Summary
Hier beschrijven we twee assays voor het meten van complement activatie geïnduceerd door antilichamen tegen rode bloedcellen. Het grote voordeel boven de huidige assays is de kwantitatieve en eenvoudig te interpreteren natuur.
Abstract
Antilichamen tegen rode bloedcellen (RBC's) kan leiden tot activatie resulteert in een versnelde klaring via complement receptoren in de lever (extravasculaire hemolyse) of tot intravasculaire lysis van erytrocyten vullen. Antistoffen (bijv. ABO) of auto-antilichamen tegen RBC antigenen (zoals in auto-immune hemolytische anemie, AIHA) leidt tot activatie vullen potentieel schadelijk en kan - vooral wanneer die tot intravasculaire lysis - fataal 1. Momenteel vullen wordt geactiveerd door een (auto)-antilichamen op rode bloedcellen wordt beoordeeld in vitro met behulp van de Coombs-test weerspiegelt complement afzetting op RBC of door een nonquantitative hemolytische assay reflecterende RBC lysis 1-4. Echter, om de werkzaamheid van complement-remmers te beoordelen, is het verplicht om kwantitatieve technieken. Hier beschrijven we twee dergelijke technieken. Eerst een test om C3 en C4 depositie detecteren op rode bloedcellen die wordt geïnduceerd door antilichamen in patiëntenserum voorafwoordigd. Hiervoor wordt FACS-analyse gebruikt fluorescent gemerkt anti-C3 of C4 anti-antilichamen. Vervolgens wordt een kwantitatieve hemolytische test beschreven. In deze test, complement-gemedieerde hemolyse geïnduceerd door patiënt serum gemeten te maken van spectrofotometrische detectie van de vrijgekomen hemoglobine. Beide testen zijn zeer reproduceerbaar en kwantitatief, vergemakkelijken studies van antilichamen geïnduceerde complement activatie.
Introduction
Antilichamen tegen rode bloedcellen (RBC's) kan worden geïnduceerd door transfusie van rode bloedcellen een antigeen tot expressie die niet aanwezig ontvanger RBC. Deze allo-antilichamen kunnen ernstige acute hemolytische transfusiereacties als gevolg van activering op de volgende transfusie 5 aanvullen veroorzaken. In auto-immune hemolytische anemie (AIHA), patiënten autoantilichamen tegen hun eigen RBCs. Dit leidt tot versnelde goedkeuring van de cellen via de interactie van IgG gebonden aan RBC met Fcy-receptoren op fagocyten in de milt en / of bij auto-antilichamen kunnen complement via complement receptoren in de lever 6,7 activeren. Fulminante complement activatie resulteert in intravasculaire hemolyse is zeldzaam maar vaak fataal. Versnelde, aanvulling bemiddelde RBC vernietiging veroorzaakt door ofwel allo-of auto-antilichamen resulteert in acute bloedarmoede en dus potentieel fatale weefsel hypoxie. De auto-antilichamen in AIHA worden ingedeeld in warme en koude antilichamen, dependinG op de optimale temperatuur die binden aan RBC (respectievelijk 37 ° C of lager). De warme antilichamen zijn gewoonlijk IgG isotype en de koude antilichamen van het IgM isotype 8,9. AIHA kan secundair aan bijvoorbeeld lymphoprolyferative aandoeningen, bindweefselziekten, vaste tumoren, infecties of drugs, maar in 50% van de gevallen AIHA idiopathisch 9.
Detectie van gammaglobulinen (bijv.. IgG of IgM) en complement gebonden aan RBC patiënt wordt uitgevoerd door middel van een semikwantitatieve directe antiglobulinetest (Coombs test) (DAT). In de DAT patiënt RBC geïncubeerd met anti-IgG of anti-C3d. Het optreden van RBC agglutinatie toont de aanwezigheid van bijgevoegde complement componenten of IgG binding. Detectie van allo-of auto-antilichamen in het serum van de patiënt wordt uitgevoerd door middel van de indirecte antiglobulinetest (IAT). In de IAT, worden-bromelaïne behandeld testen RBC geïncubeerd met patiënt serum, gewassen en vervolgens geïncubeerd met anti-hUman IgG. Indien rode bloedcellen gesensibiliseerd met anti-RBC IgG aanwezig in de patiënt serumagglutinatie optreden. IgM antilichamen tegen RBC zal direct leiden tot agglutinatie na incubatie van bromelaïne behandeld testen RBC met de patiënt serum. RBC agglutinatie in de directe Coombs-test of in de IAT wordt visueel beoordeeld hetzij door oog in een reageerbuis of door het laden van het monster op een kleine Sephadex kolom scheiden geagglutineerde en single RBC op grootte 1.
Een andere vaak gebruikte techniek om complement activatie op RBC meten is de hemolytische test 1, waarbij de capaciteit van patiënt serum (complement gemedieerde) hemolyse van bromelaïne behandelde RBC 10 induceren beoordeeld. De test wordt genoteerd als positief wanneer de bovenstaande vloeistof na centrifugeren rood is gekleurd vanwege vrijgegeven hemoglobine en als negatief beschouwd als het kleurloos blijft. Zowel de antiglobulinetest en de hemolytische assay zijn semi-kwantitatief, omdat de hoogste serum verdunning wordt aangeduid waarin de test is nog steeds positief.
De antiglobulinetest en de hemolytische assay zijn robuust testen die routinematig worden gebruikt in de diagnostiek. Aangezien deze tests zijn semikwantitatieve en afhankelijk van de ervaring van de technicus uitvoeren van de test zij niet geschikt om subtiele verschillen van complement activatie op RBC bestuderen, zoals nodig bij de beoordeling van de effectiviteit van complement inhibitors. Daarom ontwikkelden we twee kwantitatieve bepalingen om het complement activatie te bepalen door het (auto-) antilichamen tegen RBC, die we in dit artikel zal beschrijven.
Eerst, ontwikkelden we een test om de afzetting van activatie van complement fragmenten C3 en C4 op RBC (figuur 1A) te meten. In deze assay worden menselijke bromelaïne behandelde type 0 RBC geïncubeerd met warmte geïnactiveerd serum patiënt (anti-RBC antilichaam bron), vers AB serum (complement bron) en anti-C5 monoklonaal antilichaam (Eculizumab). Tijdens deze incubation, C3 en C4 depositie zal optreden als de patiënt serum bevat een aanvulling op het activeren van anti-RBC antistoffen. Om RBC lysis te voorkomen door downstream complement activatie een blokkerende anti-C5 monoklonaal antilichaam wordt toegevoegd. Vervolgens wordt C3 en C4 depositie op RBC gedetecteerd door FACS met fluorescent gemerkte monoklonale antilichamen of Fab-fragmenten reageren met C3 en C4, respectievelijk. Gating in enige RBC is belangrijk om de betrouwbaarheid van de resultaten te waarborgen. Voordelen van deze techniek zijn dat een kleine hoeveelheid patiënt materiaal nodig complementactivering in een vroeg stadium van de cascade wordt beoordeeld en de methode reproduceerbaar en kwantitatief. Een bijkomend voordeel van naar zowel C3 en C4 is dat onderscheid kan worden gemaakt tussen de klassieke en lectine-route activering (zowel C3 en C4 depositie) en de alternatieve route activering (alleen C3 depositie). Het gebruik van bromelaïne behandelde RBC plaats van onbehandelde erytrocyten verhoogt de gevoeligheid van de alszeggen.
De tweede test is gebaseerd op de momenteel gebruikte hemolytische test (Figuur 1B). Human-bromelaïne behandelde type 0 RBC worden geïncubeerd met hitte-geïnactiveerd serum patiënt (anti-RBC antilichaam bron) en verse AB-serum (complement bron). Als complement geactiveerd door de patiënt anti-RBC antilichamen, zal dosisafhankelijk RBC lysis optreden, waardoor vrij hemoglobine. De hoeveelheid vrijgekomen hemoglobine wordt gekwantificeerd door het meten van de absorptie bij 414 nm in het supernatant na stoppen met draaien de intacte en gefragmenteerde RBC. De absorptie correleert met de hoeveelheid hemolyse plaatsgevonden. In tegenstelling tot de momenteel gebruikte assay Dit protocol maakt een objectieve kwantitatieve waarde van hemolyse dat zeer reproduceerbaar en onafhankelijk van de persoon die de interpretatie van de test.
Een toepassing van deze werkwijzen is beschreven in 11, waarbij het mogelijke gebruik van C1-inhibitor complement inhibitor in AIHA was studied.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Bromelaïne-behandelde rode bloedcellen
- Wassen 0-getypte rode bloedcellen 3x met 1x PBS (centrifugeren bij 664 g gedurende 2-5 min).
- Incubeer 1 volume verpakte erytrocyten met twee volumes 0,5% bromelaïne oplossing 10 minuten bij 37 ° C.
- Was de cellen 3x met 1x PBS.
- De cellen kunnen worden opgeslagen als een 3% oplossing bij 4 ° C in 1 x PBS gedurende ten minste een week.
2. C3 en C4 Deposition analyse over RBC door FACS
- Warmte-inactivatie van het vereiste hoeveelheid patiënt serum (of andere anti-RBC antilichaam bron) door verwarmen van het monster gedurende 30 minuten bij 56 ° C.
- Was-bromelaïne behandelde RBC driemaal VBG - (5 mM Veronal, 150 mM NaCl, 0,05% gelatine pH 7,4) en resuspendeer ze in VBG + + (VBG - + 2 mM MgCl2 + 10 mM CaCl2) een geven 0,5% oplossing.
- Pipetteer de volgende componenten in een ronde bodem plaat met een glas parel (fof goede menging): 25 pi 0,5% RBCs, 37,5 pi vers AB serum (complement bron) en 37,5 pi 200 pg / ml anti-C5. Anti-C5 is duur en moeilijk te verkrijgen zou zijn. Men zou kunnen overwegen om C5-/C6-/C7- of C8-deficiënte serum in plaats van AB-serum en anti-C5.
- Voeg patiëntenserum per putje tot een uiteindelijke concentratie van 0,1-33%. Corrigeren voor verschillen in serum concentratie per goed gevolg gebruik warmte-geïnactiveerd AB-serum. Voeg VBG + + tot een eindvolume van 150 ul / putje krijgen. Sluiten plaat met ELISA folie.
- Incubeer 1,5-2 uur bij 37 ° C onder schudden.
- Was de RBC driemaal met PBS + 0,5% BSA (centrifugatie bij 664 g gedurende 2 min).
- Voeg fluorescent gelabelde anti-C3 en C4 anti-monoklonale antilichamen of hun Fab-fragmenten (agglutinatie verlagen) in PBS + 0,5% BSA tot een eindconcentratie van 1 ug / ml. Hier maat ontwikkelde anti-C3-Alexa Fluor 488 en anti-C4-Alexa Fluor 647 monoklonale antilichamen worden gebruikt, de keuze van these fluorescente labels maakt gelijktijdige detectie van C3 en C4 door FACS.
- Incubeer 30-45 minuten bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
- Was RBCs 3x met PBS + 0,5% BSA.
- Hersuspenderen RBC 150 pl in PBS 0,5% BSA en pipet ze in een nieuwe plaat (om zich te ontdoen van de glazen parels voor de FACS-analyse).
- Voer FACS-analyse. Aparte enkele cellen van wambuizen in een scatter plotten FSC-A, zet de poort op de single RBC; selecteer de juiste detectie kanaal voor de fluorescentie-signalen (bijv. FITC en APC).
- Kwantificeren met behulp van de mediaan fluorescentie-intensiteit.
Opmerking: Het is mogelijk om een isotype controle (bijv. fluorescent gemerkt anti-IL6 muis IgG1) gebruikt. Echter, is het raadzaam om een echte negatieve controle bijvoorbeeld door incubatie RBC zonder patiënt serum (alleen AB-serum) of zonder complement bron (warmte-geïnactiveerd AB-serum en hitte-geïnactiveerd serum patiënt) omvatten, eend vlek vervolgens deze met dezelfde anti-C3-Alexa Fluor 488 en anti-C4-Alexa Fluor 647-antilichamen. Dit geeft een geldige controle dan een isotype controle bij rode bloedcellen 12, hoewel deze verschillende controles geven grotendeels hetzelfde, negatieve uitkomst.
3. Kwantitatieve Hemolytic Assay
- Warmte-inactivatie van het vereiste hoeveelheid patiëntensera (of andere anti-RBC antilichaam bron) door verhitting van het monster 30 minuten bij 56 ° C.
- Wassen RBC 3x VBG - en een keer met VBG + +.
- Pipetteer de volgende componenten in een ronde bodem plaat met een glas parel (voor een goede menging): 35 pl 3% RBC, 25 ul vers AB-serum (complement bron) en 1-50% serum patiënt. Corrigeren voor verschillen in serum concentratie met behulp van warmte-geïnactiveerd AB-serum. Voeg VBG + + tot een eindvolume van 150 ul / putje krijgen. Sluiten plaat met ELISA folie.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 1,5-2 uur onder schudden.
- Centrifuge plaat bij 664 xg gedurende 5 minuten met verminderde vertraging (bijv. vertraging tot stilstand in 2-3 min.).
- Pipet 90 ul supernatant voorzichtig in een nieuwe microtiterplaat. Het is belangrijk in deze stap om luchtbellen te voorkomen en te verhinderen mee te nemen intacte cellen.
- Meten A414/690 in een geschikte spectrofotometer.
- Druk het lysis als percentage van de lysis van een monster RBCs met zuiver water.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2a toont een representatief scatterplot voor RBC. Geschikt gating voor enkele rode bloedcellen kan worden gezien in de FSC-W - FSC-Een perceel (P1). Gewoonlijk ongeveer 95% van RBC vallen binnen deze poort P1 (enkelvoudige cellen), maar wanneer een hoog percentage patiënten serum wordt gebruikt, kan dit dalen tot 70-80%, vooral als anti-RBC IgM aanwezig in de patiënt serum.
Representatieve resultaten voor de invloed van AIHA patiëntenserum op C4 depositie Figuur 2B en C3 afzetting in figuur 2C. Zoals in deze figuren, meer patiënt serum leidt tot complement afzetting, zoals verwacht. Vreemd genoeg was het complement afzetting komt in twee verschillende positieve pieken. Dit wordt waarschijnlijk niet veroorzaakt door heterogeniteit in de RBC populatie, omdat de RBC worden veralgemeend donor. We zijn nog steeds onderzoek naar de oorzaak van dit fenomeen. Figuren 2D en 2E demonstratiete De reproduceerbaarheid van de C4 (Figuur 2D) en C3 (figuur 2E) depositie assays. Ze laten ook de grote variatie in complement afzetting capaciteit van de verschillende AIHA patiënt monsters.
Een representatief resultaat van de hemolytische test met een AIHA patiënt serum monster dat auto-antilichamen tegen rode bloedcellen kan worden gezien in figuur 3A. Normaal gesproken, een titratie met serum monster levert een mooie, reproduceerbare curve. Patiëntensera verschillen aanzienlijk in complement activeren capaciteit, dus een titratie van elke patiënt serum uit te voeren. Monsters zonder patiëntenserum geven meestal een achtergrond rond de 10-15% als gevolg van absorptie door het serum monster gebruikt als aanvulling bron. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat een voldoende hoge patiënt serumconcentratie gebruiken om een signaal dat aanzienlijk boven deze achtergrond te verkrijgen. Met een geschikte complement inhibitor anti-C5, kan de hemolytische signaal weg getitreerd zoals aangegeven in Figure 3B.
Figuur 1. Schematisch overzicht van de C3-en C4 depositie assay (A) en de kwantitatieve hemolytische test (B). Kortom, de C3-en C4 depositie assay vullen afzetting geïnduceerd door AIHA patiënt serum wordt gemeten, terwijl in de hemolytische test hemolyse geïnduceerd door AIHA patiënt serum wordt gedetecteerd. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Representatieve resultaten voor C3 en C4 depositie eenssay. A) Voorgestelde gating strategie. Hier is hoe om te selecteren alleen voor de enkele RBC (P1, red). De agglutinaten worden in het groen (P2). B) Het effect van een titratie van AIHA patiëntenserum op C4 depositie. De isotypecontrole (anti-IL6 muis IgG1) wordt weergegeven als effen grijs, terwijl het monster wordt weergegeven in zwart. Het verhogen van patiënt serum leidt tot een toename van de C4 depositie. C) dezelfde als B) maar nu met detectie voor C3 depositie. D) C4 depositie FACS resultaten weergegeven in een grafiek van de reproduceerbaarheid van de test en met de aanzienlijke verschillen tussen serummonsters van verschillende patiënten. De Y-as geeft de gemiddelde fluorescentie-intensiteit. E) Vergelijkbaar als D) maar nu voor C3 depositie. Klik hier omBekijk grotere afbeelding.
Figuur 3. Representatieve resultaten voor de kwantitatieve hemolytische assays. A) AIHA patiënt serumtitratie in de hemolytische test, waaruit blijkt dat de lysis toeneemt reproduceerbaar met de patiënt serumconcentratie. Geen lysis optreedt met gezonde donor serum (oranje, negatieve controle) B) een geschikt complement inhibitor (anti-C5 in dit geval) kan complement-bemiddelde lysis teniet.. Hier afgebeeld is een titratie van anti-C5 terwijl de AIHA patiënt serum bij een constante concentratie werd gehouden. Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bovenstaande tests zijn reproduceerbaar en robuust. Ze zijn eenvoudig uit te voeren en het is mogelijk om ze uit te voeren met veel monsters tegelijk (een 96 putjes plaat). Daarom zou deze aanpak ook geschikt voor een volledig geautomatiseerd systeem, bijvoorbeeld een ELISA-robot systeem. In tegenstelling tot de momenteel gebruikte technieken, deze tests zijn kwantitatieve en dit zal helpen bijvoorbeeld in de studie van het effect van complement inhibitors. Bovendien is de interpretatie doel, namelijk een verbetering van de momenteel gebruikte tests.
Beide testen hebben een belangrijke stap. Belangrijk in de FACS-analyse is om de poort op de single RBC, omdat geagglutineerde RBC een kunstmatig hoge signaal zal geven, omdat ze worden geteld als een gebeurtenis. Het is zelfs beter om agglutinatie te voorkomen door het gebruik van lage patiënt serum concentraties, aangezien lage concentraties nog steeds geven goede signalen. In de hemolytische test, is het cruciaal om de supernatant een zorgvuldig overdragenfter incubatie in een nieuwe plaat, omdat overdracht van RBC zal leiden tot een onbetrouwbare signaal (zo zullen luchtbellen). Het wordt aanbevolen om 0-getypte RBC gebruiken in beide assays om verwarring te voorkomen met AB0 mismatch complement activatie.
Door hun betrouwbaarheid en robuustheid deze tests zijn geschikt om de werkzaamheid van complement inhibitors studeren AIHA zoals in referentie 11, teneinde kwantitatief subtiele verschillen in complement activatie te detecteren. Vanwege hun gevoeligheid deze assays complement activatie kan detecteren bij patiënten waarbij complement activatie op RBC sterk gesuggereerd maar niet gedetecteerd door de routine assays, zoals in Coombs-negatieve AIHA, hoewel deze verklaring moet nog verificatie. Ze kunnen ook worden gebruikt om complement activerende vermogen van allo-antilichamen (bijvoorbeeld geïnduceerd door bloedtransfusie of een Rhesus - moeder die van een RhD + kind) welke kunnen helpen de arts predict het klinisch gedrag van een gedetecteerde antistofvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
SZ en DW krijgen een onbeperkte subsidie van Viropharma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| Bromelain | Sanquin | K1121 |
References
- Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
- Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
- Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
- Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr,, R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
- Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
- Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
- Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
- Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
- Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
- Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
- Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
- Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).
