Summary
Nous décrivons ici un moyen pour exprimer des antigènes de surface du virus de l'influenza correctement repliés et fonctionnels dérivés du nouveau virus H7N9 chinois dans des cellules d'insectes. La technique peut être adaptée pour exprimer ectodomaines de toutes les protéines virales ou cellulaires superficiels.
Abstract
Le système d'expression de baculovirus est un outil puissant pour l'expression de protéines recombinantes. Ici, nous l'utilisons pour produire des versions correctement repliées et glycosylés de la grippe A virus glycoprotéines de surface - l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA). A titre d'exemple, nous avons choisi les protéines HA et NA exprimées par le nouveau virus H7N9 qui a récemment émergé en Chine. Cependant le protocole peut être facilement adapté pour HA et NA protéines exprimées par tout autre virus grippal A et les souches de virus B. Recombinant HA (RRS) et NA (ARN) des protéines sont des réactifs importants pour les dosages immunologiques tels que ELISPOT et ELISA, et sont également largement utilisés pour la normalisation des vaccins, découverte d'anticorps, l'isolement et la caractérisation. En outre, les molécules de NA recombinantes peuvent être utilisées pour cribler des inhibiteurs de petites molécules et sont utiles pour la caractérisation de la fonction enzymatique de la Na, ainsi que de sa sensibilité aux antiviraux. Protéines HA recombinées sont également being testés en tant que vaccins expérimentaux dans des modèles animaux, et un vaccin recombinant basé sur HA a récemment été autorisé par la FDA pour une utilisation chez l'homme. La méthode que nous décrivons ici la production de ces molécules est simple et peut faciliter la recherche dans les laboratoires de la grippe, car il permet la production de grandes quantités de protéines rapide et à faible coût. Bien que nous nous concentrons ici sur le virus de la grippe glycoprotéines de surface, cette méthode peut également être utilisé pour produire d'autres protéines virales et cellulaires de surface.
Introduction
Comme une première réponse à la récente émergence du roman H7N9 grippe souche du virus en Chine, nous avons acquis des plasmides portant les séquences génomiques de l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA) des gènes des deux premiers isolats. L'utilisation de ces plasmides, nous avons pu construire rapidement des vecteurs d'expression de baculovirus recombinant pour la production de HA et NA dans des cellules d'insectes. Ce système d'expression est bien établi dans notre laboratoire et a prouvé crucial pour bon nombre de nos projets de recherche en cours 1-8. Les cellules d'insectes sont capables de plier correctement et modifier des protéines complexes post-traductionnelle. Ces modifications comprennent la glycosylation N-liée, ce qui est important pour de nombreuses glycoprotéines virales. En tant que tel, il n'est pas surprenant que le système de baculovirus est bien établie pour les virus de la grippe exprimant les antigènes de surface. En fait, la plupart des structures cristallines HA et NA ont été résolus en utilisant cellulaires exprimé protéines d'insectes 9-11. Un autre avantage de l'système réside dans ses fiables des rendements élevés de protéines allant jusqu'à 30 mg de culture de cellules HA / L (sur la base de notre expérience de plus de 50 protéines différentes HA) - une conséquence de virus infection expression entraînée par le promoteur de la polyhédrine forte.
L'élimination de l'endodomaine transmembranaire et des protéines HA et NA permet l'expression de versions solubles sécrétées, des protéines et donc facilite grandement le processus de purification. En outre, ces ectodomaines hexahistidine sont marqués et peuvent donc être purifiés en utilisant une Chromatographie d'affinité en utilisant Ni2 +-résine. Les domaines transmembranaires des protéines HA et NA, et contribuent à la formation de homotrimère homotétramère, respectivement. Afin de préserver ces oligomérisations, nous ajoutons un domaine de trimérisation C-terminale de la HA, et un tétramérisation domaine N-terminal de la NA constructions (Figure 1). Nous avons démontré de façon concluante que ce domaine de trimérisation stabilise fonctionnelle, conséquencesrved épitopes conformationnels sur la tige-domaine de HA 1. Le tétramérisation correcte de la NA pourrait également contribuer à corriger le pliage et la fonction NA 10. Séquences et des vecteurs baculovirus transfert hébergeant trimérisation ou tétramérisation domaines peuvent être demandés aux auteurs ou à d'autres laboratoires dans le domaine, 9,10,12.
Une autre question importante pour l'expression de protéines sécrétées dans des cellules d'insectes est le choix de la lignée cellulaire droite. Alors que Spodoptera frugiperda dérivé des cellules Sf9 en charge la réplication baculovirus très bien et sont généralement utilisés pour le sauvetage de virus et la propagation, ils ont la capacité de sécréter de grandes quantités de protéines limité. Trichoplusia ni dérivé BTI-TN-5B1-4 cellules (communément appelés High Five) avoir une capacité de sécrétion plus élevée et sont de la lignée cellulaire de choix pour l'expression dans ce protocole 13,14. En outre, il est utile pour réduire ou même éliminer le sérum de veau fœtal (FBS) à partir de cultures d'expression. Nous utilisons donc médias réduite (3%) contenu FBS pour la croissance des stocks de roulement de virus, et nous effectuons l'expression de protéines dans des milieux sans sérum.
Protéines HA et NA recombinants sont utilisés pour de nombreuses techniques immunologiques. Peut-être la plus commune est dans des tests ELISA pour mesurer la conversion de sérum sur la vaccination chez les humains ou les animaux 4,6,7,15. AN engage et sont également utilisées dans des analyses ELISPOT comme les deux molécules stimulatrices et des réactifs de détection pour les cellules sécrétant l'anticorps 16. Leur utilisation comme amorces moléculaires permet de trier spécifiquement pour plasmoblastes ou d'autres types de cellules B qui peuvent ensuite être utilisés pour isoler des anticorps monoclonaux (thérapeutiques) (Acm). Des molécules de HA et NA recombinants sont ensuite utilisés dans la caractérisation de ces anticorps monoclonaux 8. D'autres exemples comprennent l'étude de la stabilité du pH ou la spécificité du récepteur de a exprimé par différents isolats de virus, ou d'évaluer quantitativement enzymatique spécifique NAl'activité ou de la résistance aux inhibiteurs. En outre, recombinant, HA purifiée peut être utilisée pour normaliser teneur en HA de vaccins inactivés du virus de la grippe.
Surtout, AHr (et dans une certaine mesure NA) candidats vaccins sont actuellement testés dans des modèles animaux et des essais cliniques sur des humains avec un candidat vaccin est autorisé par la FDA en 2013 2,17-19. L'avantage de ces nouveaux vaccins est que, en raison de la nature de ces protéines recombinantes, le procédé de génération de virus réassortis de croissance élevés de main-d'œuvre pourrait être évité. Peut-être est d'autant plus pertinente que le fait de leur rendement de HA est élevée et reproductible d'une souche à l'. En outre, étant donné que ces vaccins sont produits dans un système sans oeuf, ils ne contiennent pas de contaminants protéiques qui sont problématiques pour des individus allergiques aux œufs.
Ici, nous avons choisi d'exprimer les protéines HA et NA de deux isolats du virus de la grippe roman H7N9 chinois, A / Anhui/1/13 et A/Shanghai/1/13 20,21. Ce sont des exemples rapides, mais le protocole décrit peuvent être utilisés pour l'expression selon l'une quelconque des protéines de la grippe A et B de HA ou de NA et peuvent être adaptés pour exprimer toutes les autres protéines virales ou cellulaires sécrétés. Protéines transmembranaires trimères ou tétramères peuvent être clonées dans les cassettes d'expression utilisées pour HA et NA, respectivement. Toutefois, les protéines cellulaires sécrétées plus solubles, comme les interférons, par exemple, n'ont pas besoin d'un domaine supplémentaire pour la stabilisation et peuvent être exprimés uniquement avec un tag hexa-histidine C-terminal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Une. Génération de baculovirus recombinant
- Clonage dans plasmides transfert baculovirus
- Clone H7 HA et NA N9 ectodomaine (ou tout autre gène HA ou NA) dans des plasmides de transfert pFastBac modifiés (voir introduction). Vecteurs pour HA contenant un domaine de trimérisation C-terminal et une étiquette hexahistidine, ainsi que pour NA contenant un domaine de tétramérisation N-terminal et tag hexa-histidine, ont été décrits 1,10,11,22 (Figure 1) et peuvent être demandées les auteurs.
Note explicative: ectodomaines HA exprimées sans un domaine de trimérisation seront pliées de manière incorrecte, conduisant à la perte d'épitopes conformationnels neutralisants, en particulier dans le domaine de la tige. De même, la fonction enzymatique NA s'appuie sur tétramérisation appropriée. - Génération de bacmides
Transformer transfert de baculovirus-plasmides contenant des gènes HA et NA dans des bactéries selon DH10Bac aide d'une expression de baculovirussystème selon les instructions du fabricant. Isoler et purifier bacmides utilisant un kit Midiprep selon les instructions du fabricant (figure 2).
- Clone H7 HA et NA N9 ectodomaine (ou tout autre gène HA ou NA) dans des plasmides de transfert pFastBac modifiés (voir introduction). Vecteurs pour HA contenant un domaine de trimérisation C-terminal et une étiquette hexahistidine, ainsi que pour NA contenant un domaine de tétramérisation N-terminal et tag hexa-histidine, ont été décrits 1,10,11,22 (Figure 1) et peuvent être demandées les auteurs.
- Sauvetage de baculovirus recombinant et de la vérification de l'expression de la protéine
Note explicative: Les étapes suivantes doivent être effectuées de manière aseptique dans une hotte à flux laminaire. Effectuez cette procédure indépendante pour HA et NA (ou tout autre gène d'intérêt). Les cellules d'insectes sont généralement cultivées à 28 ° C sans CO 2. Cellules Sf9 de ce protocole sont cultivées dans des milieux de cellules d'insectes TNM-FH complet supplémenté avec 10% de FBS, 1% de Pen-Strep * et 0,1% de solution de Pluronic F68, sauf indication contraire, et des passages 01h04 deux fois par semaine. Cellules High Five sont cultivées dans des milieux de sérum libre SFX et des passages 01h15 deux fois par semaine.
* Ajout d'antibiotiques devrait être considérée comme facultative dans tout le protocole et ajusté selon les pratiques utilisées dans chaque laboratoire.- Plate cellules d'insecte Sf9 dans des plaques à 6 puits à une densité de 2 x 10 5 cellules / cm 2 et laisser reposer pendant 20 min dans un incubateur à 28 ° C (sans CO 2).
- Mélanger 2 ug (conc. 0,5 à 2 ug / ul) de bacmide recombinant avec 100 ul de milieu TNM-FH (exempt de sérum, 1% de Pen-Strep). Mélangez 6 pi d'agent de transfection avec 100 pi de milieu TNM-FH (sans sérum, Pen-Strep). Combiner les deux volumes, mélanger délicatement et laisser reposer pendant 20 min à température ambiante (mélange de transfection). Inclure une maquette transfection comme contrôle (Figure 3).
- Retirer le surnageant de cellules Sf9 plaqués (cellules vont maintenant s'en tenir à la plaque) et le remplacer par 2 ml de milieu sans sérum TNM-FH contenant Pen-Strep (1%). Ajouter le volume complet du mélange de transfection (étape 1.2.2) et faites délicatement basculer la plaque de 6 puits pendant 5 sec. Incuber dans un incubateur à 28 ° C sans CO 2 pendant 6 heures (figure 3).
- Remplacez le support wimédias ème frais complets TNM-FH (contenant 10% de FBS, 1% de Pen-Strep et 0,1% Pluronic F68). Incuber dans un incubateur à 28 ° C sans CO 2 pendant 6 jours. Vérifier de temps en temps les cellules sous un microscope. Les cellules infectées apparaissent généralement plus gros, plus rond, ont élargi noyaux, et commencent à se détacher (Figure 4).
- La récolte de cellules et la confirmation de l'expression de la protéine
- Récolte des cellules 6 jours après la transfection par centrifugation à 2000 xg pendant 5 min à température ambiante. Le surnageant contient le baculovirus recombinant - il sera utilisé pour générer les stocks de travail tout de suite, ou peut être conservé à 4 ° C pendant des années.
- Pour vérifier l'expression des protéines de recueillir des pastilles et remettre en suspension dans 500 pi de PBS. Mélanger 50 pi de la suspension de 50 pi de tampon SDS-PAGE chargement (contenant un agent réducteur). Exécuter SDS-PAGE et d'effectuer une analyse par Western blot avec un anticorps anti-hexahistidine pour confirmer l'expression des gènes. Inclure les cellules de la maquettetransfection comme témoins négatifs (Figure 3).
- Préparation des stocks de travail
- Planche 5 x 10 5 Sf9 / cm 2 dans un flacon T175 cm 2 et laisser reposer pendant 20 min permettent d'attacher à l'antenne. Remplacer complète médias TNM-FH avec les médias TNM-FH contenant 3% de FBS (et 1% de Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68).
- Infecter les cellules avec 100 pi de surnageant de sauvetage. Incuber dans un incubateur à 28 ° C sans CO 2 pendant 6 jours et vérifier de temps en temps si les cellules sont infectées (comme décrit à l'étape 1.2.5.).
- Tourner à 2000 g à la température ambiante pendant 5 min et recueillir le surnageant. C'est maintenant votre P2 actions. Ce stock peut être conservé indéfiniment à 4 ° C. Répétez la procédure de l'infection en utilisant 100 pi de stock P2 pour infecter les cellules. Le stock en résulte est appelé P3 ou stock de travail, qui peut être conservé à 4 ° C ou utilisé directement pour l'expression de la protéine. Le P3 magasin contient généralement 10 <sup> 7 -10 9 unités formant plaque / ml.
2. Protein Expression and Purification
Note explicative: cellules Sf9 de soutenir la croissance de baculovirus très bien. Cependant, leur capacité à sécréter de grandes quantités de protéine recombinante est limité. Par conséquent, nous utilisons une autre ligne de cellules d'insectes, cellules High Five, pour l'expression de protéines recombinantes sécrétées. Ces cellules ne prend pas en charge la réplication baculovirus à très haute de 13 titres, mais ont une grande capacité de sécrétion.
- Grandir cellules High Five
Cultiver cellules High Five dans SFX milieu de culture de cellules d'insecte en T175 cm2. Passage tous les jours 01h03. Pour une culture de 200 ml d'expression, vous devrez développer des flacons de 5 confluentes. - Récolte et infecter cellules High Five
- Détachez cellules High Five de 5 T175 cm2 en appuyant sur les flacons avec votre main. Recueillir le suspe cellulairension et transférer dans des tubes de 50 ml de centrifugation.
- Tourner à 1200 xg pendant 7 min à température ambiante. Retirer le surnageant par décantation et d'unir les pastilles en les remettant en suspension dans 15 ml de P3 actions.
- Laisser reposer pendant 15 min dans la hotte à flux (Figure 5).
- Transférer 200 ml de milieu de culture Hyclone SFX en un, stérile 1000 ml shaker flacon propre (sans buffles, scellé avec une feuille d'aluminium avant l'autoclavage, ne doit pas avoir été utilisé pour les cultures bactériennes avant).
- Transférer la suspension P3/cell dans le ballon à secousses. Sceller avec du papier d'aluminium stérile et transfert ballon dans un shaker. Agiter à 70 tours par minute à 28 ° C pendant 72-96 h.
- La récolte de la protéine recombinante à partir de surnageants de haute Cinq d'expression de cellules
- 72-96 h post-infection transfert surnageants de culture dans 500 ml seaux de centrifugation. Tourner à 5500 g pendant 20 min à 4 ° C. En attendant rincer les flacons shaker 3x avec de l'eau distillée deux fois(Le trou DDH 2 O).
- Transfert 3 ml suspension Ni-résine dans un tube de 50 ml avec 45 ml de PBS (on avait besoin pour 200 ml de culture). Secouez bien et tourner à 3000 xg à température ambiante pendant 10 min. Décanter le PBS et garder le culot. Mélanger le surnageant de cellules d'insecte avec le culot Ni-résine et les transférer dans des flacons secoueurs déjà rincés. Incuber à 4 ° C pendant 2-4 heures, tout en agitant (Figure 6).
- Mont colonne de 10 ml en polypropylene sur une pince sur un stand de support. Retirer les deux bouchons et placer un bécher sous la colonne pour recueillir l'écoulement à travers (déchets). Prendre le ballon à secousses de l'agitateur et commencer à transférer le mélange surnageant / de suspension sur la colonne, il va conserver la résine Ni-et uniquement le surnageant s'écoule à travers. Passer la totalité du volume au-dessus de la colonne (figure 7).
- Laver 4x la résine avec 15 ml de tampon de lavage (50 mM de Na HCO 3 2, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8). Que toute la vidange de tampon de lavagede la colonne et fermer avec le couvercle (côté inférieur).
- Ajouter 2 ml de tampon d'élution (mM Na 50 2 HCO 3, 300 mM de NaCl, mM imidazole, pH de 8 300) et laisser reposer pendant 5 min. Ouvrez colonne et recueillir l'éluat. Répéter cette opération 3 fois de plus (avec un total de 8 ml de tampon d'élution). Éluat qui contient des concentrations élevées de protéine montre typiquement mousse quand on les secoue (figure 7). Gardez éluat sur de la glace chaque fois que possible.
- échange de tampon et la concentration
- Prespin 15 ml ultrafiltration unités de centrifugation (30 kDa de coupure pour HA / NA, mais peuvent varier en fonction de la taille de la protéine purifiée) avec du PBS (pH 7.4-7.6) à 3000 g à 4 ° C pendant 20 min. Jeter traverser et charge éluat sur la colonne. Remplir avec 5 ml de stérile, glacée PBS et centrifugation pendant 60 min à 3000 g à 4 ° C.
- débit de décharge par nouveau, remplir avec 15 ml de PBS glacé et essorage pendant 60 min à 3000 g à 4 ° C. Répétez cette procédureDure une fois de plus.
- Prenez la colonne de spin-out de la centrifugeuse et recueillir le concentré de tampon échangé (typiquement 200 pi). Ceci est très concentré protéine recombinante. Rincer la colonne de spin avec 400 pi de froid de glace PBS stérile et ajouter ce au concentré. Gardez le concentré sur la glace en tout temps.
3. Caractérisation et contrôle de la qualité
- Mesure de la concentration protéique
Prélever une partie aliquote du concentré et de le mesurer à l'aide de votre méthode de quantification de protéine de choix. Régler la concentration en protéine à 1 mg / ml par addition de PBS et de geler petites aliquotes à -80 ° C. Cycles de gel-dégel nuisent à la structure de la protéine et peuvent conduire à l'agrégation. - SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie
Exécutez 500 ng de votre protéine sur un SDS-PAGE et effectuer une coloration de Coomassie. Pour la coloration rapide et pratique utiliser le réactif de Coomassie, en combinaison avec un protocole de micro-ondes. Protéines HA apparaissent généralement à 64kDa alors que les protéines NA doivent fonctionner à une taille d'environ 56 kDa (figures 8A et B). Selon le protocole décrit vous ne devriez pas voir tous les produits de dégradation. Si la dégradation se produit, il est généralement un signe de contamination levure / fongique lors de l'expression. Dans ce cas, répétez la procédure et assurez-vous de garder tout stérile. - Western blot / ELISA
Afin de vérifier l'identité des protéines que nous recommandons à faire un Western blot ou ELISA avec un anticorps spécifique. Idéalement, les tests ELISA sont réalisés avec un anticorps qui se lie à des épitopes conformationnels (par exemple des anticorps anti-HA tige 1). L'utilisation d'un tel anticorps du repliement correct de la protéine peut être confirmée (Figure 8C). - Mesure NA activité
Un repliement correct de la NA du virus peut également être déterminée en mesurant l'activité de NA. Nous vous recommandons d'effectuer ce test en utilisant le test NA * STAR disponibles dans le commerce (il suffit de suivre les lignes directrices de l'utilisateur).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Molécules HA de A/Shanghai/1/13 et A/Anhui/1/13 exprimé bien avec des rendements d'environ 20 mg / L de culture. NA molécules des deux souches ont montré des niveaux d'expression modérés allant de 0,2 mg / L de culture pour A/Shanghai/1/13 à 0,7 mg / L pour A/Anhui/1/13. Tous les quatre préparations de protéines ont très peu ou pas d'impuretés (figures 8A et B) Le fait d'être de pureté supérieur à AN qui peut s'expliquer par le niveau d'expression. A/Shanghai/1/13 HA a en outre été analysée par ELISA avec la tige réactive neutralisants humain mAb CR9114 23. Cet anticorps monoclonal se lie à un épitope conformationnel sensible dans le domaine queue et est utilisé ici en tant que sonde pour le repliement correct de ce domaine. L'anticorps montre une bonne liaison qui donne la confiance que l'HA est en effet plié correctement (figure 8C). Un second test ELISA avec des anticorps anti-H7 sérum polyclonal de souris a été effectuée pour confirmer l'identité de la protéine obtenue à partir de l'origine H7 (Figure 8D).
Figure 1. Schéma de HA et NA constructions d'expression. La construction d'expression de la HA (A) contient un peptide signal N-terminal suivi par l'ectodomaine HA, un site de clivage de thrombine, un domaine de trimérisation de T4 et une étiquette hexahistidine. La construction d'expression NA (B) contient un peptide signal N-terminal suivi par une étiquette hexahistidine, un vasodilatateur stimulant phosphoprotéine (VASP) domaine tétramérisation et l'ectodomaine NA. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Schéma de generat bacmideion (comme décrit dans l'étape 1.1.2). Un vecteur baculovirus transfert contenant des gènes HA ou NA est transformé dans des bactéries DH10Bac. Recombinaison dans le génome du baculovirus que ces bactéries portent produit un phénotype de colonie blanc sur des plaques de sélection. Une colonie blanche est ramassé et réétalées. Une seule colonie de la plaque réétalées est utilisée pour inoculer une culture de midiprep.
Figure 3. Schéma de sauvetage baculovirus et travailler génération d'actions (comme décrit dans les étapes 1.2.1-6). Bacmide recombinant et réactif de transfection sont dilués dans un milieu sans sérum TNM-FH. Les deux solutions sont combinées, le mélange est incubé pendant 20 min, puis transférées sur des cellules Sf9. Six heures après transfection du milieu de transfection est remplacé par les médias TNM-FH complets. Six jours après la transfection, le surnageant est prélevé et le culot cellulaire est analyzed pour l'expression de protéines recombinantes.
Figure 4. Des cellules de Sf9 sains et infectés. Sf9 dans (A) sont en bonne santé et non infectés. Ils sont fixés à la boîte de culture, l'air partiellement polymorphe et relativement faible. Les cellules de (B) sont infectées par le baculovirus, détachées de la boîte de culture, sont grandes et rondes et ont élargi noyaux. Le noyau présente également un aspect granuleux.
Figure 5. L'infection des cellules High Five avec baculovirus recombinant (actions de travail, comme décrit dans l'étape 2.2). Cinq confluentes T175 flacons avec cellules High Five sont récoltées par centrifugation à faible vitesse et à combiner avec 15 ml de P3 baculovirus actions. Après 15 min de encubation le mélange cellules / virus est transféré dans 1000 ml flacons shaker avec 200 ml de SFX médias.
Figure 6. Récolte de surnageant cellulaire 72-96 h post infection et l'incubation avec de la résine Ni-NTA (comme décrit dans l'étape 2.3). Suspensions cellulaires infectées sont récoltées par centrifugation à faible vitesse. Les surnageants de culture sont mélangés avec du PBS-équilibrée Ni-résine et on incube pendant 2-4 heures tout en agitant.
Figure 7. procédure de purification (comme décrit dans 2.3 et 2.4) et contrôle de la qualité (comme décrit dans les étapes 3.1.1-4). Après incubation, la totalité du mélange surnageant / résine est chargé sur des colonnes en polypropylène. La résine est retenue par les colonnes et est ensuite lavé quatre fois avec le lavage buffer et de la protéine recombinante est éluée avec 8 ml de tampon d'élution appliquées en deux étapes ml. L'éluat est ensuite concentré et un échange de tampon avec une colonne de centrifugation de l'ultrafiltration, aliquote et congelé. des analyses de contrôle de la qualité comprennent SDS-PAGE, Western Blot, ELISA et mesure de l'activité de NA NA recombinant.
Figure 8. Les résultats représentatifs. HA (A) et NA (B) des protéines de A/Anhui/1/13 et A/Shanghai/1/13 ont été analysés par SDS-PAGE et coloration au Coomassie. L'intégrité structurelle de la HA de A/Shanghai/1/13 été évaluée en utilisant la neutralisation de l'anticorps CR9114 largement de la tige-réactive humaine qui se lie à un épitope conformationnel sensible (C). L'identité de la même HA a été confirmée par un sérum de souris anti-H7 polyclonal (D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bien que l'expression de virus de la grippe HA et NA protéines dans des cellules d'insectes en utilisant le système d'expression baculovirus est généralement simple, il ya plusieurs points importants à considérer. Il est important, comme indiqué dans l'introduction, que les ectodomaines de HA et NA sont exprimés en fusion avec la trimérisation ou la tétramérisation des domaines, respectivement. Ces domaines d'assurer le repliement correct des molécules généralement assistée par le domaine transmembranaire, qui n'est pas présent si ce n'est que l'ectodomaine est exprimé. Par exemple, l'expression de l'ectodomaine de HA sans un domaine de trimérisation conduit à une oligomérisation et à la déstabilisation des épitopes de neutralisation importants dans le domaine de la manette 1. En outre, la stabilité des protéines est diminué et la dégradation par la cellule d'insecte et de baculovirus proteases se produit. Le choix du domaine de trimérisation ou tetramérisation est moins importante, un certain nombre d'entre eux allant de domaines de glissière à leucine 22à T4 foldons de phages 11 ont été testés à ce jour et tous ont montré des résultats satisfaisants. Il est important de garder à l'esprit que les sites de clivage multibasiques tels qu'ils apparaissent dans H5N1 hautement pathogène 24 ou H7N7 25 isolats (mais pas dans H7N9) doivent être retirés avant l'expression, car ils sont clivés par la furine comme protéases qui sont présents en tout temps le baculovirus 1,12 du système d'expression.
Une autre raison possible pour les produits degradational est la contamination par des levures ou moisissures. Cela peut se produire dès lors de travailler génération des stocks et peut passer inaperçue pendant le stockage des stocks à 4 ° C. Beaucoup de levures et de moisissures préfèrent des températures comprises entre 20-30 ° C pour une croissance optimale et sont effectivement inhibé à 37 ° C, qui est la température de culture commune de cellules de mammifères. Etant donné que la plupart des antibiotiques qui sont utilisés dans la culture cellulaire ne sont pas efficaces contre les organismes eucaryotes tels que les levures et les moisissures, et à la culture de cellules d'insecte est performe d dans des conditions optimales de croissance de ces germes soin supplémentaire doit être prise en termes de manipulation aseptique des cultures. En plus de envahissement des cellules d'insectes et l'acidification des médias, moisissures et levures expriment de nombreuses protéases solubles et peuvent donc dégrader complètement protéines recombinantes.
Un problème qui se produit parfois des précipitations est dans le tampon d'élution. Cela est rarement vu plus ou moins souche spécifique (par exemple A/Vietnam/1203/04 H5 tend à précipiter), mais peut être prévenue par l'échange de tampon rapide et complète de PBS. Stockage de protéines dans un tampon d'élution contenant de l'imidazole n'est pas recommandée. La procédure de purification de la récolte à la congélation d'aliquotes à -80 ° C doit être effectué dans une journée de travail et de stockage de la protéine purifiée à l'autre à -80 ° C de température doivent être évitées. En outre, des cycles répétés de gel-dégel ont été prouvés pour avoir un impact négatif sur la stabilité de certains épitopes 1.
_content "> Les rendements devraient s'attendre à être dans la gamme de 0,2 à 30 de mg / L culture. beaucoup a exprimer dans la gamme supérieure tandis que les AN ont tendance à exprimer à des niveaux inférieurs. Par ailleurs, les niveaux d'expression de a semble corréler inversement avec le nombre de sites de glycosylation. a de H3N2 humaine saisonnière et saisonnière prépandémique H1N1 isolats montrent habituellement faibles niveaux d'expression, alors que la plupart des AP d'origine du virus de la grippe aviaire ont des niveaux d'expression élevés. Pour améliorer l'expression, il est recommandé d'augmenter la densité des cellules dans le flacon ou d'essayer d'utiliser moins ou d'un stock de plus de travail par l'expression. 10 fois augmentation ou la diminution du stock de travail peuvent avoir un impact positif sur les niveaux d'expression. Un autre facteur qui peut avoir un impact sur les niveaux d'expression est le temps entre l'infection et la récolte. 96 h sont idéales pour la plupart des AP et NAS, mais plus courtes durées d'incubation pourraient en fait augmenter les rendements de certaines protéines.Les cellules d'insectes sont capables d'effectuer des modifications post-traductionnelles dans un presque mammifèresmanière n-comme et sont capables de plier les structures de protéines très complexes avec des rendements similaires à ceux des cellules de mammifères (mais produire des rendements plus élevés). En ce qui concerne la glycosylation, ils présentent un motif qui est légèrement différent de cellules de mammifère et comprend des N-glycanes pour la plupart paucimannosidic modifications qui n'ont pas d'acide sialique 19. Cependant, les lignées cellulaires d'insectes qui ont été modifiés pour produire des mammifères comme la glycosylation (incluant l'acide sialique terminal) sont disponibles dans le commerce 14.
Le système d'expression baculovirus est un outil extrêmement utile pour l'expression de l'influenza glycoprotéines de surface recombinant - HA et NA. Ces protéines recombinantes sont utilisées pour de nombreux tests immunologiques et biochimiques, ainsi que pour la normalisation de la teneur en antigènes des vaccins et comme antigènes pour des expériences de vaccination dans des modèles animaux. Baculovirus exprimé HA et NA présentent fonction biologique complète et correcte pliage si elle est exprimée dans le cadre avec trimerizatiet sur des domaines de tétramérisation respectivement. Cela les distingue des bactéries exprimé AP qui sont non-glycosylée et manquent épitopes fonctionnels dans le domaine de la tige. En outre, les pièces du système d'expression baculovirus rendements en protéines significativement plus élevés que les systèmes de cellules de mammifères et 26 manipulation et upscaling sont plus faciles. En résumé, nous décrivons un protocole simple et efficace pour l'expression de grandes quantités de virus recombinant de la grippe HA et NA molécules.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Patrick C. Wilson pour CR9114 monoclonal d'anticorps. Nous remercions également Jennifer Debeauchamp et Richard Webby pour les plasmides A/Anhui/1/13 originaux. Un soutien partiel pour ce travail a été fourni par l'Institut national de l'allergie et des maladies infectieuses projet financé par Programme de subventions AI097092-01A1 et CEIRS (Centres d'excellence pour la recherche sur l'influenza et de la surveillance, HHSN26620070010C). FK a été soutenue par une bourse de Erwin Schrödinger (J 3232) du Fonds autrichien pour la science (FWF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
References
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7, e43603 (2012).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies. J. Virol. , (2013).
- Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador. Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).
- Margine, I., et al. H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice. J. Virol. , (2013).
- Miller, M. S., et al. 1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans. J. Infect. Dis. 652, (1976).
- Pica, N., et al. Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).
- Sangster, M. Y., et al. The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination. Clin. Vaccine Immunol. , (2013).
- Tan, G. S., et al. A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324, 246-251 (2009).
- Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase. J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).
- Stevens, J., et al. Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science. 303, 1866-1870 (2004).
- Wei, C. J., et al. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).
- Krammer, F., et al. Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines. Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).
- Palmberger, D., et al. Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative. J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).
- Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems. Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).
- Wrammert, J., et al. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).
- Treanor, J. J., et al. Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial. Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).
- Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase. J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).
- Krammer, F., Grabherr, R. Alternative influenza vaccines made by insect cells. Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).
- Gao, R., et al. Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus. N. Engl. J. Med. , (2013).
- Goff, P. H., et al. Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin. J. Virol. , (2013).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (2010).
- Dreyfus, C., et al. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science. 337, 1343-1348 (2012).
- Steel, J., et al. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza. J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).
- Fouchier, R. A., et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).
- Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
