Summary
단일 또는 다수의 세포 외 기질 단백질로부터 나노 섬유 및 나노 구조 복합체를 얻는 방법을 설명한다. 이 방법은 조직 공학 및 생명 공학 응용 프로그램의 다양한 사용을위한 조정 가능한 구성과 아키텍처 무료 서 단백질 계 물질을 생성하는 단백질 표면의 상호 작용을 사용합니다.
Abstract
조직의 세포 외 기질 (ECM)의 합성과 밀접 규제 섬유 직경, 조성 및 조직 차원 섬유 성 단백질의 네트워크를 형성하기 위해 세포에 의해 조립된다. 구조적지지를 제공하는 것 외에도, ECM의 물리 화학적 특성은 접착 성, 분화 및 세포 사멸 등 다양한 세포 과정에 중요한 역할을한다. 생체, ECM은 단백질 내에서 암호화 된 자기 조립 (fibrillogenesis) 사이트를 노출시킴으로써 조립할 . 이 과정은 다른 단백질을 다양하지만, 피브로넥틴 (FN) fibrillogenesis 잘 특징입니다 세포 매개 ECM 조립을위한 모델 시스템 역할을합니다. 특히, 세포는 불용성 섬유로 어셈블리에 대한 바인딩 사이트를 펼치고 노출 FN 이량 체 및 actomyosin 생성 수축력을 바인딩하는 세포막에 인테그린 수용체를 사용합니다. 이 수용체 - 중재 과정은 조직 SCA에 세포에서 ECM을 조립하고 구성하는 세포 수레. 여기, 우리는 ECM 단백질을 전개하고 불용성 섬유로 그들을 조립하는 단백질 표면의 상호 작용을 이용하여 세포 매개 매트릭스 어셈블리를 되풀이되었습니다 방법이라면 시작한 어셈블리 (SIA)를 제시한다. 첫째, ECM 단백질들은 부분적으로 (펼치) 변성 및 암호화 된 바인딩 도메인을 노출 소수성 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 표면에 흡착된다. 펼쳐진 단백질은 다음 열 감응성 폴리 (N-이소 프로필) (PIPAAm) 표면에 미세 접촉 인쇄를 통해 잘 정의 된 마이크로 및 나노 패턴을에 전송됩니다. PIPAAm의 열 트리거 용해 최종 조립과 잘 정의 된 지오메트리와 불용성 ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조의 릴리스로 연결됩니다. 복잡한 구조는 미세 접촉 인쇄에 사용되는 PDMS 스탬프에 엔지니어링 정의 된 패턴에 의해 가능하다. FN 이외에, SIA 프로세스는 라미닌, 피브리노겐으로 사용될 수 있고 콜라겐은 I 및 IV는 다 성분 ECM의 나노 구조를 만드는 입력뚜. 따라서, SIA는 생체 내에서 ECM의 구조와 구성을 다시 요약하기 위해 단백질 조성물, 섬유 형상 및 지지체 구조를 정확하게 제어하여 ECM 단백질 계 물질을 설계하는 데 사용될 수있다.
Introduction
조직의 세포 외 기질 (ECM)를 부착, 증식, 분화 및 세포 사멸 1-3 포함한 여러 세포 프로세스의 물리적, 화학적 조절에 관여 다기능 단백질로 구성되어있다. ECM은, 합성, 조립 및 세포 조직의 구성 단백질 섬유 조직의 종류와 발달 단계에 따라 달라 독특한 성분, 섬유의 크기, 형상 및 상호 연결된 구조를 가지고있다. 최근 작품은 ECM이 조성과 구조의 측면에서 ECM을 recapitulating하는 조직 공학 및 생명 공학 응용을위한 생체 모방 재료의 개발을 가능하게 할 수 있다고 제안, 설계 조직 4를 형성하는 세포를 안내하는 유익한 단서를 제공 할 수 있음을 보여 주었다.
제조 방법의 수는 조직에 ECM의 측면을 모방 할 중합체 골격을 설계하기 위해 개발되었다. 예를 들어, 전기 방사 및 위상 저전압 회로 차단기ATION 모두 다운 수십 마이크로 미터에서 나노 미터 5-7 수십에 이르는 직경 섬유의 다공성 매트릭스를 형성하는 능력을 증명하고있다. 두 가지 기술은 나노 섬유의 다공성 매트릭스는 발판 (8)에 세포 부착 및 침투를 지원할 수있는 것으로 나타났습니다. 그러나 이러한 접근 방식을 만들 수 있습니다 가능한 섬유 형상, 방향 및 3D 아키텍처에 제한됩니다. 상 분리가 무작위로 지향 섬유 지지체를 생산하는 반면 전기 방사는 일반적으로 무작위로 지향 또는 매우 정렬 된 하나 섬유 발판을 생산하고 있습니다. 재료에 대한 제한은 연구자 전형적 폴리이어서 세포 부착을 촉진하는 ECM 단백질로 코팅된다 (ε-카프로 락톤) (8) 및 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (9)와 같은 합성 중합체를 사용하여도있다. 자연 생물 중합체는 또한, 콜라겐 타입 I (10), 젤라틴 (11), 피브리노겐 (12)을 포함하여 사용된다키토산 (13), 실크 (14) 만 네이티브 조직에서 발견되는 단백질의 일부만을 나타낸다. 대부분의 조직은 기존의 방법을 사용하여 나노 섬유를 제조하기가 어렵거나 불가능한 피브로넥틴 (FN), 라미닌 (LN), 콜라겐 IV 형과 히알루 론산 등의 ECM 단백질과 다당류의 더 큰 환경을 포함한다.
이 문제를 해결하기 위해, 우리는 세포가 조립하고 자신의 주변에서 ECM 단백질 섬유를 구성, 합성 방식을 흉내 낸에 대한 우리의 연구 노력을 집중했다. 특정 fibrillogenesis 프로세스가 상이한 ECM 단백질에 대해 다르지만, 일반적 ECM 단백질 분자의 입체 형태 변화가 애매한 자기 조립 사이트를 노출 효소 또는 수용체 매개의 상호 작용에 의해 트리거된다. 여기에서 우리는 더 fibrillogenesis 과정을 이해하는 모델 시스템으로 FN를 사용합니다. 간단히, FN 동종이 량체는 10 타입 II에서 RGD의 아미노산 서열을 통해 세포 표면의 수용체 인테그린에 결합나는 장치를 반복합니다. 일단 바인딩, 인테그린은 actomyosin 수축을 통해 떨어져 이동하고 암호화 된 자기 조립 사이트를 노출하는 FN 이량 체를 전개. 이 FN-FN 결합 부위의 노출은 바로 세포 표면 (15)에 불용성 브릴로 조립하는 FN 이합체 수 있습니다. 세포가없는 시스템에서 작업은 암호화 된 FN-FN 결합 부위가 공기 - 액체 - 고체 인터페이스 17-19에서 변성제 16 또는 표면 장력을 사용하여 전개를 통해 공개 될 수 있음을 보여 주었다. 그러나, 이들 기술에 의해 생성 된 FN 섬유는 특정 섬유 크기 및 형상에 제한되며, 일반적으로 표면에 결합된다.
여기에 우리가 독립 불용성 나노 섬유, nanofabrics (2D 시트) (그림 1 단일 또는 다중 ECM 단백질로 구성된 다른 나노 구조를 만드는 단백질 표면의 상호 작용을 이용하여 이러한 한계를 극복 할 방법이라면 시작한 어셈블리 (SIA) (20)를 설명 ). 이 P에서로웠은, ECM 단백질은 용액에서 소형, 구형 형태에서 흡착 부분적 패턴, 소수성 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 스탬프 상 (펼쳐진) 변성된다. ECM 단백질은 다음 22 인쇄 미세 접촉을 통해 열 감응성 폴리 (N-이소 프로필) (PIPAAm) 표면에이 상태로 전송됩니다. 40 ° C의 물에 수화 때 PIPAAm 고체 남아 있지만, 32 °의 C로 냉각 할 때 그것은 친수성이되는 낮은 임계 용액 온도 (LCST)를 통과, 물에 팽윤하고 용해 떨어져 조립 ECM 나노 구조를 해제 면. SIA 방법은 나노 미터 스케일의 정밀 치수 제어를 제공한다. 이러한 구성, 섬유 형상 및 구조와 같은 주요 파라미터를 제어함으로써, 생체 내에서 발견 된 ECM의 여러 속성을 요점을 되풀이하고, 조직 공학 및 생명 공학 응용을위한 고급 발판을 개발하는 것이 가능하다.
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Protocol
포토 리소그래피를 사용하여 마스터 몰드 1. 제작
- ECM 단백질 나노 섬유, nanofabrics 및 제조 할 수있는 나노 구조는 첫 번째 (CAD) 소프트웨어를 컴퓨터 지원 설계를 사용하여 설계되었습니다. 이 CAD 파일은 그 다음, 포토 마스크로 전사된다. 포토 마스크의 분류는 특징의 해상도에 의존 할 것이다; 투명도 기반의 포토 마스크와 기능에 대한 충분한은 ~ 10 ㎛까지 크기. 작은 기능은 10 ㎛ 유리 포토 마스크에 크롬이 필요합니다 <. 여기에 제시된 나노 섬유 및 나노 구조의 모든 투명도 기반의 포토 마스크를 이용하여 제조하고, 따라서 두께가 나노 미터 스케일했지만 횡되지 치수 하였다.
참고 : 그것은 (통과 자외선 방지) 포토 마스크의 영역이 어둡게되는 구분하는 것이 중요하고 투명하게되는이 같은 (UV 빛이 통과 할 수 있도록), 포토 레지스트의 종류에 따라 (양 또는 음) 마스터 몰드의 최종 지형을 지시 할 것이다. - 마스터 몰드의 제조를 시작하기 위해 15 분 동안 150 ° C의 설정, 핫 플레이트에 배치하여 4 "실리콘 웨이퍼를 탈수.
- 스핀 코터의 진공 척에 웨이퍼를 중앙. 웨이퍼의 중간에 SU8 2015 네가티브 포토 레지스트를 붓고 웨이퍼의 3 분의 2가 덮여 때까지 동심원 쏟아져 계속합니다.
참고 : 거품의 형성을 최소화하기 위해 붓는 때 웨이퍼 SU8 가까이의 병을 유지. - 다음과 같이 스핀 코터 프로그램 :
- 스프레드주기 : 10 초 동안 100 RPM / 초 가속 500 분당 회전 수.
- 회전주기 : 30 초 동안 100 RPM / 초 가속 4,000 rpm으로.
- 소프트 3 분 동안 95 ° C로 설정 열판에 배치하여 웨이퍼를 굽는다.
- 를 통해 자외선 웨이퍼를 노출140 엠제이 / cm 2의 총 투여 량을위한 포토 마스크.
참고 : SU8은 네가티브 포토 레지스트 그러므로 UV 광이 포토 마스크를 통과 할 수있는 영역은 현상 후에 남아 마스터 주형에 융기 형상이 될 것이다. - 4 분 동안 95 ° C의 설정 열판에 배치하여 웨이퍼 베이크 노출을 게시합니다.
- 3 분 동안 SU8 개발자에 배치하여 웨이퍼를 개발한다. 3 분 후에, 이소 프로필 알코올로 웨이퍼를 헹군다. 흰색 막을 세정 중에 생성되는 경우, 웨이퍼는 완전히 개발되지 않고 다른 30 초 동안 현상 제에 다시 배치되어야한다. 이소 프로필 알콜로 세척한다. 흰색 필름이 이소 프로필 알코올 세정하는 동안 형성하지 않을 때까지이 과정을 반복합니다.
- 먼지로부터 보호하기 위해 150mm 페트리 접시에 질소와 장소의 흐름에 웨이퍼를 건조.
2. PDMS 스탬프 만들기
- 탄성 중합체 기반을 결합하고있는 에이전트를 경화시켜 PDMS 예비 중합체를 준비10시 1분 w / w 비율. 일반적 기재 및 경화제 8g의 80g는 1cm 두꺼운 층에 마스터 주형을 커버하기에 충분한 PDMS가 있는지 확인하기 위해 사용된다.
- 혼합하고 다음과 같이 설정 구심 믹서를 사용하여 PDMS를 드가 :
- 혼합 : 2 분 동안 2,000 rpm으로
- 드가 : 2 분 동안 2,000 rpm으로.
- 믹서를 사용할 수없는 경우 10 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 10 분 동안 손으로 PDMS를 섞는다. 기포를 제거하기 위해 30 분간 진공 건조기에 배치하여, 혼합물을 탈기.
- 1cm 두께의 층을 형성하는 매스터 주형 (패터닝 된 실리콘 웨이퍼) 위에 충분한 PDMS의 예비 중합체를 붓는다. 48 시간 동안 4 시간 또는 실내 온도 65 ° C에서 소성하여 PDMS를 치료.
- 일단 치료, 패턴을 포함하는 영역은 PDMS 스탬프를 형성하기 위해 절단 할 수 있습니다. PDMS 스탬프의 뒤편에서 기능면을 구분하기 위해 우표의 뒷면의 모서리 중 하나 밖으로 노치를 잘라.
3. 마이크로 콘택트 홍보ECM 패턴의 inting
- 1 시간과 65 ° C 오븐에서 건조 후 95 % 에탄올에서 초음파에 의해 청소 지름 25mm 유리 커버 슬립.
- 10 %의 농도 (10 ml 중 V / w, 전형적 1g)에서 1 - 부탄올에 용해시켜 PIPAAm PIPAAm 용액을 준비한다.
- 전체 유리 표면이 피복되도록 PIPAAm 용액의 스핀 코터 피펫 200 μL의 진공 척에 유리 커버 슬립을 가운데.
- 1 분 동안 6,000 rpm에서 커버 슬립을 Spincoat.
- 30 분 질소의 흐름에 따라 다음 건조 50 % 에탄올에서 초음파에 의해 PDMS 스탬프를 청소합니다.
참고 : 건조 및 후속 단계는 ECM 나노 구조가 세포로 사용될 어플리케이션을위한 무균을 유지하는 바이오 캐비닛에서 수행되어야한다. - 코트는 각 PDMS의 패턴 화 된 표면은 단백질 용액 200 μL, FN 멸균 증류수에 일반적으로 50 μg / ㎖와 스탬프. 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
참고 : 목볼륨을 코팅하면 1.5 cm 2 PDMS 스탬프 용, PDMS 스탬프를 사용 ECM 단백질과 용액 ECM 단백질의 농도의 크기에 따라 조정해야한다. - 충분히 질소의 흐름에 따라 여분의 단백질과 건조를 제거하기 위해 증류수에 PDMS 스탬프를 씻으십시오.
참고 : 스탬프에 남아있는 모든 물이 커버 슬립에 PIPAAm 코팅의 조기 해산을 트리거하고 적절한 단백질 전송을 방지 할 수 있습니다. - 무균 제조를 들어, 폐쇄 배양 접시 안에 PIPAAm 코팅 커버 슬립을 배치하고 생물 안전 캐비닛에 자외선 노출, 자외선 아래에서 45 분을 사용하여 살균하면됩니다. 불임이 필요하지 않은 경우이 단계를 생략 할 수 있습니다.
- PIPAAm 코팅 coverslip에 접촉 PDMS 스탬프의 기능 측면을 배치하여 미세 접촉 인쇄를 수행합니다. 필요한 경우, 공기 방울을 제거하고 균일 한 접촉을 보장하기 위해 우표의 뒷면에 가볍게 살짝 집게를 사용합니다.
- 5 마일 후N, 커버 슬립에서 PDMS 스탬프를 벗긴다.
- 이 단계에서, 부가적인 ECM 단백질은 더 복잡하고 다 성분 구조를 생성하도록 패터닝 될 수있다. 최대 3 인쇄용이 과정에서 작동하도록 확인 된, 더는 실현 될 수있다.
ECM 나노 섬유 및 나노 구조 4. 출시
- 35mm 페트리 접시에있는 패턴 PIPAAm 코팅 커버 슬립을 놓고 위상차 현미경을 사용하여 패턴 충실도를 검사합니다. 패턴에 따라, CCD 카메라는 패턴의 기능을 해결해야 할 수도 있습니다. 형광 현미경도 ECM 단백질은 형광 표지되어 제공된 패턴을 검사하는데 사용될 수있다.
- 페트리 접시에 40 ° C의 증류수 3 mL를 넣고 물을 서서히 냉각 할 수 있습니다.
- PIPAAm 층의 용해 및 ECM 단백질 패턴의 방출은 위상차 현미경을 사용하여 모니터링 할 수있다. 애플리케이션은 광 TEC의 사용을 허가하지 않는 경우hniques, 릴리스는 용액의 온도를 측정하여 모니터링 할 수 있습니다. 전형적으로, 물은 ECM 단백질 나노 구조가 릴리스 된 있도록 잘 PIPAAm (32 ℃)의 LCST 이하, 실온으로 냉각된다.
- 출시 후, 나노 섬유, nanofabrics 및 기타 나노 구조는 물에 떠있다. 이를 사용하려면 추가 응용 프로그램들은 조작 할 필요가있다. 정확한 방법은 실험 목적에 따라 달라집니다하고, 다른 표면에 고정화 미세 조작기 시스템으로 이동하거나 하이드로 겔 삽입 등의 단계를 포함 할 수있다.
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Representative Results
SIA는 섬유 치수를 정확하게 제어 엔지니어링의 ECM 단백질 나노 섬유의 할 수있다. 이 방법을 설명하기 위해 50 × 20 ㎛, 평면 치수 FN 나노 섬유의 배열은 PIPAAm 코팅 커버 슬립 (그림 2A)로 패턴 화 하였다. PIPAAm 표면 (그림 2B)에 패턴 때 그들이 고유의 사전 스트레스를 받고 있었기 때문에 릴리스에 따라, 섬유는 계약. FN 나노 섬유의 분석들은 50.19의 평균 길이가 단 분산 시험판했다 밝혀 ± 19.98 ± 0.17 ㎛, 0.49 ㎛의 폭 (그림 2C). 분명 계약에도 불구하고, FN 섬유는 출시 후 여전히 14.15의 평균 길이가 단 분산했다 ± 2.65 ± 0.32 μm의 (그림 2D)의 0.92 μm의 폭. 원자 힘 현미경은 SIA 분리 프로세스와 연관된 섬유 치수 변화의 높은 해상도 관점을 제공했다. 특히, 섬유는 시험판했다~ 5 nm의 (그림 2E)의 균일 한 두께의 섬유 릴리스 후 수백 나노 미터 (그림 2 층) 정도의 이종 두께가있는 반면.
SIA 프로세스를 사용하면은 가변 크기, 형상, 및 구성 (도 3)와 ECM 단백질 나노 구조의 다양성을 설계하는 것이 가능하다. 예를 들어, FN 나노 섬유는 처음에 길이 폭 20 μm의 1cm는 PIPAAm 코팅 커버 슬립에 패턴 화 하였다. 냉각 및 PIPAAm 용해에 나노 섬유는 긴 스레드 (그림 3A)을 형성 발표했다. 패턴이 미세 접촉 인쇄에 사용 PDMS 스탬프의 표면 지형에서 정의되기 때문에, 또한, 그것은 복잡한 ECM 단백질 나노 구조물을 설계하는 것이 가능하다. 증거의 개념으로, 우리는 릴리스 (그림 3B) 후 자신의 일반적인 형태를 유지 멀티 무장 FN 별을 만들었습니다. 흥미롭게도, FN 스타의 무기 나노 섬유와 같은 계약을 체결하지만,별의 몸은 그 크기를 유지했다. FN 중요하지만, 우리는 또한 SIA는 LN 다른 ECM 단백질과 여러 ECM 단백질이 동일한 구조에 통합 될 수있는 작동하는지 증명하고 싶었다. 예를 들어, 우리는 정방 격자 어레이 (도 3c)에서 FN 및 LN의 직교 및 상호 연결된 나노 섬유로 구성된 2-D의 nanofabric를 설계. 시험판 FN 나노는 20 μm의 넓은 있었다 LN 나노는 50 ㎛ 폭이었다. 릴리스되면 나노 섬유의 두 가지 유형의 수축되지만 전체적인 상호과 정사각형 격자 구조가 유지되었다. 이러한 결과는 SIA는 조성 및 구조의 다양한 ECM 물질을 설계하는 데 사용될 수 있음을 보여준다.
ECM 나노 섬유의 실패 SIA의 인스턴스는 그림 4에 나타내었다. 하나의 원인으로 인해 미세 접촉 인쇄 (그림 4A 동안 PIPAAm 표면에 ECM 단백질의 전사 불량에 불완전한 패턴의 부적절한 릴리스). 구멍 가장자리가 고르지 및 기타 결함의 존재는 불완전하고 해제시 파손 및 분할하는 경향이 나노 섬유 및 나노 구조를 만들 것입니다. PIPAAm의 신속한 용해는 릴리스 (그림 4B) 후 가난한 패턴 충실도가 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 이미 대신 40 ° C의 물 PIPAAm의 LCST 이하 20 ° C DI 물을 실내 온도를 사용하여 PIPAAm이 빠르게 팽창하고 용해의 원인이됩니다. 이 두 가지 문제를 야기 할 수있다; (I)의 급속한 확장은 일부 ECM 나노 섬유를 찢어 수 있으며, (II) 급속한 확장은 출시 후 패턴 배열의 혼란을 일으킬 수 있습니다.
도 1. SIA 공정의 개략도. (A) 실리콘 웨이퍼 SU8 네가티브 포토 레지스트로 스핀 코팅하고, 포토 마스크를 통해 UV 광에 노출된다. 비에 노출 된 지역은 지형적 패턴 m를 떠나 멀리 개발 애 스터 형. (B) PDMS 예비 중합체가 마스터 몰드에 부어 경화 후 65 ° C. (C)에서 4 시간 동안 경화, PDMS 스탬프를 잘라입니다. (D) 스탬프는 다음 ECM 단백질 용액에 배양 단백질이 부분적으로 펼쳐진 형태의 스탬프에 흡착 곳. (E) 도장 건조, 여분의 단백질을 제거하는 세척 및 PIPAAm 코팅 된 유리 커버 슬립과 등각 접촉에 배치됩니다. (F) 스탬프는 다음 뒤에 남겨두고 제거 PIPAAm 코팅 커버 슬립에 패턴 ECM 단백질, 패턴 스탬프의 지형에 의해 결정됩니다. (G) 커버 슬립이 다음 페트리 접시에 넣고 40 ° C의 물을 포함하고 PIPAAm (의 LCST 이하로 냉각 ~ 32 PIPAAm의 해산 및 표면에서 조립 ECM 단백질 나노 섬유 및 / 또는 나노 구조의 석방을 트리거 ° C).
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40 ° C DI 물과 이후의 냉각의 그림 2. 단 분산 나노 섬유의 인구를 엔지니어에게 SIA를 사용하여. (A) FN 사각형의 배열, 가로 길이 50 μm의 20 μm의이 PIPAAm 표면에 패턴 화 하였다. (B) 추가 PIPAAm의 LCST 이하 PIPAAm의 해체와 FN 나노 섬유의 방출을 촉발시켰다. PIPAAm 표면에 패턴 할 때이 사전에 스트레스를 그대로 릴리스에 따라, 섬유는 계약. 나노 크기의 (C) 분석 시험판이 섬유는 50.19 ± 0.49 ㎛의 길이와 폭을 가진 단일 분산이며, 19.98 ± 0.17 밝혀 각각 μm의. (D)가 각각 출시되면 나노 섬유가 수축하지만, 14.15 ± 0.92 μM의 릴리스 후 길이와 폭으로 단 분산 남아 2.65 ± 0.32 μm의. (E) AFM 것을 보여 주었다 시험판 나노 섬유~ 5 nm 두께했다. 출시 후 나노 섬유 (F) AFM은 길이와 폭이 감소하면서 두께가 수백 나노 미터로 증가했다고했다. 스케일 바 (A) 50 μm의 (B) 10 ㎛이다.
그림 3. 조정 가능한 크기, 모양 및 조성 ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조물을 설계하는 SIA를 사용하여. (A) FN 나노 섬유는 길이 1 ㎝, 폭 20 ㎛의로 PIPAAm 코팅 커버 슬립에 패턴 화 하였다. 열 방출은 ~ 3 ㎛의 감소 폭이 긴, 그대로 FN 나노 섬유의 SIA의 결과. (B) 더 복잡한 다중 무장 FN 스타, SIA를 사용하여 만들 수있는 다양한 나노 구조의 대표 예. 열 방출은 팔의 수축의 결과 만 팔 함께 결합 별의 중심 지역. (C) 또한하지동일한 구조에 여러 ECM 단백질을 통합하는 것이 가능. 예를 들어, 직교, FN (적색)의 상호 20 μm의 폭 넓은 라인 및 LN (녹색)의 50 ㎛ 폭 넓은 라인 2D nanofabric에 통합 라인을 패턴 화하고 출시되었습니다. 심지어 출시 후, 패턴은 초기 형상과 상호 연결을 유지했다. 스케일 바는 50 μm의 수 있습니다.
PIPAAm 분열의 결과와 20 μm의 넓은 FN 라인의 다른 결함 위에 ECM 단백질의 그림 4. PIPAAm면에서 적절한 SIA과 단백질의 방출을 방지 할 수있는 문제의 예. (A)별로 미세 접촉 인쇄는 연속의 SIA 방지 대신에 FN 나노 파이버와 많은 작은 FN 단편. (B) 급속 PIPAAm 기판으로부터 FN 나노 파이버를 방출은 또한 최종 섬유의 배열에 영향을 미칠 수있는 형성을 초래한다. 이 경우 물에t 20 ° C는 이미 PIPAAm의 LCST 이하, 추가 및 나노 섬유는, 스냅 휴식 (30 초)와 무작위, 조직적 구성 (52 초)을 형성하는 원인이 빠른 용해를 유발했다. 스케일 바는 50 μm의 수 있습니다.
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Discussion
SIA의 방법은 여기에서 모방 세포 매개 매트릭스 어셈블리를 제시하고 조정할 수있는 크기, 조직 및 구성과 ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조의 설계를 가능하게한다. 세포 생성 ECM과 동일하지는 않지만, SIA는 기계적 변형 21 일 동안 전개 / 가역 접는를 받아야 세포 20을 바인딩 할 수 있습니다 나노 단백질 섬유 (20)로 구성 ECM을 만듭니다. 이것은 생체 내에서 발견 된 ECM의 여러 속성을 요점을 되풀이 ECM 단백질의 자료를 구축 할 수있는 독특한 기능을 제공합니다. 예를 들어, ECM 나노 파이버는 다른 기술과 불가능한 제어 레벨에 특정 길이로 제조 될 수있다. 우리는 단 분산 나노 섬유의 배열 길이의 정확한 제어와 폭 시험판 (그림 2C) 및 릴리스 후 (그림 2D)과 (그림 2)을 생성 할 수있는 기능을 보여줍니다. FN 나노 제조에 의해 입증 이러한 ECM 나노 섬유는, 어떤 길이 될 수 있습니다~ 1cm 길이 (그림 3A)의 섬유. 대조적으로, 같은 전기 방사 상분리 같은 다른 제조 기술은 주로 연속 섬유의 제조, 길이의 정확한 제어와 나노 파이버를 생성 할 수는 없지만. 이러한 기술은 또한 골격 내에서 섬유 형상과 조직에 제한됩니다. SIA는 별 (그림 3B)와 같은 임의의 평면 형상으로 ECM의 나노 구조를 구축하는 데 사용 될 수 있으며, 이러한 nanofabric (그림 3C)와 같은 섬유 조직의 임의의 제어와 2-D 시트,의.은 또한, 다른 제조 방법은 일반적으로 합성 물질이나 키토산 및 섬유소 등의 자연 사람의 제한된 번호를 사용합니다. 비교에서, SIA는 다른 방법으로 제조 할 수없는 FN 및 LN, 같은 ECM 단백질의 완전히 구성 나노 섬유 및 나노 구조의 조립을 할 수 있습니다.
SIA 프로세스에서 중요한 단계 번째부터 열 트리거 릴리스전자 PIPAAm면. 적절한 릴리스를 보장하기 위해 고려되어야합니다 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 먼저, 마이크로 콘택트 프린팅 단계 후, 전사 ECM 패턴 충실도 (ECM 단백질이 형광 태그 된 경우) 중 하나 위상차 현미경 또는 형광 현미경을 사용하여 검사한다. PIPAAm 표면에 단백질 패턴에 결함이있는 경우에, 다음 후속 릴리스 (도 4a에서 관찰)이 결함을 함유 나노 구조체를 생성 할 것이다. PDMS 스탬프를 반복적으로 결함이 단백질 패턴을 생성하는 경우, PDMS 스탬프의 마이크로 패턴면이 긁히거나 결함과 새로운 스탬프를 포함하고 잠재적으로 새 마스터 금형해야한다 된 가능성이 높다. 패턴 단백질, PIPAAm 코팅 coverslip에 수화 경우는,주의를 기울여야합니다. 물은 40 ° C에서 또는 근처에 있어야하고 서서히 냉각 될 수있다. 물이 충분히 따뜻하지 않거나 너무 빠른 속도로 냉각하면 PIPAAm 팽창한다차를 너무 빨리 용해 ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조가 잠재적으로 건조, 미리 해제 상태를 닮은 구조적 조직이 손실 될 것이라는 등 (그림 4B)을 출시 떨어져 세력과 우연히 찢어진 원인.
ECM 단백질 나노 섬유, 나노 구조 및 SIA를 사용하여 조립 nanofabrics는 생체 역학, 조직 공학, 생명 공학에있는 많은 응용 프로그램이 있습니다. 예를 들어, 최근의 증거는 ECM 단백질 섬유의 기계적 성질이 그들의 생물학적 기능 (23)을 제어 것을 나타낸다. SIA는 이상적으로 기계적인 분석을위한 정제 형태로 ECM 단백질 나노 섬유를 만드는 데 적합합니다. 이 실험을 수행하기 위해, 출시 ECM 단백질 나노 섬유 정밀 micropositioners을 사용하여 조작하고 기지개 할 수있다. Deravi 등 최근 FN 나노 섬유들이 고무, 플라스틱을 받아야하고, 성 8 배 확장을 견딜 것을 할 수 있음을 입증하기 위해이 방법을 사용했습니다비 - 경직 증가 스트레인 (21) 정권을. 조직 공학에서, ECM 단백질 젤의 형태 (예를 들면, 콜라겐 타입 I과 섬유소) 또는 decellularized 조직 (4) 널리 사용되는에 발판을 기반으로. 이들 기술에 비해, SIA의 장점은 1-D 섬유 및 2-D 시트 (도 3c)에 잘 정의 된 아키텍처와 발판을 설계 할 수있는 능력이다. 예를 들어, 우리는 이전에 심근 세포가 심장 근육 (20)의 기능적인 가닥을 형성하기 위해 FN 나노 파이버 상 시드 할 수 있다는 것을 보여 주었다. 이는 FN 나노 파이버가 셀 바인딩 그들이 정렬 조직 구조물로 세포의 이방성 조립체를 안내 할 수 있다는 것을 보여준다. 2-D의 nanofabrics 상피 및 내피 조직 공학 응용 프로그램의 기저막의 구성과 층 구조를 모방 할 수있다. 또한, 우리는 하이드로 겔 매트릭스 내에서를 포함하여 3-D에서 이러한 ECM 나노 섬유 및 nanofabrics를 배포 할 수있는 새로운 방법을 개발하고있다.이 문서에서 설명 된 프로세스로부터, 다양한 애플리케이션을위한 ECM 단백질 계, 나노 구조 물질을 설계하는 SIA를 사용하는 것이 가능하다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
금융 지원은 NIH 감독의 새로운 혁신 상 (1DP2HL117750)에서 다우드-ICES 교제 QJ과 AWF에, 재생 의학 T32 교육 프로그램 (2T32EB003392)에 NIH 역학에서 JMS에 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
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