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Bioengineering

ECM प्रोटीन Nanofibers और nanostructures इंजीनियर का उपयोग कर सतह द्वारा आरंभ विधानसभा

Published: April 17, 2014 doi: 10.3791/51176
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Carnegie Mellon University, 2Department of Materials Science and Engineering, Carnegie Mellon University

Summary

एक या कई बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन से nanofibers और जटिल है nanostructures प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन किया है. इस विधि ऊतक इंजीनियरिंग और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों की एक किस्म में इस्तेमाल के लिए ट्यून करने योग्य रचना और वास्तुकला के साथ मुक्त खड़े प्रोटीन आधारित सामग्री बनाने के लिए प्रोटीन सतह बातचीत का उपयोग करता है.

Abstract

ऊतकों में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) संश्लेषित और कसकर विनियमित फाइबर व्यास, संरचना और संगठन के साथ एक 3 डी तंतुमय, प्रोटीन नेटवर्क के रूप में कोशिकाओं द्वारा इकट्ठा किया है. संरचनात्मक समर्थन प्रदान करने के अलावा, ईसीएम की भौतिक और रासायनिक गुणों आसंजन, भेदभाव, और apoptosis सहित कई सेलुलर प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. में vivo, ईसीएम प्रोटीन के भीतर गुप्त आत्म विधानसभा (तन्तुजनन) साइटों को उजागर द्वारा इकट्ठा किया है . यह प्रक्रिया अलग प्रोटीन के लिए बदलता है, लेकिन fibronectin (एफ एन) तन्तुजनन अच्छी तरह से विशेषता है और सेल की मध्यस्थता ईसीएम विधानसभा के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में कार्य करता है. विशेष रूप से, कोशिकाओं अघुलनशील फाइबर में विधानसभा के लिए बाध्यकारी साइटों प्रकट करना और बेनकाब करने के लिए एफ एन dimers और actomyosin जनित सिकुड़ा बलों बाध्य करने के लिए कोशिका झिल्ली पर integrin रिसेप्टर्स का उपयोग करें. इस रिसेप्टर की मध्यस्थता प्रक्रिया ऊतक एससीए को सेलुलर से ईसीएम को इकट्ठा करने और संगठित करने के लिए कोशिकाओं को सक्षम बनाता हैलेस. यहाँ, हम ईसीएम प्रोटीन प्रकट करना और अघुलनशील फाइबर में उन्हें इकट्ठा करने के लिए प्रोटीन सतह बातचीत का उपयोग सेल की मध्यस्थता मैट्रिक्स विधानसभा स्मरण दिलाता है जो एक विधि कहा जाता सतह शुरू की विधानसभा (एसआईए), प्रस्तुत करते हैं. सबसे पहले, ईसीएम प्रोटीन वे आंशिक रूप से (खोलें) denature और गुप्त बाध्यकारी डोमेन का पर्दाफाश जहां एक हाइड्रोफोबिक polydimethylsiloxane (PDMS) सतह पर adsorbed रहे हैं. सामने आया प्रोटीन तो एक thermally संवेदनशील पाली (एन isopropylacrylamide) (PIPAAm) सतह पर microcontact मुद्रण के माध्यम से अच्छी तरह से परिभाषित सूक्ष्म और nanopatterns में स्थानांतरित कर रहे हैं. PIPAAm की Thermally ट्रिगर विघटन अंतिम विधानसभा और अच्छी तरह से परिभाषित geometries के साथ अघुलनशील ईसीएम प्रोटीन nanofibers और nanostructures की रिहाई के लिए जाता है. परिसर आर्किटेक्चर microcontact मुद्रण के लिए इस्तेमाल किया PDMS टिकटों पर इंजीनियरिंग परिभाषित पैटर्न से ही संभव है. एफ एन के अलावा, एसआईए प्रक्रिया laminin, फाइब्रिनोजेन के साथ प्रयोग किया जा सकता है और कोलेजन मैं और चतुर्थ बहु घटक ईसीएम nanostruc बनाने के लिए टाइप करेंtures. इस प्रकार, एसआईए विवो में ईसीएम की संरचना और संरचना पुनरावृत्ति के क्रम में प्रोटीन की संरचना, फाइबर और ज्यामिति पाड़ वास्तुकला पर सटीक नियंत्रण के साथ ईसीएम प्रोटीन आधारित सामग्री इंजीनियर इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

ऊतकों में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) आसंजन, प्रसार, भेदभाव, और apoptosis 1-3 सहित कई सेल प्रक्रियाओं की भौतिक और रासायनिक विनियमन में शामिल multifunctional प्रोटीन से बना है. ईसीएम, संश्लेषित इकट्ठे, और कोशिकाओं द्वारा आयोजित और घटक प्रोटीन तंतु ऊतक प्रकार और विकास मंच के साथ बदलती हैं कि अद्वितीय रचनाओं, फाइबर आकार, geometries और परस्पर आर्किटेक्चर है है. हाल ही में काम ईसीएम संरचना और संरचना के मामले में ईसीएम recapitulating ऊतक इंजीनियरिंग और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए biomimetic सामग्री के विकास के लिए सक्षम हो सकता है, सुझाव है कि इंजीनियर के ऊतकों 4 के लिए फार्म कोशिकाओं मार्गदर्शन करने के लिए शिक्षाप्रद cues प्रदान कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया है.

निर्माण विधियों की एक संख्या के ऊतकों में ईसीएम के पहलुओं की नकल कर सकते हैं कि polymeric scaffolds इंजीनियर करने के लिए विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए, electrospinning और चरण separव्यावहारिक दोनों नीचे micrometers के दसियों से नैनोमीटर 5-7 की दसियों को लेकर व्यास के साथ फाइबर का झरझरा matrices फार्म की क्षमता का प्रदर्शन किया है. दोनों तकनीकों भी nanofibers के बेहद असुरक्षित matrices पाड़ 8 में सेल आसंजन और घुसपैठ का समर्थन कर सकते हैं कि पता चला है. हालांकि, इन तरीकों से बनाया जा सकता है कि संभव फाइबर geometries, झुकाव और 3 डी आर्किटेक्चर में सीमित कर रहे हैं. चरण जुदाई अनियमित उन्मुख फाइबर के साथ scaffolds पैदा करता है जबकि Electrospinning आमतौर पर बेतरतीब ढंग से उन्मुख या अत्यधिक गठबंधन या तो फाइबर के साथ scaffolds पैदा करता है. सामग्री पर सीमाओं के शोधकर्ताओं आम तौर पर इस तरह के पाली बाद में सेल आसंजन को बढ़ावा देने के ईसीएम प्रोटीन के साथ लेपित हैं कि (ε-caprolactone) 8 और पाली (लैक्टिक सह एसिड) 9, के रूप में, सिंथेटिक पॉलिमर उपयोग करने के साथ, वहाँ भी कर रहे हैं. प्राकृतिक biopolymers भी, कोलेजन प्रकार मैं 10 जिलेटिन, 11, फाइब्रिनोजेन 12 सहित, उपयोग किया जाता हैchitosan 13, और रेशम 14, लेकिन देशी ऊतकों में पाया प्रोटीन के केवल एक छोटे सबसेट का प्रतिनिधित्व करते हैं. सबसे ऊतकों मौजूदा तरीकों का उपयोग कर nanofibers निर्माण के लिए मुश्किल या असंभव हैं कि fibronectin (एफ एन), laminin (एल एन), कोलेजन प्रकार चतुर्थ और hyaluronic एसिड सहित ईसीएम प्रोटीन और polysaccharides के एक बड़े वातावरण में होते हैं.

इस चुनौती का पता, हम कोशिकाओं को इकट्ठा करने और अपने परिवेश में ईसीएम प्रोटीन तंतुओं का आयोजन, synthesize तरह से नकल उतार पर हमारे अनुसंधान प्रयासों पर ध्यान केंद्रित किया है. विशिष्ट तन्तुजनन प्रक्रिया अलग ईसीएम प्रोटीन के लिए बदलता रहता है, जबकि आमतौर पर ईसीएम प्रोटीन अणु में एक गठनात्मक परिवर्तन गुप्त आत्म विधानसभा साइटों को उजागर करता है, जो एक enzymatic या रिसेप्टर की मध्यस्थता बातचीत, से शुरू हो रहा है. यहाँ हम बेहतर तन्तुजनन प्रक्रिया को समझने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में एफ एन का उपयोग करें. संक्षेप में, एफ एन homodimers 10 वीं प्रकार द्वितीय में RGD अमीनो एसिड अनुक्रम के माध्यम से कोशिका की सतह पर रिसेप्टर्स integrin करने के लिए बाध्यमैं इकाई दोहराएँ. एक बार ही, integrins actomyosin संकुचन के माध्यम से अलग ले और गुप्त आत्म विधानसभा साइटों को बेनकाब करने के लिए एफ एन dimers प्रकट करना. इन FN-एफ एन बाध्यकारी साइटों के लिए जोखिम सही कोशिका की सतह 15 पर एक अघुलनशील महीन रेशा में इकट्ठा करने के लिए एफ एन dimers सक्षम बनाता है. सेल मुक्त प्रणाली में कार्य गुप्त FN-एफ एन बाध्यकारी साइटों एक हवाई तरल ठोस इंटरफ़ेस 17-19 में denaturants 16 या सतह तनाव का उपयोग खुलासा माध्यम से पता चला जा सकता है कि प्रदर्शन किया है. हालांकि, इन तकनीकों के द्वारा बनाई गई एफ एन फाइबर विशिष्ट फाइबर आकार और geometries के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं और आम तौर पर एक सतह के लिए बाध्य कर रहे हैं.

यहाँ हम मुक्त खड़े अघुलनशील nanofibers, nanofabrics (2 डी शीट) और (चित्रा 1 एक या कई ईसीएम प्रोटीन से बना अन्य nanostructures बनाने के लिए प्रोटीन सतह बातचीत के उपयोग से इन सीमाओं पर काबू एक दृष्टिकोण है कि करार सतह शुरू की विधानसभा (एसआईए) 20 वर्णन ). इस पी मेंrocess, ईसीएम प्रोटीन समाधान में एक कॉम्पैक्ट, गोलाकार रचना से adsorbed और आंशिक रूप से एक नमूनों, हाइड्रोफोबिक polydimethylsiloxane (PDMS) के टिकट पर (सामने आया) विकृत कर रहे हैं. ईसीएम प्रोटीन तो 22 मुद्रण microcontact के माध्यम से एक thermally संवेदनशील पाली (एन isopropylacrylamide) (PIPAAm) की सतह पर इस राज्य में स्थानांतरित कर रहे हैं. 40 डिग्री सेल्सियस पानी के साथ हाइड्रेटेड जब PIPAAm एक ठोस बनी हुई है, लेकिन 32 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा जब यह यह हाइड्रोफिलिक हो जाता है, जहां एक कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान (LCST) से होकर गुजरता है, पानी के साथ पहुँच जाती है और फिर घुल, के बंद इकट्ठे ईसीएम nanostructures, रिहा सतह. एसआईए विधि नैनोमीटर पैमाने परिशुद्धता के साथ आयामों पर नियंत्रण प्रदान करता है. ऐसी रचना, फाइबर ज्यामिति, और वास्तुकला के रूप में मुख्य मापदंडों को नियंत्रित करके, यह vivo में पाया ईसीएम के कई गुण पुनरावृत्ति करना और ऊतक इंजीनियरिंग और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए उन्नत scaffolds का विकास संभव है.

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Protocol

Photolithography का उपयोग मास्टर मोल्ड के 1. निर्माण

  1. ईसीएम प्रोटीन nanofibers, nanofabrics और गढ़े जा nanostructures के लिए पहले (सीएडी) सॉफ्टवेयर कम्प्यूटर एडेड डिजाइन का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं. इस सीएडी फ़ाइल तो एक photomask को सौंप दिया है. photomask के प्रकार की सुविधाओं का संकल्प पर निर्भर करेगा; एक पारदर्शिता आधारित photomask साथ सुविधा के लिए पर्याप्त ~ 10 माइक्रोन के लिए नीचे आकार. छोटी सुविधाओं 10 माइक्रोन गिलास photomask पर एक क्रोम की आवश्यकता होगी <. यहाँ प्रस्तुत nanofibers और nanostructures की सभी पारदर्शिता आधारित photomask गढ़े का उपयोग कर, और इस प्रकार मोटाई में नैनोमीटर पैमाने पर थे लेकिन पार्श्व नहीं आयाम थे.
    नोट: यह (के माध्यम से पारित करने के लिए यूवी प्रकाश को रोकने) photomask के क्षेत्रों अंधेरा हो जाएगा जो अंतर करना महत्वपूर्ण है और पारदर्शी होगा जो इस रूप में (यूवी प्रकाश के माध्यम से पारित करने की अनुमति), photoresist के प्रकार के साथ (सकारात्मक या नकारात्मक) , मास्टर मोल्ड के अंतिम स्थलाकृति हुक्म चलाना होगा.
  2. मास्टर मोल्ड के निर्माण शुरू करने के लिए, 15 मिनट के लिए 150 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक hotplate पर रखकर एक 4 "सिलिकॉन वेफर निर्जलीकरण.
  3. एक स्पिन coater के निर्वात चक पर वेफर केंद्र. वेफर के बीच पर SU8 2015 नकारात्मक photoresist डालो और वेफर के बारे में दो तिहाई कवर किया जाता है जब तक गाढ़ा हलकों में डालने का कार्य जारी है.
    नोट: बुलबुले के गठन को कम करने के लिए घनघोर जब वेफर को SU8 करीबी की बोतल रखें.
  4. इस प्रकार के रूप spincoater कार्यक्रम:
    • फैलाओ चक्र: 10 सेकंड के लिए 100 आरपीएम / सेकंड की गति के साथ 500 आरपीएम.
    • स्पिन चक्र: 30 सेकंड के लिए 100 आरपीएम / सेकंड की गति के साथ 4,000 RPM.
    नोट: यह spincoating नुस्खा मोटाई में ~ 10 माइक्रोन है कि एक photoresist परत के रूप में होगा. कताई गति या SU8 सूत्रीकरण बदल रहा है, मोटाई समायोजित किया जा सकता है.
  5. शीतल 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक hotplate पर रखकर वेफर सेंकना.
  6. के माध्यम से यूवी प्रकाश मे बेनकाब140 MJ / 2 सेमी की कुल खुराक के लिए photomask.
    नोट: SU8 एक नकारात्मक photoresist है इसलिए पराबैंगनी प्रकाश photomask के माध्यम से पारित करने में सक्षम है जहां क्षेत्रों के विकास के बाद ही रहेंगे और मास्टर मोल्ड पर उठाया सुविधाओं बन जाएगा.
  7. 4 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक hotplate पर रखकर वेफर सेंकना जोखिम पोस्ट कर.
  8. 3 मिनट के लिए SU8 डेवलपर में रखकर वेफर का विकास करना. 3 मिनट के बाद, isopropyl शराब के साथ वेफर कुल्ला. एक सफेद फिल्म rinsing के दौरान उत्पादन किया जाता है तो, मे पूरी तरह से विकसित नहीं है और यह एक और 30 सेकंड के लिए डेवलपर में वापस रखा जाना चाहिए. Isopropyl शराब के साथ फिर से कुल्ला. एक सफेद फिल्म isopropyl शराब rinsing के दौरान फार्म नहीं करता जब तक इस प्रक्रिया को दोहराएं.
  9. धूल से बचाने के लिए एक 150 मिमी पेट्री डिश में नाइट्रोजन और जगह की एक धारा में वेफर सूखी.

2. PDMS टिकटों बनाना

  1. इलास्टोमेर बेस के संयोजन और एक में इलाज के एजेंट द्वारा PDMS prepolymer तैयार करें10:01 डब्ल्यू / डब्ल्यू अनुपात. आमतौर पर आधार है और इलाज के एजेंट की 8 ग्राम की 80 ग्राम एक 1 सेमी मोटी परत में मास्टर मोल्ड को कवर करने के लिए पर्याप्त PDMS है यह सुनिश्चित करने के लिए उपयोग किया जाता है.
  2. मिक्स और निम्नलिखित करने के लिए सेट एक केन्द्राभिमुख मिक्सर का उपयोग PDMS देगास:
    • मिक्स: 2 मिनट के लिए 2000 rpm
    • देगास: 2 मिनट के लिए 2000 rpm.
  3. एक मिक्सर अनुपलब्ध है, तो एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर 10 मिनट के लिए हाथ से PDMS मिश्रण. बुलबुले को दूर करने के लिए 30 मिनट के लिए एक निर्वात desiccator में रखकर मिश्रण देगास.
  4. एक 1 सेमी मोटी परत के रूप में मास्टर मोल्ड (नमूनों सिलिकॉन वेफर) पर पर्याप्त PDMS prepolymer डालो. 48 घंटे के लिए 4 घंटा या कमरे के तापमान पर के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर पाक द्वारा PDMS इलाज.
  5. एक बार ठीक हो, पैटर्न युक्त क्षेत्रों PDMS टिकटों के लिए फार्म बाहर काटा जा सकता है. PDMS स्टांप की पीठ से सुविधा पक्ष भेद करने के लिए, दुनिया भर के टिकट की पीठ पर कोनों में से एक के बाहर एक पायदान काटा.

3. Microcontact जनसंपर्कईसीएम पैटर्न के inting

  1. 1 घंटा और एक 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में तो सूखे के लिए 95% इथेनॉल में sonication द्वारा क्लीन 25 मिमी व्यास कांच coverslips.
  2. 10% की एकाग्रता (10 मिलीलीटर में वी / डब्ल्यू, आम तौर पर 1 ग्राम) पर 1-butanol में PIPAAm भंग करके PIPAAm समाधान तैयार करें.
  3. पूरे कांच की सतह को कवर किया जाता है ताकि PIPAAm समाधान की spincoater और पिपेट 200 μl के निर्वात चक पर एक गिलास coverslip केंद्र.
  4. 1 मिनट के लिए 6000 rpm पर coverslip Spincoat.
  5. 30 मिनट और नाइट्रोजन की एक धारा के तहत तो सूखे के लिए 50% इथेनॉल में sonication द्वारा PDMS टिकटों साफ करें.
    नोट: सुखाने और बाद के चरणों ईसीएम के nanostructures कोशिकाओं के साथ प्रयोग किया जाएगा जहां अनुप्रयोगों के लिए बाँझपन बनाए रखने के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
  6. कोट प्रत्येक PDMS के नमूनों सतह प्रोटीन समाधान के 200 μl, एफ एन के लिए बाँझ आसुत जल में आमतौर पर 50 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ टिकट. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
    नोट: गुमात्रा कोटिंग है एक 1.5 सेमी 2 PDMS स्टांप के लिए है और PDMS स्टांप का उपयोग किया था ईसीएम प्रोटीन और समाधान में ईसीएम प्रोटीन की एकाग्रता के आकार के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता होगी.
  7. अच्छी तरह से नाइट्रोजन की एक धारा के तहत अतिरिक्त प्रोटीन और सूखे को दूर करने के लिए आसुत जल में PDMS टिकटों धो लें.
    नोट: स्टाम्प पर छोड़ कोई पानी coverslip पर PIPAAm कोटिंग के समय से पहले विघटन ट्रिगर और उचित प्रोटीन हस्तांतरण को रोकने जाएगा.
  8. बाँझ निर्माण के लिए, एक बंद पेट्री डिश के अंदर PIPAAm लेपित coverslips जगह और एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में यूवी जोखिम, पराबैंगनी प्रकाश के तहत 45 मिनट का उपयोग कर बाँझ पर्याप्त है. बाँझपन की आवश्यकता नहीं है, तो इस चरण को छोड़ा जा सकता है.
  9. PIPAAm लेपित coverslip के साथ संपर्क में PDMS स्टांप की सुविधा पक्ष रखकर microcontact मुद्रण कार्य करें. यदि आवश्यक हो, किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने और वर्दी संपर्क सुनिश्चित करने के लिए टिकटों की पीठ पर हल्के से नल के लिए संदंश का उपयोग करें.
  10. 5 मील के बादएन, coverslip से PDMS स्टांप छील.
  11. इस स्तर पर, अतिरिक्त ईसीएम प्रोटीन अधिक जटिल और multicomponent संरचना बनाने के लिए किया जा सकता नमूनों. ऊपर से 3 printings इस प्रक्रिया के साथ काम करने के लिए सत्यापित किया गया है, और अधिक व्यावहारिक हो सकता है.

ईसीएम Nanofibers और nanostructures की 4. रिलीज

  1. एक 35 मिमी पेट्री डिश में नमूनों PIPAAm लेपित coverslip जगह और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग पैटर्न निष्ठा का निरीक्षण किया. पैटर्न के आधार पर, एक सीसीडी कैमरा पैटर्न की सुविधाओं को हल करने के लिए आवश्यक हो सकता है. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी भी ईसीएम प्रोटीन fluorescently लेबल कर रहे हैं प्रदान की पैटर्न का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. पेट्री डिश के लिए 40 डिग्री सेल्सियस आसुत जल के 3 मिलीलीटर जोड़ें और पानी को धीरे - धीरे शांत अनुमति देते हैं.
  3. PIPAAm परत के विघटन और ईसीएम प्रोटीन पैटर्न की रिहाई चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग पर नजर रखी जा सकती है. आवेदन ऑप्टिकल टीईसी के उपयोग की अनुमति नहीं हैhniques, रिहाई समाधान के तापमान को मापने के द्वारा नजर रखी जा सकती है. आमतौर पर, पानी ईसीएम प्रोटीन की nanostructures जारी किया गया है यह सुनिश्चित करने के लिए, अच्छी तरह से PIPAAm (32 डिग्री सेल्सियस) के LCST नीचे, कमरे के तापमान को ठंडा किया जाता है.
  4. रिहाई के बाद, nanofibers, nanofabrics और अन्य nanostructures पानी में तैर रहे हैं. उन का उपयोग करने के लिए आगे अनुप्रयोगों के लिए वे चालाकी करने की जरूरत है. सटीक दृष्टिकोण प्रयोगात्मक उद्देश्य पर निर्भर करेगा और इस तरह, एक और सतह पर immobilizing एक micromanipulator प्रणाली के साथ चलती है या एक हाइड्रोजेल में embedding के रूप में कदम शामिल हो सकते हैं.

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Representative Results

एसआईए फाइबर आयामों पर सटीक नियंत्रण के साथ इंजीनियरिंग ईसीएम प्रोटीन nanofibers करने में सक्षम है. इस प्रदर्शन, 50 x 20 माइक्रोन की तलीय आयामों के साथ एफ एन nanofibers के सरणियों एक PIPAAm लेपित coverslip (2A चित्रा) पर नमूनों गया. PIPAAm सतह (चित्रा 2 बी) पर नमूनों जब वे एक अंतर्निहित पूर्व तनाव में थे क्योंकि रिहाई पर, फाइबर अनुबंधित. एफ एन nanofibers का विश्लेषण वे 50.19 की औसत लंबाई के साथ monodisperse पूर्व रिहाई थे पता चला ± 19.98 ± 0.17 माइक्रोन से 0.49 मीटर और चौड़ाई (चित्रा -2). Appreciably करार के बावजूद, एफ एन फाइबर के बाद रिहाई अभी भी 14.15 की औसत लंबाई के साथ monodisperse थे ± 2.65 ± 0.32 माइक्रोन (चित्रा 2 डी) की 0.92 मीटर और चौड़ाई. परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी एसआईए रिहाई की प्रक्रिया से जुड़े फाइबर आयामी परिवर्तन के एक उच्च संकल्प परिप्रेक्ष्य प्रदान की. विशेष रूप से, फाइबर पूर्व रिहाई की थी~ 5 एनएम (चित्रा 2 ई) की एक समान मोटाई तंतुओं के बाद जारी कई सौ नैनोमीटर (चित्रा 2 एफ) के आदेश पर एक विषम मोटाई था जबकि.

एसआईए प्रक्रिया का उपयोग कर यह tunable आकार, आकृति, और रचना (चित्रा 3) के साथ ईसीएम प्रोटीन nanostructures की एक किस्म के लिए इंजीनियर संभव है. उदाहरण के लिए, एफ एन nanofibers शुरू में लंबाई में चौड़ाई में 20 माइक्रोन और 1 सेमी एक PIPAAm लेपित coverslip पर नमूनों गया. ठंडा और PIPAAm विघटन पर nanofibers लंबे धागे (चित्रा 3) के गठन का विमोचन किया गया. पैटर्न microcontact मुद्रण के लिए इस्तेमाल किया PDMS स्टांप की सतह स्थलाकृति द्वारा परिभाषित किया गया है, क्योंकि इसके अलावा, यह जटिल ईसीएम प्रोटीन की nanostructures इंजीनियर करने के लिए संभव है. सबूत की अवधारणा के रूप में, हम रिहाई (3B चित्रा) के बाद अपने सामान्य आकार को बनाए रखा है कि बहु सशस्त्र एफ एन स्टार बनाया. दिलचस्प है, एफ एन स्टार की बाहों nanofibers तरह अनुबंधित लेकिनसितारा के शरीर इसके आकार को बनाए रखा. एफ एन महत्वपूर्ण है, हम भी SIA ऐसे एलएन के रूप में अन्य ईसीएम प्रोटीन के साथ और कई ईसीएम प्रोटीन ही संरचना में शामिल किया जा सकता है कि काम करता है कि प्रदर्शन करना चाहता था. उदाहरण के लिए, हम एक वर्ग जाली सरणी (चित्रा -3 सी) में एफ एन और एलएन की orthogonal और परस्पर nanofibers से बना एक 2 डी nanofabric इंजीनियर. रिलीज से पहले एफ एन nanofibers 20 माइक्रोन चौड़े थे और एलएन nanofibers 50 माइक्रोन चौड़े थे. रिहाई पर nanofibers के दोनों प्रकार अनुबंधित लेकिन कुल मिलाकर इंटरकनेक्टिविटी और वर्ग जाली संरचना बनाए रखा गया था. इन परिणामों एसआईए रचनाओं और संरचनाओं की एक किस्म के साथ ईसीएम सामग्री इंजीनियर इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है.

ईसीएम nanofibers के विफल रहा एसआईए के उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया. एक कारण microcontact मुद्रण (चित्रा -4 ए के दौरान PIPAAm सतह को ईसीएम प्रोटीन की गरीब स्थानांतरण करने के लिए एक अधूरा पैटर्न के अनुचित जारी है). छेद, अनियमित किनारों, और अन्य दोष की उपस्थिति अधूरा और रिहाई पर टूटना और विखंडन से ग्रस्त हैं कि nanofibers और nanostructures पैदा करेगा. PIPAAm की रैपिड विघटन भी रिहाई (चित्रा 4 बी) के बाद गरीब पैटर्न निष्ठा पैदा कर सकता है. उदाहरण के लिए, पहले से ही बजाय 40 डिग्री सेल्सियस पानी के PIPAAm की LCST नीचे 20 डिग्री सेल्सियस डि पानी कमरे के तापमान का उपयोग PIPAAm तेजी से प्रफुल्लित और भंग करने के कारण होगा. यह दो समस्याएं पैदा कर सकते हैं; (मैं) तेजी से विस्तार के कुछ ईसीएम nanofibers अलग चीर कर सकते हैं और (ii) तेजी से विस्तार के रिलीज होने के बाद पैटर्न व्यवस्था का विघटन का कारण बन सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एसआईए प्रक्रिया के योजनाबद्ध. (ए) एक सिलिकॉन वेफर SU8 नकारात्मक photoresist के साथ spincoated और एक photomask के माध्यम से पराबैंगनी प्रकाश के संपर्क में है. गैर उजागर क्षेत्रों एक भौगोलिक विवरण के अनुसार नमूनों मीटर दूर छोड़ विकसित कर रहे हैं एस्टर ढालना. (बी) PDMS prepolymer मास्टर मोल्ड के ऊपर डाल दिया और इलाज करने के बाद 65 डिग्री सेल्सियस (सी) में 4 घंटे के लिए ठीक हो जाता है, एक PDMS स्टांप बाहर कट जाता है. (डी) के टिकट तो एक ईसीएम प्रोटीन समाधान के साथ incubated है प्रोटीन एक आंशिक रूप से सामने आया रचना में डाक टिकट को सोखना जहां. (ई) के टिकट सूखे, अतिरिक्त प्रोटीन को हटाने के लिए rinsed, और एक PIPAAm लेपित गिलास coverslip साथ conformal संपर्क में रखा गया है. (एफ) के टिकट तो पीछे हटाया जा रहा है PIPAAm लेपित coverslip पर नमूनों ईसीएम प्रोटीन, पैटर्न के टिकट की स्थलाकृति से निर्धारित होता है. (जी) coverslip तो एक पेट्री डिश में रखा गया है और 40 डिग्री सेल्सियस पानी के साथ कवर किया और फिर PIPAAm (के LCST नीचे ठंडा है ~ 32 PIPAAm के विघटन और सतह से इकट्ठे ईसीएम प्रोटीन nanofibers और / या nanostructures की रिहाई हो सके जो डिग्री सेल्सियस),.

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40 डिग्री सेल्सियस डि पानी और बाद ठंडा करने की चित्रा 2. Monodisperse nanofibers की आबादी के लिए इंजीनियर एसआईए का उपयोग करना. (ए) एफ एन आयतों की एक सरणी, चौड़ाई में 50 लंबाई में माइक्रोन और 20 माइक्रोन PIPAAm सतह पर नमूनों गया. (बी) के अलावा PIPAAm की LCST नीचे PIPAAm के विघटन और एफ एन nanofibers की रिहाई शुरू हो गया. PIPAAm सतह पर नमूनों जब वे एक पूर्व तनाव में हैं के रूप में रिहाई पर, फाइबर अनुबंधित. Nanofiber आयाम (सी) विश्लेषण पूर्व रिहाई फाइबर 50.19 ± 0.49 माइक्रोन की लंबाई और चौड़ाई के साथ monodisperse हैं और 19.98 ± 0.17 से पता चलता है क्रमशः माइक्रोन,. (डी) क्रमशः, रिहाई पर nanofibers अनुबंधित लेकिन 14.15 ± 0.92 माइक्रोन के बाद जारी की लंबाई और चौड़ाई के साथ monodisperse बने रहे और 2.65 ± 0.32 माइक्रोन. (ई) AFM पता चला है कि पूर्व रिहाई nanofibers~ 5 एनएम मोटी थे. बाद जारी nanofibers के (एफ) AFM लंबाई और चौड़ाई में कमी आई है, जबकि मोटाई कई सौ नैनोमीटर की वृद्धि हुई थी कि पता चला है. स्केल बार्स (ए) 50 माइक्रोन और (बी) 10 माइक्रोन हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. Tunable आकार, आकृति, और रचना के साथ ईसीएम प्रोटीन nanofibers और nanostructures इंजीनियर को एसआईए का उपयोग करना. (ए) एफ एन nanofibers लंबाई में 1 सेमी और चौड़ाई में 20 माइक्रोन के रूप में एक PIPAAm लेपित coverslip पर नमूनों गया. थर्मल रिहाई ~ 3 मीटर का एक कम चौड़ाई के साथ लंबे समय तक बरकरार एफ एन nanofibers के एसआईए में हुई. (बी) के एक अधिक जटिल बहु सशस्त्र एफ एन सितारा, एसआईए का उपयोग कर बनाया जा सकता है कि विविध nanostructures के प्रतिनिधि का एक उदाहरण है. थर्मल रिहाई हथियारों के संकुचन में हुई, लेकिन हथियारों के साथ शामिल हो गए जहां सितारा, के मध्य क्षेत्र. (सी) यह भी है नहींउसी संरचना में कई ईसीएम प्रोटीन एकीकृत करने के लिए संभव. उदाहरण के लिए, orthogonal, एफ एन (लाल) के परस्पर 20 माइक्रोन चौड़ा लाइनों और एलएन (हरा) का 50 माइक्रोन चौड़ा लाइनों एक 2D nanofabric में एकीकृत लाइनों नमूनों और फिर रिहा कर दिया गया. यहां तक ​​कि रिहाई के बाद, पैटर्न अपनी प्रारंभिक ज्यामिति और interconnectivity बनाए रखा. स्केल सलाखों 50 माइक्रोन हैं.

चित्रा 4
PIPAAm विखंडन में परिणाम और एक 20 माइक्रोन चौड़े एफ एन रेखा के अन्य दोषों पर ईसीएम प्रोटीन की चित्रा 4. PIPAAm सतह से उचित एसआईए और प्रोटीन रिहाई रोकने सकता है कि समस्याओं के उदाहरण हैं. (ए) गरीब microcontact मुद्रण एक निरंतर की एसआईए रोकता बजाय एफ एन nanofiber और कई छोटे एफ एन टुकड़े. (बी) तेजी से PIPAAm सब्सट्रेट से एफ एन nanofibers रिहा भी अंतिम फाइबर व्यवस्था प्रभावित हो सकता है गठन में यह परिणाम है. इस मामले पानी एक मेंटी 20 डिग्री सेल्सियस, पहले से ही PIPAAm की LCST नीचे, जोड़ा और nanofibers, वापस तस्वीर को तोड़ने (30 सेकंड) और यादृच्छिक, असंगठित विन्यास (52 सेकंड) फार्म के कारण तेजी से विघटन शुरू हो गया था. स्केल सलाखों 50 माइक्रोन हैं.

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Discussion

एसआईए विधि यहाँ mimics सेल की मध्यस्थता मैट्रिक्स विधानसभा प्रस्तुत और tunable आकार, संगठन और संरचना के साथ ईसीएम प्रोटीन nanofibers और nanostructures के इंजीनियरिंग में सक्षम बनाता है. सेल उत्पन्न ईसीएम के समान नहीं है, जबकि एसआईए यांत्रिक तनाव 21 के दौरान खुलासा / प्रतिवर्ती तह गुजरना और कोशिकाओं 20 बाध्य कर सकते हैं कि nanoscale प्रोटीन तंतुओं 20 से बना ईसीएम बनाता है. इस विवो में पाया ईसीएम के कई गुण पुनरावृत्ति कि ईसीएम प्रोटीन सामग्री का निर्माण करने के लिए एक अद्वितीय क्षमता प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, ईसीएम nanofibers अन्य तकनीकों के साथ अव्यवहार्य नियंत्रण का एक स्तर के साथ विशिष्ट लंबाई में निर्मित किया जा सकता है. हम monodisperse nanofibers के सरणियों लंबाई के सटीक नियंत्रण और चौड़ाई पूर्व रिहाई (चित्रा -2) और बाद रिहाई (चित्रा 2 डी) के साथ (चित्रा 2) बनाने की क्षमता प्रदर्शित करता है. एफ एन नैनो fabricating द्वारा प्रदर्शन के रूप में इन ईसीएम nanofibers, किसी भी हद हो सकता है~ 1 सेमी लंबाई (चित्रा 3) में फाइबर. इसके विपरीत, electrospinning और चरण जुदाई के रूप में अन्य निर्माण तकनीक ज्यादातर निरंतर फाइबर के उत्पादन, लंबाई के सटीक नियंत्रण के साथ nanofibers बना लेकिन नहीं कर सकते हैं. इन तकनीकों में भी एक पाड़ के भीतर फाइबर geometries और संगठन में सीमित कर रहे हैं. एसआईए इस तरह के एक सितारा (3B चित्रा) के रूप में मनमाने ढंग से तलीय ज्यामिति, साथ ईसीएम nanostructures के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इस तरह के एक nanofabric (चित्रा -3 सी) के रूप में फाइबर संगठन की मनमानी पर नियंत्रण के साथ 2 डी चादरें, में. इसके अलावा, अन्य निर्माण विधियों आमतौर पर सिंथेटिक सामग्री या ऐसी chitosan और आतंच के रूप में प्राकृतिक वाले का केवल एक सीमित संख्या का उपयोग करें. इसकी तुलना में, एसआईए ऐसे इन अन्य तरीकों के साथ निर्मित नहीं किया जा सकता जो एफ एन और एलएन, के रूप में ईसीएम प्रोटीन की पूरी तरह से बना nanofibers और nanostructures की विधानसभा में सक्षम बनाता है.

एसआईए प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम वें से thermally ट्रिगर जारी हैई PIPAAm सतह. उचित रिहाई सुनिश्चित करने के लिए विचार किया जाना चाहिए कि कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. सबसे पहले, microcontact मुद्रण कदम के बाद, तबादला ईसीएम पैटर्न की निष्ठा (ईसीएम प्रोटीन fluorescently टैग कर रहे हैं अगर) या तो चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर निरीक्षण किया जाना चाहिए. PIPAAm सतह पर प्रोटीन पैटर्न में कोई दोष नहीं हैं, तो फिर बाद में रिहाई (चित्रा -4 ए में मनाया के रूप में) इन दोषों होते nanostructures कि उत्पादन होगा. एक PDMS स्टांप बार बार दोष के साथ प्रोटीन पैटर्न पैदा करता है, यह PDMS स्टांप की micropatterned पक्ष खरोंच या दोष और एक नई स्टाम्प होता है और संभवतः एक नया मास्टर मोल्ड बनाया जाना चाहिए किया गया है कि संभावित है. नमूनों प्रोटीन, PIPAAm लेपित coverslip hydrating जब इसके अलावा, ध्यान रखा जाना चाहिए. पानी 40 डिग्री सेल्सियस पर या निकट होना चाहिए और धीरे - धीरे शांत करने के लिए अनुमति दी जा. पानी काफी गर्म नहीं है या बहुत तेजी से ठंडा है, PIPAAm प्रफुल्लित होगा एकएन डी भी जल्दी भंग ईसीएम प्रोटीन nanofibers और nanostructures संभावित सूखा, पूर्व जारी कर राज्य जैसी किसी भी संरचनात्मक संगठन खो जाएगा कि इस तरह के (चित्रा 4 बी) जारी किया अलग बलों से और संयोग से फटे होने के कारण.

ईसीएम प्रोटीन nanofibers, nanostructures और एसआईए का उपयोग कर इकट्ठा nanofabrics बायोमैकेनिक्स, ऊतक इंजीनियरिंग और जैव प्रौद्योगिकी में कई आवेदन किया है. उदाहरण के लिए, हाल ही में सबूत ईसीएम प्रोटीन तंतुओं के यांत्रिक गुणों उनके जैविक कार्यक्षमता 23 नियंत्रित करता है कि इंगित करता है. एसआईए आदर्श यांत्रिक विश्लेषण के लिए शुद्ध रूप में ईसीएम प्रोटीन nanofibers बनाने के लिए अनुकूल है. इन प्रयोगों को करने के लिए जारी किया ईसीएम प्रोटीन nanofibers सटीक micropositioners का उपयोग कर छेड़छाड़ और फिर बढ़ाया जा सकता है. Deravi एट अल हाल ही में एफ एन nanofibers वे लोचदार, प्लास्टिक से गुजरना है, और सेंट 8 गुना एक्सटेंशन के लिए ऊपर का सामना और है कि कर सकते हैं कि प्रदर्शित करने के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया हैबारिश से stiffening बढ़ती तनाव 21 के साथ शासनों. ऊतक इंजीनियरिंग में, ईसीएम प्रोटीन जैल के रूप (जैसे, कोलेजन प्रकार मैं और आतंच) या decellularized ऊतकों 4 व्यापक रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं में scaffolds आधारित है. इन तकनीकों की तुलना में, एसआईए का लाभ 1 डी फाइबर और 2 डी शीट (चित्रा -3 सी) में अच्छी तरह से परिभाषित वास्तुकला के साथ scaffolds इंजीनियर की क्षमता है. उदाहरण के लिए, हम पहले से cardiomyocytes हृदय की मांसपेशी 20 के कार्यात्मक किस्में के लिए फार्म एफ एन nanofibers पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है कि पता चला है. यह एफ एन nanofibers सेल बाध्यकारी और वे गठबंधन ऊतक संरचनाओं में कोशिकाओं की anisotropic विधानसभा प्रत्यक्ष कर सकते हैं कि पता चलता है कि. 2 डी nanofabrics उपकला और endothelial ऊतकों की इंजीनियरिंग में आवेदन के लिए तहखाने झिल्ली की रचना और लामिना संरचना की नकल कर सकते हैं. इसके अलावा, हम हाइड्रोजेल matrices के भीतर उन्हें embedding द्वारा 3 डी में इन ईसीएम nanofibers और nanofabrics तैनात करने के लिए नए तरीके विकसित कर रहे हैं.इस आलेख में वर्णित प्रक्रिया से, यह आवेदनों की एक विस्तृत विविधता के लिए ईसीएम प्रोटीन आधारित, nanostructured सामग्री के लिए इंजीनियर एएस उपयोग करने के लिए संभव है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

वित्तीय समर्थन एनआईएच के निदेशक नई अन्वेषक पुरस्कार (1DP2HL117750) से Dowd-ICES फैलोशिप से QJ करने और AWF के लिए, पुनर्योजी चिकित्सा T32 ट्रेनिंग प्रोग्राम (2T32EB003392) में एनआईएच Biomechanics से JMS के लिए प्रदान किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm Polysciences 21458-10 40,000 Mw
Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) Dow Corning Mix 10 parts base with 1 part curing agent. 
Butanol
Fibronectin BD biosciences 354008 Human, 1mg
Laminin BD biosciences 354239 Ultrapure, mouse, 1mg
Negative Photoresist Microchem SU8-2015
SU8 Developer Microchem
Sonicator Branson M3510 Branson Ultrasonic Corporation CPN-952-318
Thinky ARE-250 Mixer Thinky Corporation
Spincoater Specialty Coating Systems G3P-8
Glass cover 25mm diameter, No 1.5 Fisher Scientific 12-545-86

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 86 Nanofibers Nanofabrics बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन microcontact मुद्रण fibronectin laminin ऊतक इंजीनियरिंग पाली (एन isopropylacrylamide) भूतल द्वारा आरंभ विधानसभा
ECM प्रोटीन Nanofibers और nanostructures इंजीनियर का उपयोग कर सतह द्वारा आरंभ विधानसभा
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Szymanski, J. M., Jallerat, Q.,… More

Szymanski, J. M., Jallerat, Q., Feinberg, A. W. ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly. J. Vis. Exp. (86), e51176, doi:10.3791/51176 (2014).

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