Summary
Her beskriver vi to analyser for måling av komplementaktivering indusert av antistoff mot røde blodlegemer. Den store fordelen over dagens analyser er deres kvantitative og lett-å-tolke naturen.
Abstract
Antistoffer mot røde blodceller (RBC) kan føre til komplementaktivering som fører til en akselerert klaring via komplementreseptorer i leveren (ekstravaskulær hemolyse), eller fører til intravaskulær lyse av røde blodlegemer. Alloantibodies (f.eks ABO) eller autoantistoffer mot RBC antigener (som sett i autoimmun hemolytisk anemi, AIHA) som fører til komplementaktivering er potensielt skadelig og kan være - spesielt når som fører til intravaskulære lysis - fatal en. For tiden er komplementaktivering på grunn av (auto)-antistoffer på RBC-er undersøkt in vitro ved hjelp av Coombs test reflekterende komplementavsetning på RBC eller av et nonquantitative hemolytisk assay reflekterende RBC 1-4. Men for å vurdere effekten av komplement-hemmere, er det obligatorisk å ha kvantitative teknikker. Her beskriver vi to slike teknikker. For det første er pre et assay for å påvise C3-og C4-avleiring på røde blodceller som er indusert av antistoffer i pasientserumsentert. For dette er FACS-analyse brukes med fluorescensmerkede anti-C3-eller anti-C4-antistoffer. Deretter ble et kvantitativt hemolytisk analysen beskrevet. I dette assay, komplement-mediert hemolyse indusert av pasientserum blir målt gjør bruk av spektrofotometrisk detektering av det frigjorte hemoglobin. Begge disse analysene er meget reproduserbare og kvantitativ, tilrettelegging for studier av antistoff-fremkalt komplement-aktivering.
Introduction
Antistoffer mot røde blodceller (RBC) kan induseres ved transfusjon av røde blodlegemer uttrykker et antigen som ikke er tilstede på mottaker RBC. Disse allo-antistoffer kan føre til alvorlige akutte hemolytiske transfusjonsreaksjoner på grunn av komplementaktivering på følgende transfusjon fem. I auto-immune hemolytisk anemi (AIHA), pasienter har auto-antistoffer mot sine egne RBC. Dette fører til raskere clearance av cellene via interaksjonen av IgG bundet til røde blodlegemer med Fcγ-reseptorer på fagocytter i milten og / eller i tilfelle av auto-antistoffer i stand til å aktivere komplement via komplementreseptorer i leveren 6,7. Fulminant komplementaktivering resulterer i intravaskulær hemolyse er sjeldne, men ofte dødelig. Akselerert, utfylle mediert RBC ødeleggelse indusert av enten allo-eller autoantistoffer resulterer i akutt anemi og dermed potensielt dødelig vev hypoksi. De auto-antistoffer i AIHA er klassifisert i varme og kalde antistoffer, depending på den optimale temperatur de binder seg til RBC-er (37 ° C eller lavere, henholdsvis). De varme antistoffer er vanligvis av IgG-isotype, og de kalde antistoffer av IgM-isotypen 8,9. AIHA kan være sekundært til f.eks lymphoprolyferative lidelser, bindevevssykdommer, solide svulster, infeksjoner eller medikamenter, men i 50% av tilfellene AIHA er idiopatisk ni.
Påvisning av gammaglobulins (f.eks. IgG eller IgM) og utfylle bundet til pasientens RBC er utført ved hjelp av en semikvantitativ direkte antiglobulin (Coombs) test (DAT). I DAT pasientens RBC-er ble inkubert med anti-IgG eller anti-C3d. Forekomst av RBC agglutinasjon demonstrerer tilstedeværelse av vedlagte komplementkomponenter eller IgG-binding. Påvisning av allo-eller antistoffer i pasientens serum utføres ved hjelp av den indirekte antiglobulintest (IAT). I IAT, er bromelain behandlede test RBC-er inkubert med pasientserum, ble vasket og deretter inkubert med anti-hUman IgG. I tilfelle RBCs er blitt sensibilisert med anti-RBC IgG til stede i pasientens serum agglutinasjon oppstår. IgM antistoffer mot RBC vil direkte føre til agglutinasjon ved inkubasjon av bromelain behandlet test RBC med pasientserum. RBC agglutinasjon i den direkte Coombs test eller i IAT blir vurdert visuelt, enten ved øyet i et testrør, eller ved å laste prøven på en liten Sephadex kolonne separere agglutinerte og enkelt RBCs ved størrelse 1.
Et annet ofte brukt teknikk for å måle komplementaktivering på RBC-er den hemolytiske analysen 1, karakterisert ved at kapasiteten av pasientserum til å indusere (komplement-mediert) hemolyse av bromelain-behandlede røde blodlegemer 10 blir vurdert. Testen er kjent som positiv når supernatanten etter sentrifugering er farget rødt på grunn av frigjort hemoglobin og anses å være negativ hvis det forblir fargeløse. Både antiglobulintest og den hemolytiske analysen er semikvantitativ, ettersom den høyeste serum fortynning betegnes som testen fortsatt er positive.
Den antiglobulintest og hemolytisk analysen er robuste analyser som brukes rutinemessig i diagnostikk. Siden disse analysene er semikvantitativ og avhengig av erfaringen til teknikeren utførelse av analysen er de ikke egnet for å studere små forskjeller i komplementaktivering for RBC-er, som er nødvendig når man skal vurdere effekten av komplement-inhibitorer. Derfor utviklet vi to kvantitative analyser for å fastslå komplementaktivering av (auto-) antistoffer til RBC, som vi vil beskrive i denne artikkelen.
Først, har vi utviklet en analyse for å måle avsetningen av aktiverings fragmenter av komplement C3 og C4 på RBC-er (fig. 1A). I denne analyse, er humane bromelain behandlet type 0 RBCs inkubert med varme-inaktivert pasientserum (anti-RBC-antistoff-kilde), friskt AB serum (komplementkilde), og anti-C5 monoklonalt antistoff (Eculizumab). I løpet av denne incubation, vil C3 og C4 deponering oppstår hvis pasienten serum inneholder kompaktiverende anti-RBC-antistoffer. For å hindre at RBC ved nedstrøms komplementaktivering en blokkerende anti-C5 monoklonalt antistoff blir tilsatt. Deretter er C3-og C4 avsetning på RBCs detektert ved FACS ved bruk av fluorescensmerkede monoklonale antistoffer eller Fab-fragmenter som reagerer med C3 og C4, respektivt. Gating on enkelt RBC-er viktig for å sikre påliteligheten av resultatene. Fordelene ved denne teknikk er at et lite volum av pasientmaterialet er nødvendig, komplementaktivering på et tidlig trinn av kaskaden blir vurdert, og fremgangsmåten er reproduserbar og kvantitativ. En ytterligere fordel av å se på begge C3 og C4 er at en distinksjon kan gjøres mellom den klassiske og lectin aktiveringsveien (både C3-og C4-avsetning) og den alternative aktiveringsveien (bare C3 deposition). Anvendelse av bromelain-behandlede røde blodlegemer i stedet for ubehandlede RBCs øker følsomheten til somsi.
Den andre analysen er basert på for tiden brukes hemolytiske analysen (figur 1B). Menneskelige bromelain behandlet type 0 RBC blir inkubert med varme-inaktivert pasientserum (anti-RBC-antistoff-kilde) og frisk AB serum (komplementkilde). Hvis komplement aktiveres av pasienten anti-RBC-antistoffer, vil doseavhengig RBC forekomme, som fører til frigjøring av hemoglobin. Mengden av frigjort hemoglobin er kvantifisert ved å måle absorbans ved 414 nm i supernatanten etter sentrifugering ned intakt og fragmentert RBC-er. Absorbansen korrelerer med mengden av oppstått hemolyse. I motsetning til den nåværende brukte analysen, gir denne protokollen for en objektiv, kvantitativ verdi for hemolyse som er meget reproduserbar og ikke avhengig av personen tolke analysen.
En anvendelse av disse fremgangsmåter er blitt beskrevet i 11, hvor den potensielle bruk av C1-inhibitor som komplement inhibitor i AIHA var studied.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av Bromelain-behandlede røde blodceller
- Vask 0-skrev røde blodceller 3x med 1x PBS (sentrifugering ved 664 xg for 2-5 min).
- Inkuber 1 volum av pakkede røde blodlegemer med to volumdeler av en 0,5% bromelain oppløsningen i 10 minutter ved 37 ° C.
- Vask cellene 3x med 1x PBS.
- Cellene kan bli lagret som en 3% løsning ved 4 ° C i 1 x PBS i minst en uke.
2. C3-og C4 Deposition Analyse på RBC ved FACS
- Varme inaktivere den nødvendige mengden av pasientens serum (eller et annet anti-RBC-antistoff-kilde) ved oppvarming av prøven i 30 minutter ved 56 ° C.
- Vask bromelain-behandlede RBCs tre ganger i VBG - (5 mM Veronal, 150 mM NaCl, 0,05% gelatin pH 7,4) og resuspender dem i VBG + + (VBG - + 2 mM MgCl 2 + 10 mM CaCl 2) for å gi et 0,5% løsning.
- Pipetter følgende komponenter i en rund-bunnplate med et glass perle (for riktig blanding): 25 mikroliter 0,5% RBC, 37,5 mL friskt AB serum (komplementkilde) og 37,5 pl 200 pg / ml anti-C5. Anti-C5 er kostbart og kan være vanskelig å oppnå. Man kan vurdere å bruke C5-/C6-/C7- eller C8-mangel serum i stedet for AB serum og anti-C5.
- Til pasientens serum per brønn til en endelig konsentrasjon på 0,1 til 33%. Riktig for forskjeller i serumkonsentrasjon per brønn på grunn ved hjelp av varme-inaktivert AB serum. Legg VBG + + for å få et sluttvolum på 150 ul / brønn. Lukk plate med ELISA folie.
- Inkuber 1,5-2 timer ved 37 ° C under risting.
- Vask RBCs tre ganger med PBS + 0,5% BSA (sentri-fugering ved 664 x g i 2 min).
- Legg fluorescensmerkede anti-C3-og anti-C4-monoklonale antistoffer eller deres Fab-fragmenter (for å redusere agglutinasjon) i PBS + 0,5% BSA til en endelig konsentrasjon på 1 pg / ml. Her tilpasset utviklet anti-C3-Alexa Fluor 488 og anti-C4-Alexa Fluor 647 monoklonale antistoffer brukes, valg av these fluorescerende merkelapper tillater samtidig påvisning av C3-og C4 ved FACS.
- Inkuber 30-45 min ved romtemperatur med forsiktig risting.
- Vask RBC 3x med PBS + 0,5% BSA.
- Resuspender RBC 150 mL i PBS 0,5% BSA og pipetter dem inn i en ny plate (for å kvitte seg med glassperler før FACS-analyse).
- Utfør FACS analyse. Separate enkeltceller fra dubletter i et spredningsplotting FSC-A, sette porten på de enkelte RBC, velger du den aktuelle deteksjons kanal for fluorescens-signaler (f.eks FITC og APC).
- Kvantifisere resultater ved å bruke median fluorescens intensitet.
Merk: Det er mulig å bruke en isotype kontroll (f.eks fluorescensmerkede anti-IL6 mus IgG1). Imidlertid anbefales det å inkludere en sann negativ kontroll for eksempel ved inkubering av RBC-er uten pasientserum (kun AB serum) eller uten en komplementkilde (varme-inaktivert AB serum-og varme-inaktivert pasientserum), end deretter flekken disse med den samme anti-C3-Alexa Fluor 488 og anti-C4-Alexa Fluor 647 antistoffer. Dette gir en mer gyldig kontroll enn en isotype-kontroll i tilfelle av røde blodlegemer 12, selv om disse forskjellige kontroller vanligvis gi den samme, negativt utfall.
Tre. Kvantitativ Hemolytisk analysen
- Varme inaktivere den nødvendige mengden av pasientsera (eller et annet anti-RBC-antistoff-kilde) ved oppvarming av prøven i 30 min ved 56 ° C.
- Vask RBC 3x med VBG - og en gang med VBG + +.
- Pipetter av følgende komponenter til en rundbunnet plate med en glassperle (for riktig blanding): 35 pl 3% RBC-er, 25 pl frisk AB serum (komplementkilde) og 1-50% pasientserum. Riktig for forskjeller i serumkonsentrasjonen ved hjelp av varme-inaktivert AB serum. Legg VBG + + for å få et sluttvolum på 150 ul / brønn. Lukk plate med ELISA folie.
- Inkuber ved 37 ° C i 1,5-2 timer med risting.
- Centrifuge plate på 664 xg i 5 min med redusert retardasjon (f.eks retardasjon til full stopp i 2-3 min).
- Pipette 90 pl supernatant forsiktig i en ny mikrotiter-plate. Det er viktig på dette trinnet for å hindre at luftbobler og for å hindre å ta med intakte celler.
- Mål A414/690 i et egnet spektrofotometer.
- Uttrykk lysis som en prosentandel av den lysering av en prøve RBC-er med rent vann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A viser et representativt spredningsdiagram for RBC. Passende gating for enkelt RBCs kan sees i de FSC-W - FSC-A plot (P1). Vanligvis rundt 95% av RBCs faller innenfor denne P1 gate (enkeltceller), men når en høy prosentandel av pasientserum blir brukt, kan denne reduseres til 70 til 80%, spesielt når anti-RBC IgM er til stede i pasientens serum.
Representative resultater for virkningen av AIHA pasientserum på C4 deponering er vist i figur 2B og på C3 deponering i figur 2C. Som det kan sees i disse figurer, fører mer pasientserum til mer komplement avsetning, som ville være forventet. Merkelig, oppstår komplement deponering i to forskjellige positive topper. Dette er sannsynligvis ikke er forårsaket av heterogeniteten i RBC populasjonen, da de RBC-er trukket fra en enkelt donor. Vi undersøker fortsatt årsaken til dette fenomenet. Figurene 2D og 2E demonstrasjonste reproduserbarheten av C4 (fig. 2D) og C3 (fig. 2E) avleirings assays. De viser også den store variasjon i komplementavsetning kapasiteten av de forskjellige AIHA pasientprøver.
Et representativt resultat av den hemolytiske analysen med en AIHA pasientserumprøve inneholdende auto-antistoffer til RBC kan bli sett i figur 3A. Normalt en titrering med serumprøve gir en fin, reproduserbar kurve. Pasientsera variere betydelig i komplement aktivering kapasitet, og derfor utføre en titrering av hver pasient serum. Prøvene uten pasientens serum vanligvis gi en bakgrunn rundt 10-15% på grunn av absorpsjon av serumprøven anvendes som komplement-kilde. Derfor bør man sørge for å benytte en høy nok pasientserumkonsentrasjonen for å oppnå et signal som er vesentlig over denne bakgrunn. Med en passende komplement inhibitor som anti-C5, kan den hemolytiske signal titreres for seg som vist i f-igure 3B.
Figur 1. Skjematisk oversikt over de C3-og C4 avsetning assay (A) og den kvantitative hemolytiske analysen (B). Kort sagt, i C3-og C4 deponering assay, komplementavsetning indusert av AIHA pasientserum blir målt, mens i den hemolytiske analysen hemolyse indusert av AIHA pasientens serum oppdages. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Representative resultater for C3 og C4 avsetning enssay. A) Forslag gating strategi. Vist her er hvordan du velger bare for enkelt RBC (P1, rød). De agglutinates er vist i grønt (P2). B) Effekten av en titrering av AIHA pasientserumet på C4 deponering. Isotype kontroll (anti-IL6 mus IgG1) vises som solid grå, mens prøven er vist i svart. Økning av mengden av pasientens serum fører til en økning i C4 deponering. C) samme som B), men nå med deteksjon for C3 deponering. D) C4 deposition FACS resultater er vist i et diagram som viser reproduserbarheten av analysen, og som viser de betydelige forskjeller mellom serumprøver fra ulike pasienter. Y-aksen representerer median fluorescens intensitet. E) Lignende som D), men nå for C3 deponering. Klikk her for åse større bilde.
Figur 3. Representative resultater for de kvantitative hemolytiske assays. A) AIHA pasientserum titrering i den hemolytiske analysen, som viser at lysis øker reproduserbart med pasientserumkonsentrasjon. Ingen lysis oppstår med frisk donor serum (i oransje, negativ kontroll) B) En egnet komplement inhibitorer (anti-C5 i dette tilfellet) kan oppheve komplement-formidlet lysering.. Vist her er en titrering av anti-C5 mens AIHA pasientserumet ble holdt på et konstant konsentrasjon. Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ovennevnte analyser er reproduserbar og robust. De er lette å utføre, og det er mulig å utføre dem med mange prøver samtidig (i en 96-brønns plate). Derfor ville denne metode også være egnet for et helautomatisk system, for eksempel en ELISA robotsystem. I motsetning til de i dag brukte teknikk er disse analysene er kvantitativt, og dette vil bidra til å for eksempel i studier av effekten av komplement-inhibitorer. Videre er tolkningen målet, noe som er en forbedring i forhold til de nåværende brukte assays.
Begge analysene har ett kritisk punkt. Viktig i FACS analysen er å gate på enkelt RBC, fordi agglutinated RBC vil gi et kunstig høyt signal, siden de regnes som én hendelse. Det er enda bedre å hindre agglutinering ved bruk av lav pasientserumkonsentrasjoner, da lave konsentrasjoner fremdeles gi gode signaler. I den hemolytiske analysen, er det avgjørende å nøye overføre en supernatantfter inkubasjon inn en ny plate, vil siden carry-over av RBC føre til en upålitelig signal (som vilje luftbobler). Det anbefales å bruke 0-skrev RBC i begge analysene for å unngå forvirring med AB0 mismatch komplementaktivering.
Med hensyn til deres pålitelighet og robusthet disse analysene er egnet for å studere effekten av komplement-inhibitorer for AIHA som vist i referanse 11, for å detektere kvantitativt små forskjeller i komplementaktivering. På grunn av deres følsomhet disse analysene kan oppdage komplementaktivering hos pasienter hvor komplementaktivering på RBC er sterkt anbefalt, men ikke oppdages av den rutinemessige analyser, for eksempel i Coombs-negativ AIHA, men denne uttalelsen fortsatt krever verifisering. De kan også brukes til å bestemme komplementaktiverende effekt på allo-antistoffer (for eksempel indusert ved blodtransfusjon eller i en RhD - mor bærer en RhD + barn), som kan hjelpe legen til å forutsit den kliniske oppførselen til en oppdaget alloantibody.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
SZ og DW får en ubegrenset tilskudd av ViroPharma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| Bromelain | Sanquin | K1121 |
References
- Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
- Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
- Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
- Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr,, R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
- Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
- Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
- Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
- Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
- Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
- Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
- Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
- Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).
