Summary
यहाँ हम लाल रक्त कोशिकाओं के खिलाफ एंटीबॉडी से प्रेरित सक्रियण पूरक मापने के लिए दो assays का वर्णन है. वर्तमान assays से अधिक प्रमुख लाभ उनकी मात्रात्मक और आसान करने के लिए व्याख्या प्रकृति है.
Abstract
लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) के खिलाफ एंटीबॉडी जिगर (extravascular रक्तापघटन) या लाल रक्त कोशिकाओं की intravascular सेल करने के लिए अग्रणी में पूरक रिसेप्टर्स के माध्यम से एक त्वरित निकासी में जिसके परिणामस्वरूप सक्रियण पूरक हो सकता है. Intravascular सेल के प्रमुख के लिए विशेष रूप से जब - - सक्रियण पूरक करने के लिए अग्रणी Alloantibodies (autoimmune एनीमिया, AIHA में देखा है) (जैसे एबीओ) या आरबीसी एंटीजन को autoantibodies संभावित हानिकारक हैं और हो सकता है घातक 1. वर्तमान में, कारण लाल रक्त कोशिकाओं पर (ऑटो) एंटीबॉडी के लिए सक्रियण पूरक आरबीसी पर या आरबीसी सेल 1-4 दर्शाती एक nonquantitative रक्तलायी परख द्वारा पूरक बयान को दर्शाती Coombs परीक्षण का उपयोग करके इन विट्रो में मूल्यांकन किया है. हालांकि, पूरक inhibitors की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए, यह मात्रात्मक तकनीकों है अनिवार्य है. यहाँ हम दो तरह की तकनीक का वर्णन. सबसे पहले, रोगी सीरम में एंटीबॉडी से प्रेरित है कि लाल रक्त कोशिकाओं पर C3 और C4 बयान पता लगाने के लिए एक परख पूर्व हैभेंट. इस के लिए, FACS विश्लेषण fluorescently लेबल विरोधी C3 या विरोधी C4 एंटीबॉडी के साथ प्रयोग किया जाता है. इसके बाद, एक मात्रात्मक रक्तलायी परख वर्णित है. रोगी सीरम से प्रेरित इस परख में, पूरक की मध्यस्थता रक्तापघटन जारी किया हीमोग्लोबिन की spectrophotometric का पता लगाने का उपयोग कर मापा जाता है. इन assays के दोनों एंटीबॉडी प्रेरित सक्रियण पूरक की पढ़ाई की सुविधा, बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मात्रात्मक हैं.
Introduction
लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) के खिलाफ एंटीबॉडी प्राप्तकर्ता लाल रक्त कोशिकाओं पर मौजूद नहीं है जो एक प्रतिजन व्यक्त लाल रक्त कोशिकाओं के आधान द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. ये allo-एंटीबॉडी निम्नलिखित आधान 5 पर सक्रियण पूरक की वजह से गंभीर तीव्र रक्तलायी आधान प्रतिक्रिया हो सकती है. ऑटो प्रतिरक्षा एनीमिया (AIHA) में, रोगियों को अपने स्वयं के लाल रक्त कोशिकाओं के खिलाफ ऑटो एंटीबॉडी है. इस तिल्ली में और / या जिगर 6,7 में पूरक रिसेप्टर्स के माध्यम से पूरक सक्रिय करने में सक्षम ऑटो एंटीबॉडी के मामले में फ़ैगोसाइट पर Fcγ रिसेप्टर्स के साथ लाल रक्त कोशिकाओं के लिए बाध्य आईजीजी की बातचीत के माध्यम से कोशिकाओं के त्वरित निकासी के लिए जाता है. Intravascular रक्तापघटन में जिसके परिणामस्वरूप एकाएक बढ़ानेवाला सक्रियण पूरक दुर्लभ लेकिन अक्सर घातक है. त्वरित, तीव्र रक्ताल्पता में allo-या autoantibodies परिणाम और इसलिए घातक ऊतक हाइपोक्सिया या तो द्वारा प्रेरित मध्यस्थता आरबीसी विनाश के पूरक हैं. AIHA में ऑटो एंटीबॉडी dependin, गर्म और ठंडे एंटीबॉडी में वर्गीकृत कर रहे हैंवे लाल रक्त कोशिकाओं (क्रमशः 37 डिग्री सेल्सियस या कम,) करने के लिए बाध्य अधिकतम तापमान पर जी. गर्म एंटीबॉडी आईजीजी निर्धारण के आम तौर पर कर रहे हैं और आईजीएम की ठंड एंटीबॉडी 8,9 निर्धारण. AIHA जैसे lymphoprolyferative विकारों, संयोजी ऊतक रोगों, ठोस ट्यूमर, संक्रमण या दवाओं के लिए माध्यमिक जा सकता है, लेकिन मामलों के 50% में AIHA अज्ञातहेतुक 9 है.
Gammaglobulins (जैसे. आईजीजी या आईजीएम) का पता लगाने और मरीज की लाल रक्त कोशिकाओं के लिए बाध्य पूरक एक semiquantitative प्रत्यक्ष antiglobulin (Coombs) परीक्षण (डीएटी) के माध्यम से किया जाता है. डैट में रोगी लाल रक्त कोशिकाओं विरोधी आईजीजी या विरोधी C3d साथ incubated हैं. आरबीसी समूहन की घटना को संलग्न पूरक घटकों या आईजीजी बंधन की उपस्थिति को दर्शाता है. Allo-या रोगी के सीरम में autoantibodies की जांच अप्रत्यक्ष antiglobulin टेस्ट (आई ए टी) के माध्यम से किया जाता है. आई ए टी में, bromelain इलाज परीक्षण लाल रक्त कोशिकाओं, रोगी सीरम के साथ incubated धोया और फिर विरोधी ज के साथ incubated हैंआईजीजी उमान. मामले में लाल रक्त कोशिकाओं विरोधी आरबीसी आईजीजी रोगी सीरम समूहन में उपस्थित घटित होगा के साथ अवगत किया गया है. लाल रक्त कोशिकाओं को आईजीएम एंटीबॉडी सीधे रोगी सीरम के साथ ब्रोमलेन इलाज परीक्षण लाल रक्त कोशिकाओं की ऊष्मायन पर समूहन को बढ़ावा मिलेगा. प्रत्यक्ष Coombs परीक्षण में या आईएटी में आरबीसी समूहन नेत्रहीन एक टेस्ट ट्यूब में आंखों से या आकार 1 से agglutinated और एक लाल रक्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक छोटा सा Sephadex स्तंभ पर नमूना लोड करके या तो मूल्यांकन किया है.
लाल रक्त कोशिकाओं पर सक्रियण पूरक उपाय करने के लिए एक और अक्सर इस्तेमाल तकनीक ब्रोमलेन इलाज लाल रक्त कोशिकाओं से 10 (पूरक की मध्यस्थता) रक्तापघटन प्रेरित करने के लिए रोगी सीरम की क्षमता का आकलन किया जाता है जिसमें रक्तलायी परख 1, है. Centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला के कारण जारी किया हीमोग्लोबिन को लाल दाग और यह बेरंग रहता है अगर नकारात्मक माना जाता है जब परीक्षण सकारात्मक रूप में विख्यात है. Antiglobulin परीक्षण और रक्तलायी परख दोनों, semiquantitative हैं के बाद से उच्चतम SERUएम कमजोर पड़ने परीक्षण अभी भी सकारात्मक है, जिसमें दर्शाया जाता है.
antiglobulin परीक्षण और रक्तलायी परख नियमित निदान में किया जाता है कि मजबूत assays हैं. इन assays semiquantitative और पूरक inhibitors की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करते समय जरूरत के रूप में वे, लाल रक्त कोशिकाओं पर सक्रियण पूरक के सूक्ष्म अंतर का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं परख प्रदर्शन तकनीशियन के अनुभव पर निर्भर हैं. इसलिए, हम हम इस पत्र में वर्णन करेंगे जो लाल रक्त कोशिकाओं, के लिए (ऑटो) एंटीबॉडी द्वारा सक्रियण पूरक निर्धारित करने के लिए दो मात्रात्मक assays विकसित की है.
सबसे पहले, हम लाल रक्त कोशिकाओं पर पूरक C3 और C4 के सक्रियण टुकड़े के बयान (चित्रा 1 ए) को मापने के लिए एक परख विकसित की है. इस परख में, मानव ब्रोमलेन इलाज प्रकार -0 लाल रक्त कोशिकाओं गर्मी निष्क्रिय रोगी सीरम (एंटी आरबीसी एंटीबॉडी स्रोत), ताजा अटल बिहारी सीरम (पूरक स्रोत) और विरोधी C5 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (Eculizumab) के साथ incubated हैं. इस इंक के दौरानरोगी सीरम विरोधी आरबीसी एंटीबॉडी को सक्रिय करने के लिए पूरक होता अगर ubation, C3 और C4 बयान घटित होगा. बहाव के सक्रियण पूरक द्वारा आरबीसी सेल को रोकने के लिए एक अवरुद्ध विरोधी C5 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी गयी है. अगला, लाल रक्त कोशिकाओं पर C3 और C4 बयान क्रमशः C3 और C4, साथ प्रतिक्रिया fluorescently लेबल मोनोक्लोनल एंटीबॉडी या फैब टुकड़े का उपयोग कर FACS द्वारा पता चला है. एकल लाल रक्त कोशिकाओं पर gating परिणामों की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस तकनीक का लाभ रोगी सामग्री की एक छोटी मात्रा, झरना का एक प्रारंभिक चरण में सक्रियण पूरक मूल्यांकन किया है की आवश्यकता है और विधि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मात्रात्मक है कि शामिल हैं. C3 और C4 दोनों को देखने का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि एक अंतर शास्त्रीय और लेक्टिन मार्ग सक्रियण (C3 और C4 बयान दोनों) और वैकल्पिक मार्ग सक्रियण (केवल सी 3 जमाव) के बीच किया जा सकता है. बजाय अनुपचारित लाल रक्त कोशिकाओं की ब्रोमलेन इलाज लाल रक्त कोशिकाओं के उपयोग के रूप में की संवेदनशीलता बढ़ जाती हैकहने.
दूसरी परख वर्तमान में इस्तेमाल किया रक्तलायी परख (चित्रा 1 बी) पर आधारित है. मानव ब्रोमलेन इलाज प्रकार -0 लाल रक्त कोशिकाओं गर्मी निष्क्रिय रोगी सीरम (एंटी आरबीसी एंटीबॉडी स्रोत) और ताजा अटल बिहारी सीरम (पूरक स्रोत) के साथ incubated हैं. पूरक रोगी विरोधी आरबीसी एंटीबॉडी से सक्रिय है, तो खुराक निर्भर आरबीसी सेल हीमोग्लोबिन की रिहाई के लिए अग्रणी हो जाएगा. जारी की हीमोग्लोबिन की मात्रा बरकरार है और खंडित लाल रक्त कोशिकाओं नीचे कताई के बाद सतह पर तैरनेवाला में 414 एनएम पर अपनी absorbance को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित है. absorbance हुई रक्तापघटन की राशि के साथ संबद्ध करता है. वर्तमान में इस्तेमाल किया परख के विपरीत, इस प्रोटोकॉल एक उद्देश्य, बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और परख की व्याख्या व्यक्ति पर निर्भर नहीं है कि रक्तापघटन की मात्रात्मक मूल्य के लिए अनुमति देता है.
इन तरीकों में से एक आवेदन AIHA में पूरक अवरोध करनेवाला के रूप C1 अवरोध करनेवाला की क्षमता का उपयोग है था, जहां 11 में वर्णित किया गया हैTUDIED.
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Protocol
1. Bromelain इलाज लाल रक्त कोशिकाओं की तैयारी
- धो 0 टाइप लाल रक्त कोशिकाओं 1x पीबीएस (2-5 मिनट के लिए 664 XG पर centrifugation) के साथ 3x.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक 0.5% ब्रोमलेन समाधान के दो संस्करणों के साथ पैक लाल रक्त कोशिकाओं की 1 मात्रा सेते
- कोशिकाओं 1x पीबीएस के साथ 3x धो लें.
- कोशिकाओं में कम से कम एक सप्ताह के लिए 1x पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 3% समाधान के रूप में जमा किया जा सकता है.
2. FACS द्वारा लाल रक्त कोशिकाओं पर C3 और C4 बयान विश्लेषण
- 56 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूना हीटिंग द्वारा रोगी सीरम के लिए आवश्यक राशि (या अन्य विरोधी आरबीसी एंटीबॉडी स्रोत) गर्मी निष्क्रिय
- (5 मिमी Veronal, 150 मिमी NaCl, 0.05% जिलेटिन पीएच 7.4) और VBG + + में resuspend - VBG में ब्रोमलेन इलाज लाल रक्त कोशिकाओं में तीन बार धोएं (VBG - + 2 मिमी 2 MgCl + 10 मिमी 2 CaCl) एक देने के लिए 0.5% समाधान.
- (च एक गिलास मोती के साथ एक दौर नीचे थाली में निम्न घटक पिपेटया उचित मिश्रण): 25 μl 0.5% लाल रक्त कोशिकाओं, 37.5 μl ताजा अटल बिहारी सीरम (पूरक स्रोत) और 37.5 μl 200 माइक्रोग्राम / एमएल विरोधी सी 5. विरोधी C5 महंगा है और प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है. एक C5-/C6-/C7- या C8 की कमी सीरम के बजाय अटल बिहारी सीरम और विरोधी C5 उपयोग करने पर विचार कर सकता है.
- 0.1-33% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए अच्छी तरह से प्रति रोगी सीरम जोड़ें. सही गर्मी निष्क्रिय अटल बिहारी सीरम का उपयोग होने के कारण अच्छी तरह से प्रति सीरम एकाग्रता में मतभेद के लिए. अच्छी तरह से 150 μl / के अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए VBG + + जोड़ें. एलिसा पन्नी के साथ बंद थाली.
- मिलाते हुए, जबकि 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5-2 घंटा सेते हैं.
- पीबीएस + 0.5% BSA (2 मिनट के लिए 664 XG पर centrifugation) के साथ लाल रक्त कोशिकाओं में तीन बार धोएं.
- जोड़ें fluorescently विरोधी C3 लेबल और विरोधी C4 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी या उनके फैब टुकड़े 1 ग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस + 0.5% BSA में (समूहन को कम करने के लिए). यहाँ कस्टम विरोधी C3-एलेक्सा Fluor 488 विकसित की है और विरोधी C4-एलेक्सा Fluor 647 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का इस्तेमाल कर रहे हैं, thes के विकल्पई फ्लोरोसेंट लेबल FACS द्वारा C3 और C4 के साथ पता लगाने की अनुमति देता है.
- कोमल झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 30-45 मिनट सेते हैं.
- पीबीएस + 0.5% BSA के साथ धो लाल रक्त कोशिकाओं 3x.
- Resuspend लाल रक्त कोशिकाओं 150 पीबीएस 0.5% BSA में μl और (FACS विश्लेषण से पहले कांच मोती से छुटकारा पाने के लिए) एक नई प्लेट में उन्हें विंदुक.
- FACS विश्लेषण करते हैं. एक तितर बितर साजिश रचने FSC-A में दोहरी से अलग एकल कक्षों, एक लाल रक्त कोशिकाओं पर गेट सेट, प्रतिदीप्ति संकेत (जैसे FITC और एपीसी) के लिए उपयुक्त पता लगाने के चैनल का चयन करें.
- मंझला प्रतिदीप्ति तीव्रता का उपयोग कर परिणाम यों.
नोट: यह एक निर्धारण नियंत्रण (जैसे fluorescently विरोधी IL6 माउस IgG1 लेबल) का उपयोग करना संभव है. हालांकि, यह रोगी सीरम (केवल अटल बिहारी सीरम) के बिना या एक पूरक स्रोत (गर्मी निष्क्रिय अटल बिहारी सीरम और गर्मी निष्क्रिय रोगी सीरम) के बिना लाल रक्त कोशिकाओं incubating द्वारा जैसे एक सच्चे नकारात्मक नियंत्रण शामिल करने के लिए सिफारिश की है एकडी तो एक ही विरोधी C3-एलेक्सा Fluor 488 और विरोधी C4-एलेक्सा Fluor 647 एंटीबॉडी के साथ इन दाग. इन विभिन्न नियंत्रण आमतौर पर एक ही, नकारात्मक परिणाम देने, हालांकि यह लाल रक्त कोशिकाओं को 12 के मामले में एक निर्धारण नियंत्रण की तुलना में एक अधिक मान्य नियंत्रण देता है.
3. मात्रात्मक Hemolytic परख
- 56 डिग्री सेल्सियस पर नमूना 30 मिनट हीटिंग द्वारा रोगी सीरा के लिए आवश्यक राशि (या अन्य विरोधी आरबीसी एंटीबॉडी स्रोत) गर्मी निष्क्रिय
- VBG साथ धो लाल रक्त कोशिकाओं 3x - और एक बार VBG साथ + +.
- (उचित मिश्रण के लिए) एक गिलास मोती के साथ एक दौर नीचे थाली में निम्न घटक पिपेट: 35 μl 3% लाल रक्त कोशिकाओं, 25 μl ताजा अटल बिहारी सीरम (पूरक स्रोत) और 1-50% रोगी सीरम. गर्मी निष्क्रिय अटल बिहारी सीरम का उपयोग सीरम एकाग्रता में अंतर के लिए सही है. अच्छी तरह से 150 μl / के अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए VBG + + जोड़ें. एलिसा पन्नी के साथ बंद थाली.
- झटकों के साथ 1.5-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- सीकम मंदी (2-3 मिनट में पूर्ण विराम के लिए जैसे मंदी) के साथ 5 मिनट के लिए 664 XG पर entrifuge थाली.
- ध्यान से एक नया microtiter प्लेट में 90 μl सतह पर तैरनेवाला पिपेट. यह हवाई बुलबुले को रोकने के लिए और कोशिकाओं बरकरार साथ लेने के लिए रोकने के लिए इस कदम पर महत्वपूर्ण है.
- एक उपयुक्त स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में A414/690 उपाय.
- शुद्ध पानी के साथ एक नमूना लाल रक्त कोशिकाओं के सेल का एक प्रतिशत के रूप में सेल व्यक्त करें.
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Representative Results
चित्रा 2A लाल रक्त कोशिकाओं के लिए एक प्रतिनिधि तितर बितर साजिश से पता चलता है. FSC द्वारा एक साजिश (P1) - एक लाल रक्त कोशिकाओं के लिए उपयुक्त gating डे FSC-W में देखा जा सकता है. लाल रक्त कोशिकाओं के आसपास आम तौर पर 95% इस P1 के गेट (एकल कक्षों) में आते हैं, लेकिन रोगी सीरम की एक उच्च प्रतिशत प्रयोग किया जाता है जब विरोधी आरबीसी आईजीएम रोगी सीरम में मौजूद है, खासकर जब यह 70-80% करने के लिए छोड़ सकते हैं.
C4 बयान पर AIHA रोगी सीरम के प्रभाव के लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2B में और चित्रा -2 में C3 बयान पर दिखाए जाते हैं. इन आंकड़ों में देखा जा सकता है की संभावना होगी, अधिक रोगी सीरम, अधिक पूरक बयान की ओर जाता है. मजे की बात है, पूरक बयान के दो अलग सकारात्मक चोटियों में होता है. लाल रक्त कोशिकाओं एक दाता से तैयार कर रहे हैं के बाद से यह शायद, आरबीसी आबादी में विविधता के कारण नहीं है. हम अभी भी इस घटना के कारण की जांच कर रहे हैं. 2 डी और 2 ई प्रदर्शन है आंकड़ेसी 4 (चित्रा 2 डी) और C3 (चित्रा 2 ई) बयान assays के reproducibility ते. उन्होंने यह भी विभिन्न AIHA मरीज के नमूनों की पूरक बयान क्षमता में व्यापक बदलाव दिखा.
लाल रक्त कोशिकाओं को ऑटो एंटीबॉडी युक्त एक AIHA रोगी सीरम के नमूने के साथ रक्तलायी परख का एक प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 में देखा जा सकता है. आम तौर पर, सीरम के नमूने के साथ एक अनुमापन एक अच्छा, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वक्र पैदावार. रोगी सीरा पूरक को सक्रिय करने की क्षमता में काफी भिन्नता है, इसलिए प्रत्येक रोगी के सीरम की एक अनुमापन प्रदर्शन करते हैं. रोगी सीरम के बिना नमूने कारण आम तौर पर पूरक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया सीरम नमूना द्वारा अवशोषण के लिए एक पृष्ठभूमि लगभग 10-15% दे. इसलिए, देखभाल काफी हद तक इस पृष्ठभूमि के ऊपर है कि एक संकेत प्राप्त करने के लिए एक काफी उच्च रोगी सीरम एकाग्रता का उपयोग करने के लिए लिया जाना चाहिए. एफ के रूप में दिखाया विरोधी C5 के रूप में एक उपयुक्त पूरक अवरोध करनेवाला के साथ, रक्तलायी संकेत दूर titrated किया जा सकता हैigure 3 बी.
चित्रा 1. C3-और C4 बयान परख में संक्षेप में C3 और C4 बयान परख (ए) और मात्रात्मक रक्तलायी परख (बी)., योजनाबद्ध सिंहावलोकन, AIHA रोगी सीरम से प्रेरित बयान के पूरक हैं, मापा जाता है रक्तलायी परख रक्तापघटन में जबकि AIHA रोगी सीरम का पता चला है द्वारा प्रेरित किया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. C3 और C4 बयान एक के लिए प्रतिनिधि परिणामssay. ए) रणनीति gating का सुझाव दिया. यहाँ दिखाया गया है केवल (लाल पी 1,) एक लाल रक्त कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए है. agglutinates ग्रीन (P2) में दिखाया गया है. बी) C4 बयान पर AIHA रोगी सीरम की एक अनुमापन का प्रभाव. नमूना काले रंग में दिखाया गया है, जबकि निर्धारण नियंत्रण (एंटी IL6 माउस IgG1), ठोस ग्रे के रूप में दिखाया गया है. रोगी सीरम की राशि बढ़ाने बी के रूप में इसी तरह के C4 बयान. सी)) में वृद्धि हो जाती है लेकिन अब C3 बयान के लिए पता लगाने के साथ. डी) C4 बयान FACS परिणाम परख के reproducibility दिखा और काफी मतभेद दिखा ग्राफ में दर्शाया विभिन्न रोगियों से सीरम नमूनों के बीच. वाई अक्ष डी के रूप में इसी तरह के) ई. मंझला प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है), लेकिन अब C3 बयान लिए. के लिए क्लिक करेंबड़ी छवि को देखने.
चित्रा 3. दिखा मात्रात्मक रक्तलायी assays रक्तलायी परख में. ए) AIHA रोगी सीरम अनुमापन, के लिए प्रतिनिधि परिणाम है कि रोगी सीरम एकाग्रता के साथ reproducibly सेल बढ़ जाती है. ख) इस मामले में एक उपयुक्त पूरक अवरोध करनेवाला (एंटी सी 5) पूरक की मध्यस्थता सेल रद्द कर सकते हैं. कोई सेल (नकारात्मक नियंत्रण नारंगी में) स्वस्थ दाता सीरम के साथ होता है. AIHA रोगी सीरम एक निरंतर एकाग्रता में रखा गया था, जबकि विरोधी C5 के एक अनुमापन यहाँ दिखाया गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
ऊपर assays प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मजबूत कर रहे हैं. वे प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं और यह (एक 96 अच्छी तरह से थाली में) एक ही समय में कई नमूनों के साथ उन्हें प्रदर्शन करने के लिए संभव है. इसलिए, इस दृष्टिकोण भी एक एलिसा रोबोट प्रणाली जैसे, एक पूरी तरह से स्वचालित प्रणाली के लिए उपयुक्त होगा. वर्तमान में इस्तेमाल की तकनीक के विपरीत, इन assays मात्रात्मक कर रहे हैं और यह पूरक inhibitors के प्रभाव के अध्ययन में जैसे मदद मिलेगी. इसके अलावा, व्याख्या वर्तमान में इस्तेमाल किया assays पर एक सुधार है, जो उद्देश्य है.
दोनों assays के एक महत्वपूर्ण कदम है. वे एक घटना के रूप में गिने जाते हैं, क्योंकि agglutinated लाल रक्त कोशिकाओं, एक कृत्रिम रूप से उच्च संकेत दे देंगे क्योंकि FACS विश्लेषण में महत्वपूर्ण है, एक लाल रक्त कोशिकाओं पर फाटक के पास है. कम मात्रा अभी भी अच्छे संकेत देने के बाद से यह कम रोगी सीरम सांद्रता का उपयोग करके समूहन को रोकने के लिए भी बेहतर है. रक्तलायी परख में, यह ध्यान से सतह पर तैरनेवाला एक हस्तांतरण के लिए महत्वपूर्ण हैएक नई प्लेट में fter ऊष्मायन, लाल रक्त कोशिकाओं की अधिकता के बाद से (विल हवाई बुलबुले के रूप में) एक अविश्वसनीय संकेत को बढ़ावा मिलेगा. यह AB0 बेमेल सक्रियण पूरक के साथ भ्रम की स्थिति को रोकने के लिए दोनों assays में 0 टाइप लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.
कारण उनकी विश्वसनीयता और मजबूती के लिए इन assays संदर्भ 11 में प्रदर्शन के रूप में सक्रियण पूरक में मात्रात्मक सूक्ष्म अंतर का पता लगाने के क्रम में, AIHA के लिए पूरक inhibitors की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैं. इस बयान अभी भी सत्यापन की आवश्यकता है, हालांकि, आरबीसी पर सक्रियण पूरक दृढ़ता से सुझाव दिया है जहां के कारण उनकी संवेदनशीलता को इन assays रोगियों में सक्रियण पूरक पता लगा सकता है लेकिन इस तरह के Coombs नकारात्मक AIHA में के रूप में नियमित assays, द्वारा पता नहीं. Predic के लिए चिकित्सक की मदद कर सकते हैं - वे भी (एक RhD + बच्चे असर मां जैसे रक्त आधान द्वारा या एक RhD में प्रेरित) allo-एंटीबॉडी के पूरक को सक्रिय करने की क्षमता का निर्धारण किया जा सकता हैएक का पता चला alloantibody के नैदानिक व्यवहार टी.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
SZ और DW ViroPharma का एक अप्रतिबंधित अनुदान प्राप्त करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| Bromelain | Sanquin | K1121 |
References
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