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Immunology and Infection

Baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग उपन्यास H7N9 इन्फ्लूएंजा वायरस से कार्यात्मक संयोजक Hemagglutinin और neuraminidase प्रोटीन की अभिव्यक्ति

Published: November 6, 2013 doi: 10.3791/51112
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Graduate School of Biological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

यहाँ हम कीट कोशिकाओं में उपन्यास चीनी H7N9 वायरस से व्युत्पन्न सही ढंग से मुड़ा और कार्यात्मक इन्फ्लूएंजा वायरस की सतह एंटीजन व्यक्त करने के लिए एक तरह का वर्णन. तकनीक किसी भी वायरल या सेलुलर सतह प्रोटीन की ectodomains व्यक्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता.

Abstract

baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. (हेक्टेयर) hemagglutinin और neuraminidase (एनए) - यहाँ हम इन्फ्लूएंजा के सही ढंग से मुड़ा और ग्लाइकोसिलेटेड संस्करण एक वायरस की सतह ग्लाइकोप्रोटीन निर्माण करने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं. एक उदाहरण के रूप में, हम हाल ही में चीन में उभरा है कि उपन्यास H7N9 वायरस द्वारा व्यक्त हा और एनए प्रोटीन चुना है. हालांकि प्रोटोकॉल आसानी से किसी भी अन्य इन्फ्लूएंजा ए और बी वायरस उपभेदों द्वारा व्यक्त हा और एनए प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता. संयोजक हा (RHA) और एनए (आरएनए) प्रोटीन ऐसे ELISPOT और एलिसा रूप प्रतिरक्षाविज्ञानी assays के लिए महत्वपूर्ण अभिकर्मकों हैं, और टीका मानकीकरण, प्रतिरक्षी खोज, अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए व्यापक प्रयोग में भी कर रहे हैं. इसके अलावा, पुनः संयोजक NA अणुओं छोटे अणु inhibitors के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया और एनए के enzymatic समारोह के लक्षण वर्णन है, साथ ही antivirals के लिए अपनी संवेदनशीलता के लिए उपयोगी होते हैं किया जा सकता है. संयोजक हा प्रोटीन भी बी हैंएनजी पशु मॉडल में प्रयोगात्मक टीकों के रूप में परीक्षण किया है, और पुनः संयोजक हेक्टेयर पर आधारित एक टीका हाल ही में मानव में इस्तेमाल के लिए एफडीए द्वारा लाइसेंस प्राप्त था. यह तेजी से और कम कीमत पर प्रोटीन की बड़ी मात्रा के उत्पादन के लिए अनुमति देता है के बाद से हम इन अणुओं का उत्पादन करने के लिए यहाँ का वर्णन विधि, सीधे आगे है और इन्फ्लूएंजा प्रयोगशालाओं में अनुसंधान की सुविधा कर सकते हैं. हम इन्फ्लूएंजा वायरस की सतह ग्लाइकोप्रोटीन पर ध्यान केंद्रित यहाँ हालांकि, इस विधि भी अन्य वायरल और सेलुलर सतह प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

चीन में उपन्यास H7N9 इन्फ्लूएंजा वायरस तनाव के हाल ही के उद्भव के लिए पहली बार एक प्रतिक्रिया के रूप में, हम (हेक्टेयर) hemagglutinin और neuraminidase (एनए) के पहले दो आइसोलेट्स के जीनों के लिए जीनोमिक दृश्यों ले जाने plasmids हासिल कर ली. हम जल्दी से कीट कोशिकाओं में पुनः संयोजक हा और एनए के उत्पादन के लिए baculoviral अभिव्यक्ति वैक्टर का निर्माण करने में सक्षम थे इन plasmids का उपयोग करना. यह अभिव्यक्ति प्रणाली अच्छी तरह से हमारी प्रयोगशाला में स्थापित है और हमारे चल रहे अनुसंधान परियोजनाओं 1-8 से कई के लिए निर्णायक साबित हो गया है. कीट कोशिकाओं को सही ढंग से गुना और बाद translationally जटिल प्रोटीनों को संशोधित करने में सक्षम हैं. इन संशोधनों के कई वायरल ग्लाइकोप्रोटीन के लिए महत्वपूर्ण है जो उत्तर से जुड़े ग्लाइकोसिलेशन, शामिल हैं. जैसे, यह baculovirus प्रणाली काफी इन्फ्लूएंजा वायरस की सतह एंटीजन व्यक्त करने के लिए स्थापित किया गया है आश्चर्य की बात नहीं है. वास्तव में, हा और एनए क्रिस्टल संरचनाओं के कई कीट सेल व्यक्त प्रोटीन 9-11 का उपयोग कर हल किया गया है. का एक अन्य लाभमजबूत polyhedrin प्रमोटर से वायरस संक्रमण संचालित अभिव्यक्ति का एक परिणाम - प्रणाली (50 से अधिक विभिन्न हा प्रोटीन के साथ हमारे अनुभव के आधार पर) हा / एल सेल संस्कृति के लिए 30 मिलीग्राम की अपनी विश्वसनीय उच्च प्रोटीन पैदावार में निहित है.

हा और एनए प्रोटीन की transmembrane और endodomain का हटाया प्रोटीन की secretable, घुलनशील संस्करणों की अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है और इस प्रकार बहुत शुद्धिकरण की प्रक्रिया की सुविधा. इसके अलावा, इन ectodomains hexahistidine टैग कर रहे हैं और इसलिए नी 2 + राल का उपयोग आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है. हा और एनए प्रोटीन की transmembrane डोमेन क्रमशः, homotrimer और homotetramer गठन के लिए योगदान करते हैं. इन oligomerizations बनाए रखने के लिए, हम हा, और एनए के लिए एक एन टर्मिनल tetramerization डोमेन (चित्रा 1) constructs करने के लिए एक सी टर्मिनल trimerization डोमेन जोड़ें. हम इस तरह के एक trimerization डोमेन कार्यशील, नतीजे स्थिर कि अंतिम तौर से पता चला हैहा 1 के डंठल डोमेन पर गठनात्मक epitopes rved. एनए के सही tetramerization भी तह और एनए समारोह 10 को ठीक करने के लिए योगदान हो सकता है. Trimerization या tetramerization डोमेन शरण दृश्यों और baculo हस्तांतरण वैक्टर लेखकों से या क्षेत्र, 9,10,12 में अन्य प्रयोगशालाओं से अनुरोध किया जा सकता है.

कीट कोशिकाओं में स्रावित प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा सही सेल लाइन का विकल्प है. स्पोडोप्टेरा frugiperda Sf9 कोशिकाओं को बहुत अच्छी तरह से baculovirus प्रतिकृति का समर्थन और आम तौर पर वायरस बचाव और प्रचार के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं व्युत्पन्न हैं, वे प्रोटीन की बड़ी मात्रा में स्रावित करने की क्षमता सीमित है. Trichoplusia नी (आमतौर पर उच्च पाँच के रूप में जाना) BTi-TN-5B1 -4 कोशिकाओं व्युत्पन्न एक उच्च स्राव क्षमता है और इस प्रोटोकॉल 13,14 में अभिव्यक्ति के लिए पसंद की सेल लाइन कर रहे हैं. इसके अलावा, यह भ्रूण गोजातीय सीरम कम या दूर करने के लिए उपयोगी है (अमेरिकन प्लानअभिव्यक्ति संस्कृतियों से एस). इसलिए हम वायरस काम कर रहे शेयरों में उगाने के लिए कम (3%) FBS सामग्री के साथ मीडिया का उपयोग, और हम सीरम मुक्त मीडिया में प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रदर्शन करते हैं.

संयोजक हा और एनए प्रोटीन कई प्रतिरक्षाविज्ञानी तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जाता है. शायद सबसे आम एक मनुष्य या पशुओं 4,6,7,15 में टीकाकरण पर सीरम रूपांतरण मापने के लिए एलिसा assays में है. गया है और NAS भी एंटीबॉडी स्रावित कोशिकाओं 16 के लिए stimulatory अणुओं और पता लगाने अभिकर्मकों के रूप में दोनों ELISPOT assays में उपयोग किया जाता है. आणविक फँसाना रूप में उनके उपयोग विशेष रूप से plasmablasts या तो (चिकित्सीय) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (MAbs) को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि बी कोशिकाओं के अन्य प्रकार के लिए सॉर्ट करने के लिए अनुमति देता है. संयोजक हा और एनए के अणुओं आगे इन mAbs 8 के लक्षण वर्णन में किया जाता है. अन्य उदाहरणों में पीएच स्थिरता या रिसेप्टर विशिष्टता अलग वायरस आइसोलेट्स द्वारा व्यक्त की है की, या मात्रात्मक आकलन विशिष्ट NA एंजाइमी अध्ययन में शामिलinhibitors के लिए गतिविधि या विरोध. इसके अलावा, पुनः संयोजक, शुद्ध हा निष्क्रिय इन्फ्लूएंजा वायरस टीके के हा सामग्री मानकीकृत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

महत्वपूर्ण बात है, RHA (और कुछ हद तक एनए) वैक्सीन उम्मीदवारों वर्तमान में एक टीका उम्मीदवार 2013 2,17-19 में एफडीए द्वारा लाइसेंस प्राप्त किया जा रहा है साथ पशु मॉडल और मानव नैदानिक ​​परीक्षणों में परीक्षण किया जा रहा है. इन उपन्यास टीके का लाभ वजह से इन प्रोटीनों की पुनः संयोजक प्रकृति के कारण, उच्च विकास reassortant वायरस के सृजन का श्रम प्रधान प्रक्रिया से बचा जा सकता है, कि है. शायद और भी अधिक प्रासंगिक उनके हा उपज उच्च और तनाव से तनाव के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि इस तथ्य है. इन टीकों एक अंडा मुक्त प्रणाली में उत्पादित कर रहे हैं के बाद से ही, वे अंडा एलर्जी के साथ व्यक्तियों के लिए समस्याग्रस्त हैं कि प्रोटीन contaminants शामिल नहीं है.

यहाँ हम उपन्यास चीनी H7N9 इन्फ्लूएंजा वायरस, ए / अन्ह के दो आइसोलेट्स से हा और एनए प्रोटीन व्यक्त करने के लिए चुनाui/1/13 और A/Shanghai/1/13 20,21. ये समय पर उदाहरण हैं, लेकिन वर्णित प्रोटोकॉल किसी भी इन्फ्लूएंजा ए और बी हा या NA प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और किसी भी अन्य secreted वायरल या सेलुलर प्रोटीन व्यक्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता. Trimeric या tetrameric transmembrane प्रोटीन क्रमशः, हा और एनए के लिए इस्तेमाल अभिव्यक्ति कैसेट में क्लोन किया जा सकता है. हालांकि, सबसे घुलनशील secreted सेलुलर प्रोटीन, उदाहरण के लिए इंटरफेरॉन की तरह, स्थिरीकरण के लिए एक अतिरिक्त डोमेन की जरूरत नहीं है और एक सी टर्मिनल hexahistidine टैग के साथ पूरी तरह से व्यक्त किया जा सकता है.

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Protocol

1. संयोजक baculovirus की पीढ़ी

  1. Baculovirus स्थानांतरण plasmids में क्लोनिंग
    1. क्लोन H7 हा और संशोधित pFastBac स्थानांतरण plasmids में N9 NA ectodomain (या किसी भी अन्य हा या NA जीन) (परिचय देखें). हा एक एन टर्मिनल tetramerization डोमेन और hexahistidine टैग युक्त एक सी टर्मिनल trimerization डोमेन और एक hexahistidine टैग युक्त है, साथ ही एनए के लिए के लिए वैक्टर, चित्रा (1) 1,10,11,22 वर्णित किया गया है और से अनुरोध किया जा सकता है लेखकों.
      व्याख्यात्मक नोट: एक trimerization डोमेन बिना व्यक्त हा ectodomains विशेष रूप से डंठल डोमेन, गठनात्मक उदासीन epitopes के नुकसान के लिए अग्रणी, गलत तरीके से जोड़ जाएगा. इसी तरह, एनए एंजाइमी समारोह उचित tetramerization पर निर्भर करता है.
    2. Bacmids की पीढ़ी
      एक baculovirus अभिव्यक्ति का उपयोग अनुसार DH10Bac बैक्टीरिया में हा और एनए जीन युक्त baculovirus स्थानांतरण plasmids रूपांतरणनिर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रणाली. पृथक और निर्माता के निर्देशों (चित्रा 2) के अनुसार एक Midiprep किट का उपयोग कर bacmids शुद्ध.
  2. प्रोटीन अभिव्यक्ति की पुनः संयोजक baculovirus और सत्यापन का बचाव
    व्याख्यात्मक नोट: निम्न चरणों का एक लामिना का प्रवाह हुड में aseptically प्रदर्शन किया जाना है. हा और एनए (या हित के किसी भी अन्य जीन) के लिए स्वतंत्र रूप से इस प्रक्रिया का प्रदर्शन. कीट कोशिकाओं आमतौर पर सीओ 2 के बिना 28 डिग्री सेल्सियस पर बड़े हो रहे हैं. इस प्रोटोकॉल के लिए Sf9 कोशिकाओं अन्यथा इंगित नहीं तो 10% FBS, 1% पेन Strep * और 0.1% Pluronic F68 समाधान, साथ पूरक पूर्ण TNM-एफ एच कीट सेल मीडिया में बड़े हो गए, और सप्ताह में दो बार 01:04 passaged हैं. उच्च पांच कोशिकाओं SFX सीरम मुक्त मीडिया में वृद्धि हुई है और दो बार एक सप्ताह 01:15 passaged हैं.
    * एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा प्रोटोकॉल भर में वैकल्पिक माना जाता है और प्रत्येक प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया प्रथाओं के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए.
    1. / 2 सेमी 2 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर 6 अच्छी तरह प्लेटें में Sf9 कीट कोशिकाओं की थाली और (सीओ 2) के बिना एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 20 मिनट के लिए बैठते हैं.
    2. मिक्स 2 ग्राम TNM-एफ एच मध्यम (सीरम मुक्त, 1% पेन Strep) के 100 μl साथ पुनः संयोजक bacmid की (conc. 0.5-2 ग्राम / उल). TNM-एफ एच मध्यम (सीरम मुक्त, पेन Strep) के 100 μl के साथ अभिकर्मक एजेंट के 6 μl मिलाएं. दो संस्करणों का मिश्रण धीरे मिश्रण और कमरे के तापमान (अभिकर्मक मिश्रण) पर 20 मिनट के लिए बैठते हैं. नियंत्रण के रूप में एक नकली अभिकर्मक (चित्रा 3) शामिल हैं.
    3. (कोशिकाओं अब थाली के लिए छड़ी होगी) और पेन Strep (1%) युक्त सीरम मुक्त TNM-एफ एच मध्यम 2 मिलीलीटर के साथ की जगह चढ़ाया Sf9 कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला निकालें. (कदम 1.2.2 से) अभिकर्मक मिश्रण की पूरी मात्रा में जोड़ें और 5 सेकंड के लिए सावधानी से 6 अच्छी तरह से थाली रॉक. 6 घंटा (चित्रा 3) के लिए सीओ 2 के बिना एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं.
    4. मीडिया वाई बदलेंवें ताजा पूर्ण TNM-एफ एच मीडिया (10% FBS, 1% पेन Strep और 0.1% Pluronic F68 युक्त). 6 दिन के लिए सीओ 2 के बिना एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं. एक खुर्दबीन के नीचे कभी कभी कोशिकाओं की जाँच करें. संक्रमित कोशिकाओं को आम तौर पर, ऑलराउंडर, बड़ा दिखाई नाभिक बढ़ा दिया है, और (चित्रा 4) को अलग करने के लिए शुरू करते हैं.
    5. कोशिकाओं और प्रोटीन अभिव्यक्ति की पुष्टि की फसल
      1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर centrifugation द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं 6 दिनों के बाद अभिकर्मक. सतह पर तैरनेवाला पुनः संयोजक baculovirus होता है - यह सही दूर काम शेयरों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, या वर्षों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
      2. प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच करने पीबीएस के 500 μl में छर्रों और resuspend इकट्ठा. (एक कम करने एजेंट युक्त) एसडीएस पृष्ठ लोड हो रहा है बफर के 50 μl के साथ निलंबन के 50 μl मिलाएं. एसडीएस पृष्ठ भागो और जीन अभिव्यक्ति की पुष्टि के लिए एक विरोधी hexahistidine एंटीबॉडी के साथ एक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करते हैं. नकली से कोशिकाओं में शामिलनकारात्मक नियंत्रण के रूप में अभिकर्मक (चित्रा 3).
    6. काम करने के शेयरों की तैयारी
      1. प्लेट 5 एक्स 10 5 Sf9 कोशिकाओं / एक T175 सेमी 2 फ्लास्क में 2 सेमी और 20 मिनट के लिए उन्हें डिश के लिए संलग्न करने की अनुमति के लिए बैठते हैं. TNM-एफ एच मीडिया 3% FBS (और 1% पेन Strep, 0.1% Pluronic F68) को रोकने के साथ पूरा TNM-एफ एच मीडिया की जगह.
      2. बचाव सतह पर तैरनेवाला के 100 μl के साथ कोशिकाओं को संक्रमित. 6 दिन के लिए सीओ 2 के बिना एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं और कोशिकाओं संक्रमित हो अगर कभी कभी जाँच (चरण 1.2.5 में वर्णित के रूप में.).
      3. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2,000 XG पर स्पिन और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा. यह अब अपने p2 के शेयर है. यह शेयर 4 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए p2 शेयर के 100 μl का उपयोग संक्रमण प्रक्रिया को दोहराएँ. परिणामस्वरूप स्टॉक पी 3 या 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत या प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है, जो काम कर स्टॉक, कहा जाता है. पी 3 स्टॉक आमतौर पर 10 में शामिल <समर्थन> 7 -10 9 पट्टिका इकाइयों / मिलीलीटर के गठन.

2. प्रोटीन अभिव्यक्ति और शोधन

व्याख्यात्मक नोट: Sf9 कोशिकाओं को बहुत अच्छी तरह से baculovirus के विकास का समर्थन. हालांकि, पुनः संयोजक प्रोटीन की बड़ी मात्रा में स्रावित करने के लिए उनकी क्षमता सीमित है. इसलिए हम secreted पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक और कीट सेल लाइन, उच्च पांच कोशिकाओं का उपयोग करें. इन कोशिकाओं को बहुत ही उच्च titers से 13 baculovirus प्रतिकृति समर्थन लेकिन उच्च स्रावी क्षमता नहीं है.

  1. उच्च पांच कोशिकाओं बढ़ रहा है
    T175 सेमी 2 बोतल में SFX कीट सेल संस्कृति माध्यम में उच्च पांच कोशिकाओं को विकसित. बीतने हर दूसरे दिन 01:03. एक 200 मिलीलीटर अभिव्यक्ति संस्कृति के लिए आप 5 मिला हुआ बोतल बढ़ने की जरूरत होगी.
  2. उच्च पांच कोशिकाओं कटाई और से संक्रमण
    1. अपने हाथ से बोतल दोहन से 5 T175 सेमी 2 बोतल से उच्च पांच कोशिकाओं को अलग. सेल suspe लीजिएnsion और 50 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब में स्थानांतरण.
    2. कमरे के तापमान पर 7 मिनट के लिए 1200 XG पर स्पिन. Decanting से सतह पर तैरनेवाला निकालें और पी 3 शेयर का 15 मिलीलीटर में उन्हें resuspending द्वारा छर्रों एकजुट हो जाएं.
    3. (चित्रा 5) का प्रवाह हुड में 15 मिनट के लिए बैठते हैं.
    4. एक स्वच्छ, बाँझ 1000 मिलीलीटर प्रकार के बरतन कुप्पी में HyClone SFX संस्कृति के माध्यम से 200 एमएल हस्तांतरण (autoclaving पहले एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बंद buffles बिना, पहले बैक्टीरियल संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल किया गया है नहीं होना चाहिए).
    5. हिलनेवाला फ्लास्क में P3/cell निलंबन स्थानांतरण. एक प्रकार के बरतन में बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी और हस्तांतरण कुप्पी के साथ सील. 72-96 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर 70 rpm पर हिला.
  3. उच्च पाँच सेल अभिव्यक्ति supernatants से पुनः संयोजक प्रोटीन कटाई
    1. 500 मिलीलीटर centrifugation बाल्टी में 72-96 घंटे के बाद संक्रमण हस्तांतरण संस्कृति supernatants. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 5500 XG पर स्पिन इस बीच में एक प्रकार के बरतन बोतल दोहरा आसुत जल के साथ 3x कुल्ला(DDH 2 हे).
    2. पीबीएस (एक 200 मिलीलीटर संस्कृति प्रति आवश्यक) का 45 मिलीलीटर के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित 3 मिलीलीटर नी राल घोल. अच्छी तरह हिला और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 3,000 XG पर स्पिन. पीबीएस छानना और गोली रखने के लिए. नी, राल गोली के साथ कीट सेल सतह पर तैरनेवाला मिक्स और पहले से ही rinsed प्रकार के बरतन बोतल में हस्तांतरण. (चित्रा 6) मिलाते हुए, 2-4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    3. एक समर्थन स्टैंड पर एक क्लैंप पर माउंट 10 मिलीलीटर polypropylene स्तंभ. दोनों टोपी निकालें और (कचरे) के माध्यम से प्रवाह को इकट्ठा करने के लिए स्तंभ के नीचे एक बीकर जगह है. शेखर बाहर प्रकार के बरतन कुप्पी लो और स्तंभ पर सतह पर तैरनेवाला / गारा मिश्रण हस्तांतरण शुरू करने के लिए, यह नी राल रख सकेंगे और केवल सतह पर तैरनेवाला के माध्यम से प्रवाह होगा. स्तंभ के ऊपर पूरी मात्रा (चित्रा 7) उत्तीर्ण.
    4. धोने बफर के 15 मिलीलीटर (50 मिमी ना 2 HCO 3, 300 मिमी NaCl, 20 मिमी imidazole, पीएच 8) के साथ राल 4x धो लें. सभी धोने बफर नाली हैंस्तंभ से और टोपी (कम पक्ष) के साथ बंद हुआ.
    5. क्षालन बफर के 2 मिलीलीटर (50 मिमी ना 2 HCO 3, 300 मिमी NaCl, 300 मिमी imidazole, पीएच 8) जोड़ें और 5 मिनट के लिए बैठते हैं. स्तंभ खोलें और eluate इकट्ठा. (क्षालन बफर के 8 एमएल की कुल के साथ) इस 3 बार दोहराएँ. (चित्रा 7) जब हिल प्रोटीन की उच्च सांद्रता शामिल है कि eluate आम तौर पर फोम से पता चलता है. जब भी संभव गीला बर्फ पर eluate रखें.
  4. बफर विनिमय और एकाग्रता
    1. Prespin 15 मिलीलीटर ultrafiltration centrifugation इकाइयों में 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 XG पर पीबीएस (पीएच 7.4-7.6) के साथ (हेक्टेयर / एनए के लिए 30 केडीए कट ऑफ लेकिन शुद्ध प्रोटीन आकार पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकते हैं). स्पिन स्तंभ पर के माध्यम से और लोड eluate प्रवाह त्यागें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 बाँझ, बर्फ ठंड पीबीएस के मिलीलीटर और 3,000 XG पर 60 मिनट के लिए स्पिन के साथ भरें
    2. फिर से निर्वहन प्रवाह, 15 बर्फ ठंड पीबीएस के मिलीलीटर और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 XG पर 60 मिनट के लिए स्पिन के साथ फिर से भरना इस प्रक्रिया को दोहराएंएक बार और Dure.
    3. अपकेंद्रित्र से बाहर स्पिन स्तंभ लो और बफर विमर्श ध्यान (आम तौर पर 200 μl) इकट्ठा. यह अत्यधिक पुनः संयोजक प्रोटीन ध्यान केंद्रित किया है. बाँझ बर्फ ठंड पीबीएस के 400 μl के साथ स्पिन स्तंभ कुल्ला और ध्यान केंद्रित करने के लिए इस जोड़ें. हर समय बर्फ पर ध्यान केंद्रित रखें.

3. विशेषता और गुणवत्ता नियंत्रण

  1. प्रोटीन एकाग्रता को मापने
    ध्यान की एक विभाज्य ले लो और अपनी पसंद के प्रोटीन मात्रा का ठहराव विधि का उपयोग कर यह उपाय. पीबीएस जोड़कर 1 मिलीग्राम / एमएल के लिए प्रोटीन एकाग्रता सेट और सेल्सियस -80 के लिए छोटे aliquots फ्रीज फ्रीज पिघलना चक्र प्रोटीन संरचना को नुकसान पहुँचा और एकत्रीकरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
  2. एसडीएस पृष्ठ और Coomassie धुंधला
    एक एसडीएस पृष्ठ पर अपने प्रोटीन के 500 एनजी चलाने और एक Coomassie धुंधला प्रदर्शन करते हैं. तेज और सुविधाजनक धुंधला के लिए एक माइक्रोवेव प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में Coomassie अभिकर्मक का उपयोग करें. हा प्रोटीन आमतौर पर 64 पर दिखाई देते हैंकेडीए एनए प्रोटीन लगभग 56 केडीए (आंकड़े 8A और बी) के एक आकार पर चलाना चाहिए जबकि. वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके आप किसी भी गिरावट के उत्पादों को देख नहीं करना चाहिए. गिरावट आती है तो उसे आमतौर पर अभिव्यक्ति के दौरान खमीर / कवक संदूषण का एक संकेत है. इस मामले में प्रक्रिया दोहराने और बाँझ सब कुछ रखना सुनिश्चित करें.
  3. पश्चिमी धब्बा / एलिसा
    प्रोटीन की पहचान सत्यापित करने के लिए हम एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ एक पश्चिमी धब्बा या एलिसा परख करने के लिए क्या सलाह देते हैं. आदर्श रूप में, एलिसा assays गठनात्मक epitopes (जैसे विरोधी हा डंठल एंटीबॉडी 1) को बांधता है कि एक एंटीबॉडी के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. इस तरह के एक एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटीन की सही तह (चित्रा 8C) की पुष्टि की जा सकती है.
  4. गतिविधि NA मापने
    वायरल एनए की सही तह भी NA गतिविधि को मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एनए * स्टार परख (सिर्फ उपयोगकर्ता दिशा निर्देशों का पालन) का उपयोग करते हुए इस परीक्षण को करने के लिए सलाह देते हैं.

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Representative Results

A/Shanghai/1/13 और A/Anhui/1/13 से हा अणुओं के बारे में 20 मिलीग्राम / एल संस्कृति की पैदावार के साथ अच्छी तरह से व्यक्त किया. दोनों उपभेदों के एनए अणुओं A/Shanghai/1/13 के लिए 0.2 मिलीग्राम / एल संस्कृति से A/Anhui/1/13 के लिए 0.7 मिलीग्राम / एल से लेकर मध्यम अभिव्यक्ति के स्तर से पता चला है. सभी चार प्रोटीन की तैयारी अभिव्यक्ति के स्तर से समझाया जा सकता है, जो Nas से अधिक शुद्धता की जा रही है साथ (आंकड़े 8A और ख) कोई दोष करने के लिए बहुत कुछ किया था. A/Shanghai/1/13 हा आगे मोटे तौर पर उदासीन डंठल प्रतिक्रियाशील मानव एमएबी CR9114 23 के साथ एलिसा का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था. इस एमएबी डंठल डोमेन में एक संवेदनशील गठनात्मक मिलान करने के लिए बांधता है और इस क्षेत्र की सही तह के लिए एक जांच के रूप में प्रयोग किया जाता है. एंटीबॉडी हा वास्तव में (चित्रा 8C) सही ढंग से जोड़ रहा है कि आत्मविश्वास देता है जो बाध्यकारी अच्छा दिखाता है. विरोधी H7 माउस पॉलीक्लोनल सीरम के साथ एक दूसरे एलिसा (H7 मूल के रूप में प्राप्त प्रोटीन की पहचान की पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन किया थाचित्रा 8D).

चित्रा 1
चित्रा 1. हा और एनए अभिव्यक्ति निर्माणों के योजनाबद्ध. अभिव्यक्ति हा (ए) हा ectodomain, एक थ्रोम्बिन दरार साइट, एक टी -4 trimerization डोमेन और एक hexahistidine टैग द्वारा पीछा एक एन टर्मिनल संकेत पेप्टाइड शामिल करने के लिए निर्माण. एनए अभिव्यक्ति का निर्माण (बी) एक hexahistidine टैग, एक vasodilator उत्तेजक phosphoprotein (वीएएसपी) tetramerization डोमेन और एनए ectodomain इसके बाद एन टर्मिनल संकेत पेप्टाइड होता. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा .2. Bacmid generat के योजनाआयन (चरण 1.1.2 में वर्णित है). हा या NA जीन युक्त एक baculovirus हस्तांतरण वेक्टर DH10Bac बैक्टीरिया में तब्दील हो जाता है. इन बैक्टीरिया ले कि baculovirus जीनोम में पुनर्संयोजन चयन प्लेटों पर एक सफेद कालोनी phenotype पैदा करता है. एक सफेद कॉलोनी उठाया और restreaked है. Restreaked थाली में से एक भी कॉलोनी एक midiprep संस्कृति टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. Baculovirus बचाव और काम स्टॉक पीढ़ी की योजना (चरणों में वर्णित के रूप में 1.2.1-6). संयोजक bacmid और अभिकर्मक अभिकर्मक सीरम मुक्त TNM-एफ एच मध्यम में पतला कर रहे हैं. दो समाधान, संयुक्त रहे हैं मिश्रण 20 मिनट के लिए incubated है और फिर Sf9 कोशिकाओं पर स्थानांतरित कर दिया. छह घंटे के बाद अभिकर्मक अभिकर्मक मीडिया पूर्ण TNM-एफ एच मीडिया की जगह है. छह दिनों सतह पर तैरनेवाला काटा जाता है अभिकर्मक के बाद और सेल गोली गुदा हैपुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए yzed.

चित्रा 4
चित्रा 4. (ए) में निरोग और संक्रमित Sf9 कोशिकाओं. Sf9 कोशिकाओं को स्वस्थ और असंक्रमित हैं. वे आंशिक रूप से बहुरूपी और अपेक्षाकृत छोटे देखो, संस्कृति पकवान से जुड़े होते हैं. (बी) में सेल, baculovirus से संक्रमित संस्कृति पकवान से अलग, बड़े और गोल कर रहे हैं और नाभिक बढ़े हुए कर रहे हैं. नाभिक भी एक बारीक उपस्थिति को दर्शाता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. (2.2 कदम के रूप में वर्णित, शेयर काम कर रहे). उच्च पाँच कोशिकाओं के साथ पांच मिला हुआ T175 बोतल कम गति centrifugation द्वारा काटा और पी 3 baculovirus शेयर की 15 मिलीलीटर के साथ संयुक्त कर रहे हैं पुनः संयोजक baculovirus साथ उच्च पांच कोशिकाओं के संक्रमण. में से 15 मिनट के बादसेल / वायरस मिश्रण SFX मीडिया की 200 मिलीलीटर के साथ 1,000 मिलीलीटर प्रकार के बरतन बोतल में स्थानांतरित कर रहा है cubation.

चित्रा 6
चित्रा 6. नी NTA राल (2.3 कदम में वर्णित है) के साथ सेल सतह पर तैरनेवाला 72-96 घंटे के बाद संक्रमण और ऊष्मायन की फसल. संक्रमित कोशिका निलंबन कम गति centrifugation द्वारा काटा जाता है. संस्कृति supernatants पीबीएस equilibrated नी राल के साथ मिलाया जाता है और मिलाते हुए 2-4 घंटे के लिए incubated हैं.

चित्रा 7
चित्रा 7. शुद्धिकरण प्रक्रिया (2.3 और 2.4 में वर्णित है) और गुणवत्ता नियंत्रण (कदम 3.1.1-4 में वर्णित है). ऊष्मायन के बाद सतह पर तैरनेवाला / राल मिश्रण के सभी polypropylene स्तंभों पर लोड किया जाता है. राल स्तंभों द्वारा बनाए रखा है और उसके बाद धोने buf के साथ चार बार धोया जाता हैfer और पुनः संयोजक प्रोटीन 2 मिलीलीटर चरणों में लागू किया क्षालन बफर के 8 मिलीग्राम के साथ eluted है. eluate तो बफर विमर्श किया और एक ultrafiltration स्पिन स्तंभ के साथ केंद्रित, aliquoted और जमे हुए है. गुणवत्ता नियंत्रण assays एसडीएस पृष्ठ, वेस्टर्न ब्लाट, एलिसा और पुनः संयोजक एनए के एनए गतिविधि की माप शामिल हैं.

8 चित्रा
चित्रा 8. A/Anhui/1/13 और A/Shanghai/1/13 के प्रतिनिधि परिणाम. हा (ए) और एनए (बी) प्रोटीन एसडीएस पृष्ठ और Coomassie धुंधला उपयोग विश्लेषण किया गया. A/Shanghai/1/13 हेक्टेयर के संरचनात्मक अखंडता एक संवेदनशील गठनात्मक मिलान (सी) को बांधता है कि मोटे तौर पर उदासीन मानव डंठल प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी CR9114 उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था. एक ही हा की पहचान एक पॉलीक्लोनल विरोधी H7 माउस सीरम (डी) द्वारा पुष्टि की गई.

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Discussion

Baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग कर कीट कोशिकाओं में इन्फ्लूएंजा वायरस हा और एनए प्रोटीन की अभिव्यक्ति सीधे आगे आम तौर पर है, पर विचार करने के लिए कई महत्वपूर्ण बातें हैं. शुरूआत में बताया यह हा और एनए के ectodomains क्रमशः, trimerization या tetramerization डोमेन के साथ फ्यूजन में व्यक्त कर रहे हैं कि, महत्वपूर्ण है. इन डोमेन आमतौर पर केवल ectodomain व्यक्त किया है यदि मौजूद नहीं है जो transmembrane डोमेन, द्वारा सहायता प्रदान की अणुओं की सही तह सुनिश्चित करते हैं. उदाहरण के लिए, एक trimerization डोमेन बिना हा ectodomain की अभिव्यक्ति oligomerization और डंठल डोमेन 1 में महत्वपूर्ण उदासीन epitopes की अस्थिरता की ओर जाता है. इसके अलावा, प्रोटीन की स्थिरता में कमी आई और कीट सेल और baculovirus proteases से गिरावट होती है. trimerization या tetramerization डोमेन के चुनाव में कम महत्वपूर्ण है, लेकर उनमें से एक नंबर leucine जिपर डोमेन से 22टी -4 फेज foldons को 11 अब तक परीक्षण किया गया है और सभी संतोषजनक परिणाम दिखाया. यह multibasic दरार साइटों वे उच्च रोगजनक H5N1 24 या H7N7 25 वियोजन (लेकिन नहीं H7N9 में) में होने के रूप में वे में हर समय मौजूद हैं, जो proteases तरह furin से चिपके रहते हैं क्योंकि अभिव्यक्ति से पहले हटाया जाना है कि मन में रखने के लिए महत्वपूर्ण है baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली 1,12.

Degradational उत्पादों के लिए अन्य संभावित कारण खमीर या मोल्ड साथ संदूषण है. इस रूप में जल्दी के दौरान काम कर रहे शेयर पीढ़ी के रूप में भी हो सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर शेयरों की भंडारण के दौरान किसी का ध्यान नहीं जा सकते कई yeasts और molds इष्टतम विकास के लिए 20-30 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान पसंद करते हैं और वास्तव में स्तनधारी कोशिकाओं के लिए आम संस्कृति तापमान है, जो 37 डिग्री सेल्सियस, पर हिचकते हैं. सेल संस्कृति में उपयोग किया जाता है कि सबसे अधिक एंटीबायोटिक दवाओं खमीर और मोल्ड, और कीट सेल संस्कृति की तरह यूकेरियोटिक जीवों के खिलाफ प्रभावी नहीं हैं performe है अतिरिक्त ध्यान संस्कृतियों का aseptically से निपटने के संदर्भ में लिया जाना चाहिए इन कीटाणुओं का इष्टतम विकास की स्थिति में डी. कीट कोशिकाओं overgrowing और acidifying के अलावा मीडिया, नए नए साँचे और yeasts कई घुलनशील proteases व्यक्त करते हैं और इसलिए पूरी तरह से पुनः संयोजक प्रोटीन नीचा कर सकते हैं.

कभी कभी होता है एक समस्या क्षालन बफर में तेज़ी है. यह बहुत ही कम है और कम या ज्यादा तनाव विशिष्ट (जैसे A/Vietnam/1203/04 H5 हा वेग के लिए जाता है) में देखा जाता है, लेकिन पीबीएस के लिए जल्दी और पूरी बफर विनिमय से रोका जा सकता है. Imidazole युक्त क्षालन बफर में प्रोटीन की भंडारण की सिफारिश नहीं है. -80 डिग्री सेल्सियस तक aliquots की ठंड के लिए फसल से शोधन प्रक्रिया -80 डिग्री सेल्सियस के अलावा और तापमान में शुद्ध प्रोटीन का एक काम कर दिन और भंडारण से बचा जाना चाहिए के भीतर किया जाना चाहिए. इसके अलावा, दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र कुछ epitopes 1 की स्थिरता पर नकारात्मक प्रभाव सिद्ध किया गया है.

_content "> पैदावार 0.2-30 मिलीग्राम / एल संस्कृति के दायरे में रहने की उम्मीद की जानी चाहिए. NAS निचले स्तर पर व्यक्त करते हैं, जबकि कई ऊपरी सीमा में व्यक्त किया है. इसके अलावा, के लिए अभिव्यक्ति के स्तर संख्या के साथ विपरीत रूप सहसंबंधी प्रतीत गया है ग्लाइकोसिलेशन साइटों की. गया है मानव मौसमी H3N2 और से मौसमी prepandemic H1N1 के सबसे उच्च स्तर अभिव्यक्ति है एवियन इन्फ्लूएंजा वायरस की उत्पत्ति की गई है जबकि आमतौर पर, कम अभिव्यक्ति के स्तर दिखा आइसोलेट्स. अभिव्यक्ति में सुधार करने के लिए यह कुप्पी में सेल घनत्व बढ़ाने के लिए या कोशिश करने की सिफारिश की है कम उपयोग करने के लिए या अभिव्यक्ति प्रति अधिक काम कर रहे शेयर. 10 गुना वृद्धि हुई है या काम कर स्टॉक की कमी अभिव्यक्ति के स्तर पर सकारात्मक प्रभाव डाल सकता है. अभिव्यक्ति के स्तर पर प्रभावित कर सकता है कि एक और पहलू संक्रमण और फसल के बीच का समय है. 96 घंटा सबसे अधिक है और के लिए आदर्श होते हैं NAS लेकिन कम ऊष्मायन बार वास्तव में कुछ प्रोटीन की पैदावार में वृद्धि हो सकती.

कीट कोशिकाओं लगभग एक स्तनपायी में posttranslational संशोधनों प्रदर्शन करने में सक्षम हैंN-तरह तरह और स्तनधारी कोशिकाओं (लेकिन अधिक पैदावार के उत्पादन) के रूप में इसी तरह की क्षमता के साथ बहुत जटिल प्रोटीन संरचनाओं गुना करने में सक्षम हैं. ग्लाइकोसिलेशन के संदर्भ में, वे स्तनधारी कोशिकाओं से थोड़ा अलग है और सियालिक एसिड संशोधन 19 की कमी है कि ज्यादातर paucimannosidic एन ग्लाइकान है कि सुविधाओं के एक पैटर्न दिखा रहे हैं. हालांकि, (टर्मिनल सियालिक एसिड सहित) ग्लाइकोसिलेशन जैसे स्तनधारी निर्माण करने के लिए संशोधित किया गया है कि कीट सेल लाइनों 14 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं.

हा और एनए - baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली पुनः संयोजक इन्फ्लूएंजा सतह ग्लाइकोप्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक अत्यंत उपयोगी उपकरण है. ये पुनः संयोजक प्रोटीन कई प्रतिरक्षाविज्ञानी और जैव रासायनिक assays के लिए, साथ ही टीके के प्रतिजन सामग्री के मानकीकरण के लिए और पशु मॉडल में टीकाकरण के प्रयोगों के लिए प्रतिजन के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. Trimerizati साथ फ्रेम में व्यक्त अगर हा और एनए पूर्ण जैविक समारोह और सही तह प्रदर्शन baculovirus व्यक्तक्रमशः और tetramerization डोमेन पर. यह अलग से उन्हें बैक्टीरियल गैर ग्लाइकोसिलेटेड हैं और डंठल डोमेन कार्यात्मक epitopes कि कमी की है व्यक्त की है. इसके अलावा, baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली प्रदर्शन स्तनधारी सेल सिस्टम 26 और हैंडलिंग और बढ़ाने से काफी अधिक प्रोटीन पैदावार आसान कर रहे हैं. संक्षेप में हम पुनः संयोजक इन्फ्लूएंजा वायरस हा और एनए अणुओं की बड़ी मात्रा में व्यक्त करने के लिए एक आसान और कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम मोनोक्लोनल एंटीबॉडी CR9114 के लिए पैट्रिक सी. विल्सन को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी मूल A/Anhui/1/13 plasmids के लिए जेनिफर Debeauchamp और रिचर्ड वेबी धन्यवाद. इस काम के लिए आंशिक समर्थन एलर्जी के लिए राष्ट्रीय संस्थान द्वारा प्रदान की गई और संक्रामक कार्यक्रम परियोजना अनुदान AI097092-01A1 और CEIRS (इन्फ्लूएंजा अनुसंधान और निगरानी के लिए उत्कृष्टता के केंद्र, HHSN26620070010C) रोग से वित्त पोषित किया गया था. FK ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (FWF) से एक इरविन श्रोडिंगर फैलोशिप (जे 3232) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Bac-to-Bac Baculovirus expression system Invitrogen 10359-016 Follow manufacturer's instructions
TNM-FH insect medium Gemini Bioproducts 600-311
HyClone SFX-Insect Thermo Fisher SH30278.02
Cellfectin II Reagent Invitrogen P/N58760
Pluronic F68 Sigma 1000702664
SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060
Ni-NTA Agarose Qiagen 1018240
Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K Millipore UFC902024
Pen Strep Gibco 15140-122
Polypropylene Columns (5 ml) Qiagen 34964
Max efficiency DH10Bac bacteria Invitrogen 10361-012
PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit Invitrogen K210015
Imidazole Sigma-Aldrich I2399-100G for elution and wash buffers
Sf9 cells ATCC CRL-1711
High Five cells Invitrogen B85502

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References

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Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J. Vis. Exp. (81), e51112, doi:10.3791/51112 (2013).

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