Summary
여기에서 우리는 곤충 세포에 새로운 중국어 H7N9 바이러스에서 파생 제대로 접혀 기능 인플루엔자 바이러스 표면 항원을 표현하는 방법에 대해 설명합니다. 기술은 어떤 바이러스 성 또는 세포 표면 단백질의 ectodomains을 표현하도록 할 수있다.
Abstract
배큘로 바이러스 발현 시스템은 재조합 단백질의 발현을위한 강력한 도구이다. 헤 마글 루티 닌 (HA)과 뉴 라미니다 아제 (NA) - 여기서 우리는 독감의 제대로 접어 당화 버전의 바이러스 표면 당 단백질을 생산하기 위해 사용합니다. 예를 들어, 우리는 최근 중국에서 출현 한 새로운 H7N9 바이러스에 의해 표현 된 HA 및 NA 단백질을 선택했다. 그러나 프로토콜은 쉽게 다른 인플루엔자 및 B 바이러스 균주에 의해 발현 HA 및 NA 단백질을 위해 적응 될 수있다. 재조합 HA (RHA)와 NA (RNA) 단백질은 ELISPOT 및 ELISA와 같은 면역 학적 분석을위한 중요한 시약, 그리고 백신 표준화, 항체 발견, 분리 및 특성 분석을위한 다양한 프로그램도 사용합니다. 또한, 재조합 NA 분자는 작은 분자 억제제에 대한 화면으로 사용하고 NA의 효소 기능의 특성뿐만 아니라, 항 바이러스제에 대한 민감도에 유용하다 할 수있다. 재조합 HA 단백질은 또한 바이 아르NG는 동물 모델에서 실험적인 백신으로, 테스트 및 재조합 HA 기반의 백신은 최근에 인간에 사용하기 위해 FDA에 의해 허가했다. 그것은 빠르고 저렴한 비용으로 단백질의 대량 생산이 가능하기 때문에 우리는이 분자를 생산하기 위해 여기에 설명하는 방법은, 곧장 앞으로 인플루엔자 실험실에서 연구를 촉진 할 수 있습니다. 우리는 인플루엔자 바이러스의 표면 당 단백질에 초점 여기 있지만,이 방법은 또한 다른 바이러스 및 세포 표면 단백질을 생산하는 데 사용될 수있다.
Introduction
중국에서 새로운 H7N9 인플루엔자 바이러스 균주의 최근 출현에 첫 번째 응답으로, 우리는 헤 마글 루티 닌 (HA)과 뉴 라미니다 제 (NA)의 처음 두 균주의 유전자에 대한 게놈 서열을 운반하는 플라스미드를 취득했다. 우리는 신속하게 곤충 세포에서 재조합 HA와 NA의 생산 배큘로 바이러스 발현 벡터를 구축 할 수 있었다 이러한 플라스미드를 사용하여. 이 발현 시스템은 잘 실험실에 설립되어 지속적인 연구 프로젝트 1-8의 많은 중요한 입증되었습니다. 곤충 세포는 올바르게 접혀 사후 병진 복합 단백질을 수정할 수있다. 이러한 수정은 많은 바이러스 당 단백질에 중요한 N-결합 글리코 실화를 포함한다. 따라서, 그것은 배큘로 바이러스 시스템이 꽤 인플루엔자 바이러스 표면 항원을 발현하는 확립되는 것은 놀라운 일이 아니다. 사실, HA 및 NA 결정 구조의 많은 곤충 세포 발현 된 단백질을 사용하여 9-11 해결되었다. 또 다른 장점강한 폴리 헤드린 프로모터로부터 바이러스 감염 구동 식의 결과 - 시스템 (50 개 이상의 서로 다른 HA 단백질과 우리의 경험을 바탕으로) HA / L 세포 배양의 최대 30 밀리그램의 신뢰성 높은 단백질 수율에 자리 잡고 있습니다.
HA 및 NA 단백질의 막 횡단 및 endodomain 제거하여 단백질 secretable, 수용성 버전의 발현을 허용하고 따라서 크게 정제 공정을 용이하게한다. 또, 이러한 ectodomains는 hexahistidine 태그 된 따라서 니켈 2 +-수지를 사용하여 친 화성 크로마토 그래피를 이용하여 정제 할 수있다. HA 및 NA 단백질의 막 관통 도메인은 각각 homotrimer 및 homotetramer 형성에 기여한다. 이러한 oligomerizations을 유지하기 위해, 우리는 HA-, 및 NA에 N-말단 테트라 도메인 (그림 1) 생성에 C-말단 삼량 도메인을 추가합니다. 우리는 삼량 도메인 기능,하고 당연한를 안정 결론적으로 보여 주었다HA 1의 줄기 영역에 구조적 에피토프를 rved. NA의 올바른 테트라는 접는 및 NA 기능 10를 해결하는 데 기여할 수 있습니다. 삼량 또는 테트라 도메인을 품고 시퀀스와 baculo 전송 벡터는 저자 또는 필드, 9,10,12의 다른 실험실에서 요청하실 수 있습니다.
곤충 세포에서 분비되는 단백질의 발현을위한 또 다른 중요한 문제는 바로 세포주의 선택입니다. 스포 도프 테라 프 루기 페르가 인 Sf9 세포가 잘 배큘로 바이러스 복제를 지원하고 일반적으로 바이러스 구조 및 증식을 위해 사용되는 파생 동안, 단백질의 다량 분비하는 능력을 제한 하였다. Trichoplusia NI는 (일반적으로 하이 파이브로 알려진) BTI-TN-5B1-4 세포 유래 높은 분비 능력을 가지고 있고이 프로토콜 13, 14의 발현에 대한 선택의 세포주이다. 또한,이 소 태아 혈청을 감소 또는 제거하는 것이 도움이된다 (FB표현 문화의 S). 따라서 우리는 바이러스 일 주식을 성장에 대한 감소 (3 %) FBS 콘텐츠와 미디어를 사용하여, 우리는 혈청이없는 배지에서 단백질 발현을 수행합니다.
재조합 HA 및 NA 단백질은 많은 면역 학적 기술에 사용된다. 아마도 가장 일반적인 것은 사람이나 동물에 접종 4,6,7,15에 혈청 전환을 측정하기위한 ELISA 분석법이다. 가 및 NAS는 항체를 분비하는 세포 (16)에 대한 자극 분자 검출 시약 모두로 ELISPOT 분석 실험에 사용됩니다. 분자 미끼로서의 용도는 특별히 plasmablasts 또는 후 (치료) 단일 클론 항체 (모노클로 날 항체)를 분리하기 위해 사용될 수 B-세포의 다른 유형에 대해 정렬 할 수있다. 재조합 HA 및 NA 분자는 더 이상 이러한 단클론 항체 (8)의 특성 분석에 사용됩니다. 다른 예로는 pH가 안정 또는 수용체 특이성 다른 바이러스 균주에 의해 표명의, 또는 정량적으로 평가하는 특정 NA의 효소를 연구 포함억제제 활동이나 저항. 또한, 재조합, 정제 된 HA는 불 활성화 인플루엔자 바이러스 백신의 HA 함량을 표준화하기 위해 사용될 수있다.
중요한 것은, RHA (그리고 어느 정도 NA) 백신 후보는 현재 하나의 백신 후보 2013 2,17-19에 FDA에 의해 허가 된 상태 동물 모델과 인간의 임상 실험으로 테스트되고있다. 이러한 신규 한 백신의 장점으로 인해 이들 단백질의 재조합 특성으로 높은 성장 재조합 바이러스의 생성의 노동 집약적 공정이 회피 될 수 있다는 것이다. 아마도 더욱 중요한 자신의 HA의 수율이 높고 변형의 변형을 재현 할 수 있다는 사실입니다. 이 백신은 계란이없는 시스템에서 생산되기 때문에 또한, 그들은 계란 알레르기가있는 개인에 대한 문제가있다 단백질 오염 물질을 포함하지 않습니다.
여기서 우리는 새로운 중국어 H7N9 인플루엔자 바이러스, A / ANH의 두 균주에서 HA와 NA 단백질을 표현하기 위해 선택ui/1/13 및 A/Shanghai/1/13 (20, 21). 이들은 적시 예이지만 설명한 프로토콜은 임의의 인플루엔자 A와 B HA 또는 NA 단백질의 발현을 위해 사용할 수있는 다른 어떤 분비 된 바이러스 또는 세포 단백질을 표현하도록 할 수있다. 삼량 체 또는 사량 막 횡단 단백질은 각각, HA 및 NA에 사용되는 발현 카세트로 클로닝 될 수있다. 그러나, 대부분의 수용성 분비 세포 단백질은, 예를 들어 인터페론 같은 안정화를위한 추가 도메인을 필요로하지 않고, C-말단 hexahistidine 태그 전적으로 표현 될 수있다.
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Protocol
1. 재조합 배큘로 바이러스의 생성
- 배큘로 바이러스 전송 - 플라스미드에 복제
- 복제 H7 HA 및 수정 pFastBac 전송 플라스미드에 N9 NA의 ectodomain (또는 다른 HA 또는 NA 유전자) (소개 참조). HA는 N-말단 헥사 도메인 및 hexahistidine 태그를 포함하는 C-말단 삼량 체화 도메인 및 hexahistidine 태그를 함유뿐만 아니라 NA 용 용 벡터는, (도 1) 1,10,11,22 설명되었으며로부터 요청 될 수있다 저자.
해설 : 삼량 도메인없이 표현 HA의 ectodomains 특히 줄기 도메인에서, 구조적 중화 항원의 손실로 이어지는, 잘못 접힌됩니다. 마찬가지로, NA의 효소 기능은 적절한 테트라에 의존합니다. - bacmids의 생성
배큘로 바이러스 표현식을 사용하여 따라 DH10Bac 박테리아에 HA 및 NA 유전자를 포함하는 배큘로 바이러스 전송 - 플라스미드를 변환제조업체의 지침에 따라 시스템. 분리 및 제조 업체의 지침 (그림 2)에 따라 Midiprep 키트를 사용하여 bacmids를 정화.
- 복제 H7 HA 및 수정 pFastBac 전송 플라스미드에 N9 NA의 ectodomain (또는 다른 HA 또는 NA 유전자) (소개 참조). HA는 N-말단 헥사 도메인 및 hexahistidine 태그를 포함하는 C-말단 삼량 체화 도메인 및 hexahistidine 태그를 함유뿐만 아니라 NA 용 용 벡터는, (도 1) 1,10,11,22 설명되었으며로부터 요청 될 수있다 저자.
- 단백질의 발현 재조합 배큘로 바이러스 및 검증의 구조
해설 : 다음 단계는 층류 후드에서 무균 적으로 수행해야합니다. HA 및 NA (또는 그 어떤 다른 유전자)에 대해 독립적으로이 절차를 수행합니다. 곤충 세포는 일반적으로 CO 2없이 28 ° C에서 재배되고 있습니다. 이 프로토콜 인 Sf9 세포를 지시하지 않을 경우 10 % FBS, 1 % 펜 패 혈성 * 0.1 % 플루로 닉 F68 솔루션, 보충 전체 TNM-FH 곤충 세포 미디어에서 성장하고, 일주일에 두 번 1:4 계대 있습니다. 하이 파이브 세포 SFX 혈청이없는 배지에서 재배하고 일주일에 두 번 1:15 계대 있습니다.
* 항생제 첨가 프로토콜을 통하여 선택적으로 간주하고, 각 실험에 사용 된 방법에 따라 조정되어야한다.- / cm 2 × 10 5 세포의 밀도로 6 - 웰 플레이트에 인 Sf9 곤충 세포를 플레이트와 (CO 2)없이 28 ° C 배양기에서 20 분 동안 앉아 보자.
- 혼합 2 μg TNM-FH 배지 (혈청, 1 % 펜 연쇄상 구균)의 100 μL와 재조합 백 미드의 (conc. 0.5 ㎍ / UL). TNM-FH 배지 (혈청 무료, 펜 연쇄상 구균)의 100 μL로 형질 전환 제 6 μl를 섞는다. 두 개의 볼륨을 결합 부드럽게 섞어 실온 (형질 전환 혼합물)에서 20 분 동안 앉아 보자. 컨트롤로 한 모의 형질 (그림 3)를 포함합니다.
- (세포가 이제 플레이트에 붙어 것) 및 펜 연쇄상 구균 (1 %)를 포함하는 혈청 TNM-FH 배지 2 ㎖로 대체 도금 인 Sf9 세포에서 뜨는을 제거합니다. (단계 1.2.2에서) 형질 전환 혼합물의 전체 볼륨을 추가하고 5 초 동안주의 깊게 6 잘 플레이트 바위. 6 시간 (그림 3)에 대한 CO 2없이 28 ° C 배양기에서 배양한다.
- 미디어 위스콘신 교체th 신선한 전체 TNM-FH 미디어 (10 % FBS, 1 % 펜 - Strep의 0.1 % 플루로 닉 F68를 포함). 육일에 대한 CO 2없이 28 ° C 배양기에서 배양한다. 현미경으로 때때로 세포를 확인합니다. 감염된 세포는 일반적으로, 라운드, 더 큰 나타 핵을 확대하였으며, (그림 4)를 분리하기 시작합니다.
- 세포와 단백질 발현의 확인 수확
- 상온에서 5 분 2,000 XG에 원심 분리하여 수확 세포 육일 포스트 형질. 상층 액을 재조합 배큘로 바이러스를 포함 -이 바로 작동 주식을 생성하는 데 사용됩니다, 또는 몇 년 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 단백질 발현을 확인하기 위해 PBS 500 μL에 펠릿에 resuspend를 수집합니다. (환원제를 포함) SDS-PAGE 로딩 버퍼 50 μL와 현탁액의 50 μl를 섞는다. SDS-PAGE를 실행하고 유전자 발현을 확인하기 위해 안티 hexahistidine 항체로 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다. 모의에서 세포를 포함음성 대조군으로 형질 전환 (그림 3).
- 작업 주식의 준비
- 판 5 × 5 인 Sf9 세포 / T175의 cm 2 플라스크 cm 2, 20 분 그들을 요리에 부착 할 수 있도록 방치. TNM-FH 미디어는 3 % FBS (1 % 펜 연쇄상 구균, 0.1 % 플루로 닉 F68)를 포함하는 완전한 TNM-FH 미디어를 교체합니다.
- 구조의 상층 액 100 μL와 세포를 감염. 육일에 대한 CO 2없이 28 ° C 배양기에서 품어 세포가 감염 얻을 경우 가끔 확인한다 (단계 1.2.5에 설명 된대로.).
- 5 분 상온에서 2,000 XG에 스핀과 상층 액을 수집합니다. 이 이제 P2의 재고입니다. 이 주식은 4 ℃에서 무한정 저장할 수 있습니다 세포를 감염 P2 주식 100 μl를 사용하여 감염의 절차를 반복합니다. 그 결과 주식은 P3 또는 4 ° C에 저장되거나 단백질 발현에 직접 사용할 수있는 작업 주식,라고합니다. P3의 주식은 보통 10를 포함 <SUP> 7 -10 9 패 단위 / ㎖을 형성한다.
2. 단백질 발현 및 정제
해설 : 인 Sf9 세포는 잘 바쿨로 바이러스의 성장을 지원한다. 그러나, 재조합 단백질의 다량 분비하는 그들의 능력은 제한된다. 그러므로 우리는 분비 된 재조합 단백질의 발현에 대한 또 다른 곤충 세포주, 하이 파이브 세포를 사용합니다. 이 세포는 매우 높은 역가 13 배큘로 바이러스 복제를 지원하지만, 높은 분비 능력이 없습니다.
- 하이 파이브 세포를 성장
T175의 cm 2 플라스크에 SFX 곤충 세포 배양 배지에서 하이 파이브 세포를 성장. 항로 매일 1시 3분. 200 ㎖의 식 문화의 경우 5 합류 플라스크 성장을해야합니다. - 하이 파이브 세포를 수확하고 감염
- 손으로 플라스크를 눌러 5 T175의 cm 2 플라스크에서 하이 파이브 세포를 분리합니다. 셀 suspe 수집nsion 및 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 실온에서 12 분 동안 1,200 XG에 스핀. 경사 분리하여 상층 액을 제거하고 P3 주식의 15 ㎖에 그들을 재현 탁하여 알약을 결합한다.
- (그림 5) 흐름 후드에서 15 분 동안 앉아 보자.
- 깨끗하고 무균 1,000 ml로 흔드는 플라스크에 HyClone 사 SFX의 배지 200 ㎖로 이동 (고압 증기 멸균 전에 알루미늄 호일로 밀봉 buffles하지 않고, 이전에 세균 배양에 사용되지 않은해야합니다.)
- 진탕 플라스크에 P3/cell 현탁액을 전송합니다. 쉐이커에 무균 알루미늄 호일 및 전송 플라스크 인감. 72-96 시간 동안 28 ° C에서 70 rpm으로 흔들어.
- 하이 파이브 세포 발현 상층 액에서 재조합 단백질을 수확
- 500 ㎖의 원심 분리 버킷에 72-96 시간 후 감염 전송 배양 상층 액. 4 ℃에서 20 분 동안 5,500 XG에 스핀 그 동안 진탕 플라스크 두 번 증류수로 3 배 씻어(DDH 2 O).
- PBS (한 200 ㎖의 배양에 필요한이) 45 mL를 50 ㎖ 튜브에 전송 3 ㎖ 니켈 수지 슬러리. 잘 흔들어서 10 분 동안 실온에서 3000 XG에 스핀. PBS를 가만히 따르다 펠릿을 유지합니다. 니켈 수지 펠렛과 곤충 세포의 상층 액을 혼합하고 이미 세척 통 플라스크에 옮긴다. (그림 6)을 흔들면서 2-4 시간 동안 4 ° C에서 알을 품다.
- 지원 스탠드에 클램프 산 10 ㎖ 폴리 프로필렌 열. 두 캡을 제거하고 (폐기물)를 통해 흐름을 수집하기 위해 열 아래 비커를 놓습니다. 통 밖으로 흔드는 플라스크를 타고 칼럼에 뜨는 / 슬러리 혼합물을 전송하기 시작, 그것은 니켈 수지를 유지하고 만 상등액을 통해 흐를 것이다. 열을 통해 전체 볼륨 (그림 7)를 전달합니다.
- 세척 완충액 15 ㎖ (50 mM의 나 2 HCO 3, 300 밀리미터의 NaCl, 20 mM의 이미 다졸, 산도 8)과 수지의 4 배를 씻으십시오. 모든 세척 버퍼 드레인에게하자열에서 캡 (아래쪽)를 닫습니다.
- 용출 버퍼의 2 ㎖ (50 mM의 나 2 HCO 3, 300 밀리미터의 NaCl, 300 mM의 이미 다졸, 산도 8)을 추가하고 5 분 동안 앉아 보자. 열을 열고 용출액을 수집합니다. (용출 버퍼 8 ㎖의 총)이 3 번 이상 반복합니다. (그림 7) 흔들릴 때 단백질의 높은 농도를 포함 용출액은 일반적으로 폼을 보여줍니다. 가능하면 젖은 얼음에 용출액을 유지합니다.
- 버퍼 교환 및 농도
- Prespin 15 ㎖의 한외 여과 원심 분리 장치 20 분 동안 4 ° C에서 3,000 XG에서 PBS (pH가 7.4-7.6)과 (HA / NA 30 kDa의 차단하지만 정제 된 단백질의 크기에 따라 달라질 수 있습니다.) 스핀 컬럼으로 통해로드 용출액 흘러 버린다. 4 ℃에서 5 살균, 얼음 차가운 PBS의 ML 3,000 XG에 60 분 동안 스핀으로 채워
- 다시 통해 배출 흐름은 15 얼음 차가운 PBS의 ML, 4 ° C에서 3,000 XG에 60 분 동안 스핀 리필 이 proce를 반복한 번 더 두레.
- 원심 분리기 밖으로 스핀 열을 가지고 버퍼 교환 농축 (일반적으로 200 μL)를 수집합니다. 이것은 매우 재조합 단백질을 농축한다. 살균 얼음 차가운 PBS 400 μL와 스핀 열을 씻어 농축이를 추가합니다. 항상 얼음에 집중하십시오.
3. 특성 및 품질 관리
- 단백질 농도를 측정
농축 나누어지는을 가지고 선택의 단백질 정량 방법을 사용하여 측정합니다. PBS를 추가하여 1 ㎎ / ㎖의 단백질 농도를 설정하고 -80 ° C.에 작은 분량 씩 동결 동결 해동 사이클은 단백질 구조를 손상과 통합으로 이어질 수 있습니다. - SDS-PAGE와 쿠마시 염색
SDS-PAGE에 단백질의 500 NG를 실행하고 쿠마시 염색을 수행합니다. 빠르고 편리하게 염색을 위해 전자 프로토콜과 함께 쿠마 시약을 사용합니다. HA 단백질은 일반적으로 64에서 나타나는kDa의 NA 단백질은 약 56 kDa의 (그림 8A와 B)의 크기로 실행해야합니다 반면. 설명 된 프로토콜을 사용하면 모든 해산물을 볼 수 없습니다. 저하가 발생하면 일반적으로 표현하는 동안 효모 / 곰팡이 오염의 표시이다. 이 경우 절차를 반복하고 멸균 모든 것을 유지해야합니다. - 웨스턴 블롯 / ELISA
단백질의 신원을 확인하기 위해 우리는 특정 항체로 웨스턴 블롯 또는 ELISA 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 이상적으로, ELISA 분석 실험은 형태 적 항원 (예 : 항-HA 줄기 항체 1)에 결합하는 항체로 수행됩니다. 이러한 항체를 이용한 단백질의 정확한 폴딩 (도 8C)를 확인할 수있다. - 활동 NA 측정
바이러스 NA의 정확한 폴딩 또한 NA 활성을 측정함으로써 결정될 수있다. 우리는 상업적으로 이용 가능한 NA * STAR의 분석을 (단지 사용자의 지침을 따르십시오)를 사용하여이 테스트를 수행하는 것이 좋습니다.
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Representative Results
A/Shanghai/1/13 및 A/Anhui/1/13에서 HA 분자는 약 20 ㎎ / L 문화의 수율을 잘 표현했다. 두 균주의 NA 분자는 A/Shanghai/1/13 0.2 ㎎ / L의 문화에서 A/Anhui/1/13 0.7 ㎎ / L에 이르기까지 적당한 표현 수준을 보여 주었다. 네 개의 단백질 제제는 발현 수준에 의해 설명 될 수의 NA보다 높은 순도의 복지가와 (그림 8a 및 B) 불순물이없는 매우 작은이 있었다. A/Shanghai/1/13 HA 더욱 광범위 중화 스토킹 반응성 인간 단클론 CR9114 23 ELISA를 사용하여 분석 하였다. 이 단클론 항체는 줄기 도메인에 민감한 구조적 에피토프에 결합하고이 도메인의 정확한 접는 프로브로 여기에 사용됩니다. 항체는 HA가 참 (그림 8C) 제대로 접혀 있다는 확신을주는 바인딩을 잘 보여줍니다. 반대로 H7 마우스 폴리 클로 날 혈청은 ELISA 제 (H7 계로서 얻어진 단백질의 신원을 확인하기 위하여 실시 하였다그림 8D).
그림 1. HA 및 NA 식 구조의 개략도. 표현식은 HA (A)의 HA ectodomain, 트롬빈 절단 부위, T4 삼량 도메인 및 hexahistidine 태그 이어 N-말단 신호 펩티드를 포함 위해 구축. NA 식 구조 (B)가 hexahistidine 태그, 혈관 확장 자극 인 단백질 (VASP) 테트라 도메인과 NA의 ectodomain 다음에 N-말단 신호 펩타이드를 포함하는 것은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 백 미드 generat라는의 계획이온 (단계 1.1.2에 설명 된대로). HA 또는 NA 유전자를 포함하는 배큘로 바이러스 전달 벡터는 DH10Bac 박테리아로 변환됩니다. 이 박테리아는 휴대 배큘로 바이러스 게놈에 재조합 선택 접시에 흰색 식민지 표현형을 생산하고 있습니다. 흰색 식민지가 들어서 restreaked된다. restreaked 판에서 하나의 식민지가 midiprep 문화를 접종하는 데 사용됩니다.
그림 3. 배큘로 바이러스의 구조 및 작동 재고 세대 계획 (단계에 설명 된대로 1.2.1-6). 재조합 백 미드와 형질 전환 시약 혈청 TNM-FH 배지에 희석된다. 이 해법은, 결합되어 혼합을 20 분 동안 배양 한 다음 인 Sf9 세포 상에 전사. 여섯 시간 후 형질은 형질 미디어는 전체 TNM-FH 미디어로 대체됩니다. 엿새 동안은 상층 액을 수확 형질을 게시하고 세포 펠렛은 항문이다재조합 단백질의 발현에 yzed.
그림 4. (A)에서 건강하고 감염을 Sf9 세포. 인 Sf9 세포가 건강하고 감염되지 않은 있습니다. 그들은 부분적으로 다형성과 상대적으로 작은 모양, 배양 접시에 부착된다. (B)에있는 세포, 배큘로 바이러스에 감염된 배양 접시에서 분리, 크고 둥근와 핵을 확대했다됩니다. 핵은 또한 세분화 된 모습을 보여줍니다.
그림 5. (단계 2.2에 설명 된대로 주식을 작동). 하이 파이브 세포 5 개의 합류 T175 플라스크는 저속 원심 분리하여 수확 P3의 배큘로 바이러스 주식의 15 ㎖로 결합 된 재조합 배큘로 바이러스와 하이 파이브 세포의 감염. 에서 15 분 후세포 / 바이러스 혼합물을 SFX 미디어 200 ㎖와 1000 ㎖를 흔드는 플라스크에 옮겨 cubation.
그림 6. 니켈 - NTA 수지 (2.3 단계에 설명 된대로)와 세포 상층 액을 72-96 시간 게시물 감염 배양의 수확은. 감염된 세포 현탁액은 저속 원심 분리하여 수확. 배양 상층 액은 PBS 평형화 니켈 수지와 혼합하고, 진탕하면서 2-4 시간 동안 배양 하였다.
그림 7. 정제 과정 (2.3 및 2.4에서 설명) 및 품질 관리 (단계 3.1.1-4에서 설명). 배양 후 상청액 / 수지 혼합물의 전부는 폴리 프로필렌 컬럼에 로딩된다. 수지는 열에 의해 유지 된 후, 세척 BUF로 4 회 세척FER 및 재조합 단백질을 2 ㎖의 단계에서 적용 용출 완충액 13 ㎖로 용출된다. 용출액은 버퍼 교환 및 한외 스핀 컬럼과 집중, 분주 및 냉동됩니다. 품질 관리 분석은 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, ELISA 및 재조합 NA의 NA 활동의 측정을 포함한다.
그림 8. A/Anhui/1/13 및 A/Shanghai/1/13의 대표적인 결과. HA (A) 및 NA (B) 단백질을 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색을 이용하여 분석 하였다. A/Shanghai/1/13의 HA의 구조 무결성에 민감한 구조적 에피토프 (C)에 결합 광범위 중화 인간 줄기 반응 항체 CR9114를 사용하여 평가 하였다. 같은 HA의 ID는 클론 항-H7 마우스 혈청 (D)에 의해 확인되었다.
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Discussion
배큘로 바이러스 발현 시스템을 이용하여 곤충 세포에서 인플루엔자 바이러스 HA 및 NA 단백질의 발현이 곧장 앞으로 일반적이지만, 고려해야 할 여러 가지 중요한 점이있다. 서론에서 지적한 것처럼 그것은 HA와 NA의 ectodomains이 각각 삼량 또는 테트라 도메인과의 융합으로 표현되는, 중요합니다. 이 도메인은 일반적 ectodomain 표현하면 존재하지 않는 횡단 도메인의 도움으로 분자의 정확한 폴딩을 보장합니다. 예를 들어, 삼량 도메인없이 HA의 ectodomain의 표현은 올리고머와 줄기 도메인에 중요한 중화 에피토프의 불안정으로 이어집니다. 또한, 단백질의 안정성이 감소하고 곤충 세포 및 바큘로 바이러스 프로테아제에 의한 열화가 발생된다. 삼량 또는 테트라 도메인의 선택은 덜 중요하다 이르기까지 그들 중 다수 류신 지퍼 도메인 22T4 파지 foldons에 (11)는 지금까지 테스트 한 모두가 만족스러운 결과를 보여 주었다. 그것은 multibasic 분열 사이트들이 고병원성 H5N1 24 또는 H7N7 25 균주 (그러나 H7N9에있는)에서 발생하는 것은 그들이 모든 시간에 존재하는 단백질 분해 효소 등 furin에 의해 절단되어 있기 때문에 표현하기 전에 제거해야하는 것을 명심하는 것이 중요하다 배큘로 바이러스 발현 시스템 1,12.
degradational 제품에 대한 또 다른 가능한 이유는 효모 나 곰팡이의 오염이다. 이 같은 초기 동안 작업 재고 세대로 일어날 수있는 4 ℃에서 주식의 저장 중에 들키지 수 있습니다 많은 효모 및 곰팡이는 최적의 성장을 20 ~ 30 °의 C 사이의 온도를 선호하고 실제로 포유 동물 세포에 대한 일반적인 배양 온도 37 ° C,에서 억제된다. 세포 배양에 사용되는 대부분의 항생제는 효모와 곰팡이, 곤충 세포 배양과 같은 진핵 생물에 대한 효과가 아니기 때문에 performe입니다 각별한주의가 문화의 무균 처리의 관점에서주의가 필요하다 이러한 세균의 최적 성장 조건에서 D. 곤충 세포를 overgrowing 및 산성화뿐만 아니라 미디어, 곰팡이와 효모는 많은 수용성 단백질 분해 효소를 표현하기 때문에 완전히 재조합 단백질이 저하 될 수 있습니다.
때때로 발생하는 문제는 용출 완충액의 침전이다. 이것은 거의 다소간 변형 특정 (예 : A/Vietnam/1203/04 H5 HA 침전하는 경향이) 보이지 않는,하지만 PBS에 빠르고 완전한 버퍼 교환에 의해 방지 될 수있다. 이미 다졸 함유 용출 버퍼의 단백질을 저장하지 않는 것이 좋습니다. -80 ° C에 분취 량의 동결에 수확에서 정화 절차는 -80 ° C 이외의 온도에서 정제 된 단백질의 작업 일 및 저장은 피해야 내에서 수행되어야한다. 또한, 반복 동결 - 해동주기는 특정 항원 결정기 1의 안정성에 부정적인 영향을 입증되었습니다.
_content "> 수율 0.2-30 ㎎ / L 배양의 범위에있을 것으로 예상한다.의 NA가 낮은 수준으로 표현하는 경향이 있지만 대부분은 상부 범위에서 표현 있음. 또한 대한 발현 수준이 수에 반비례 상관 관계를 보인다 있음 글리코 실화 부위 건. 있음 인간 계절 H3N2 및 제철 prepandemic H1N1이 가장 높은 발현 수준을 갖고 조류 인플루엔자 바이러스 유래의 갖지만, 보통 낮은 발현 수준을 보여준다 분리. 발현을 향상시키기 위해 그것이 플라스크에서 세포 밀도를 증가하거나 시도 추천 덜 사용하거나 식 당 더 많은 일 주식. 10 배 증가하거나 작업 주식의 감소가 발현 수준에 긍정적 인 영향을 미칠 수 있습니다. 발현 수준에 영향을 줄 수있는 또 다른 요인은 감염과 수확 사이의 시간입니다. 96 시간이 가장하고 이상적입니다 의 NA하지만 짧은 배양 시간은 실제로 어떤 단백질의 수율을 높일 수 있습니다.곤충 세포는 거의 포유에서 번역 후 변형을 수행 할 수있다N과 같은 방식 및 포유 동물 세포 (그러나 높은 수율을 생산)과 비슷한 효율로 매우 복잡한 단백질 구조를 접을 수 있습니다. 당화의 관점에서, 이들은 포유 동물 세포 약간 다른 및 시알 산 수정 19 부족 주로 paucimannosidic N-글리 칸 특징 패턴을 나타낸다. 그러나, (단자 시알 산 등) 당화 같은 포유 동물을 생산하기 위해 수정 된 곤충 세포주 (14) 시판되고있다.
HA 및 NA - 배큘로 바이러스 발현 시스템은 재조합 인플루엔자 표면 당 단백질의 발현을위한 매우 유용한 도구이다. 이 재조합 단백질은 많은 면역 학적, 생화학 적 분석을위한뿐만 아니라 백신의 항원 내용의 표준화 및 동물 모델에서 예방 접종 실험을위한 항원으로 사용됩니다. trimerizati 프레임으로 표현하는 경우 HA와 NA가 가득 생물학적 기능과 올바른 접이식 전시 배큘로 바이러스 발현각각과 테트라 도메인에. 이것은에서 그들을 구별 세균 비 당화이며 줄기 도메인의 기능적인 항원이 부족하다는 표현이있다. 또한, 배큘로 바이러스 발현 시스템 전시는 포유 동물 세포 시스템 (26)과 처리 및 스케일링보다 훨씬 높은 단백질 수익률은 쉽다. 요약하면, 우리는 재조합 인플루엔자 바이러스 HA 및 NA 분자 다량 발현에 대한 쉽고 효율적인 프로토콜을 설명한다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 단일 클론 항체 CR9114 패트릭 C. 윌슨에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 원래 A/Anhui/1/13 플라스미드에 제니퍼 Debeauchamp 리처드 웨비 감사합니다. 이 작품에 대한 부분 지원은 알레르기에 대한 국립 연구소에 의해 제공되고 전염성 프로그램 프로젝트 부여 AI097092-01A1와 CEIRS (인플루엔자 연구 및 감시를위한 우수의 센터 HHSN26620070010C) 질병 - 투자되었다. FK는 오스트리아 과학 기금 (FWF)에서 어윈 슈뢰딩거의 교제 (J 3232)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
References
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