Summary
Un método para obtener nanofibras y nanoestructuras complejas de proteínas de la matriz extracelular individuales o múltiples se describe. Este método utiliza las interacciones proteína-superficie para la creación de materiales a base de proteínas exentas con la composición sintonizable y la arquitectura para el uso en una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos y de biotecnología.
Abstract
La matriz extracelular (ECM) en los tejidos se sintetiza y ensambla por las células para formar un fibrilar 3D, la red de proteínas con estrictamente regulados diámetro de la fibra, la composición y la organización. Además de proporcionar soporte estructural, las propiedades físicas y químicas de la ECM desempeñan un papel importante en varios procesos celulares que incluyen la adhesión, diferenciación y apoptosis. In vivo, el ECM se ensambla mediante la exposición de críptico de auto-ensamblaje (fibrilogénesis) sitios dentro de las proteínas . Este proceso varía para diferentes proteínas, pero la fibronectina (FN) fibrilogénesis es bien caracterizado y sirve como un sistema modelo para el montaje de ECM mediada por células. Específicamente, las células utilizan receptores de la integrina en la membrana celular para unirse dímeros FN y las fuerzas contráctiles de actomiosina-generada para desplegar y exponer sitios de unión para el montaje en fibras insolubles. Este proceso mediado por receptor permite que las células de montar y organizar el ECM desde el celular al tejido scales. A continuación, presentamos un conjunto iniciado por superficie método denominado (SIA), que recapitula el montaje matriz mediada por células mediante interacciones proteína-superficie para desplegar proteínas ECM y ensamblarlos en fibras insolubles. En primer lugar, las proteínas ECM se adsorben sobre un polidimetilsiloxano (PDMS) hidrófobo superficie donde se desnaturalizan parcialmente (desplegar) y exponen dominios de unión crípticos. Las proteínas no plegadas se transfieren luego en bien definidos micro y nanopatterns través de la impresión microcontacto sobre un poli térmicamente sensible (N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) superficie. Disolución térmicamente activado de la PIPAAm conduce hasta el montaje final y la liberación de nanofibras de proteínas ECM insolubles y nanoestructuras con geometrías bien definidas. Arquitecturas complejas son posibles por los patrones de ingeniería se define en los sellos PDMS utilizados para la impresión por microcontacto. Además de FN, el proceso de SIA se puede utilizar con la laminina, fibrinógeno y colágenos de tipo I y IV a crear nanoestructuras ECM de componentes múltiplesturas. Por lo tanto, SIA se puede utilizar para diseñar materiales a base de proteínas de ECM con un control preciso sobre la composición de proteínas, la geometría de la fibra y la arquitectura andamio con el fin de recapitular la estructura y la composición de la MEC in vivo.
Introduction
La matriz extracelular (ECM) en los tejidos se compone de proteínas multifuncionales implicadas en la regulación física y química de múltiples procesos celulares, incluyendo la adhesión, la proliferación, la diferenciación, la apoptosis y 1-3. El ECM está sintetizado, ensamblado, y organizada por las células y las fibrillas de proteínas constituyentes tienen composiciones únicas, tamaño de la fibra, geometrías y arquitecturas interconectadas que varían con el tipo de tejido y la etapa de desarrollo. Trabajos recientes han demostrado que el ECM puede proporcionar señales instructivas para guiar a las células para formar tejidos de ingeniería 4, lo que sugiere que la recapitulación de la ECM en términos de composición y estructura podría permitir el desarrollo de materiales biomiméticos para aplicaciones de ingeniería de tejidos y de biotecnología.
Un número de métodos de fabricación se han desarrollado para diseñar andamios poliméricos que pueden imitar aspectos de la ECM en los tejidos. Por ejemplo, electrospinning y separ faseción han demostrado tanto la capacidad para formar matrices porosas de fibras con diámetros que van desde decenas de micrómetros abajo hasta decenas de nanómetros 5-7. Ambas técnicas han demostrado también que las matrices altamente porosas de nanofibras pueden apoyar la adhesión celular y la infiltración en el armazón 8. Sin embargo, estos métodos son limitados en las geometrías de fibra, orientaciones y 3D posibles arquitecturas que se pueden crear. Electrospinning produce típicamente andamios con fibras orientadas al azar o ya sea altamente alineados mientras que la separación de fases produce andamios con fibras orientadas al azar. También hay limitaciones en los materiales, con los investigadores típicamente usando polímeros sintéticos, tales como poli (ε-caprolactona) 8 y poli (ácido láctico-co-glicólico) 9, que posteriormente se recubre con proteínas de ECM para promover la adhesión celular. También se utilizan los biopolímeros naturales, incluyendo el colágeno de tipo I 10, gelatina 11, fibrinógeno 12,quitosano 13, 14 y seda, pero representan sólo una pequeña parte de las proteínas que se encuentran en el tejido nativo. La mayoría de los tejidos contienen un medio más grande de proteínas ECM y polisacáridos incluyendo la fibronectina (FN), laminina (LN), colágeno tipo IV y ácido hialurónico que son difíciles o imposibles de fabricar nanofibras utilizando métodos existentes.
Para hacer frente a este desafío, hemos centrado nuestros esfuerzos de investigación en la imitación de la forma en las células de sintetizar, reunir y organizar las fibrillas de proteínas ECM en sus alrededores. Mientras que el proceso de fibrilogénesis específica varía para diferentes proteínas ECM, típicamente un cambio conformacional en la molécula de proteína de ECM se activa por un enzimática o la interacción mediada por receptor, que expone sitios de autoensamblaje crípticos. Aquí se utiliza FN como un sistema modelo para comprender mejor el proceso de fibrilogénesis. Brevemente, homodímeros FN se unen a los receptores de integrina en la superficie celular a través de la secuencia de aminoácidos RGD en el décimo tipo IIRepito unidad. Una vez unido, las integrinas se separan a través de la contracción actomiosina y despliegan los dímeros FN para exponer los sitios de autoensamblaje crípticos. La exposición de estos sitios de unión FN FN-permite a los dímeros de FN para montar en un fibrillas insolubles a la derecha en la superficie de la célula 15. El trabajo en sistemas libres de células se ha demostrado que los sitios crípticos vinculantes FN-FN pueden ser revelados a través de desarrollo usando desnaturalizantes 16 o la tensión superficial en la interfase aire-líquido-sólido 17-19. Sin embargo, las fibras FN creados por estas técnicas se limitan a los tamaños y geometrías de fibra específicas y típicamente se une a una superficie.
Aquí se describe un conjunto iniciado por superficie denominado enfoque (SIA) 20 que supera estas limitaciones mediante la utilización de las interacciones proteína-superficie para crear exentas nanofibras insolubles, nanofabrics (planos 2D) y otras nanoestructuras compuestas de proteínas únicas o múltiples de ECM (Figura 1 ). En esta proceso, proteínas ECM se adsorben a partir de una conformación compacta, globular en solución y parcialmente desnaturalizado (desplegado) en una, polidimetilsiloxano (PDMS) hidrófobo el sello estampado. Las proteínas ECM se transfieren entonces en este estado en un poli térmicamente sensible (N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) superficie a través de la impresión por microcontacto 22. Cuando se hidrata con 40 ° C el agua la PIPAAm sigue siendo un sólido, pero cuando se enfría a 32 ° C que pasa a través de una temperatura de solución crítica inferior (LCST) donde se convierte en hidrófila, se hincha con agua y luego se disuelve, la liberación de las nanoestructuras de ECM montados fuera de la superficie. El método SIA proporciona control sobre las dimensiones con precisión a escala nanométrica. Mediante el control de los parámetros clave tales como la composición, la geometría de la fibra, y la arquitectura, es posible recapitular muchas propiedades de la ECM se han encontrado in vivo y para desarrollar andamios avanzados para aplicaciones de ingeniería de tejidos y de biotecnología.
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Protocol
1. Fabricación de Molde Maestro Usando Fotolitografia
- Las nanofibras de proteínas ECM, nanofabrics y nanoestructuras para ser fabricados primero se diseñaron utilizando diseño asistido por ordenador (CAD) software. Este archivo CAD se transfiere entonces a una fotomáscara. El tipo de fotomáscara dependerá de la resolución de las características; con una foto máscara basada en la transparencia adecuada para la función de los tamaños de hasta ~ 10 micras. Características más pequeñas <10 micras requerirá un cromo en photomask vidrio. Todas las nanofibras y nanoestructuras presentados aquí fueron fabricados utilizando una fotomáscara a base de la transparencia, y por lo tanto eran a escala nanométrica en espesor pero no dimensiones laterales.
Nota: Es importante distinguir qué regiones del photomask serán oscuro (evitar que la luz UV para pasar a través) y que será transparente (permite que la luz pase a través de los rayos UV), ya que, junto con el tipo de fotoprotector (positivo o negativo) , dictará la topografía final del molde maestro. - Para empezar la fabricación del molde maestro, deshidratar una oblea de 4 "de silicio colocándolo en una placa caliente ajustado a 150 ° C durante 15 min.
- Centre la oblea en el plato de vacío de un spin-revestidor. Vierta SU8-2015 fotorresistente negativa sobre el centro de la oblea y continuar vertiendo en círculos concéntricos hasta aproximadamente dos tercios de la oblea está cubierto.
Nota: Mantenga la botella de SU8 cerca de la oblea cuando se vierte a minimizar la formación de burbujas. - Programar el spincoater de la siguiente manera:
- Ciclo de propagación: 500 rpm con una aceleración de 100 rpm / s durante 10 s.
- El ciclo de centrifugado: 4000 rpm con una aceleración de 100 rpm / s durante 30 seg.
- Soft hornear la oblea colocándolo en una placa caliente ajustado a 95 ° C durante 3 min.
- Exponer la oblea con luz UV a travésla fotomáscara para una dosis total de 140 mJ / cm 2.
Nota: SU8 es un fotoprotector negativo, por tanto, las regiones donde la luz UV es capaz de pasar a través de la fotomáscara permanecerán después del revelado y convertido en características planteadas en el molde maestro. - Publique exposición hornear la oblea, colocándolo sobre una placa caliente ajustado a 95 ° C durante 4 min.
- Desarrollar la oblea colocándolo en desarrollador SU8 durante 3 min. Después de 3 minutos, enjuague la oblea con alcohol isopropílico. Si se produce una película en blanco durante el enjuague, la oblea no está completamente desarrollado y debe ser colocado de nuevo en el revelador durante otros 30 seg. Enjuague de nuevo con alcohol isopropílico. Repita este proceso hasta que una película en blanco no se forma durante el enjuague de alcohol isopropílico.
- Seque la oblea en una corriente de nitrógeno y colocar en una placa de Petri de 150 mm para proteger del polvo.
2. Realización de los Sellos de PDMS
- Preparar el prepolímero de PDMS mediante la combinación de la base de elastómero y agente de curado en un10:01 relación w / w. Normalmente se utilizan 80 g de base y 8 g de agente de curado para asegurar que no PDMS suficientes para cubrir el molde maestro en una capa de 1 cm de espesor.
- Mezclar y desgasificar el PDMS utilizando un mezclador centrípeta se establece en lo siguiente:
- Mezclar: 2000 rpm durante 2 minutos
- Degas: 2000 rpm durante 2 min.
- Si no está disponible un mezclador mezclar los PDMS con la mano durante 10 min utilizando una pipeta serológica de 10 ml. Desgasificar la mezcla mediante la colocación en un desecador de vacío durante 30 min para eliminar las burbujas.
- Vierta suficiente prepolímero de PDMS sobre el molde maestro (modelado de la oblea de silicio) para formar una capa de 1 cm de espesor. Curar el PDMS por cocción a 65 ° C durante 4 horas o a temperatura ambiente durante 48 h.
- Una vez curado, Las regiones que contienen los patrones se pueden cortar para formar los sellos PDMS. Para distinguir el lado característica de la parte trasera del sello PDMS, cortar una muesca de una de las esquinas en la parte trasera del sello.
3. Microcontacto PrInting de Patrones de ECM
- Limpiar cubreobjetos de vidrio de diámetro 25 mm por sonicación en etanol al 95% durante 1 hora y luego se seca en un horno de 65 ° C.
- Preparar la solución de PIPAAm disolviendo PIPAAm en 1-butanol a una concentración de 10% (w / v, típicamente de 1 g en 10 ml).
- Centre un cubreobjetos de vidrio en el plato de vacío de los spincoater y de pipeta 200 l de la solución PIPAAm de modo que toda la superficie de vidrio está cubierta.
- Spincoat el cubreobjetos a 6.000 rpm durante 1 min.
- Limpiar los sellos PDMS por sonicación en etanol al 50% durante 30 min y luego seco bajo una corriente de nitrógeno.
Nota: El secado y pasos posteriores deben realizarse en una cabina de bioseguridad para mantener la esterilidad para aplicaciones donde se utilizan las nanoestructuras de ECM con las células. - Cubra la superficie estampada de cada PDMS sello con 200 l de la solución de proteína, típicamente 50 mg / ml en agua destilada estéril para FN. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
Nota: Thes el recubrimiento de volumen es para un sello de PDMS 1,5 cm 2 y tendrá que ser ajustada en función del tamaño del sello de PDMS, la proteína de ECM utilizado y de la concentración de la proteína en solución de ECM. - Lave los sellos PDMS en agua destilada para eliminar el exceso de proteínas y seque bien bajo una corriente de nitrógeno.
Nota: Cualquier agua que queda en el sello se activará la disolución prematura de la capa PIPAAm sobre el cubreobjetos y evitar la transferencia de la proteína adecuada. - Para la fabricación estéril, colocar el cubreobjetos recubiertos de PIPAAm dentro de una caja de petri cerrada y esterilizar mediante exposición a rayos UV, 45 minutos bajo la luz UV en un gabinete de bioseguridad es suficiente. Si no se requiere esterilidad este paso se puede omitir.
- Realizar la impresión por microcontacto mediante la colocación de la parte característica de la marca de PDMS en contacto con el cubreobjetos recubiertos de PIPAAm. Si es necesario, el uso de fórceps para golpear ligeramente en la parte posterior de los sellos para eliminar las burbujas de aire y asegurar un contacto uniforme.
- Después de 5 millasn, retire el sello PDMS del cubreobjetos.
- En esta etapa, las proteínas ECM adicionales pueden ser modelados para crear estructuras más complejas y de múltiples componentes. Hasta 3 impresiones han sido verificados para trabajar con este proceso, y más pueden ser factibles.
4. Liberación de ECM nanofibras y nanoestructuras
- Coloque el PIPAAm cubreobjetos recubiertos con dibujos en una placa de Petri de 35 mm e inspeccionar la fidelidad patrón usando microscopía de contraste de fase. Dependiendo del modelo, una cámara CCD puede ser necesario para resolver las características del patrón. La microscopía de fluorescencia también se puede utilizar para inspeccionar el patrón proporcionado las proteínas ECM están etiquetados con fluorescencia.
- Añadir 3 ml de agua destilada a 40 ° C a la placa de Petri y dejar que el agua poco a poco fresco.
- La disolución de la capa de PIPAAm y la liberación de los patrones de proteínas de ECM se pueden monitorizar mediante microscopía de contraste de fase. Si la aplicación no permite el uso de tec ópticahniques, la liberación se puede controlar mediante la medición de la temperatura de la solución. Típicamente, el agua se enfría a temperatura ambiente, muy por debajo de la LCST de PIPAAm (32 ° C), para garantizar las nanoestructuras de proteínas ECM han sido puestos en libertad.
- Después de la liberación, las nanofibras, nanofabrics y otras nanoestructuras están flotando en el agua. Para utilizarlos para otras aplicaciones que necesitan para ser manipulados. El enfoque exacto dependerá del objetivo experimental y puede incluir etapas tales como la inmovilización sobre otra superficie, que se mueve con un sistema micromanipulador o incrustar en un hidrogel.
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Representative Results
SIA es capaz de ECM Ingeniería nanofibras de proteínas con un control preciso sobre dimensiones de la fibra. Para demostrar esto, las matrices de nanofibras FN con dimensiones planas de 50 x 20 m eran iguales en un cubreobjetos PIPAAm recubierto (Figura 2A). Tras la liberación, las fibras contratados porque estaban bajo una pre-tensión inherente al patrón en la superficie PIPAAm (Figura 2B). Análisis de las nanofibras FN reveló que eran monodispersas de pre-liberación con una longitud media de 50,19 ± 0,49 m y la anchura de 19,98 ± 0,17 micras (Figura 2C). A pesar de la contratación de forma apreciable, fibras FN posterior a la liberación estaban todavía monodispersa con una longitud media de 14,15 ± 0,92 my ancho de 2,65 ± 0,32 micras (Figura 2D). Microscopía de fuerza atómica proporcionó una perspectiva más alta resolución de los cambios dimensionales de fibras asociadas con el proceso de liberación de SIA. En particular, las fibras pre-lanzamiento tuvieronun espesor uniforme de ~ 5 nm (Figura 2 E) mientras que las fibras después de la liberación tuvo un espesor heterogénea del orden de varios cientos de nanómetros (Figura 2F).
Usando el proceso de SIA es posible diseñar una variedad de ECM de nanoestructuras de proteínas con el tamaño sintonizable, forma, y composición (Figura 3). Por ejemplo, nanofibras FN inicialmente 20 micras de ancho y 1 cm de longitud fueron modelados sobre un cubreobjetos recubierto con PIPAAm. Al enfriarse y PIPAAm disolución las nanofibras fueron liberados formando hilos largos (Figura 3A). Además, porque el patrón es definido por la topografía de la superficie del sello de PDMS utilizado para la impresión por microcontacto, es posible diseñar nanoestructuras complejas de proteínas de ECM. Como prueba de concepto, creamos estrellas multi-armados FN que conservaron su forma general después de la liberación (Figura 3B). Curiosamente, los brazos de la estrella FN contratados como las nanofibras peroel cuerpo de la estrella mantiene su tamaño. Mientras FN es importante, también queríamos demostrar que SIA trabaja con otras proteínas de ECM, tales como LN y que múltiples proteínas ECM se pueden incorporar en la misma estructura. Por ejemplo, hemos diseñado una nanofabric 2-D compuesta de nanofibras ortogonales e interconectados de FN y LN en una celosía matriz cuadrada (Figura 3C). Pre-liberar las nanofibras FN fueron de 20 m de ancho y las nanofibras LN fueron de 50 m de ancho. Tras la liberación de ambos tipos de nanofibras contratados pero se mantuvo la interconexión global y la estructura de red cuadrada. Estos resultados demuestran que SIA se puede utilizar para diseñar materiales de ECM con una variedad de composiciones y estructuras.
Los casos de no SIA de nanofibras de ECM se muestran en la Figura 4. Una de las causas es la liberación inadecuada de un patrón incompleta debido a la mala transferencia de proteínas ECM a la superficie de PIPAAm durante la impresión por microcontacto (Figura 4A). La presencia de agujeros, bordes irregulares, y otros defectos creará nanofibras y nanoestructuras que están incompletas y propenso a la rotura y fragmentación en caso de liberación. Rápida disolución de PIPAAm también puede causar patrón pobres fidelidad después de la liberación (Figura 4B). Por ejemplo, el uso de temperatura ambiente 20 ° C de agua DI ya por debajo de la LCST de PIPAAm en lugar de 40 ° C el agua hará que el PIPAAm se hinche rápidamente y se disuelve. Esto puede causar dos problemas; (I) la rápida expansión puede destrozar algunas nanofibras ECM y (ii) la expansión rápida puede causar la interrupción de la disposición de patrón después de la liberación.
Figura 1. Esquema del proceso de EIS. (A) Una oblea de silicio se spincoated con fotorresistencia negativa de SU8 y expuesto a la luz UV a través de una fotomáscara. Las zonas no expuestas se desarrollan lejos dejando un m topográficamente modelada molde aster. (B) PDMS prepolímero se vierte sobre el molde maestro y se curó durante 4 horas a 65 ° C. (C) Después del curado, un sello PDMS se corta. (D) El sello se incuba con una solución de proteínas ECM donde las proteínas se adsorben a la estampa en una conformación parcialmente desplegada. (E) El sello se enjuaga para eliminar el exceso de proteína, se secó, y se coloca en contacto conforme con un cubreobjetos de vidrio recubierta con PIPAAm. (F) Luego se retira el sello dejando tras proteínas ECM modelado en el cubreobjetos recubiertos con PIPAAm, el patrón está dictada por la topografía del sello. (G) El cubreobjetos se coloca entonces en una placa de Petri y se cubre con 40 ° C el agua y luego se enfrió por debajo de la LCST de PIPAAm (~ 32 ° C), lo que desencadena la disolución de PIPAAm y la liberación de ensamblados nanofibras de proteínas ECM y / o nanoestructuras de la superficie.
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Figura 2. Uso de SIA para diseñar las poblaciones de nanofibras monodispersas. (A) Una matriz de rectángulos FN, 50 micras de longitud y 20 micras de ancho se modeló sobre la superficie de PIPAAm. (B) Adición de 40 ° C de agua DI y el enfriamiento subsiguiente por debajo de la LCST de PIPAAm provocado la disolución de PIPAAm y la liberación de las nanofibras de FN. Tras la liberación, las fibras contratados como que están bajo una pre-tensión cuando estampado en la superficie PIPAAm. (C) Análisis de las dimensiones de nanofibras pre-liberación revela las fibras son monodispersas con una longitud y anchura de 50,19 ± 0,49 m y 19,98 ± 0,17 micras, respectivamente. (D) Después de la liberación de las nanofibras se contrajo, pero se mantuvo monodispersa con longitud posterior a la liberación y la anchura de 14,15 ± 0,92 micras y 2,65 ± 0,32 micras, respectivamente. (E) AFM mostraron que las nanofibras de pre-lanzamientoeran ~ 5 nm de espesor. (F) de AFM de nanofibras mensaje de liberación mostró que el espesor se había incrementado a varios cientos de nanómetros, mientras que la longitud y la anchura disminuyeron. -Escala de barras son (A) 50 micras y (B) 10 micras.
Figura 3. Uso de SIA para diseñar nanofibras de proteínas ECM y nanoestructuras con tamaño sintonizable, la forma y composición. (A) nanofibras de FN eran iguales en un cubreobjetos recubierto con PIPAAm como 1 cm de longitud y 20 micras de ancho. Disparo térmico resultó en el SIA de largo, nanofibras FN intactas con un ancho reducido de ~ 3 m. (B) Un ejemplo de una estrella FN múltiples brazos más complicado, representante de las diversas nanoestructuras que pueden ser creados usando SIA. Liberación térmica dio lugar a la contracción de los brazos, pero no la región central de la estrella, donde se unieron a los brazos juntos. (C) Es tambiénposible integrar múltiples proteínas de la MEC en la misma estructura. Por ejemplo, ortogonal, interconectados 20 micras de ancho líneas de FN (rojo) y 50 m de ancho líneas de LN (verde) integrado líneas en un nanofabric 2D se modeló y luego puesto en libertad. Incluso después de la liberación, el patrón retuvo su geometría inicial y la interconectividad. Las barras de escala son 50 micras.
Figura 4. Ejemplos de problemas que pueden impedir SIA adecuada y la liberación de proteínas de la superficie PIPAAm. (A) Malo impresión por microcontacto de proteínas ECM en los resultados PIPAAm de fragmentación y otros defectos de un micras de ancho de línea FN 20 impide que el SIA de un continuo FN de nanofibras y en su lugar da como resultado la formación de muchos fragmentos más pequeños Fn. (B) de liberación rápida las nanofibras FN del sustrato PIPAAm también pueden afectar a la disposición final de la fibra. En este caso el agua unt 20 ° C, ya por debajo de la LCST de PIPAAm, se añadió y provocó una rápida disolución provocando las nanofibras se retraiga, rompen (30 seg) y forman al azar, las configuraciones no organizados (52 seg.) Las barras de escala son 50 micras.
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Discussion
El método SIA presenta aquí imita la matriz de montaje mediada por células y permite la ingeniería de nanofibras y nanoestructuras de proteínas ECM con el tamaño sintonizable, organización y composición. Aunque no es idéntica a la ECM de células generadas, SIA crea ECM compuesta de fibrillas de proteína nanoescala 20 que se someten plegable reversible / desplegado durante la tensión mecánica 21 y se pueden unir las células 20. Esto proporciona una capacidad única para construir materiales de proteínas de ECM que recapitular muchas propiedades de la ECM que se encuentran in vivo. Por ejemplo, las nanofibras de ECM se pueden fabricar en longitudes específicas con un nivel de control no factible con otras técnicas. Demostramos la capacidad de crear matrices de nanofibras monodispersas (Figura 2), con un control preciso de la longitud y el pre-lanzamiento de ancho (Figura 2 C) y posterior a la liberación (Figura 2D). Estas nanofibras de ECM pueden ser de cualquier longitud, como se ha demostrado mediante la fabricación de nano FNfibras en ~ 1 cm longitudes (Figura 3A). En contraste, otras técnicas de fabricación, tales como electrospinning y la separación de fases pueden crear nanofibras pero no con el control preciso de la longitud, la producción de fibras principalmente continuos. Estas técnicas también son limitadas en las geometrías de fibra y la organización dentro de un andamio. SIA se puede utilizar para construir nanoestructuras ECM con geometría plana arbitraria, como una estrella (Figura 3B), y en hojas de 2-D con control arbitrario de organización de las fibras, como por ejemplo un nanofabric (Figura 3C). Además, otros métodos de fabricación típicamente utilizan materiales sintéticos o sólo un número limitado de los naturales, tales como quitosano y fibrina. En comparación, SIA permite que el conjunto de nanofibras y nanoestructuras compuestas completamente de las proteínas ECM tales como FN y LN, que no puede ser fabricado con estos otros métodos.
El paso crítico en el proceso de la EIS es la liberación térmicamente activado por de thsuperficie e PIPAAm. Para garantizar la correcta liberación, hay algunos pasos clave que deben ser considerados. En primer lugar, después de la etapa de impresión por microcontacto, la fidelidad de la ECM patrón transferido debe ser inspeccionado, ya sea usando microscopía de contraste de fase o microscopía de fluorescencia (si las proteínas ECM etiquetados con fluorescencia). Si hay algunos defectos en el patrón de proteínas en la superficie de PIPAAm, a continuación, la liberación posterior producirá nanoestructuras que contienen estos defectos (como se observa en la Figura 4A). Si un sello PDMS produce reiteradamente patrones de proteínas con defectos, es probable que el lado micropatterned del sello PDMS se haya rayado o contiene defectos y un nuevo sello y, potencialmente, debería hacerse un nuevo molde maestro. Además, se debe tener cuidado cuando la hidratación de la proteína de modelado, cubreobjetos recubiertos de PIPAAm. El agua debe estar en o cerca de 40 ° C y se dejó enfriar lentamente. Si el agua no es lo suficientemente caliente o enfríe demasiado rápidamente, el PIPAAm se hinchará unnd disuelven muy rápido haciendo que las nanofibras de proteínas ECM y nanoestructuras para ser potencialmente destrozadas de las fuerzas y sin orden ni concierto liberado de tal manera que se perderá cualquier organización estructural semejante al, estado pre-lanzado seco (Figura 4B).
Nanofibras de proteínas ECM, nanoestructuras y nanofabrics ensambladas utilizando SIA tienen muchas aplicaciones en biomecánica, la ingeniería de tejidos, y la biotecnología. Por ejemplo, la evidencia reciente indica que las propiedades mecánicas de las fibrillas de proteínas ECM gobierna su funcionalidad biológica 23. SIA es ideal para crear nanofibras de proteínas ECM en forma purificada para el análisis mecánico. Para llevar a cabo estos experimentos, nanofibras de proteínas ECM liberados pueden ser manipulados usando micropositioners precisión y luego estiran. Deravi et al han utilizado recientemente este método para demostrar que las nanofibras FN pueden soportar hasta 8 extensiones veces y que no sean objeto elástico, plástico y stlluvia rigidez regímenes con el aumento de la tensión 21. En la ingeniería de tejidos, proteínas ECM andamios basa en la forma de geles (por ejemplo, colágeno de tipo I y de fibrina) o tejidos descelularizado 4 son ampliamente utilizados. En comparación con estas técnicas, la ventaja de SIA es la capacidad para diseñar andamios con arquitectura bien definida en fibras 1-D y 2-D hojas (Figura 3C). Por ejemplo, hemos demostrado anteriormente que los cardiomiocitos pueden ser sembradas en nanofibras de FN para formar hebras funcionales de músculo cardíaco 20. Esto muestra que las nanofibras FN son de unión celular y que pueden dirigir el ensamblaje anisotrópico de células en estructuras de tejido alineados. Los nanofabrics 2-D pueden imitar la estructura y composición laminar de la membrana basal para su aplicación en la ingeniería de tejidos epiteliales y endoteliales. Además, estamos desarrollando nuevas formas de implementar estas nanofibras ECM y nanofabrics en 3-D mediante la incorporación dentro de matrices de hidrogel.Desde el proceso descrito en este artículo, es posible utilizar SIA para diseñar ECM a base de proteínas, materiales nanoestructurados para una amplia variedad de aplicaciones.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Se prestó apoyo financiero a JMS de los NIH Biomecánica en el Programa de Capacitación T32 Medicina Regenerativa (2T32EB003392), a QJ del Dowd-ICES Fellowship y para AWF del Premio Innovador Nueva del director del NIH (1DP2HL117750).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
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