Summary
Aqui nós descrevemos uma forma de expressar antígenos de superfície do vírus da influenza corretamente dobradas e funcionais decorrentes do novo vírus H7N9 chinês em células de insetos. A técnica pode ser adaptado para expressar ectodomínios de quaisquer proteínas de superfície virais ou celulares.
Abstract
O sistema de expressão de baculovírus é uma ferramenta poderosa para a expressão de proteínas recombinantes. Aqui vamos usá-lo para produzir versões dobradas corretamente e glicosiladas da vírus influenza A glicoproteínas da superfície - a hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). Como um exemplo, nós escolhemos as proteínas HA e NA expressas pelo novo vírus H7N9, que surgiu recentemente na China. No entanto, o protocolo pode ser facilmente adaptado para proteínas HA e NA expressas por qualquer outro vírus influenza A e estirpes de vírus B. Proteínas recombinantes HA (rHA) e NA (ARN) são reagentes importantes para ensaios imunológicos, tais como ELISPOT e ELISA, e também são largamente utilizados para a padronização da vacina, a descoberta de anticorpos, o isolamento e caracterização. Além disso, as moléculas de NA recombinante pode ser usada para o rastreio de inibidores de moléculas pequenas e que são úteis para a caracterização da actividade enzimática do NA, bem como a sua sensibilidade para os antivirais. Proteínas HA recombinantes também são being testado como vacinas experimentais em modelos animais, e de uma vacina baseada na HA recombinante foi recentemente licenciada pela FDA para utilização em seres humanos. O método que descrevemos aqui para produzir essas moléculas é direto e pode facilitar a pesquisa nos laboratórios da gripe, uma vez que permite a produção de grandes quantidades de proteínas rápidas e de baixo custo. Embora aqui se concentrar em glicoproteínas da superfície do vírus da gripe, este método também pode ser usado para produzir outras proteínas de superfície virais e celulares.
Introduction
Como uma primeira resposta ao recente surgimento do romance H7N9 estirpe do vírus da gripe na China, adquirimos plasmídeos que transportam as seqüências genômicas para a hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) genes dos dois primeiros isolados. Usando estes plasmídeos fomos capazes de construir rapidamente os vectores de expressão de baculovírus recombinante para a produção de HA e NA em células de insetos. Este sistema de expressão é bem estabelecida em nosso laboratório e provou crucial para muitos dos nossos projectos de investigação em curso 1-8. Células de insetos são capazes de dobrar corretamente e após a tradução modificar proteínas complexas. Essas modificações incluem a glicosilação N-ligada, o que é importante para muitas glicoproteínas virais. Como tal, não é surpreendente que o sistema de baculovirus é bem estabelecida para a expressão de antigénios de superfície de vírus da gripe. De facto, muitas das estruturas cristalinas de HA e de NA foram resolvidos utilizando células de insecto expressaram proteínas 9-11. Outra vantagem dosistema encontra-se em seus rendimentos de alta proteína confiáveis de até 30 mg de HA / L de cultura de células (com base na nossa experiência com mais de 50 proteínas diferentes de HA) - uma conseqüência da infecção pelo vírus da expressão expulsos do forte promotor da poliedrina.
A remoção do domínio transmembranar e endodomínio de proteínas HA e NA permite a expressão de versões secretável, solúveis das proteínas e, assim, facilita muito o processo de purificação. Além disso, estes ectodomínios hexahistidina são marcados e podem, portanto, ser purificado usando a cromatografia de afinidade usando Ni 2 +-resina. Os domínios transmembranares de proteínas HA e NA contribuir para homotrímero e formação homotetrâmero, respectivamente. A fim de preservar estes oligomerizations, que adiciona um domínio de trimerização C-terminal para a HA-, e um domínio N-terminal de tetramerização à AN construções (Figura 1). Temos mostrado de forma conclusiva que um tal domínio de trimerização estabiliza funcional, conserved epítopos conformacionais na haste do domínio de HA 1. O tetramerização correta do NA também pode contribuir para corrigir dobrável e função NA 10. Seqüências e vetores de transferência de baculovírus abrigando trimerização ou tetramerização domínios podem ser solicitadas aos autores ou de outros laboratórios no campo, 9,10,12.
Um outro problema importante para a expressão de proteínas secretadas em células de insectos é a escolha da linha de células para a direita. Enquanto Spodoptera frugiperda derivadas de células Sf9 suporte à replicação de baculovírus muito bem e são geralmente utilizados para resgate e propagação de vírus, eles têm a capacidade de secretar grandes quantidades de proteína limitado. Trichoplusia ni derivado BTI-TN-5B1-4 células (vulgarmente conhecido como High Five) têm uma capacidade maior secreção e são a linha de células de escolha para a expressão neste protocolo 13,14. Além disso, é útil para reduzir ou até mesmo eliminar soro fetal bovino (FBS) a partir de culturas de expressão. Nós, portanto, usar a mídia com reduzida (3%) conteúdo FBS para o cultivo das ações de trabalho do vírus, e realizar a expressão da proteína em meio livre de soro.
Proteínas HA e NA recombinantes que são usados para muitas técnicas imunológicas. Talvez o mais comum é em ensaios de ELISA para medir a soroconversão após a vacinação em humanos ou animais 4,6,7,15. HAs e AEs são também utilizados em ensaios ELISPOT de ambas as moléculas estimuladoras e reagentes de detecção de células secretoras de anticorpos 16. A sua utilização como iscas moleculares permite classificar especificamente para plasmablasts ou outros tipos de células-B, que podem então ser utilizados para isolar os anticorpos monoclonais (terapêutico) (mAbs). Moléculas de HA e NA recombinantes que são posteriormente usados para a caracterização destes mAbs 8. Outros exemplos incluem o estudo da estabilidade do pH ou especificidade do receptor de expressou por diferentes isolados de vírus, ou quantitativamente avaliar enzimática NA específicaactividade ou resistência a inibidores. Por outro lado, recombinante, purificada de HA pode ser utilizada para padronizar o conteúdo de HA de vacinas inactivadas do vírus da gripe.
Importante, rHA (e até certo ponto NA) candidatos a vacinas estão sendo testadas em modelos animais e ensaios clínicos em humanos com um candidato a vacina que está sendo licenciada pelo FDA em 2013 2,17-19. A vantagem destes novos vacinas é de que, devido à natureza recombinante destas proteínas, o processo de trabalho intensivo de geração de vírus de crescimento elevadas reassortant poderia ser evitado. Talvez ainda mais relevante é o fato de que seu rendimento HA é alto e reproduzível de estirpe para estirpe. Além disso, uma vez que essas vacinas são produzidas em um sistema de livre-ovo, eles não contêm contaminantes de proteínas que são problemáticos para indivíduos com alergias ao ovo.
Aqui nós escolhemos para expressar as proteínas HA e NA de dois isolados do romance chinês do vírus da gripe H7N9, A / Anhui/1/13 e A/Shanghai/1/13 20,21. Estes são exemplos oportunos, mas o protocolo descrito pode ser usado para a expressão de qualquer vírus influenza A e B proteínas HA ou NA e pode ser adaptado para expressar quaisquer outras proteínas virais ou celulares segregados. Proteínas transmembranares triméricos ou tetraméricos pode ser clonado em cassetes de expressão utilizados para HA e NA, respectivamente. No entanto, as proteínas celulares secretados mais solúveis, como interferons, por exemplo, não precisa de um domínio adicional para a estabilização e pode ser expresso apenas com uma marca de hexa-histidina C-terminal.
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Protocol
1. Geração de Baculovirus Recombinante
- A clonagem em baculovírus transferência plasmídeos
- Clone H7 HA e NA N9 ectodomínio (ou qualquer outro gene de HA ou NA), em plasmídeos de transferência pFastBac modificados (ver introdução). Vectores de HA contendo um domínio de trimerização C-terminal e uma etiqueta de hexa-histidina, assim como para NA contendo um domínio N-terminal de tetramerização e tag hexa-histidina, foram descritos 1,10,11,22 (Figura 1) e pode ser pedido a partir de os autores.
Nota explicativa: ectodomínios HA expressas sem um domínio de trimerização vai ser dobrado de forma incorrecta, levando à perda de epítopos de neutralização conformacionais, em especial no domínio do talo. Da mesma forma, a função enzimática NA invoca tetramerização adequada. - Geração de bacmids
Transformação de transferência plasmídeos de baculovírus contendo genes HA e NA nas bactérias DH10Bac acordo com uma expressão de baculovírussistema de acordo com as instruções do fabricante. Isolar e purificar bacmids usando um kit Midiprep de acordo com as instruções do fabricante (Figura 2).
- Clone H7 HA e NA N9 ectodomínio (ou qualquer outro gene de HA ou NA), em plasmídeos de transferência pFastBac modificados (ver introdução). Vectores de HA contendo um domínio de trimerização C-terminal e uma etiqueta de hexa-histidina, assim como para NA contendo um domínio N-terminal de tetramerização e tag hexa-histidina, foram descritos 1,10,11,22 (Figura 1) e pode ser pedido a partir de os autores.
- Resgate de baculovírus recombinante e verificação da expressão de proteínas
Nota explicativa: Os seguintes passos têm de ser realizados assepticamente numa câmara de fluxo laminar. Execute este procedimento de forma independente para HA e NA (ou qualquer outro gene de interesse). As células de insecto são normalmente cultivadas a 28 ° C, sem CO2. Células Sf9 para este protocolo são cultivadas em meios completos de células de insecto TNM-FH suplementado com 10% FBS, 1% de Pen-Strep * e solução Pluronic F68 a 0,1%, se não for indicado de outra forma, e passadas a 1:04 duas vezes por semana. High Five de células são cultivadas em meio de soro livre SFX 1:15 e passadas duas vezes por semana.
* A adição de antibióticos deve ser considerada opcional ao longo do protocolo e ajustado de acordo com as práticas utilizadas em cada laboratório.- Placa de células de insecto Sf9 em placas de 6 poços a uma densidade de 2 x 10 5 células / cm 2 e deixar repousar durante 20 minutos, num incubador de 28 ° C (sem CO2).
- Misture 2 mg (concentração de 0,5-2 mg / ul) de bacmídeo recombinante com 100 l de meio TNM-FH (sem soro, 1% Pen-Strep). Misture 6 l de agente de transfecção com 100 l de meio TNM-FH (soro livre, Pen-Strep). Combine os dois volumes, misture delicadamente e deixe descansar por 20 minutos em temperatura ambiente (mistura de transfecção). Incluir um pseudo-transfecção como controlo (Figura 3).
- Remover o sobrenadante a partir de células Sf9 embutidas (células irá agora ficar com a placa) e substitua com 2 ml de meio isento de soro TNM-FH contendo Pen-Strep (1%). Adicionar o volume total da mistura de transfecção (a partir do passo 1.2.2) e agitar a placa de 6 poços cuidadosamente durante 5 segundos. Incubar numa incubadora de 28 ° C, sem CO 2 durante 6 horas (Figura 3).
- Substitua wi mídiacompletas mídia TNM-FH fresco th (contendo 10% de FBS, 1% de Pen-Strep e 0,1% de Pluronic F68). Incubar numa incubadora de 28 ° C, sem CO 2 durante 6 dias. Verifique ocasionalmente células sob um microscópio. As células infectadas aparecem geralmente maior, mais redondo, ampliaram núcleos, e começar a separar (Figura 4).
- Colheita das células e a confirmação da expressão da proteína
- Colheita de células 6 dias após a transfecção por centrifugação a 2000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. O sobrenadante contém o baculovirus recombinante - o que irá ser utilizado para gerar stocks de trabalho imediatamente, ou pode ser armazenado a 4 ° C durante anos.
- Para verificar a expressão da proteína coletar pelotas e ressuspender em 500 mL de PBS. Misturar 50 ml da suspensão com 50 mL de tampão de carga de SDS-PAGE (contendo um agente de redução). Executar SDS-PAGE e efectuar uma análise de Western blot com um anticorpo anti-hexa-histidina para confirmar a expressão do gene. Incluir células do simuladotransfecção como controlos negativos (Figura 3).
- Elaboração de ações de trabalho
- Placa 5 x 10 5 células Sf9 / cm 2 em um frasco T175 cm 2 e deixe descansar por 20 min permitir que eles atribuem ao prato. Substitua completo mídia TNM-FH com a mídia TNM-FH contendo 3% FBS (e 1% Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68).
- Infectar as células com 100 ul do sobrenadante de resgate. Incubar numa incubadora de 28 ° C, sem CO 2, durante 6 dias e, ocasionalmente, se vá obter células infectadas (tal como descrito no passo 1.2.5.).
- Gire a 2.000 xg à temperatura ambiente durante 5 minutos e recolher o sobrenadante. Este é agora o seu estoque P2. Este material pode ser armazenado indefinidamente a 4 ° C. Repita o procedimento de infecção usando 100 mL do estoque P2 para infectar as células. O material resultante é denominada P3 ou estoque de trabalho, que pode ser armazenado a 4 ° C ou utilizado directamente para a expressão da proteína. O estoque P3 geralmente contém 10 <sup> 7 a 10 9 unidades formadoras de placas / ml.
2. Protein Expression and Purification
Nota explicativa: células Sf9 suportar o crescimento de baculovirus muito bem. No entanto, a sua capacidade para segregar grandes quantidades de proteína recombinante é limitada. Assim, utilizamos uma outra linha de células de insectos, células de High Five, para a expressão de proteínas recombinantes segregadas. Estas células não suportam a replicação de baculovírus para muito altos títulos 13, mas têm alta capacidade secretora.
- Crescendo High Five células
Crescer High Five células em meio de cultura celular SFX inseto em T175 cm 2 frascos. Passagem a cada dois dias 01:03. Para uma cultura de 200 ml expressão que você vai precisar para crescer 5 frascos confluentes. - Colheita e infectar células High Five
- Retire High Five células de 5 cm 2 frascos T175 tocando os frascos com a mão. Recolher o suspe celularnsion e transferir para tubos de 50 ml de centrifugação.
- Gire a 1.200 xg por 7 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante por decantação e unir as pelotas por ressuspensão em 15 ml de estoque P3.
- Deixar repousar durante 15 minutos na câmara de fluxo (Figura 5).
- Transferir 200 ml de Hyclone SFX meio de cultura em um, estéril 1000 ml frasco agitador limpo (sem Buffles, selado com folha de alumínio antes da autoclavagem, não deveria ter sido usado para culturas bacterianas antes).
- Transferir a suspensão P3/cell para o balão agitador. Seal com folha de alumínio estéril e frasco de transferência num shaker. Agitar a 70 rpm a 28 ° C durante 72-96 horas.
- Colhendo proteína recombinante a partir de cinco altos sobrenadantes expressão celular
- 72-96 hr de transferência de sobrenadante de cultura de infecção pós em 500 ml baldes centrifugação. Gire a 5.500 xg por 20 min a 4 ° C. Entretanto lave os frascos shaker 3x com água bidestilada(DdH2O).
- Transferência de 3 ml de resina Ni-lama para um tubo de 50 ml com 45 ml de PBS (uma necessária por 200 ml de cultura). Agitar bem e girar a 3000 xg à temperatura ambiente durante 10 min. Decantar o PBS e manter o sedimento. Mistura-se o sobrenadante de células de insecto com o sedimento de Ni-resina e transferir para os frascos de agitação já lavadas. Incubar a 4 ° C durante 2-4 horas, enquanto se agita (Figura 6).
- Monte 10 ml coluna de polipropileno em um grampo em um suporte de apoio. Remova as duas tampas e coloque um copo abaixo da coluna para coletar o fluxo através (resíduos). Tomar o agitador rotativo para fora do agitador e começar a transferir a mistura do sobrenadante / pasta na coluna, que irá reter o Ni-resina e apenas o sobrenadante irá fluir. Passar todo o volume ao longo da coluna (Figura 7).
- Lavar as resinas com 4x 15 ml de tampão de lavagem (50 mM de Na 2 HCO 3, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8). Vamos todos a fuga tampão de lavagema partir da coluna e fechá-lo com a tampa (lado inferior).
- Adicionar 2 ml de tampão de eluição (50 mM de Na 2 HCO 3, NaCl 300 mM, 300 mM de imidazol, pH 8) e deixar repousar durante 5 min. Abra coluna e recolher o eluído. Repetir este procedimento mais três vezes (com um total de 8 ml de tampão de eluição). O eluato que contém elevadas concentrações de proteína apresenta tipicamente espuma quando agitadas (Figura 7). Mantenha eluato no gelo molhado sempre que possível.
- Troca e concentração do tampão
- Prespin 15 ml unidades de centrifugação (de ultrafiltração de 30 kDa de corte para HA / NA, mas pode variar dependendo do tamanho da proteína purificada) com PBS (pH 7,4-7,6) a 3000 xg, a 4 ° C durante 20 min. Descartar fluir através de e carga eluído na coluna rodada. Encha-se com 5 ml de estéril, gelada PBS e centrifugação por 60 minutos a 3.000 xg, a 4 ° C.
- Fluxo de descarga através de novo, encha com 15 ml de PBS gelado e rotação por 60 minutos a 3.000 xg, a 4 ° C. Repita este procedimentoDure mais uma vez.
- Tome a coluna girar fora da centrífuga e recolher o tampão trocado concentrado (tipicamente 200 mL). Isto é altamente concentrada de proteína recombinante. Lavar a coluna de spin com 400 l de estéril gelada PBS e adicione ao concentrado. Manter o concentrado em gelo em todos os momentos.
3. Caracterização e Controle de Qualidade
- Medição de concentração de proteínas
Tome uma alíquota do concentrado e medi-la usando o método de quantificação de proteínas de escolha. Definir a concentração de proteína a 1 mg / ml por adição de PBS e congelar pequenas alíquotas a -80 ° C. Ciclos de descongelamento Congelar prejudicar a estrutura da proteína e pode levar à agregação. - SDS-PAGE e coloração com Coomassie
Executar 500 ng de sua proteína numa SDS-PAGE e efectuar uma coloração com Coomassie. Para a coloração rápida e conveniente utilizar o reagente de Coomassie, em combinação com um protocolo de micro-ondas. Proteínas HA normalmente aparecem em 64kDa enquanto que as proteínas de NA devem funcionar com um tamanho de cerca de 56 kDa (Figuras 8A e B). Usando o protocolo descrito você não deve ver qualquer produto de degradação. Se ocorrer a degradação é geralmente um sinal de contaminação por fungos / fúngico durante a expressão. Neste caso, repita o procedimento e certifique-se de manter tudo estéril. - Western blot / ELISA
A fim de verificar a identidade da proteína recomendamos fazer para um Western blot ou ensaio ELISA com um anticorpo específico. Idealmente, ensaios de ELISA são efectuadas com um anticorpo que se liga aos epítopos conformacionais (por exemplo, anticorpos anti-HA haste 1). Usando um tal anticorpo o enrolamento correcto da proteína pode ser confirmada (Figura 8C). - Medindo NA atividade
Enrolamento correcto da NA virai também podem ser determinados medindo a actividade de NA. Sugerimos realizar este teste usando o ensaio NA * STAR comercialmente disponível (apenas seguir as orientações do usuário).
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Representative Results
Moléculas de HA e de A/Shanghai/1/13 A/Anhui/1/13 expressa bem com rendimentos de cerca de 20 mg / L de cultura. Moléculas de NA de ambas as estirpes apresentaram níveis moderados de expressão variam entre 0,2 mg / L de cultura para A/Shanghai/1/13 a 0,7 mg / L para A/Anhui/1/13. Todas as quatro preparações de proteína teve muito pouco ou nenhum impurezas (Figuras 8A e B) com vem sendo de pureza mais elevada do que o AN, que pode ser explicado por o nível de expressão. A/Shanghai/1/13 HA foi ainda analisada utilizando ELISA com o amplamente neutralizantes caule reativa humano mAb CR9114 23. Este mAb liga-se a um epitopo conformacional no domínio sensível haste e é aqui utilizado como uma sonda para a correcta dobragem deste domínio. O anticorpo mostra boa ligação que dá a confiança de que a HA é realmente dobrada corretamente (Figura 8C). Um segundo teste ELISA com anti-soro de ratinho policlonal H7 foi realizada para confirmar a identidade da proteína obtida a partir de origem H7 (A Figura 8D).
Figura 1. Esquemático de HA e NA construções de expressão. A construção de expressão para o HA (A) contém um péptido de sinal N-terminal seguido pela ectodomínio HA, um local de clivagem de trombina, um domínio de trimerização de T4 e um tag de hexa-histidina. A construção de expressão NA (B) contém um peptídeo sinal N-terminal seguido por uma marca de hexa-histidina, um vasodilatador estimulando fosfoproteína (VASP) domínio tetramerização eo ectodomain NA. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Esquema de generat bacmídeode iões (como descrito no passo 1.1.2). Um vector de transferência de baculovírus contendo genes HA ou NA é transformado em bactérias DH10Bac. A recombinação no genoma do baculovírus que estas bactérias transportar produz um fenótipo colónia branca em placas de selecção. Uma colônia branco é colhido e semeados. Uma única colónia do prato novamente riscados é usado para inocular uma cultura midiprep.
Figura 3. Esquema de salvamento de baculovírus e geração de estoque de trabalho (como descrito nos passos 1.2.1-6). Bacmid recombinante e reagentes de transfecção são diluídos em meio isento de soro TNM-FH. As duas soluções são combinadas, a mistura é incubada durante 20 min e em seguida transferida para células Sf9. Seis horas após a transfecção o meio de transfecção é substituído pela mídia TNM-FH completos. Seis dias após a transfecção, o sobrenadante é colhido e o sedimento celular é analyzed para a expressão de proteínas recombinantes.
Figura 4. Células Sf9 saudáveis e infectadas. Sf9 em (A) são saudáveis e não infectados. Eles são ligados à placa de cultura, olha parcialmente polimórfico e relativamente pequeno. As células em (B) estão infectadas com baculovírus, separado da placa de cultura, são grandes e redondos e ampliaram núcleos. O núcleo também mostra uma aparência granular.
Figura 5. A infecção de células de High Five com baculovírus recombinante (estoque de trabalho, como descrito no passo 2.2). Cinco frascos confluentes T175 com High Five células são colhidas por centrifugação a baixa velocidade e combinado com 15 ml de estoque de baculovírus P3. Após 15 min de emcubation a mistura de células / vírus é transferida para 1.000 ml de frascos de agitação com 200 ml de meio SFX.
Figura 6. Colheita do sobrenadante de células 72-96 horas após a infecção e incubação com resina de Ni-NTA (como descrito no passo 2.3). Suspensões de células infectadas são colhidas por centrifugação a baixa velocidade. Os sobrenadantes de cultura são misturados com PBS-equilibrada Ni-resina e incubada durante 2-4 horas enquanto se agita.
Figura 7. Procedimento de purificação (tal como descrito em 2.3 e 2.4) e de controlo de qualidade (tal como descrito nos passos 3.1.1-4). Após a incubação, a toda a mistura do sobrenadante / resina é carregada em colunas de polipropileno. A resina é retido pelas colunas e é então lavado quatro vezes com buf lavarfer e a proteína recombinante é eluída com 8 ml de tampão de eluição aplicado em duas etapas ml. O eluato é em seguida trocada de tampão e concentrou-se com uma coluna de centrifugação de ultrafiltração, divididos em alíquotas e congelada. Ensaios de controle de qualidade incluem SDS-PAGE, Western Blot, ELISA e medição da atividade de NA recombinante NA.
Figura 8. Proteínas resultados representativos. HA (A) e NA (B) de A/Anhui/1/13 e A/Shanghai/1/13 foram analisados por meio de SDS-PAGE e coloração Coomassie. Integridade estrutural da HA de A/Shanghai/1/13 foi avaliada usando o anticorpo CR9114 caule reativa humana amplamente neutralizantes que se liga a um epitopo conformacional sensível (C). A identidade do mesmo HA foi confirmada por um anti-soro policlonal de ratinho H7 (D).
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Discussion
Embora a expressão de proteínas do vírus da influenza, HA e NA em células de insecto utilizando o sistema de expressão de baculovírus é geralmente para a frente, existem diversos pontos importantes a considerar. É importante, como apontado na introdução, que ectodomínios da HA e NA são expressos em fusão com trimerização ou tetramerização domínios, respectivamente. Estes domínios de assegurar a correcta dobragem das moléculas normalmente assistida por o domínio transmembranar, o que não está presente apenas se o ectodomínio é expresso. Por exemplo, a expressão do ectodomínio HA sem um domínio de trimerização leva a oligomerização e desestabilização de epitopos neutralizantes importantes no domínio da haste 1. Além disso, a estabilidade das proteínas é diminuída e à degradação pela célula de insecto e proteases baculovírus ocorre. A escolha do domínio de trimerização ou tetramerização é menos importante, uma série delas variando a partir de domínios de fecho de leucina 22a T4 foldons fago 11 foram testados até agora e todos apresentaram resultados satisfatórios. É importante ter em mente que os locais de clivagem multibásica como surgem na H5N1 altamente patogénico H7N7 24 ou 25 isolados (mas não em H7N9) devem ser removidos antes da expressão, uma vez que são clivados por furin como proteases que estão presentes em todos os momentos em o sistema de expressão de baculovírus 1,12.
Outra razão possível para produtos degradacionais é a contaminação por fungos ou mofo. Isso pode acontecer mais cedo durante a geração de estoque de trabalho e pode passar despercebida durante o armazenamento de estoques, a 4 ° C. Muitos fungos e bolores preferência temperaturas entre 20-30 ° C para o crescimento óptimo e estão efectivamente inibida a 37 ° C, que é a temperatura da cultura comum para células de mamíferos. Uma vez que a maioria dos antibióticos que são usados na cultura de células não são eficazes contra organismos eucariotas como leveduras e bolores, e cultura de células de insecto é performe d em condições de crescimento ideais de esses germes cuidado extra tem de ser tomada em termos de manuseamento asséptico de culturas. Além overgrowing células de insecto e meios de acidificação, bolores e leveduras expressam muitas proteases solúveis e, por conseguinte, pode degradar completamente proteínas recombinantes.
Um problema que ocorre por vezes, é a precipitação no tampão de eluição. Este raramente é visto e mais ou menos específicos estirpe (por exemplo, A/Vietnam/1203/04 H5 HA tende a precipitar), mas pode ser prevenida por troca de tampão rápida e completa de PBS. Armazenamento de proteínas no tampão de eluição contendo imidazol não é recomendado. O processo de purificação da colheita para o congelamento de aliquotas a -80 ° C deve ser realizada dentro de um dia de trabalho e de armazenamento de proteína purificada à temperatura diferente -80 ° C deve ser evitada. Além disso, os ciclos de congelamento e descongelamento repetidos têm sido provada a ter um impacto negativo sobre a estabilidade de determinados epítopos 1.
_content "> yield deve ser esperado para estar no intervalo de 0,2-30 mg / L de cultura. muitos tem expressar na gama superior, enquanto AN tendem a expressar a níveis mais baixos. Além disso, os níveis de expressão de HA por parecem correlacionar-se inversamente com o número de locais de glicosilação. tem desde H3N2 sazonal humana e sazonal Prepandemic H1N1 isolados apresentam normalmente baixos níveis de expressão, enquanto que a maioria é de origem do vírus da gripe aviária têm níveis de expressão elevados. Para melhorar a expressão, recomenda-se aumentar a densidade de células no frasco ou tentar usar menos ou ações mais trabalhando por expressão. aumento de 10 vezes ou diminuição do estoque de trabalho pode ter um impacto positivo sobre os níveis de expressão. Outro fator que pode ter impacto sobre os níveis de expressão é o tempo entre a infecção ea colheita. às 96 h são ideais para a maioria tem e AN, mas os tempos de incubação mais curtos pode realmente aumentar a produção de algumas proteínas.As células de insecto são capazes de realizar modificações pós-tradução em quase mammaliaforma n-like e são capazes de dobrar estruturas de proteínas muito complexas com eficiências semelhantes como células de mamíferos (mas produzindo rendimentos mais elevados). Em termos de glicosilação, que exibem um padrão que é ligeiramente diferente a partir de células de mamíferos e possui principalmente paucimannosidic N-glicanos que carecem de alterações de ácido siálico 19. No entanto, as linhas de células de insectos que tenham sido modificadas para produzir mamíferos como glicosilação (incluindo o ácido siálico terminal) estão comercialmente disponíveis 14.
O sistema de expressão de baculovirus é um instrumento extremamente útil para a expressão das glicoproteínas de superfície recombinantes de influenza - HA e NA. Estas proteínas recombinantes são utilizadas para muitos ensaios imunológicos e bioquímicos, bem como para a normalização do teor de antigénio de vacinas e como antigénio para experiências de vacinação em modelos animais. Baculovirus-expressa HA e NA apresentam função biológica completo e correto enovelamento se expressa no quadro com trimerizatiem e domínios tetramerização respectivamente. Isso os distingue bacteriana expressa tem esse são não-glicosilada e carecem de epítopos funcionais no domínio caule. Além disso, as exposições do sistema de expressão de baculovírus rendimentos de proteína significativamente mais elevados do que os sistemas de células de mamíferos 26 e manuseio e upscaling são mais fáceis. Em resumo, descrevemos um protocolo simples e eficiente para a expressão de grandes quantidades de vírus de gripe recombinante, HA e NA moléculas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Patrick C. Wilson para monoclonal CR9114 anticorpo. Agradecemos também a Jennifer Debeauchamp e Richard Webby para os plasmídeos originais A/Anhui/1/13. Suporte parcial para este trabalho foi fornecido pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas financiado Projeto Programa Bolsa AI097092-01A1 e CEIRS (Centros de Excelência para Pesquisa e Influenza Surveillance, HHSN26620070010C). FK foi apoiado por uma bolsa de Erwin Schrödinger (3232 J) do Fundo de Ciência Austríaco (FWF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
References
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