Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

استخدام المصابيح الفلورية الهدف صالحة لتقييم T الردود الخليوي Published: June 19, 2014 doi: 10.3791/51627
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

Summary

القدرة على رصد استجابات الخلايا التائية بالتفصيل في الجسم الحي المهم لتطوير فهمنا للاستجابة المناعية. نحن هنا وصف استخدام صفائف الهدف الفلورسنت (اتفاقيات التجارة الحرة) في الجسم الحي في فحص الخلايا التائية التي يقيم> 250 معلمات في وقت واحد من قبل التدفق الخلوي.

Abstract

القدرة على رصد استجابات الخلايا T في الجسم الحي المهم لتطوير فهمنا للاستجابة المناعية وتصميم المناعية. نحن هنا وصف استخدام الفلورسنت مجموعة المستهدفة (FTA) والتكنولوجيا، التي تستخدم الأصباغ الحيوية مثل استر carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE)، البنفسجي ليزر الأصباغ منفعل (CellTrace فيوليت: CTV) والليزر الحمراء الأصباغ منفعل (خلية انتشار صبغ eFluor 670: وثيقة البرنامج القطري ) لcombinatorially الخلايا الليمفاوية الماوس في التسمية> 250 ملحوظ مجموعات الخلايا الفلورسنت. مجموعات الخلايا داخل هذه اتفاقيات التجارة الحرة يمكن نابض مع التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) من الدرجة الأولى والدرجة MHC-II الببتيدات ملزمة، وبالتالي تكون بمثابة خلايا CD8 + الهدف لوخلايا CD4 + T، على التوالي. تبقى هذه الخلايا قابلة للحياة واتفاقية التجارة الحرة تعمل بكامل طاقتها، وبالتالي يمكن أن تدار في الفئران للسماح تقييم CD8 + T قتل بوساطة خلية من الخلايا المستهدفة اتفاقية التجارة الحرة وCD4 + T-هيل التأمل الخليةp من اتفاقية التجارة الحرة B الخلايا المستهدفة خلية في الوقت الحقيقي في الجسم الحي بواسطة التدفق الخلوي. منذ> 250 الخلايا المستهدفة يمكن تقييمها في وقت واحد، والأسلوب يسمح رصد استجابات الخلايا T ضد عدة الحواتم المستضد في عدة تركيزات ومكررات متعددة. على هذا النحو، يمكن للتقنية قياس استجابات الخلايا التائية في كل من الكمية (على سبيل المثال حجم التراكمي للاستجابة) والنوعية (على سبيل المثال. الطمع وظيفية وحاتمة عبر التفاعل من الاستجابة) المستوى. هنا، نحن تصف كيفية بناء هذه اتفاقيات التجارة الحرة وتعطي مثالا على الكيفية التي يمكن تطبيقها لتقييم استجابات الخلايا التائية الناجمة عن الفيروس لقاح جدري المؤتلف.

Introduction

الخلايا التائية تلعب دورا محوريا في الاستجابة المناعية التكيفية، وغالبا ما تستهدف التلاعب في العلاج المناعي. CD4 + T المستجيب الخلايا الرد على مستضد عن طريق إفراز السيتوكينات الخارجية التي تنظم جوانب كثيرة من الحصانة ويمكن أن يساعد أيضا الخلايا البائية مباشرة لتصنيع الأجسام المضادة. خلايا CD8 + T السامة للخلايا (CTLs) يمكن أن تستجيب أيضا لمستضد عن طريق إفراز السيتوكينات الخارجية وكذلك تلعب دورا مركزيا في قتل الخلايا مباشرة تعبر عن مستضد الأجنبية. التفاعل الأساسي الذي يبدأ هذه الوظائف المستجيب الخلايا التائية ينطوي على التفاعل بين الخلايا مستقبلات T (TCR) مع الببتيدات الأجنبية المعروضة على جزيئات MHC على سطح الخلايا. خلايا CD4 + T تعترف الببتيدات المعروضة على جزيئات MHC من الدرجة الثانية على مستضد تقديم الخلايا وخلايا CD8 + T تعترف الببتيدات المعروضة على جزيئات MHC-I الطبقة التي عادة ما يتم عرضها على الخلايا المصابة ميكروب.

من أجللتقييم الدور الذي تلعبه الخلايا التائية في الاستجابة المناعية، فمن الضروري أن ظائف المستجيب التي يتم قياسها من خلال تقنيات موثوقة وحساسة. وتشمل الطرق الشائعة لتقييم استجابة الخلايا T؛ MHC class-I/II/peptide tetramer التفاعل؛ إنتاج السيتوكينات التي كتبها ELISPOT والخلايا تلطيخ خلوى؛ وقتل القدرات بنسبة 51 المقايسات الكروم، الإصدار. هذه المقايسات، ومع ذلك، وعادة ما يتم تنفيذ فيفو السابقين مع التحفيز في المختبر، أو تقديم رؤية محدودة في وظيفة خلايا تي. من الناحية المثالية، عند قياس استجابات الخلايا التائية أنه سيكون من المفيد لتقييم لهم في الموقع، في الجسم الحي عند حدوثها، مع عدم وجود التلاعب من الخلايا T وذلك لتجنب التغيرات في المعايير الفنية التي قد تحدث من خلال التحفيز في المختبر. وتستند بعض من الأكثر شيوعا في الجسم الحي الخلايا التائية المقايسات الفنية على قياس القتل CTL بوساطة الخلايا المستهدفة نابض مع الطبقة MHC الببتيدات أنا ملزم بأن يتم تعداد في الجسم الحيعبر الكشف من خلال وضع العلامات الفلورية مع الأصباغ الحيوية مثل CFSE. في حين أن هذه الأنواع من المقايسات يمكن رصد مقتل CTL بوساطة من الأهداف عندما يحدث في الجسم الحي، وكان لديهم في السابق قدرة محدودة نسبيا لتقييم مقتل أهداف متعددة تقديم تركيزات مختلفة وأنواع مختلفة من الحواتم الببتيد، وهو مطلوب للسماح المعلمات النوعية مثل الطمع وظيفية وحاتمة البديل عبر التفاعل ليتم تقييمها. هذه المقايسات أيضا لا توفر أي معلومات عن CD4 + T الخلية بوساطة الاستجابات.

للتغلب على العديد من القيود مع الأساليب الحالية المستخدمة لتقييم استجابات الخلايا التائية، وقد وضعنا مؤخرا مقايسة متعددة استنادا صفائف الفلورسنت الهدف (اتفاقيات التجارة الحرة)، والذي يسمح للرصد استجابات الخلايا T ضد> 250 الخلايا المستهدفة في وقت واحد في حيوان واحد من قبل التدفق الخلوي 1، 2. وتتألف اتفاقيات التجارة الحرة من الخلايا الليمفاوية المسمى مع بغازيتركيزات األطراف ومزيج من الأصباغ الحيوية مثل CFSE، CTV وثيقة البرنامج القطري السماح> 250 خلية من مجموعات مضان فريدة لتكون ولدت. لأن هذه الخلايا لا تزال قابلة للحياة وتعمل بكامل طاقتها، ويمكن حقنها في الحيوانات للسماح رصد تفاعلها مع الخلايا التائية المستجيب في الجسم الحي 3. على سبيل المثال، مجموعات الخلايا اتفاقية التجارة الحرة يمكن نابض مع MHC-I-الببتيدات ملزمة الطبقة للسماح تقييم مستضد محددة CTL بوساطة قتل الخلايا المستهدفة 1. بالإضافة إلى ذلك، ومجموعات الخلايا اتفاقية التجارة الحرة يمكن أيضا أن يكون نابض مع الببتيدات MHC الدرجة الثانية ملزمة، مما يتيح تقييم مستضد محددة الخلايا التائية المساعدة (T H) النشاط عن طريق تقييم تفعيل (عن طريق تقييم علامات تفعيل مثل CD69، CD44 و / أو CD62L) من خلايا B ضمن اتفاقية التجارة الحرة التي تحمل الببتيد وما شابه ذلك 2. منذ ويمكن الكشف عن أكثر من 250 أهداف في وقت واحد، فمن الممكن لقياس CTL وT H الاستجابات ضد العديد من مجموعات الخلايا المستهدفة نابض مع nالببتيدات umerous بتركيزات مختلفة وإدراج العديد من مكررات. وبالتالي يوفر الفحص FTA مستوى غير مسبوق من T تقييم استجابة المستجيب خلية في الجسم الحي.

نحن هنا تصف بالتفصيل بناء منطقة التجارة الحرة وإظهار الكيفية التي يمكن تطبيقها على تقييم استجابات الخلايا T في الجسم الحي. يصف الإجراء بناء منطقة تجارة حرة تتكون من 252 مجموعات الخلايا ملحوظ من خلال استخدام ثلاثة الأصباغ الحيوية، تتألف من 6 تكرارات من 42 مجموعات الخلايا نابض مع الطبقة MHC-I والببتيدات الثاني ملزم. وضع العلامات من 42 مجموعات الخلايا يحدث في 10 مل المخروطية القاع أنابيب وأنها مفيدة لوضع هذه في رف أنبوب كما هو مبين في الجدول رقم 1. يمكن تعديل هذه الطريقة لأعداد أقل من كتل ملحوظ كما هو مطلوب عن طريق تقليل كمية من وضع العلامات كل صبغة يؤديها 1.

نسلط الضوء على فائدة الفحص من خلال إظهار كيف يمكن قياس رد ووفاق الناتجة عن التطعيم للفيروسات جدري المؤتلف ضد الحواتم متعددة في لفيف صغير من الفئران. هذا يبين كيف يمكن استخدام مقايسة اتفاقية التجارة الحرة لقياس الاستجابات التراكمية والطمع وظيفية من خلال، على التوالي، واستخدام المساحة تحت منحنى (AUC) تقييم وقياس تركيز الببتيد الفعالة اللازمة لتوليد استجابات القصوى نصف (EC 50).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تمت معالجة الفئران المستخدمة في إطار هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات تجارب على الحيوانات الجامعة الوطنية الاسترالية والفئران والموت الرحيم من قبل خلع عنق الرحم.

1. صبغ وإعداد الببتيد

  1. إعداد صبغ
    ملاحظة: يتم prediluted الأصباغ بتركيزات مختلفة للسماح للتوسيم الخلايا في كثافة مضان منفصلة. يستخدم CFSE في سبعة تجمعات تتم من خلال التخفيفات التسلسلي 3.5 أضعاف، وتستخدم CTV وثيقة البرنامج القطري في ستة تركيزات مختلفة تتم من خلال التخفيفات التسلسلي 3.7 أضعاف (انظر الجداول 2-4). سيتم استخدام تركيزات المخزون من الأصباغ المدرجة في الجدولين 2-4 لتسمية الخلايا المستهدفة في تركيزات الصبغة النهائية المدرجة في الجدولين 2-4. الأصباغ تتفاعل عند التعرض لمحلول مائي. ولذا فمن المهم أن تكون قارورة معايرتها لRT قبل فتح للحد من التعرض للأصباغ إلى التكثيف.
    1. CFSE
      ملاحظة: يتم شراء CFSE كما carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات succinimidyl استر (CFDA، SE؛ MW 557.47)، وعادة عند 25 ملغ / القارورة.
      1. في resuspend 25 ملغ من CFSE في 4.48 مل DMSO للحصول على محلول المخزون 10 ملي.
      2. متسلسل تخفيف CFSE: إضافة 35 ميكرولتر من 10 ملي الأسهم CFSE إلى 87.5 ميكرولتر من DMSO وكرر هذا مع محلول المخزون المخفف لإعطاء كل تركيز الصبغة في الجدول 3.
    2. CTV
      ملاحظة: عادة ما يتم شراؤها CTV في حزم من 9 قارورة، كل منها يمكن أن يعاد مع 10 ميكرولتر من DMSO لتوليد حل 10 ملم من الصبغة.
      1. إعادة تجميع وكل قارورة 9 من CTV مع 90 ميكرولتر من DMSO لإعطاء حل 10 ملم.
      2. متسلسل تمييع CTV: إضافة 11 ميكرولتر من 10 ملي CTV الأسهم إلى 29.7 ميكرولتر من DMSO وكرر هذا مع محلول المخزون المخفف لإعطاء كل تركيز الصبغة في الجدول 2.
    3. وثيقة البرنامج القطري
      ملاحظة: وثيقة البرنامج القطري (MW 792.6) هو نموذجيكما اشترت لاي 0.5 ملغ / القارورة.
      1. في resuspend 0.5 ملغ من وثيقة البرنامج القطري في 63 مل من DMSO للحصول على حل 10 ملم.
      2. متسلسل تمييع وثيقة البرنامج القطري: إضافة 11 ميكرولتر من 10 ملي الأسهم وثيقة البرنامج القطري إلى 29.7 ميكرولتر من DMSO وكرر هذا مع محلول المخزون المخفف لإعطاء كل تركيز الصبغة في الجدول 4.
        ملاحظة: يمكن تخزين مخزونات صبغ في -20 درجة مئوية لعدة أشهر ويمكن إذابة وأعيد تجميدها مرة أخرى عدة مرات دون خسارة كبيرة في وظيفة.
  2. إعداد الببتيد
    ملاحظة: يتم استخدام الببتيدات MHC من الدرجة-I-ملزم عموما إلى نبض الخلايا المستهدفة في 6 تركيزات مختلفة مصنوعة باستخدام 10 أضعاف التخفيفات من تركيز بدءا من 1 ميكرومتر (الجدول 5). وتستخدم الطبقة MHC الببتيدات الثاني ملزم عموما إلى نبض الخلايا المستهدفة في 6 تركيزات مختلفة مصنوعة باستخدام 3 أضعاف التخفيفات من تركيز بدءا من 400 ميكرومتر (الجدول 5). يرصد كل الببتيد في التركيز النهائي 2X في برنامج تلفزيوني مثل ثار كل تركيز الببتيد لديه الحد الأدنى من حجم 250 ميكرولتر. الأسهم الببتيد يمكن إعداد اتفاقية التجارة الحرة قبل البناء وتخزينها في -20 درجة مئوية دون خسارة كبيرة في وظيفة.
    1. الببتيدات الأسهم إعداد الطبقة MHC-I-ملزم
    2. إعداد على أعلى تركيز كل حاتمة الببتيد إلى 2 الحلول الأسهم ميكرومتر (2X 1 ميكرومتر)
    3. متسلسل تمييع MHC-I-الببتيدات ملزمة الدرجة: إضافة 44.4 ميكرولتر من 2 ميكرومتر الببتيد محلول المخزون إلى 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. كرر هذا مع محلول المخزون المخفف لإعطاء كل تركيز الببتيد في الجدول 5.
    4. الببتيدات الأسهم إعداد الطبقة MHC-II-ملزم
    5. إعداد على أعلى تركيز كل حاتمة الببتيد إلى 800 ميكرومتر الحلول الأسهم من (2x 400 ميكرومتر).
    6. متسلسل تمييع MHC الببتيدات الفئة-II-ملزم: إضافة 150 ميكرولتر من 800 ميكرومتر حل الببتيد في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. كرر هذا مع محلول المخزون المخفف لإعطاء كل تركيز الببتيد في الجدول 5

2. إعداد اتفاقية التجارة الحرة

ملاحظة: يحدد الإجراء أدناه بناء على اتفاقية التجارة الحرة تتألف من خلايا نابض مع 7 الحواتم الببتيد مختلفة في 6 تركيزات مختلفة (أي 42 مجموعات الخلايا.) كرر 6 مرات لتوليد 252 مجموعات الخلايا ملحوظ. داخل كل تكرار، كتلة الخلية لا نابض مع أي حاتمة (النيل)، يتم تضمين كمجموعة تحكم. فإنه من المفيد لاتفاقيات التجارة الحرة لديها اختلاف CD45 النمط الخيفي من الحيوانات المضيفة للسماح التمييز ضدهم من خلايا المتلقي عن طريق وضع العلامات الأجسام المضادة في وقت التحليل. خلاف ذلك اتفاقيات التجارة الحرة يمكن المسمى مع الأصباغ الأخرى مثل PKH-26 لهذا الغرض (موضح في الخطوة 2.6). عادة، يتم إجراء إعداد اتفاقية التجارة الحرة خارج من البداية الى النهاية خلال جلسة واحدة.

  1. تسمية 42، 10 مل المخروطية القاع أنابيب بلاستيكية 1-42 (كما في الجدول رقم 1 على سبيل المثال).
  2. إعداد الخلايا
    1. عزل الطحال و / أو lymphnodes من الفئران. إعداد تعليق خلية واحدة من الأنسجة التي كتبها يهرس من خلال 70 ميكرون مسامي غربال مع 5 مل حقنة الغطاس وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
    2. في resuspend الخلايا اللمفية بسرعة تصل إلى 200 × 10 6 خلية / مل في 11.5 مل من روتشستر معهد ميموريال بارك 1640 (RPMI، أو ما يعادلها) تحتوي على 5٪ مصل العجل الجنين (FCS). ملاحظة: من المهم استخدام العازلة مع ارتفاع محتوى أمين لتقليل سمية للخلايا الصبغة 3.
  3. وضع العلامات CTV
    ملاحظة: وصفت الخلايا في البداية مع 6 تركيزات CTV.
    1. بدقة resuspend الخلايا بواسطة قلب الأنبوب عدة مرات. إضافة 1.9 مل من تعليق خلية إلى 6 من 10 مل أنابيب المسمى 37-42، مع الحرص على عدم الرطب النصف العلوي من الأنابيب.
    2. لتسمية الخلايا مع CTV، وإزالة الغطاء أنبوب ووضع أنبوب أفقيا.
    3. إضافة 83 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى الجزء غير مبلل في الجزء العلوي من الأنبوب، وهذا إضافة 17 ميكرولتر من الأسهم CTV (انظر تبويبلو 2 الذي تم تعيينه حل الأسهم التي أنبوب). ملاحظة: أنبوب غير مبلل المهم لمنع حركة تعليق خلية وخلط المبكرة من الحل الخلية مع محلول الصبغة.
    4. غطاء الأنبوب وخلط تعليق خلية مع الصبغة بسرعة وبدقة من قبل vortexing.
    5. كرر الخطوات 2.3.2-2.3.4 للحلول المخزون من CTV في أنابيب المعين هو موضح في الجدول رقم 2.
    6. احتضان الخلايا لمدة لا تقل عن 5 دقائق على RT (20 درجة مئوية).
  4. وضع العلامات CFSE
    1. بعد وضع العلامات CTV، إضافة 5 مل من RPMI تحتوي على 5٪ FCS إلى كل أنبوب و resuspend بدقة الخلايا من قبل vortexing.
      1. من أنبوب نقل 37 1 مل من تعليق خلية لأنابيب 31، 25، 19، 13، 7، و 1.
      2. من أنبوب نقل 38 1 مل من تعليق خلية لأنابيب 32، 26، 20، 14، 8، و 2.
      3. من أنبوب نقل 39 1 مل من تعليق خلية لأنابيب 33، 27، 21، 15، 9، و 3.
      4. من أنبوب نقل 40 1 مل من خليةتعليق لأنابيب 34، 28، 22، 16، 10، و 4.
      5. من أنبوب نقل 41 1 مل من تعليق خلية لأنابيب 35، 29، 23، 17، 11، و 5.
      6. من أنبوب نقل 42 1 مل من تعليق خلية لأنابيب 36، 30، 24، 18، 12، و 6
        ملاحظة: الحرص على عدم الرطب النصف العلوي من الأنابيب خلال الخطوات 2.4.1.1-2.4.1.6.
    2. لتسمية الخلايا مع CFSE، وإزالة الغطاء أنبوب ووضع أنبوب أفقيا.
    3. إضافة 103 مل من برنامج تلفزيوني إلى الجزء غير مبلل في الجزء العلوي من الأنبوب، وهذه الإضافة 7 مل من الأسهم CFSE (انظر الجدول 3 الذي تم تعيينه حل الأسهم التي أنبوب).
    4. غطاء الأنبوب وخلط تعليق خلية مع الصبغة بسرعة وبدقة من قبل vortexing.
    5. تفعل الخطوات 2.4.2-2.4.4 للحلول المخزون من CFSE في أنابيب المعين هو موضح في الجدول رقم 3.
    6. احتضان الخلايا لمدة لا تقل عن 5 دقائق على RT (20 درجة مئوية).
    7. غسل الخلايا: تمييع تعليق خلية مع 9 مل من 20 درجة مئويةRPMI تحتوي على 5٪ FCS والرواسب بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة عند 20 درجة مئوية وإزالة supernatants بواسطة الشفط مع ماصة نقل.
  5. ينبض الببتيد وغسل الخلايا
    ملاحظة: بعد أن وصفت الخلايا مع CTV وCFSE، ونابض أنها مع MHC من الدرجة-I و / أو الطبقة MHC-II الببتيدات ملزمة (المعد في 1.2). كما يجب أن لا يكون نابض واحدة من السكان الخلية مع الببتيد (على سبيل المثال. النيل في الجدول 1) وتستخدم كعنصر تحكم السلبية لحساب استجابات الخلايا التائية.
    1. الببتيد النبض
      1. Resuspend الخلايا في الحجم الكلي لل250 ميكرولتر من RPMI تحتوي على 5٪ FCS. ملاحظة: عادة 50 ميكرولتر من تعليق خلية يبقى بعد تطلع طاف في نهاية الخطوة 2.4.7، وبالتالي إضافة 200 ميكرولتر من المتوسطة إلى الخلية بيليه.
      2. إضافة 250 ميكرولتر من الأسهم الببتيد قبل استعداد (كما في الجدول 5) ليعين بشكل مناسب أنابيب (كما في الجدول رقم 1) ويكون سوره لتشمل أنبوب السيطرة من برنامج تلفزيوني وأضاف وحدها دون الببتيد كعنصر تحكم النيل.
      3. مزيج تعليق خلية مع دوامة. ملاحظة: ومن الأهمية بمكان أن كل حاتمة الببتيد وكل تركيز الببتيد تم تعيينه إلى أنبوب واحد وهذا سجلت بوضوح على أساس مضان المتوقع للخلايا في هذا الأنبوب، منذ توقيع مضان من هذه المجموعة ستحدد هذا الببتيد (كما في الجدول 1 على سبيل المثال).
      4. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. غسل الخلايا
      1. إضافة 5 مل من الجليد الباردة (4 ° C) RPMI تحتوي على 5٪ FCS لتعليق الخلية وResuspend الخلايا بواسطة قلب الأنبوب. الأساس الذي تقوم عليه بعناية تعليق الخلية مع 3 مل من الجليد الباردة (4 ° C) FCS.
      2. الرواسب الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. استخدام التسارع والكبح بطيئة لضمان واجهة من FCS ويتم الحفاظ على حل تعليق خلية.
      3. نضح بعناية قبالة RPMI ثمالسفح مع ماصة نقل، وترك الخلايا الكريات غسلها دون عائق. ملاحظة: إن استخدام الأساس الذي تقوم عليه FCS لغسل الخلايا يساعد على ضمان تتم إزالة قدر حل الببتيد من الخلايا ممكن، وبالتالي الحد من التعرض للسكان الخلية إلى الببتيدات حرة متعددة عندما يتم تجميع الخلايا.
      4. غسل خلايا مرة أخرى: Resuspend وكريات خلية في 10 مل من 4 درجات مئوية RPMI تحتوي على 5٪ FCS. الرواسب الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تخلصي supernatants.
      5. تجمع كل سكان الخلية معا في أنبوب واحد مع ماصة باستخدام 6 مل من 4 درجات مئوية RPMI تحتوي على 5٪ FCS. الرواسب المجمعة الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. نضح قبالة طاف مع ماصة نقل.
  6. CPD وضع العلامات الخليوي
    ملاحظة: عند هذه النقطة يمكن أن تتولد ستة مكررات فحص داخل الخلايا عن طريق وضع العلامات الببتيد نابض مع 6 تركيزات مختلفة من وثيقة البرنامج القطري.
    1. إضافة 11.4 مل من 20 درجة مئويةRPMI تحتوي على 5٪ FCS لبيليه الخلية المجمعة و resuspend بدقة باستخدام ماصة.
    2. إضافة 1.9 مل من تعليق خلية إلى 6، 10 مل أنابيب المسمى بالعربية، مع الحرص على عدم الرطب النصف العلوي من الأنابيب.
    3. لتسمية الخلايا مع وثيقة البرنامج القطري، وإزالة الغطاء أنبوب ووضع أنبوب أفقيا.
    4. إضافة 92 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى الجزء غير مبلل في الجزء العلوي من الأنبوب، وهذه الإضافة الأسهم وثيقة البرنامج القطري (انظر الجدول رقم 4 لكمية من محلول المخزون المسندة إلى كل أنبوب).
    5. غطاء الأنبوب وخلط تعليق خلية مع الصبغة بسرعة وبدقة من قبل vortexing.
    6. . لا 2.6.3-2.6.5 الخطوات لحلول الأوراق المالية من وثيقة البرنامج القطري في أنابيب المعين هو موضح في الجدول رقم 4 ملاحظة: خلافا CFSE وCTV، تركيز وضع العلامات وثيقة البرنامج القطري ليست متصلة على وجه التحديد خطيا إلى كثافة مضان الناتجة من الخلايا المسمى، و لذلك كان تركيز وضع العلامات المستخدمة للحصول على مسافة واحدة من قمم الفلورسنت العديد من السكان المسمىتحدد تجريبيا (انظر الجدول 4).
    7. احتضان الخلايا لمدة لا تقل عن 5 دقائق على RT (20 درجة مئوية).
    8. غسل الخلايا مرتين: Resuspend الخلايا إلى 10 مل مع 20 ° C RPMI تحتوي على 5٪ FCS. الرواسب الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة عند 20 درجة مئوية. نضح قبالة طاف مع ماصة نقل. تكرار.
    9. تجمع جميع الخلايا معا في أنبوب واحد باستخدام 8 مل 4 ° C RPMI تحتوي على 5٪ FCS مع ماصة. الرواسب المجمعة الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، ونضح قبالة طاف مع ماصة نقل.
  7. (اختياري) PKH-26 وضع العلامات الخليوي
    ملاحظة: إذا اتفاقيات التجارة الحرة لا يمكن بناؤها مع الخلايا معربا عن اختلاف النمط الخيفي CD45 لاستضافة الفئران، فإنها يمكن أن يكون المسمى مع PKH-26 للسماح التمييز ضدهم من خلايا المتلقي.
    1. إضافة 2.9 مل من 20 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني لبيليه الخلية المجمعة و resuspend بدقة مع ماصة.
    2. إضافة تعليق الخلية إلى أين المبللة 10 مل أنبوب، مع الحرص على عدم الرطب النصف العلوي من الأنبوب.
    3. إزالة الغطاء أنبوب ووضع أنبوب أفقيا.
    4. إضافة 58 ميكرولتر من مخفف C (في الصبغة عدة PKH-26) إلى الجزء غير مبلل في الجزء العلوي من الأنبوب، وهذا إضافة 42 ميكرولتر من 1 ملم الأسهم PKH-26.
    5. غطاء الأنبوب وتخلط مع حل الخلية الصبغة بدقة من قبل vortexing.
    6. احتضان الخلايا لمدة لا تقل عن 10 دقيقة في RT (20 درجة مئوية).
    7. غسل الخلايا مرتين: Resuspend الخلايا إلى 10 مل مع 20 ° C RPMI تحتوي على 5٪ FCS. الرواسب الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة عند 20 درجة مئوية. نضح قبالة طاف مع ماصة نقل. تكرار.
  8. اتفاقيات التجارة الحرة عن طريق الحقن في الحيوانات المضيفة
    ملاحظة: لقياس استجابات الخلايا T في الجسم الحي، يتم حقن الحيوانات في اتفاقيات التجارة الحرة التي لديها استجابة مناعية نشطة وتركت في الموقع لمدة تصل إلى 24 ساعة. فمن الأهمية بمكان أن يتم حقن اتفاقيات التجارة الحرة أيضا في حيوان السذاجة كعنصر تحكم السلبية.
    1. عد و resuspend الخلايا في 2.5 × 10 8 خلايا لكل مل في برنامج تلفزيوني. ضخ 200 ميكرولتر من الخلايا في الفئران عن طريق الوريد المضيفة، بما في ذلك حيوان السذاجة كمجموعة تحكم.

3. التدفق الخلوي

  1. 18-24 ساعة بعد الحقن FTA حصاد الدم أو الطحال (أو الأنسجة الأخرى من الفائدة) من الفئران المضيف.
  2. إعداد تعليق خلية واحدة من الأنسجة التي كتبها يهرس من خلال 70 ميكرون مسامي غربال مع 5 مل حقنة الغطاس.
  3. الخلايا resuspend على ما يصل إلى 65 × 10 6 خلية / مل في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA.
  4. الاستغناء 100 ميكرولتر مأخوذة من تعليق خلية في آبار من لوحة microtitre لوضع العلامات الأجسام المضادة.
  5. خلايا التسمية مع تألقي المسمى الأضداد وتحقيقات الجدوى الفلورسنت مع مضان متوافق طيفيا لCFSE، CTV وثيقة البرنامج القطري. ملاحظة: الأجسام المضادة إلى B علامات الخلية مثل B220 وعلامات تفعيل مثل CD69 ضرورية لقياس تنشيط الخلايا B إذا باستخدام FTA لقياس استجابات الخلايا T H 2. وتشمل الأجسام المضادة لCD45.1 و / أو CD45.2 إذا اتفاقيات التجارة الحرة والفئران المضيف لديها اختلاف النمط الخيفي CD45.
  6. إضافة 100 ميكرولتر من محلول المخزون 2X الأصباغ الأجسام المضادة / بقاء (في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA) إلى 100 ميكرولتر مأخوذة من الخلايا، تخلط جيدا واحتضان على الجليد (4 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
  7. غسل الخلايا: خلايا الرواسب بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة طاف. الخلايا resuspend في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA، وخلايا الرواسب بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة طاف.
  8. Resuspend الخلايا في الحجم الكلي لل400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA، وخلايا التصفية من خلال شبكة 70 ميكرون وتحليل التدفق الخلوي في تدفق عداد الكريات قادرة على الكشف عن الأصباغ وتقارن الفلورسنت ذات الصلة. جمع ما يصل إلى 3 × 10 6 اللمفاويات الأحداث من أجل حل كل عنقود خلية اتفاقية التجارة الحرة والحصول على ما يكفي من الخلايا لاحصاءتحليل كال. ملاحظة: تأكد من أن جميع الضوابط النموذجية (مثل التحكم الملون واحد) للالتدفق الخلوي يعملون. عادة، يتطلب CFSE الإثارة من مصدر الليزر الأزرق (عادة في 488 نانومتر) والكشف مع الفرقة تمرير مرشحات طيرانها فوق 520 نانومتر؛ يتطلب CTV الإثارة من مصدر الليزر البنفسجي (عادة في 405 نانومتر) والكشف مع الفرقة تمرير مرشحات طيرانها فوق 450 نانومتر؛ وثيقة البرنامج القطري يتطلب الإثارة من مصدر ليزر أحمر (عادة في 633 نانومتر أو 640 نانومتر) والكشف مع الفرقة تمرير مرشحات طيرانها فوق 670 نانومتر.

4. تحليل البيانات

  1. تحليل التدفق الخلوي البيانات باستخدام معيار البرمجيات التدفق الخلوي (انظر نتيجة ممثل للحصول على مثال من هذا النوع من استراتيجية النابضة العاملين).
  2. لقتل محددة٪، وحساب عدد الخلايا في كل مجموعة خلية اتفاقية التجارة الحرة مع نابض MHC-I-الببتيدات ملزمة الصف والمجموعات اتفاقية التجارة الحرة التي لم الببتيد نابض ("النيل") واستخدام الصيغة التالية لحساب٪ مقتل محددة.
    ٪ مقتل محددة صيغة
    ملاحظة: في الصيغة أعلاه "تستعد" يشير إلى أهداف من الحيوانات التي يعتقد أن لديهم استجابة مناعية ضد الببتيدات المستهدفة، "السذاجة" يشير إلى أهداف من الحيوانات السذاجة، "ببتيد" يشير إلى أهداف نابض مع الببتيدات و "لا شيء" يشير إلى أهداف لا نابض مع أي الببتيدات.
  3. لتنشيط الخلايا B كمقياس للT H النشاط، وحساب متوسط ​​كثافة مضان هندسية (GMFI) من CD69 الضد مضان على خلايا B اتفاقية التجارة الحرة مع نابض الببتيدات MHC الدرجة الثانية ملزم في الحيوانات "معبي" وهذا من طرح GMFI من CD69 التعبير على الخلايا المناظرة FTA B في الحيوانات "ساذجة" لإعطاء مقياس T H النشاط.
  4. من الإحصاءات التي تم إنشاؤها في الخطوات 4.2 و 4.3، استخدامبرنامج جداول البيانات الحسابية مثل GraphPad بريزم لحساب غيرها من العوامل الكمية والنوعية مثل منطقة تحت منحنى وEC 50 (في عمق صفا لكيفية يتم تنفيذ هذه الحسابات لمفوضية الاتحاد الأفريقي ويمكن الاطلاع على
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm؟stat_area_under_the_curve.htm، وEC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. HTM؟ reg_the_ec50.htm).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كمثال على استخدام مقايسة اتفاقية التجارة الحرة، وتحصين BALB / ج الماوس مع فيروس اللقاحية المؤتلف (VV) معربا عن فيروس نقص المناعة البشرية الحواتم-I (VV-HIV) والردود على فيروس نقص المناعة البشرية الحواتم CTL-I، الكمامة، موت الكمامة، تم تقييم الحياة الفطرية وبول، وVV CTL الحواتم F2L وF2L موت، وفيروس نقص المناعة البشرية حاتمة الخلايا T-I H، الكمامة ث (كما هو موضح في 2) باستخدام 252 معلمة FTA فحص (الشكل 1B). لا يتم التعبير عن المتغيرات حاتمة من الكمامة (موت الكمامة) وF2L (F2L موت) في ناقلات VV-فيروس نقص المناعة البشرية، وبالتالي استجابات ضد هذه الحواتم هي انعكاس لحاتمة البديل عبر استجابات الخلايا التائية المتفاعلة. تم حقن الفئران السذاجة أيضا مع اتفاقية التجارة الحرة كعنصر تحكم السلبية. تم تمييز اتفاقية التجارة الحرة من خلايا فأر المضيف PKH-26 وضع العلامات والخلايا B FTA التمييز التي كتبها B220 تلوين الأجسام المضادة عن طريق التدفق الخلوي (أرقام 1A و 1B). وبوابات كل من 6 مكررات الحيوان داخل على أساس وثيقة البرنامج القطري مضان (الشكل 1C (الشكل 1D). تم تقييم٪ مقتل محددة من كل تكرار بمقارنة FTA العنقودية موت الخلايا في الحيوانات معبي النسبية لمجموعات اتفاقية التجارة الحرة في الحيوانات السذاجة (الشكل 1D) المقابلة. تم تقييم T H النشاط بمقارنة FTA B upregulation خلية من خلايا CD69 في الحيوانات معبي النسبية لمجموعات الخلايا B في اتفاقية التجارة الحرة بين الحيوانات السذاجة (الشكل 1E) المقابلة.

من هذا التحليل، ولدت عدوى فيروس نقص المناعة البشرية VV-استجابات CTL قوية ضد سائد مناعيا VV حاتمة F2L، مع 100٪ من الخلايا المستهدفة اتفاقية التجارة الحرة مع نابض 0.001 ملي أو أكثر من حاتمة يتم إزالتها من الطحال (الشكل 2A). كان هناك أيضا رد فعل قوي ضد ولدت على شكل متغير من F2L، F2L موت، مع 100٪ من الخلايا المستهدفة اتفاقية التجارة الحرة مع نابض 0.01 ملم أو أكثر من حاتمة يتم إزالتها من الطحال. منذF2L موت غير موجود في فيروس يصيب، يشير هذا الرد حاتمة البديل استجابة عبر رد الفعل. كان هناك أيضا استجابة معتدلة نسبيا ولدت ضد أهداف معربا عن حاتمة فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة وردا على رد الفعل عبر طفيف ضد النموذج البديل من هذا حاتمة، فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة موت. يبدو أن هناك استجابات تذكر ولدت لفيروس نقص المناعة البشرية HIV بول وبيئية CTL الحواتم.

بالإضافة إلى استجابات CTL، والمثال فحص FTA أظهرت أيضا قياس T H ردود تقييم تفعيل اتفاقية التجارة الحرة B خلية معربا عن فيروس نقص المناعة البشرية MHC حاتمة الفئة-II-ملزم فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة ال (الشكل 2B). وأظهر هذا حدث تنشيط الخلايا B مستضد محددة في الحيوانات معبي يشير جيل من فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة المستجيبات ال محددة الخلايا التائية H.

هذه التدابير من استجابة الخلايا T حجم يمكن تلخيصها من خلال توليد منطقة تحت منحنى القيم (AUC) لكل من الحواتم (الشكل 2C) أن شركة طيران الشرق الأوسطسورس حجم التراكمي للاستجابة.

بالإضافة إلى حجم مستضد الاستجابات عبر التفاعل محددة وحاتمة البديل، مقايسة اتفاقية التجارة الحرة تسمح قياسات الطمع وظيفية في هذا الشأن. على سبيل المثال، وتركيزات الببتيد فعالة تستخدم لنبض الخلايا المستهدفة اتفاقية التجارة الحرة المطلوبة لاعطاء اجابات القصوى نصف (EC 50)، ويرد للالمستجيبات CTL (الشكل 2D). وهذا يدل على الطمع وظيفية للموت F2L الحواتم، فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة وفيروس نقص المناعة البشرية الكمامة موت، كان ما يقرب من 10، 100 و 4،000 أقل أضعاف، على التوالي، من الردود ولدت لVV حاتمة المهيمنة F2L.

الجدول 1
الجدول 1. تخطيط من 252 معلمة اتفاقية التجارة الحرة. تخطيط نموذجي من تكرار واحد من 252 FTA تتألف من 42 عينات / أنابيب نابض مع 7 الحواتم الببتيد مختلفة في 6 مختلفاتركيزات ر بما في ذلك الامم المتحدة ونابض (النيل) عينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

عدد أنبوب حجم (ميكرولتر) الأسهم صبغ (ملي CTV) تركيز النهائي (ميكرومتر)
37 0 0 0
38 17 0.053 0.451
39 17 0.197 1.48
40 17 0.73 6.21
41 17 2.7 23
42 17 10 85

الجدول 2. الأسهم CTV تستخدم لتسمية الخلايا. حجم المدرجةالأسهم CTV تستخدم لتسمية الخلايا في 2 مل لإعطاء تركيز النهائي وسم الصبغة.

عدد أنبوب حجم (ميكرولتر) الأسهم صبغ (ملي CFSE) تركيز النهائي (ميكرومتر)
37 - 42 0 0 0
31-36 7 0.022 0.139
25 - 30 7 0.078 0.492
19-24 7 0.23 1.45
13-18 7 0.82 5.17
7-12 7 2.9 18.3
1-6 7 10 63.1

الجدول 3. الأسهم CFSE تستخدم لتسمية الخلايا. حجم المدرجة CFSE الأسهم لناإد لتسمية الخلايا في 1.11 مل لإعطاء تركيز النهائي وسم الصبغة.

عدد أنبوب حجم (ميكرولتر) الأسهم صبغ (ملي CPD) تركيز النهائي (ميكرومتر)
A 0 0 0
B 4 0.053 0.106
C 6.3 0.197 0.62
D 7.5 0.73 2.74
E 7.3 2.7 9.86
F 7.7 10 38.5

الجدول 4. الأسهم CPD تستخدم لتسمية الخلايا. حجم الأسهم المدرجة CPD تستخدم لخلايا التسمية في 2 مل لإعطاء labelin النهائيز تركيز الصبغة.

تركيز الببتيد (ميكرومتر)
الببتيدات ملزم أنا الطبقة MHC 0 0.00002 0.0002 0.002 0.012 0.2 2
الطبقة MHC الببتيدات الثاني ملزم 0 3.29 9.88 29.6 88.9 266 800

الجدول 5. MHC من الدرجة الأولى والثانية ملزم تركيزات الأسهم الببتيد. تركيزات الأسهم النموذجية 1 من الحواتم الببتيد تستخدم لبناء منطقة التجارة الحرة 1. هذه التركيزات يتم 2X تركيزات النهائي تستخدم لنبض الخلايا المستهدفة.

الشكل 1 واستخدمت الرقم 1. التدفق الخلوي نموذجي تحليل اتفاقيات التجارة الحرة. Splenocytes من الفئران BALB / ج لبناء 252 معلمة اتفاقية التجارة الحرة كما هو موضح في النص. تم نابض مجموعات اتفاقية التجارة الحرة مع 6 تركيزات (كما هو موضح في الجدول رقم 5) من 7 الحواتم الفيروسية المختلفة، بما في ذلك الحواتم MHC من الدرجة-I-ملزمة، F2L (SPYAAGYDL، وهو L-يقتصر د اللقاحية الفيروس (VV) حاتمة)؛ F2L موت (SP G AAGYDL، وهو البديل من F2L)، الكمامة (AMQMLKETI، وهو K-يقتصر د فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة حاتمة 4)، موت الكمامة (AMQMLK D TI، وهو البديل من فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة 5)، بول (VGPTPVNII، وD د المقيدة فيروس نقص المناعة البشرية بول حاتمة 6)، بيئية (RGPGRAFVTI، وD المقيدة د فيروس نقص المناعة البشرية الحياة الفطرية حاتمة 7)؛ والطبقة MHC-II-ملزمة الببتيد الكمامة T H (PVGEIYKRWIILGLN، وهو H-2-يقتصر د فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة حاتمة 4). تم حقن اتفاقيات التجارة الحرة د. في BALB / ج الماوس التي تم إصابة الأنف (في.) في وقت سابق 6 أيام مع تفصيلombinant VV معربا عن الحواتم فيروس نقص المناعة البشرية (VV-فيروس نقص المناعة البشرية والحيوانية معبي). تم حقن اتفاقية التجارة الحرة أيضا في الفئران السذاجة كمجموعة تحكم. بعد 18 ساعة في الجسم الحي، وقد تم تحليل الخلايا اتفاقية التجارة الحرة موجودة في تعليق خلية طحالية من الفئران المضيف بواسطة التدفق الخلوي. أ) استراتيجية النابضة التدريجي النموذجية لتحديد الخلايا اتفاقية التجارة الحرة لتظهر بوابات الخلايا الليمفاوية، singlets وPKH-26 + الخلايا اتفاقية التجارة الحرة (كما أنها مفيدة ل لحل الخلايا الحية باستخدام صبغة حيوية مثل هويشت 33258، لا تظهر). B) مؤامرة 3D تظهر جميع الكتل اتفاقية التجارة الحرة من السذاجة الماوس المضيف. C) المؤامرات الرسم البياني يظهر FTA CPD مضان وسم كل من الحيوان داخل 6 يعيد دال) المؤامرات 2D تظهر واحدة من 6 خلايا داخل الحيوان FTA B يعيد تقديم أنواع وتركيزات مختلفة من الحواتم الحيوان السذاجة ومعبي. وهذا يدل على عدم وجود اتفاقية التجارة الحرة في الخلايا الحيوانية المتعلقة معبي للحيوان السذاجة، وكشف عن "مقتل الأحداث"بواسطة CTLs التي تشكل أساس اتفاقية التجارة الحرة مما أسفر عن مقتل مقايسة 1. E) تحليل الرسم البياني من اتفاقية التجارة الحرة B التعبير خلية من خلايا CD69 التنشيط علامة في الحيوانات معبي نسبة إلى السذاجة الحيوانات، التي تشكل الأسس التي قامت عليها اتفاقية التجارة الحرة خميس مساعد الفحص 2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. اتفاقيات التجارة الحرة تمكين قياس حجم والطمع من استجابات الخلايا T في الجسم الحي. تم استخدام 252 معلمة اتفاقية التجارة الحرة لتقييم استجابات الخلايا التائية في الفئران المصابة VV-فيروس نقص المناعة البشرية كما هو موضح في الشكل رقم 1. A) تم حساب قتل محددة٪ لجميع الحواتم CTL والنتائج من كل من 6 إعادةتم تقييم plicates عرض (اللوحة اليسرى) وكذلك الوسائل والخطأ القياسي من الوسائل (اللوحة اليمنى) هو مبين. B) T H استجابة عن طريق قياس تفعيل اتفاقية التجارة الحرة الخلية B تقديم حاتمة فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة ث لكل من 6 مكررات الحيوان داخل ( اللوحة اليسرى) والوسائل والخطأ القياسي من الوسائل (اللوحة اليمنى) المحسوبة. C) القياسات AUC لقتل٪ محددة (أ) و T الردود مساعد (ب) تم حساب كمقياس لحجم تراكمية. D) حسبت EC 50 قياسات ل٪ بيانات محددة القتل (أ) كتدبير من الطمع وظيفية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الاستفادة من اتفاقية التجارة الحرة القائمة على المقايسات هو أنها تسمح للتمييز من> 250 السكان الخلية المستهدفة قابلة للحياة وظيفية بالكامل من حيوان مضيف واحد بواسطة التدفق الخلوي. هذا يوفر مستوى من التعقيد لفي الجسم الحي تتدفق المقايسات مقرها الخلوي الذي لم يكن ممكنا من قبل. ويبرز هذا في التجارب على الحيوانات 2 هو مبين أعلاه، حيث يمكن رصد الاستجابات إلى 7 الحواتم الفيروسية متميزة في 6 تجمعات في مكررات من 6 في وقت واحد في حيوان واحد مما يتيح المعلمات مثل مفوضية الاتحاد الأفريقي والمفوضية الأوروبية 50 يتم تحديدها لاستجابات الخلايا T في الجسم الحي .

بالإضافة إلى قياس استجابات الخلايا T في الجسم الحي، والمقايسات تستند اتفاقية التجارة الحرة، يمكن تعديلها لقياس الاستجابات في المختبر 1. وهذا ينطوي أساسا مضيفا اتفاقيات التجارة الحرة إلى T الخلايا في الثقافة لقياس الاستجابات على مدى عدة ساعات في المختبر. واحد الحد من القدرة على مقرها في فحوصات المختبر باستخدام اتفاقيات التجارة الحرة هو ركان الميل للخلايا المسمى ضمن اتفاقية التجارة الحرة لنقل الصبغة وضع العلامات على الخلايا المحيطة 1، 3. هذا يمكن أن يؤدي في القرار انخفضت من مجموعات الخلايا اتفاقية التجارة الحرة كما يصبح مضان بهم أقل وضوحا بين كل السكان. وهذا هو أكثر وضوحا في فحوصات في المختبر مقارنة في الجسم الحي المقايسات لأن الخلايا هي على مقربة لفترات أطول من الوقت في فحوصات في المختبر. هذه الخسارة في القرار من السكان الخلية اتفاقية التجارة الحرة يمكن التقليل في فحوصات في المختبر عن طريق تقليل الوقت ثقافة اتفاقيات التجارة الحرة مع الخلايا التائية المستجيب وباستخدام اتفاقيات التجارة الحرة التي لديها أقل السكان الخلية المستهدفة التي تحتوي على كمية أكبر من "الفضاء الفلورسنت" بينهما حتى أن نقل صبغ له تأثير أقل.

لاحظنا أيضا خسارة في القرار من السكان الخلية FTA عندما وضعت اتفاقيات التجارة الحرة في الجسم الحي لمدة 48 ساعة 1. هذا على ما يبدو نتيجة الخلايا المستهدفة B ضمن المؤيدة اتفاقية التجارة الحرةتقييمات وبالتالي تقليل صبغ كثافة مضان. هذا من المحتمل أن يكون نتيجة لخلايا B مستضد تقديم المشابهة لالمستجيب المستضد محددة CD4 + الخلايا التائية التي أدت إلى تحفيز الخلايا B. لذا فمن المستحسن أن يكون مقصورا على فحص ~ 24 ساعة أو أقل عندما يتم رصد أهداف الخلية البائية.

القدرة على تسمية متعددة (> 96) مجموعات الخلايا fluorescently فريدة من نوعها وقد ذكرت سابقا باستخدام خلايا غير قابلة للحياة ثابتة 8. تلطيخ الخلايا الحية، ومع ذلك، فقد كان أكثر إشكالية مع توافر الأصباغ الحيوية المتوافقة، وأحرز فقط 8-12 خلايا قابلة للحياة مجموعات سابقا 9. القدرة على توليد> 250 فريد fluorescently المسمى خلايا قابلة للحياة ويعمل ذكرت هنا، تعتمد على خصائص الأصباغ الحيوية مثل CFSE. العديد من هذه الأصباغ، مثل CTV وثيقة البرنامج القطري، أصبحت متاحة مؤخرا فقط. هذه الأصباغ لها خصائص كونها قادرة علىوصفها الخلايا مع كثافة مضان عالية، وهذا هو عاش فترة طويلة ومنخفضة التباين 3. هذه الخصائص إلى جانب حقيقة أن هناك علاقة خطية (وخاصة في حالة CFSE وCTV) بين تركيز الصبغة المستخدمة لوصفها وكثافة مضان من الخلايا المسمى، يعني أن الخلايا يمكن أن توصف مع عدة (حتى إلى 7 هو موضح هنا) شدة كل الصبغة التي يمكن تمييزها بسهولة عن طريق التدفق الخلوي. علاوة على ذلك، منذ الانبعاثات مضان CFSE، وثيقة البرنامج القطري CTV يكون الحد الأدنى من التداخل الطيفي، وأنها يمكن أن تستخدم في تركيبة لتسمية الخلايا، مما يسمح حتى> 250 خلية التوقيعات الفلورسنت ليتم الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي. تجدر الإشارة إلى أنه من أجل تحقيق توسيم الخلايا مع هذا العدد من التوقيعات فلوري ملحوظ، فمن المهم أن يتم تنفيذ وسم الخلية بسرعة 10 و 11 (لتوليد المنخفضة التباين مضان) وجود مخزن مؤقت المناسبة التي تحتوي علىالأمينات الحرة 3 (لتخفيف سمية الصبغة التي يمكن أن تحدث إلا مع هذه الأصباغ بتركيزات عالية). ومن الأهمية بمكان أيضا أنه خلال الاستحواذ على اتفاقيات التجارة الحرة من قبل التدفق الخلوي أن تقلبات الخاطئة في مضان الحدث يتم مراقبة (على سبيل المثال عن طريق قياس CFSE، CTV و / أو وثيقة البرنامج القطري كثافة مضان بمرور الوقت). هذا أمر مهم لأن مثل هذه التقلبات في مضان الحدث الذي من المقرر أن آلة أدخلت قد ينتج أخطاء في التفسير الخاطئ من الصحيح تحديد المواقع كتلة الخلية المستهدفة وهذا بدوره قد يؤدي إلى أخطاء في الإجراءات النهائية لT وظيفة المستجيب الخلية. مثل تدفق عداد الكريات أخطاء أدخلت يمكن أن تقتصر من خلال ضمان إعداد العينات ذات جودة عالية (وخاصة الالتفات الى تصفية الخلايا من خلال شبكة 70 ميكرون للحد من انسداد خطوط فلويديك في تدفق عداد الكريات من قبل المجاميع خلية كبيرة) وأن تدفق عداد الكريات يتم الاحتفاظ ل على مستوى عال.

قياس استجابات الخلايا T في الجسم الحيوقد أجريت لسنوات عديدة باستخدام الأصباغ الحيوية مثل CFSE لرصد الخلايا المستهدفة في الجسم الحي الموت 12. عادة هذه المقايسات، ومع ذلك، كانت فقط قادرة على رصد ما يصل إلى 7-8 خلايا المستهدفة المختلفة في وقت واحد 13 وحتى توفير قدرة محدودة على تقييم مقتل أهداف التعبير عن تركيزات متعددة من الحواتم المتعددة التي تكون مطلوبة عادة لتوليد تقييم مفصل ل المعلمات مثل الطمع وظيفية من استجابات الخلايا التائية. في هذا الصدد، المقايسات tetramer تفارق يمكن استخدامها لتوفير قدر من الخلايا التائية من الطمع طازجة معزولة المستجيب الخلايا التائية 14-16. هذا الأسلوب، ومع ذلك، يقيس MHC / TCR الطمع ملزمة، وذلك ليس انعكاسا كاملة من الطمع وظيفية، والتي يمكن أن تعتمد أيضا على تغييرات في بنية المشبك المناعية وحالة الخلايا التائية يشير مكونات 17. وبالتالي، من الناحية المثالية، الطمع وظيفية يتطلب تجارب الاستجابة للجرعة التي يتعين القيام بها. هذاتم إنجازه سابقا باستخدام تقنيات في المختبر مثل الكروم 51 الافراج عن الفحص، وداخل الخلايا تلطيخ خلوى مقايسة 18، 19 أو مقايسة ELISPOT 20، 21. هذه التقنيات، ومع ذلك، غالبا ما تتطلب الخلايا التائية المستجيب ليكون حافزا في المختبر، والتي يمكن أن تغير الطمع وظيفية العامة للسكان 22. المقايسات اتفاقية التجارة الحرة، بالتالي، يوفر تحسنا التقنيات الموجودة، وقياس CD4 + الخلايا التائية CD8 + T والخلايا الجرعة والردود في الموقع، في الوقت الحقيقي ضد الحواتم متعددة في وقت واحد، ولذا فإن توفير إضافة قيمة إلى التقنيات الحالية لقياس الخلايا التائية وظيفة المستجيب. نتوقع أن استخدام التكنولوجيا اتفاقية التجارة الحرة قد تصبح قيمة في استراتيجيات العلاج المناعي فحص مصممة لتوليد جودة عالية T الردود الخلية، مثل لقاحات ضد فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد C. 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل عن طريق منح المشروع # 1010395 (بكريل وCP) و # 525431 (CR)، وبرنامج المنح # 455395 (CP) من المجلس الوطني للبحوث الصحية والطبية في أستراليا، وهو المركز الأسترالي للالتهاب الكبد وفيروس نقص المناعة البشرية الفيروسات EOI 2012 منحة (CR وRJJ) ومنحة من مؤسسة غوردون وجريتل قسم مشتركي DSL (بكريل وCR). نود أن نشكر Harpreet فوهرا ومايكل Devoy لصيانتها ممتازة من المختبر JCSMR نظام مراقبة الأصول الميدانية، ومرفق الاسترالية مؤسسة أبحاث السرطان الجزيئية البيولوجية للموارد، JCSMR، انو، لتخليق الببتيد، والدكتور ديفيد بويل، معامل CSIRO للصحة الحيوانية، جيلونج، أستراليا لتوفير الوالد الأسهم قاح فيروس نقص المناعة البشرية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Sigma R8758
Fetal calf serum Serana FCS-500
CTV Invitrogen C34557
CFDA, SE Invitrogen C1157
CPD eBioscience 65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5 eBioscience 110730
anti-CD69 brilliant violet 605 Biolegend 104529
PKH-26 Sigma PKH26GL-1KT
Vortex Scientific Industries Inc
Centrifuge Eppendorf
Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) BD Bioscience

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
  2. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
  3. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
  4. Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
  5. Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
  6. Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
  7. Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
  8. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
  9. Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
  10. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
  11. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
  13. Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
  14. Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
  15. Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
  16. Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
  17. von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
  18. Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
  19. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
  20. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
  21. Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  22. Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).

Tags

علم المناعة، العدد 88، تقنيات التحقيق، استجابة الخلايا T، التدفق الخلوي، Multiparameter، CTL مقايسة
استخدام المصابيح الفلورية الهدف صالحة لتقييم T الردود الخليوي<em&gt; في الجسم الحي</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quah, B. J. C., Wijesundara, D. K.,… More

Quah, B. J. C., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo. J. Vis. Exp. (88), e51627, doi:10.3791/51627 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter