Summary
כאן אנו מתארים שני מבחני למדידת הפעלת משלימים הנגרמת על ידי נוגדנים כנגד תאי דם אדומים. היתרון הגדול על פני מבחני הנוכחיים הוא מטבעם כמוני וקל לפרש.
Abstract
נוגדנים כנגד תאי דם אדומים (RBCs) יכולים להוביל להשלמת הפעלה וכתוצאה מכך אישור מואץ באמצעות קולטנים משלימים בכבד (המוליזה extravascular) או מוביל לתמוגה intravascular של RBCs. Alloantibodies (למשל ABO) או נוגדנים עצמיים לאנטיגנים RBC (כפי שניתן לראות באנמיה המוליטית אוטואימונית, AIHA) המוביל כדי להשלים את ההפעלה הם מזיקים ויכול להיות - במיוחד כאשר מובילים לתמוגה intravascular - 1 קטלני. נכון לעכשיו, להשלים את ההפעלה בשל (אוטומטי)-נוגדנים על פני כדוריות דם אדום נבחנת במבחנה על ידי שימוש בבדיקת קומבס משקפת בתצהיר משלים בRBC או על ידי assay המוליטית nonquantitative משקף RBC תמוגה 1-4. עם זאת, כדי להעריך את היעילות של מעכבי משלים, הוא חובה שיש טכניקות כמותיות. כאן אנו מתארים שתי טכניקות כאלה. ראשית, assay כדי לזהות C3 ו-C4 בתצהיר על תאי דם אדומים הנגרמים על ידי נוגדנים בסרום חולה מראשsented. לשם כך, ניתוח FACS משמש עם נוגדנים נגד C3 או אנטי-C4 שכותרתו fluorescently. בשלב הבא, assay המוליטית כמותית מתואר. המוליזה ב assay זה, להשלים בתיווך הנגרמת על ידי סרום מטופל נמדדת שימוש ביצוע של זיהוי spectrophotometric של המוגלובין שפורסם. שני מבחני האלה הם מאוד לשחזור וכמותיים, בהנחיית מחקרים של הפעלת משלים-Induced נוגדן.
Introduction
נוגדנים כנגד תאי דם אדומים (RBCs) יכולים להיגרם על ידי עירוי של תאי דם אדומים מבטאים אנטיגן שאינו נמצא בתאי דם אדומים נמען. הלו, נוגדנים אלו יכולים לגרום לתגובות קשות חריפות המוליטית עירוי עקב להשלים הפעלה על העירוי 5 הבא. באנמיה המוליטית אוטואימונית (AIHA), חולים נוגדנים עצמיים כנגד תאי הדם האדום שלהם. זה מוביל לאישור מואץ של התאים באמצעות האינטראקציה של IgG חייבת RBCs עם Fcγ-קולטנים על phagocytes בטחול ו / או במקרה של נוגדנים עצמיים מסוגלים להפעיל משלימים באמצעות קולטנים משלימים בכבד 6,7. הפעלת השלמה המוחלטת של תפקוד וכתוצאה מכך המוליזה intravascular היא נדירה אך לעתים קרובות קטלנית. מואץ, משלים הרס RBC בתיווך הנגרם על ידי או תוצאותיו הלו או נוגדנים עצמיים באנמיה חריפה וחוסר חמצן ברקמות ומכאן שעלול להיות קטלני. הנוגדנים העצמיים בAIHA מסווגים בנוגדנים חמים וקרים, תלויg על הטמפרטורה האופטימלית הם נקשרים לתאי דם אדומים (37 מעלות צלזיוס או נמוכה, בהתאמה). הנוגדנים הם בדרך כלל החמים של אלוטיפ IgG והנוגדנים הקרים של IgM אלוטיפ 8,9. AIHA יכולה להיות משנית לדוגמא lymphoprolyferative הפרעות, מחלות רקמת חיבור, גידולים מוצקים, זיהומים או סמים, אבל ב50% מהמקרים AIHA היא אידיופטית 9.
איתור של gammaglobulins (למשל. IgG או IgM) ומשלים כבול לRBCs של המטופל מתבצע באמצעות antiglobulin הישיר semiquantitative מבחן (קומבס) (DAT). בDAT RBCs מטופל מודגרת עם אנטי IgG או אנטי C3d. מופע של התלכדות RBC מדגים את נוכחותם של רכיבים משלימים מצורפים או IgG מחייב. זיהוי שלו הלו או נוגדנים עצמיים בסרום של המטופל מתבצע באמצעות הבדיקה העקיפה antiglobulin (IAT). בIAT, RBCs המבחן טופלו ברומלין מודגרת עם סרום מטופל, נשטף ולאחר מכן הודגרו עם אנטי-hאומן IgG. במקרה RBCs כבר רגיש עם הווה נגד RBC IgG בהתלכדות סרום המטופל יתרחש. נוגדני IgM לRBCs ישירות יובילו להתלכדות על דגירה של RBCs מבחן טופלו ברומלין עם סרום מטופל. התלכדות RBC בבדיקת קומבס הישירה או בIAT מוערך מבחינה ויזואלית או על ידי העין במבחנה או על ידי טעינת המדגם על עמודת Sephadex קטנה מפרידה RBCs agglutinated ואחת לפי גודל 1.
טכניקה משמשת לעתים קרובות אחרת למדוד הפעלה משלים על פני כדוריות דם אדום היא assay המוליטית 1, שבו היכולת של סרום מטופל כדי לגרום להמוליזה (משלים בתיווך) של תאי דם אדומים שטופלה ברומלין 10 מוערכת. המבחן הוא כאמור חיובי כאשר את supernatant לאחר צנטריפוגה מוכתם אדום בשל המוגלובין שוחרר ונחשב לשלילי אם הוא נשאר חסר צבע. שתי מבחן antiglobulin וassay המוליטית הם semiquantitative, מאז Seru הגבוה ביותרהדילול מ 'הוא כונה שבמבחן הוא עדיין חיובי.
מבחן antiglobulin וassay המוליטית הם מבחני חזקים המשמשים באופן שיגרתי באבחון. מאז מבחני אלה הם semiquantitative ותלויים בניסיונו של טכנאי ביצוע assay הם אינם מתאימים ללמוד להבדלים של הפעלת משלים על פני כדוריות דם אדומים, במידת צורך בעת הערכת היעילות של מעכבי משלים. לכן, פיתחנו שני מבחני כמותיים כדי לקבוע הפעלת ההשלמה על ידי נוגדנים (אוטומטי) לתאי דם אדומים, שנתאר במאמר זה.
ראשית, פיתחנו assay כדי למדוד את התצהיר של שברי הפעלה של משלים C3 ו-C4 על פני כדוריות דם אדומים (איור 1 א). ב assay זה, מסוג 0 RBCs טופלו ברומלין אדם מודגרת עם סרום חום מומת מטופל (מקור נוגדן אנטי RBC), סרום טרי AB (מקור משלים) ונוגדנים חד שבטיים אנטי C5 (Eculizumab). במהלך inc זהubation, בתצהיר C3 ו-C4 יתרחש אם הסרום מכיל המטופל להשלים הפעלת נוגדנים נגד RBC. על מנת למנוע תמוגה RBC על ידי הפעלת משלים במורד הזרם נוגדן חד שבטי אנטי C5 חסימה הוא הוסיף. בשלב בא, בתצהיר C3 ו-C4 על פני כדוריות הדם האדום הוא זוהה על ידי FACS באמצעות נוגדנים חד שבטיים או שכותרתו fluorescently Fab-ברים מגיבים עם C3 ו-C4, בהתאמה. Gating על פני כדוריות דם אדום בודדות הוא חשוב כדי להבטיח את אמינות התוצאות. יתרונות של שיטה זו כוללים שנפח קטן של חומר מטופל נדרש, תשלים את ההפעלה בשלב מוקדם של המפל מוערך והשיטה לשחזור וכמותיים. יתרון נוסף של התבוננות בשני C3 ו-C4 הוא שניתן להבחין בין ההפעלה הקלסית וקטיני המסלול (גם C3 ו-C4 בתצהיר) וההפעלה החלופית מסלול (רק בתצהיר C3). השימוש בתאי הדם אדום שטופלה ברומלין במקום RBCs מטופל מגביר את הרגישות של כאומר.
Assay השני מתבסס על assay משמש כיום המוליטית (איור 1). סוג-0 RBCs טופלו ברומלין אדם מודגרת עם סרום חום מומת מטופל (מקור נוגדן אנטי RBC) וסרום טרי AB (מקור משלים). אם משלימים מופעל על ידי נוגדנים נגד RBC מטופל, תמוגה RBC תלויה המינון תתרחש, מה שמוביל לשחרור של המוגלובין. כמות ההמוגלובין שפורסם היא לכימות על ידי מדידת הספיגה שלה ב414 ננומטר בsupernatant לאחר שצנח RBCs השלמה ומקוטע. הספיגה בקורלציה עם הכמות של המוליזה התרחשה. בניגוד לassay משמש כיום, פרוטוקול זה מאפשר לאובייקטיבי, ערכם הכמותי של המוליזה כי הוא מאוד לשחזור ואינו תלוי באדם לפרש את assay.
יישום של שיטות אלה תואר ב11, שבם השימוש הפוטנציאלי של C1-מעכב כמעכב משלים בAIHA היה שלtudied.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה של תאי דם אדומים שטופלו ברומלין
- תאי דם אדומים לשטוף 0 הקלידו-3x עם 1x PBS (צנטריפוגה ב664 XG במשך 2-5 דקות).
- דגירה 1 נפח של תאי דם אדומים צפופים עם שני כרכים של פתרון ברומלין 0.5% עבור 10 דקות ב37 ° C.
- לשטוף את התאים 3x עם 1x PBS.
- ניתן לאחסן את התאים כפתרון 3% ב 4 ° C ב1x PBS למשך שבוע אחד לפחות.
2. C3 ו-C4 הפקדת ניתוח על פני כדוריות דם אדומים על ידי FACS
- חום להשבית את הכמות הנדרשת של סרום מטופל (או במקור נוגדן אנטי RBC אחר) על ידי חימום הדגימה ל30 דקות ב56 ° C.
- שטפו RBCs טופלו ברומלין שלוש פעמים בVBG - (5 מ"מ ורונל, 150 mM NaCl, 0.05% pH ג'לטין 7.4) ו resuspend אותם בVBG + + (VBG - + 2 מ"מ MgCl 2 + 10 מ"מ CaCl 2) לתת פתרון 0.5%.
- פיפטה את המרכיבים הבאים לתוך צלחת מסביב לתחתית עם פנינת זכוכית (ואו ערבוב נכון): 25 μl RBCs 0.5%, 37.5 סרום μl טרי AB (מקור משלים) ו37.5 μl אנטי C5 200 מיקרוגרם / מיליליטר. Anti-C5 הוא יקר ועלול להיות קשה להשגה. אפשר לשקול שימוש בסרום C5-/C6-/C7- או C8 לקוי במקום סרום AB ואנטי-C5.
- להוסיף סרום מטופל בכל טוב לריכוז סופי של 0.1-33%. נכון להבדלים בריכוז בסרום לכל גם בשל שימוש בסרום AB חום מומת. הוספת VBG + + כדי לקבל נפח סופי של 150 μl / טוב. צלחת לסגור בנייר ELISA.
- דגירה 1.5-2 שעות על 37 מעלות צלזיוס בזמן טלטולים.
- שטוף פעמים RBCs שלוש עם PBS + BSA 0.5% (צנטריפוגה ב664 XG במשך 2 דקות).
- הוספת כותרתו fluorescently אנטי C3 ונוגדנים חד שבטיים אנטי C4 או שברי Fab שלהם (כדי להפחית את התלכדות) בארגון ה-BSA + 0.5% PBS לריכוז סופי של מיקרוגרם / מיליליטר 1. כאן התפתח מנהג אנטי C3-Alexa פלואוריד 488 ו647 נוגדנים חד שבטיים אנטי C4-Alexa פלואוריד משמשים; הבחירה של thesדואר תוויות ניאון מאפשרת זיהוי בו זמני של C3 ו-C4 על ידי FACS.
- דגירה 30-45 דקות בטמפרטורת חדר עם רעד עדין.
- RBCs 3x לשטוף עם BSA + 0.5% PBS.
- Resuspend RBCs 150 μl בBSA +0.5% PBS ו פיפטה אותם לצלחת חדשה (להיפטר מפניני הזכוכית לפני ניתוח FACS).
- ביצוע ניתוח FACS. תאים בודדים נפרדים מכפילויות בFSC-זומם פיזור; להגדיר את השער על פני כדוריות הדם האדום אחת; בחר את הערוץ המתאים לזיהוי אותות הקרינה (למשל FITC וAPC).
- לכמת תוצאות שימוש בעוצמת הקרינה החציונית.
הערה: אפשר להשתמש בשליטת אלוטיפ (שכותרת למשל fluorescently אנטי IL6 העכבר IgG1). עם זאת, מומלץ לכלול ביקורת שלילית אמיתית למשל על ידי דוגרים RBCs ללא סרום מטופל (רק בסרום א.ב.) או ללא מקור משלים (סרום AB חום מומת וסרום חולה חום מומת),ד אז כתם אלה עם אותו אנטי-C3-Alexa פלואוריד 488 ואנטי C4-Alexa פלואוריד 647 נוגדנים. זה נותן שליטה תקפה יותר מאשר שליטת אלוטיפ במקרה של תאי דם אדומים 12, למרות פקדים השונים אלה בדרך כלל לתת את אותה תוצאה, שלילית.
3. Assay המוליטית כמותיים
- חום להשבית את הכמות הנדרשת של סרה מטופל (או במקור נוגדן אנטי RBC אחר) על ידי חימום דקות המדגם 30 ב56 ° C.
- RBCs 3x לשטוף עם VBG - ופעם אחת עם VBG + +.
- פיפטה את המרכיבים הבאים לתוך צלחת מסביב לתחתית עם פנינת זכוכית (לערבוב נכון): תאי דם אדום 35 μl 3%, 25 μl סרום טרי AB (מקור משלים) ו1-50% בסרום חולה. נכון להבדלים בריכוז בסרום באמצעות סרום AB חום מומת. הוספת VBG + + כדי לקבל נפח סופי של 150 μl / טוב. צלחת לסגור בנייר ELISA.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.5-2 עם רעד.
- Cצלחת entrifuge ב664 XG במשך 5 דקות עם האטה מופחתת (למשל האטה לעצירה מלאה ב2-3 דק ').
- זהירות פיפטה 90 supernatant μl בצלחת microtiter חדש. חשוב בשלב זה כדי למנוע בועות אוויר ולמניעת לקחת יחד תאים שלמים.
- מדוד A414/690 בספקטרופוטומטר מתאים.
- להביע תמוגה כאחוז מתמוגה של RBCs מדגם עם מים טהורים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2 א מראה עלילת פיזור נציג לRBCs. gating המתאים לRBCs היחיד שניתן לראות בדה FSC-W - FSC-עלילה (P1). בדרך כלל סביב 95% מתאי הדם האדומים ליפול בתוך השער הזה P1 (תאים בודדים), אבל כאשר אחוז גבוה של סרום חולה משמש, זה יכול לרדת ל 70-80%, במיוחד כאשר אנטי RBC IgM נמצא בסרום החולה.
נציג תוצאות להשפעת סרום מטופל AIHA על תצהיר C4 מוצגות באיור 2 ועל תצהיר C3 באיור 2C. כפי שניתן לראות בנתונים אלה, סרום סבלני יותר מוביל לעוד תצהיר משלים, כפי שניתן היה לצפות. למרבה הפלא, בתצהיר המשלים מתרחש בשתי פסגות חיוביות ברורות. זה כנראה לא נגרמת על ידי ההטרוגניות באוכלוסיית RBC, שכן תאי הדם האדומים נמשכים מתורם יחיד. אנחנו עדיין חוקרים את הסיבה לתופעה זו. איורים 2D ו2E הפגנותte שחזור של C4 (איור 2 ד) ו-C3 (איור 2E) מבחני בתצהיר. הם גם מראים את הווריאציה הרחבה של קיבולת בתצהיר המשלים של הדגימות החולים AIHA השונות.
תוצאת נציג של assay המוליטית עם מדגם סרום מטופל AIHA המכיל נוגדנים עצמיים לתאי דם אדומים שניתן לראות באיור 3 א. בדרך כלל, טיטרציה עם מדגם סרום תשואות עקומה נחמד, לשחזור. סרה מטופל להשתנות במידה ניכרת ביכולת השלמה הפעלה, ולכן לבצע טיטרציה של כל סרום מטופל. דוגמאות ללא סרום מטופל בדרך כלל לתת רקע סביב 10-15% עקב ספיגה על ידי מדגם הסרום המשמשת כמקור משלים. לכן, יש להקפיד להשתמש בריכוז בסרום חולה גבוה מספיק כדי לקבל אות שהיא באופן משמעותי מעל רקע זה. עם מעכב משלים מתאים כמו אנטי C5, אות המוליטית ניתן טיטרציה משם כפי שמוצגת בFigure 3B.
איור 1. סקירה סכמטי של assay C3-C4 והתצהיר (א) ו assay כמותיים המוליטית (ב '). בקיצור, בassay תצהיר C3-C4 ו, משלים בתצהיר הנגרם על ידי סרום מטופל AIHA נמדדת, ואילו בהמוליזה assay המוליטית הנגרם על ידי סרום מטופל AIHA מזוהה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. תוצאות עבור נציג בתצהיר C3 ו-C4ssay.) הציע gating אסטרטגיה. מוצג כאן הוא כיצד לבחור רק לRBCs היחיד (P1, אדום). Agglutinates מוצג בירוק (P2). B) השפעת טיטרציה של סרום מטופל AIHA על תצהיר C4. שליטת אלוטיפ (אנטי IL6 עכבר IgG1) מוצגת כאפורה מוצק, ואילו המדגם מוצג בשחור. הגדלת כמות סרום מטופל מובילה לעלייה בתצהיר. C C4) דומה כמו B), אבל עכשיו עם גילוי לתצהיר C3. ד) C4 תצהיר FACS תוצאות מתוארות בגרף המציג את שחזור של assay ומראה את ההבדלים ניכרים בין דגימות סרום מחולים שונים. ציר Y מייצג את עוצמת הקרינה החציונית. ה) דומה כמו D), אבל עכשיו בתצהיר C3. לחץ כאן כדיצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. נציג תוצאות למבחנים כמותיים המוליטית.) טיטרציה סרום מטופל AIHA בassay המוליטית, מראים כי עליות תמוגה reproducibly עם הריכוז בסרום החולה. לא תמוגה מתרחשת עם סרום בריא תורם (בכתום; בקרה שלילית) B) מעכב מתאים משלימים (אנטי C5 במקרה זה) יכול לבטל תמוגה בתיווך משלימים.. המוצג כאן היא טיטרציה של אנטי C5 בעוד סרום מטופל AIHA נשמר בריכוז קבוע. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מבחני לעיל הם שחזור וחזקים. הם קלים לביצוע וניתן לבצע אותם עם דגימות רבות באותו הזמן (בצלחת 96 היטב). לפיכך, גישה זו תהיה גם מתאימה למערכת אוטומטית לחלוטין, כגון: מערכת רובוט ELISA. בניגוד לטכניקות המשמשות כיום, מבחני האלה הם כמוני וזה יעזור לדוגמא: במחקר של ההשפעה של מעכבי משלים. יתר על כן, הפרשנות היא אובייקטיבית, אשר מהווה שיפור של מבחני המשמשים כיום.
לשניהם יש מבחני שלב אחד קריטי. חשוב בניתוח FACS הוא שער על פני כדוריות הדם האדום אחת, כי RBCs agglutinated ייתן גבוהה באופן מלאכותי אות, שכן הם נספרים כאירוע אחד. זה אפילו טוב יותר כדי למנוע התלכדות באמצעות ריכוזי סרום מטופל נמוכים, שכן ריכוזים נמוכים עדיין נותנים אותות טובים. ב assay המוליטית, חשוב להעביר את supernatant בזהירותדגירה חרי לתוך צלחת חדשה, שכן לשאת על פני כדוריות דם אדום של תוביל לאות לא אמינה (כמו בועות אוויר). מומלץ להשתמש RBCs 0 הקליד-בשני מבחני כדי למנוע בלבול עם הפעלה המשלימה חוסר התאמת AB0.
בשל האמינות וחוסנם מבחני אלה מתאימים ללמוד את היעילות של מעכבי משלים לAIHA כפי שמודגם בהתייחסות 11, על מנת לזהות הבדלי כמותית עדינים בהפעלה המשלימה. בשל רגישותם מבחני אלה עשויים לזהות הפעלת משלים בחולים שבו ההפעלה המשלימה בRBC מומלץ בחום, אך לא זוהו על ידי מבחני השגרתיים, כגון בAIHA קומבס שלילית, אם כי הצהרה זו עדיין דורשת אימות. הם גם יכולים לשמש כדי לקבוע את קיבולת השלמה הפעלה של allo-נוגדנים (הנגרמים על ידי עירוי דם או לדוגמא בRHD - אם היולדת ילד RHD +) אשר עשוי לסייע למטפל לנבאt ההתנהגות הקלינית של alloantibody זוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
SZ וDW לקבל מענק בלתי מוגבל של ViroPharma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| Bromelain | Sanquin | K1121 |
References
- Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
- Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
- Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
- Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr,, R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
- Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
- Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
- Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
- Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
- Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
- Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
- Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
- Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).
