt signalpeptid efterfulgt af HA ectodomænet et trombinspaltningssted, T4 trimerisering domæne og et hexahistidin-tag. NA Ekspressionskonstruktionen (B) indeholder en N-terminal signalpeptid efterfulgt af en hexahistidinmærke, en vasodilator stimulerende phosphoprotein (VASP) tetrameriseringsdomæne domæne og NA ectodomænet. Klik her for at se større figur .

Figur 2.. Scheme of bacmid generation (som beskrevet i trin 1.1.2). En baculovirus-transfervektor indeholdende HA eller NA gener transformeres ind DH10Bac bakterier. Rekombination i baculovirus-genomet, som disse bakterier bære frembringer en hvid koloni fænotype på selektionsplader. En hvid koloni opsamles og strøget. En enkelt koloni fra udstrøget plade anvendes til at pode en midiprep kultur.

Figur 3. Ordning af baculovirus redning og arbejder materiel generation (som beskrevet i trin 1.2.1-6). Rekombinant bacmid og transfektionsreagens fortyndes i serum fri TNM-FH medium. De to opløsninger kombineres, blandingen inkuberes i 20 minutter og overføres derefter til Sf9-celler. Seks timer efter transfektion transfektion medier erstattes med fuld TNM-FH medier. Seks dage efter transfektion supernatanten høstes og cellepelleten er analyzed til ekspression af rekombinante proteiner.

Figur 4.. Sunde og inficerede Sf9 celler. Sf9 celler i (A) er sunde og ikke-inficerede. De er fastgjort til dyrkningsskålen, se delvist polymorfe og forholdsvis lille. Celler i (B) er inficeret med baculovirus, løsrevet fra dyrkningsskålen, er store og runde og har udvidet kerner. Kernen viser også et granulært udseende.

Figur 5. Infektion af High Five-celler med rekombinant baculovirus (arbejdsvilkår lager, som beskrevet i trin 2.2). Fem sammenflydende T175 kolber med High Five-celler høstes ved lavhastighedscentrifugering og kombineret med 15 ml P3 baculovirus lager. Efter 15 min af incubation cellen / virus blandingen overføres til 1000 ml rystekolber med 200 ml SFX medier.

Figur 6. Høst af cellesupernatant 72-96 timer efter infektion og inkubation med Ni-NTA-harpiks (som beskrevet i trin 2.3.) Er inficerede cellesuspensioner høstet ved centrifugering med lav hastighed. Kultursupernatanter blandes med PBS-ækvilibreret Ni-harpiks og inkuberet i 2-4 timer under omrystning.

Figur 7. Oprensning fremgangsmåde (som beskrevet i 2.3 og 2.4), og kvalitetskontrol (som beskrevet i trin 3.1.1-4). Efter inkubation hele supernatanten / harpiksblandingen er indlæst på polypropylen kolonner. Harpiksen opbevares af kolonnerne og derefter vasket fire gange med vask bufFer og det rekombinante protein elueres med 8 ml elueringspuffer anvendes i 2 ml trin. Eluatet derefter buffer udvekslet og koncentreret med en ultrafiltrering spinkolonne alikvoteret og frosne. Kvalitetskontrol assays indbefatter SDS-PAGE, Western Blot, ELISA og måling af NA aktiviteten af ​​rekombinant NA.

Figur 8. Repræsentative resultater. HA (A) og NA (B) proteiner af A/Anhui/1/13 og A/Shanghai/1/13 blev analyseret ved SDS-PAGE og Coomassie-farvning. Strukturelle integritet af HA i A/Shanghai/1/13 blev vurderet ved hjælp af bredt neutraliserende menneskelig stilk-reaktivt antistof CR9114, som binder til en følsom konformationel epitop (C). Identiteten af det samme HA blev bekræftet af et polyklonalt anti-H7 museserum (D).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bac-to-Bac Baculovirus expression system	Invitrogen	10359-016	Follow manufacturer's instructions
TNM-FH insect medium	Gemini Bioproducts	600-311
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher	SH30278.02
Cellfectin II Reagent	Invitrogen	P/N58760
Pluronic F68	Sigma	1000702664
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018240
Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K	Millipore	UFC902024
Pen Strep	Gibco	15140-122
Polypropylene Columns (5 ml)	Qiagen	34964
Max efficiency DH10Bac bacteria	Invitrogen	10361-012
PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit	Invitrogen	K210015
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-100G	for elution and wash buffers
Sf9 cells	ATCC	CRL-1711
High Five cells	Invitrogen	B85502