Summary
ここでは、赤血球に対する抗体により誘導される補体活性化を測定するための2つのアッセイを記載する。現在のアッセイ以上の主要な利点は、それらの定量的かつ簡単に解釈する性質である。
Abstract
赤血球（RBC）に対する抗体は、活性化の肝臓における補受容体を介して加速されたクリアランス（血管外溶血）を生じるか、RBCの血管内溶解をもたらすを補完する可能性があります。補体活性化につながる赤血球抗原に対する同種抗体（ 例えば ABO）または自己抗体（自己免疫性溶血性貧血、AIHAに見られるように）潜在的に有害であるとすることができます-血管内溶解をもたらす場合は特に-致命的な1。現在、原因のRBC ON（自動） -抗体に補体活性化は、RBCまたはRBC溶解1-4を反映した非定量溶血アッセイによる補体沈着を反映したクームス試験を使用することにより、in vitroで評価される。しかしながら、補体阻害剤の有効性を評価するためには、定量的な技術を有することが必須である。ここでは、そのような2つの手法を説明します。まず、患者の血清中の抗体により誘導される赤血球上C3及びC4沈着を検出するためのアッセイは、プレsented。このために、FACS分析を蛍光標識した抗C3または抗C4抗体とともに使用される。次に、定量的溶血アッセイが記載されている。このアッセイでは、患者血清により誘導される補体媒介性溶血が放出されたヘモグロビンの分光光度検出を利用して測定される。これらのアッセイの両方が抗体誘導性の補体活性化の研究を容易にする、非常に再現性および定量的である。
Introduction
赤血球（RBC）に対する抗体は、レシピエント赤血球上に存在しない抗原を発現する赤血球の輸血によって誘導することができる。これらのアロ抗体は、以下の輸血5時に補体活性化に起因する重篤な急性溶血性輸血反応を引き起こす可能性があります。自己免疫性溶血性貧血（AIHA）において、患者は、自分自身の赤血球に対する自己抗体を有する。これは、脾臓および/ または肝臓6,7における補体受容体を介して補体を活性化することが自己抗体の場合には食細胞上のFcγ受容体と赤血球に結合したIgGの相互作用を介して細胞の加速クリアランスにつながる。血管内溶血をもたらし劇補体活性化は、稀ではあるが、多くの場合致命的である。加速、急性貧血ので、潜在的に致命的な組織低酸素のいずれかで同種もしくは自己抗体の結果によって誘導された媒介赤血球の破壊を補完します。 AIHAにおける自己抗体はdependin、暖かいと冷たい抗体に分類されている彼らは赤血球（それぞれ37℃以下）に結合し、最適な温度にグラム。暖かい抗体は、IgGアイソタイプおよびIgMアイソタイプ8,9の寒抗体の通常です。 AIHAは例えば lymphoprolyferative疾患、結合組織疾患、固形腫瘍、感染症や薬物への二次的であり得るが、症例の50％においてAIHAは特発9です。
γグロブリン（ 例えば、。のIgGまたはIgM）の検出、患者の赤血球に結合した補体は、半定量的な直接抗グロブリン（クームス）試験（DAT）によって行われる。 DATにおいて、患者RBCは抗IgGまたは抗C3dのとインキュベートする。 RBC凝集の発生が取り付けられ、補体成分の存在を実証またはIgG結合。同種または患者の血清中の自己抗体の検出は、間接抗グロブリン試験（IAT）を用いて行われる。 IATでは、ブロメライン処理した試験RBCは、患者の血清とインキュベートし、洗浄した後、抗HとインキュベートするIgGのUMAN。ケース赤血球に凝集が発生し、患者血清中の抗赤血球に存在するIgGで感作されています。赤血球に対するIgM抗体は、直接患者血清とブロメライン処理した試験RBCのインキュベーションで凝集につながる。直接クームス試験やIATにおける赤血球凝集反応を視覚的に試験管内の目によって、またはサイズ1によって凝集し、単一RBCを分離する小さなセファデックスカラムにサンプルをロードすることによって、どちらかに評価される。
赤血球上の補体活性化を測定するために、別の頻繁に使用される技術は、ブロメライン処理したRBC 10の（補体媒介）溶血を誘発する患者血清の容量が評価された溶血アッセイ1、である。遠心分離後の上清が原因で放出されたヘモグロビンを赤色に染色し、無色のままである場合は負であると考えられる場合に試験が陽性として注目されている。抗グロブリン試験や溶血アッセイの両方が最高出せるので、半定量的であるMの希釈はテストがまだ正である示されている。
抗グロブリン試験や溶血アッセイは、日常の診断に使用されている堅牢なアッセイである。これらのアッセイは、半定量的および補体阻害剤の有効性を評価する際に、必要に応じて、彼らは、赤血球上の補体活性化の微妙な違いを研究するのに適していないアッセイを行う技術者の経験に依存しているので。したがって、我々は我々がこの論文で説明赤血球に（オート）抗体による補体活性化を決定するために、2の定量的アッセイを開発した。
まず、赤血球上の補体C3およびC4の活性化フラグメントの沈着（ 図1A）を測定するためのアッセイを開発した。このアッセイにおいて、ヒトブロメライン処理したタイプ0 RBCは、熱不活性化患者血清（抗RBC抗体源）、新鮮なAB血清（補体源）および抗C5モノクローナル抗体（エクリズマブ）と共にインキュベートする。この社の間に患者血清は抗RBC抗体を活性化補完が含まれている場合ubation、C3、C4の沈着が発生します。下流の補体活性化によりRBC溶解を防ぐために、ブロッキング抗C5モノクローナル抗体が添加される。次に、赤血球上のC3およびC4沈着は、それぞれC3およびC4と反応する蛍光標識されたモノクローナル抗体またはFabフラグメントを用いてFACSによって検出される。単一の赤血球上のゲーティングは、結果の信頼性を確保することが重要である。この技術の利点は、カスケードの初期段階で、補体活性化、患者材料の小さな体積が必要であることを含んで評価し、この方法は、再現可能かつ定量的である。 C3およびC4の両方を見てのさらなる利点は、区別は、古典経路およびレクチン経路の活性化（C3とC4の沈着の両方）および代替経路の活性化（C3のみ堆積）の間に行うことができることである。代わりに、未処理のRBCのブロメライン処理したRBCの使用は、感度を増加させると言う。
第二のアッセイは、現在使用されて溶血アッセイ（ 図1B）に基づいている。ヒトブロメライン処理したタイプ0 RBCは、熱不活性化患者血清（抗RBC抗体源）と新鮮なAB血清（補体源）と共にインキュベートする。補数を患者抗RBC抗体によって活性化されている場合は、用量依存性のRBC溶解は、ヘモグロビンの放出につながるが発生します。放出されたヘモグロビンの量は、無傷の断片化RBCをスピンダウンした後、上清中の414 nmでの吸光度を測定することによって定量化される。吸光度が発生した溶血の量と相関する。現在使用されるアッセイとは対照的に、このプロトコルは、客観的な、非常に再現性およびアッセイの解釈者に依存しない溶血の定量値を可能にします。
これらの方法の適用はAIHAにおける補体阻害剤としてのC1-阻害剤の使用の可能性は11秒であった、に記載されているtudied。
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Protocol
1。ブロメライン処理した赤血球の準備
- 1X PBS（2-5分間664×gの遠心分離）で3回0に型指定された赤血球を洗浄します。
- 37℃で10分間、0.5％ブロメライン溶液を2倍量のパックされたRBCの1の体積をインキュベート
- 細胞は1×PBSで3回洗浄します。
- 細胞は、少なくとも1週間1×PBS中で4℃で3％の溶液として保存することができる。
2。 FACSによる赤血球上のC3、C4の堆積分析
- 56℃で30分間サンプルを加熱することによって患者の血清（または他の抗RBC抗体源）の必要量を、熱不活性化
- ブロメライン処理した赤血球のVBG 3回洗浄する。 - （5mMのベロナール、150mMのNaCl、0.05％ゼラチン液pH7.4）およびVBG + +（VBG - + 2mMのMgCl 2 + 10mMのCaCl 2）に再懸濁し得0.5％溶液。
- ガラスパール（fで丸底プレートには、次のコンポーネントをピペットまたは適切な混合）：25μlの0.5％赤血球、37.5μlの新鮮なAB血清（補体源）と37.5μL200μg/ mlの抗C5。抗C5は高価であり、入手が困難な場合があります。一つはC5-/C6-/C7-またはC8-欠損血清の代わりに、AB血清および抗C5の使用を検討して可能性があります。
- 0.1から33パーセントの最終濃度になるようにウェルあたり患者血清を追加します。正しい熱不活性化AB血清を用いによりウェル当たり血清濃度の違いのために。よく150μL/の最終容量を得るためにVBG + +を追加します。 ELISA箔との緊密なプレート。
- 振とうしながら37℃で1.5〜2時間インキュベートする。
- PBS +0.5％BSA（2分間664×gの遠心分離）でRBCを3回洗浄する。
- 1μg/ mlの終濃度になるようPBS + 0.5％BSA中で（凝集を低減するために）蛍光標識した抗C3および抗C4モノクローナル抗体またはそれらのFabフラグメントを追加する。ここでは、カスタム抗C3-アレクサフルーア488を開発し、抗C4-アレクサフルーア647モノクローナル抗体が使用され、テサロニケの選択電子蛍光標識は、FACSによってC3及びC4の同時検出を可能にする。
- 穏やかに振盪しながら、室温で30〜45分間インキュベートする。
- PBS +0.5％BSAで洗浄赤血球3X。
- PBS +0.5％BSA中に再懸濁赤血球150μLと（FACS分析の前にガラスパールを取り除くために）新しいプレートにそれらをピペット。
- FACS分析を行う。スキャッタプロットFSC-Aのダブレットとは別の単一細胞は、単一の赤血球上にゲートを設定し、蛍光シグナル（ 例えば 、FITCとAPC）のための適切な検出チャネルを選択します。
- 蛍光強度中央値を使用して結果を定量化する。
注：これは、（ 例えば、蛍光標識抗IL6標識マウスIgG1）アイソタイプコントロールを使用することが可能である。しかしながら、それは、患者血清（AB血清のみ）なしで、または補体源（熱不活性化AB血清および熱不活性化患者血清）なしで赤血球をインキュベートすることによって、例えば、真の陰性対照を含むことが推奨されるDそして同じ抗C3-アレクサフルーア488および抗C4-アレクサフルーア647抗体でこれらを染色。これらの異なるコントロールは、典型的には、同じ、否定的な結果を与えるが、これは、赤血球12例におけるアイソタイプコントロールよりも多くの有効なコントロールを提供します。
3。定量的溶血アッセイ
- 56℃で30分間サンプルを加熱することによって患者の血清（または他の抗RBC抗体源）の必要量を、熱不活性化
- VBGを洗浄赤血球3X -一度VBG + +と。
- （適切な混合用）ガラスパールと丸底プレートには、次のコンポーネントをピペット：35μlの3％赤血球、25μlの新鮮なAB血清（補体源）と1から50パーセントの患者の血清。熱不活性AB血清を用いて、血清濃度の差を補正。よく150μL/の最終容量を得るためにVBG + +を追加します。 ELISA箔との緊密なプレート。
- 振とうしながら1.5〜2時間、37℃でインキュベートする。
- C言語減少減速（2〜3分で完全に停止するなど減速）で5分間664×gでentrifugeプレート。
- 慎重に新しいマイクロタイタープレートに90μlの上清をピペット。なお、気泡を防止し、無傷の細胞沿っ取ることを防止するために、この段階で重要である。
- 適切な分光光度計でA414/690を測定します。
- 純水でサンプルRBCの溶解の割合として溶解を表現しています。
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Representative Results
図2Aは、赤血球のための代表的な散布図を示しています。 FSC-プロット（P1） - シングル赤血球に適しゲーティングはデFSC-Wで見ることができます。通常、RBCの約95％がこのP1のゲート（単セル）内に入るが、患者血清中の高い割合が使用される場合、これは、抗IgMのRBCは、患者血清中に存在する場合は特に、70〜80％に低下することができる。
C4沈着にAIHA患者血清の効果についての代表的な結果を図2B及び図2CにおけるC3沈着に示されている。これらの図から分かるように、より多くの患者の血清は予想されるように、より多くの補体沈着をもたらす。不思議なことに、補体の堆積は、2つの異なる正のピークで発生します。赤血球は、単一のドナーから採取されたので、これはおそらく、赤血球集団の不均一性が原因ではありません。我々はまだこの現象の原因を調べている。 図2D及び2Eの demonstraC4（ 図2D）とC3（ 図2E）の堆積アッセイの再現性をTEを彼らはまた、様々なAIHA患者試料の補体沈着容量の大きなばらつきを示している。
赤血球への自己抗体を含有するAIHA患者血清試料と溶血アッセイの代表的結果を図3Aに見ることができる。通常、血清試料の滴定はいい、再現性のある曲線が得られます。患者血清は、補体活性化能力が大幅に変化するので、それぞれの患者の血清の滴定を行う。患者血清を含まない試料は、通常、補体源として使用した血清サンプルによって吸収による10〜15％程度のバックグラウンドを与える。したがって、注意を実質このような背景の上にある信号を得るために十分に高い患者血清濃度を使用するように注意すべきである。抗C5のような適当な補体阻害剤で、溶血性信号は、Fのように離れて滴定することができるigure 3B。
図1。溶血アッセイ溶血ながらC3及びC4沈着アッセイにおいて要するにC3およびC4沈着アッセイ（A）および定量的溶血アッセイ（B）の概略図。、AIHA患者血清によって誘起付着を補完するが、測定されるAIHA患者血清が検出されたことで誘発される。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。 C3およびC4沈着aの代表的な結果ssay。A）戦略ゲーが示唆された。ここに示されている単一のRBC（P1、赤）のために選択する方法である。凝集が緑（P2）に示されている。B）C4沈着にAIHA患者血清の滴定の効果。試料は黒色で示されているが、アイソタイプコントロール（抗IL6マウスIgG1）を灰色固体として示されている。患者血清の量を増加させると、Bのような同様のC4沈着。C））の増加をもたらすが、今C3沈着の検出に。D）C4沈着FACSの結果は、アッセイの再現性を示すとかなりの相違を示したグラフに示されている異なる患者からの血清試料の間である。 Y軸はDと同様に）、E。蛍光強度中央値を表します）が、今のC3沈着のために。 するには、ここをクリックしてください拡大表示する。
図3。定量的溶血アッセイのための代表的な結果。溶血アッセイのA）AIHA患者血清滴定、患者血清濃度で再現性の溶解が増加していることを示している。いいえ溶解（オランジュ、陰性コントロール）健常人血清を発生します。B）を適当な補体阻害剤（この場合、抗C5）は、補体媒介性溶解を排除することはできません。ここに示したAIHA患者血清を一定濃度に保ちながら、抗C5の滴定である。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
上記のアッセイは、再現性と堅牢である。それらは、実施が容易であり、それは（96ウェルプレート）で同時に多数のサンプルを用いてそれらを行うことができる。したがって、このアプローチはまた、ELISAロボットシステム、例えば 、完全に自動化されたシステムに適しているであろう。現在使用される技術とは対照的に、これらのアッセイは定量的であり、これは、補体阻害剤の効果の研究において、例えばを助ける。さらに、解釈は、現在使用されたアッセイを改良したもので客観的である。
両アッセイは、1重要なステップがあります。これらは1イベントとしてカウントされますので、凝集したRBCは、人為的に高いシグナルを与えるので、FACS分析において重要なのは、単一の赤血球にゲートにある。低濃度は依然として良好なシグナルを与えるので、それは、低い患者の血清中濃度を用いて凝集を防止するためにも優れている。溶血アッセイでは、慎重に上清aを転送するために重要である新しいプレートにFTERのインキュベーションは、RBCのキャリーオーバーするので（意志の気泡のような）信頼性の低い信号につながる。これは、AB0の不一致補体活性化との混同を防ぐために、両方のアッセイで0に型指定されたRBCを使用することをお勧めします。
それらの信頼性および堅牢性をこれらのアッセイは、参照11で示されるように、補体活性化の定量的微妙な違いを検出するために、AIHAのための補体阻害剤の効力を研究するのに適している。この文は、まだ検証が必要であるものの、赤血球上の補体活性化が強く示唆されている場合に、それらの感度のため、これらのアッセイは、患者の補体活性化を検出することができるが、そのようなクームス陰性AIHAのように日常的アッセイによって検出されません。 predicに臨床医を助けるかもしれない-彼らはまた、（RHD +の子を持つ母親などの輸血によってまたはのRhDに誘導される）アロ抗体の補体活性化能力を決定するために使用することができます検出された同種抗体の臨床的挙動をトン。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
SZとDWがViropharmaの無制限の助成金を受ける。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| Bromelain | Sanquin | K1121 |
References
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