Summary
インビボで詳細に T細胞応答をモニターする能力は、免疫応答の我々の理解の開発のために重要である。ここでは、フローサイトメトリーで同時に> 250のパラメータを評価するin vivoでの T細胞アッセイにおける蛍光の標的配列（のFTA）の使用を記載している。
Abstract
in vivoで T細胞応答をモニターする能力は、免疫応答および免疫療法の設計の我々の理解の開発のために重要である。赤色レーザ励起可能染料（細胞増殖色素eFluor 670：CPD：ここでは、そのようなカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）などの重要な染料を利用した蛍光ターゲット配列（FTA）技術、紫色レーザー励起可能染料（CTV CellTraceバイオレット）の使用を記載）> 250識別可能な蛍光細胞のクラスタにラベルをマウスリンパ球を、組み合わせた。これらのFTA内の細胞クラスタは、主要組織適合性複合体（MHC）クラスIおよびMHCクラスII結合ペプチドでパルスし、それによって、それぞれCD8 +およびCD4 + T細胞のための標的細胞として作用することができる。これらのFTA細胞は生存可能で、完全に機能的なままであり、したがって、FTA標的細胞およびCD4 + T細胞瞑想HELのCD8 + T細胞媒介死滅の評価を可能にするためにマウスに投与することができるフローサイトメトリーによるインビボでリアルタイムにFTA B細胞標的細胞におけるp。 > 250標的細胞を一度に評価することができるので、この技術は、いくつかの濃度では、複数の反復のいくつかの抗原エピトープに対するT細胞応答のモニタリングを可能にする。このように、この技術は、定量的（ 例えば、累積的な応答の大きさ）および定性的（ 例えば、機能性アビディティおよび応答のエピトープの交差反応性）レベルの両方でT細胞応答を測定することができる。ここで、我々はこれらのFTAを構築する方法を記述し、それらは、組換えポックスウイルスワクチンによって誘導されるT細胞応答を評価するために適用することができる方法の例を与える。
Introduction
T細胞は、適応免疫応答において中心的な役割を果たし、多くの場合、免疫療法における操作のために標的化される。 CD4 +エフェクターT細胞が免疫の多くの局面を調節し、直接抗体を製造するためにB細胞を助けることができるサイトカインを分泌することによって外来抗原に応答する。 CD8 +細胞傷害性T細胞（CTL）は、サイトカインを分泌すること、ならびに直接に外来抗原を発現する細胞を死滅させる中心的な役割を再生することにより、外来抗原に応答することができる。これらのT細胞エフェクター機能を開始する基本的な相互作用は、細胞表面上のMHC分子上に表示された外来ペプチドとT細胞受容体（TCR）との相互作用を伴う。 CD4 + T細胞は、抗原提示細胞上のMHCクラスII分子上に提示されるペプチドを認識し、CD8 + T細胞は、典型的には、微生物に感染した細胞上に表示されるMHCクラス-I分子上に提示されるペプチドを認識する。
順番にT細胞は免疫応答において果たす役割を評価するためには、それらのエフェクター機能が確実かつ敏感な技術によって測定することが必須である。 T細胞応答の評価のための一般的な方法としては、 MHC class-I/II/peptide四量体の反応性; ELISPOTおよび細胞内サイトカイン染色によるサイトカイン産生; 51 Cr放出アッセイによって容量を殺す。これらのアッセイは、しかしながら、典型的には、 インビトロ刺激によりエクスビボで行うか、またはT細胞機能に制限された洞察を提供している。 T細胞応答を測定する際に、発生したin vitro刺激によって起こり得る機能的パラメータの変化を回避するように理想的には、T細胞の無操作に、in vivoで、in situでそれらを評価することが有益であろう。最も一般的にインビボで T細胞機能アッセイにおいて使用されるのいくつかは、インビボで列挙されるMHCクラスI結合ペプチドをパルスした標的細胞のCTL媒介死滅を測定することに基づいているこのようCFSEなどの重要な染料で蛍光標識を通じて検出による。これらのタイプのアッセイは、それらがインビボで起こる場合、それらは以前に定性的なパラメータは、例えば可能にするために必要とされる、異なる濃度のペプチドエピトープの異なるタイプを提示する複数の標的の死滅を評価するための比較的限られた能力を持っていた標的のCTL媒介死滅を監視することができるがなどの官能アビディティおよびエピトープ変異体の交差反応性を評価することができる。これらのアッセイはまた、CD4 + T細胞媒介応答に関するあらゆる情報を提供しない。
T細胞応答を評価するために使用される現在の方法で制限の多くを克服するために、我々は最近ずつの動物に同時に> 250標的細胞に対するT細胞応答のモニタリングを可能にする蛍光性標的アレイ（のFTA）に基づいて、多重アッセイを開発した1、2フローサイトメトリー。自由貿易協定は、SEVで標識されたリンパ球から構成されているERAL濃度およびCFSE、CTV及びCPDのような生体染色色素の組み合わせは、ユニークな蛍光の> 250細胞クラスターが生成されることを可能にする。これらの細胞は生存可能で、完全に機能的なままであるので、それらは、インビボ3におけるエフェクターT細胞との相互作用のモニタリングを可能にするために動物に注射することができる。例えば、FTA細胞クラスターは、標的細胞1の抗原特異的CTL媒介死滅の評価を可能にするためにMHCクラス-I結合性ペプチドでパルスすることができる。また、FTA細胞クラスタはまた、CD69、CD44および/ または活性化マーカーを評価することによって（活性化を評価することによって、抗原特異的Tヘルパー細胞（T H）活性の評価を可能にする、MHCクラス-II結合性ペプチドでパルスすることができる同族ペプチド2を有するFTA内のB細胞のCD62L）。 250以上の標的を同時に検出することができるので、n個でパルス多くの標的細胞クラスタに対するCTLおよびT H応答を測定することが可能である異なる濃度や多くの反復を含めることでumerousペプチド。 FTAのアッセイは、したがって、in vivoでのT細胞エフェクター応答評価の前例のないレベルを提供します。
ここでは、詳細にFTAの構成を説明し、それらはin vivoで T細胞応答の評価に適用することができる方法を示す。手順は、MHCクラスIおよびII結合ペプチドをパルスした42細胞クラスターの6反復から成る3の重要な染料を使用することで252識別可能な細胞クラスターで構成される自由貿易協定（FTA）の構築を記載する。標識の量を減少させることによって、必要に応じて42細胞クラスターの標識は、チューブ底の10mlの円錐形で発生し、それを表1に示すように管ラックにこれらを配置することが有用である。この方法は、識別可能なクラスタの少ない数のために調整することができる各色素の1を行った。
我々は、それが的応答を測定することができますどのように示すことによって、アッセイの有用性を強調マウスの小さなコホートにおける複数のエピトープに対する組換えポックスウイルスワクチン接種によって生成されたES。これは、FTAアッセイは、それぞれを通る曲線（AUC）の評価および半最大応答（EC 50）を生成するために必要な効果的なペプチド濃度の被測定領域の使用を累積応答および機能的結合活性を測定するために使用することができる方法を示している。
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Protocol
注：このプロトコルの下で使用したマウスは、オーストラリア国立大学動物実験倫理委員会のガイドラインに従って処理され、マウスを頸椎脱臼により安楽死させた。
1。色素およびペプチドの準備
- 染料の準備
注：染料離散蛍光強度での細胞の標識化を可能にするために異なる濃度で予備希釈する。 CFSEで3.5倍連続希釈を介して行わ7の濃度で使用され、CTVおよびCPDは、（ 表2-4を参照）3.7倍連続希釈を介して行わ六つの異なる濃度で使用される。 表2〜4に記載されている染料のストック濃度は、 表2-4にリストされている最終的な色素濃度で標的細胞を標識するために使用されます。染料は、水溶液に曝露されると反応する。これは、バイアルを凝縮染料の曝露を最小限にするために前に開口部に室温に平衡化されることが重要である。- CFSE
注：CFSEはカルボジアセテートスクシンイミジルエステル（CFDA、SE、MW 557.47）として購入されている典型的には25ミリグラム/バイアルで、。- 10mMストック溶液を得るために4.48ミリリットルDMSO中CFSE 25mgを懸濁する。
- シリアルにCFSEを希釈：DMSOを87.5μLに10 mMのCFSEストックの35μLを加え、 表3に各色素の濃度が得られるように希釈し保存溶液でこれを繰り返します。
- CTV
注：CTVは、典型的には、色素の10 mM溶液を生成するために、10μlのDMSOで再構成することができる各々が9バイアルのパックで購入される。- 10 mMの溶液を得DMSOを90μlのCTVのすべての9のバイアルを再構成し、プール。
- シリアルにCTVを希釈：DMSOを29.7μLに10 mMのCTVストックを11μl加え、表2に各色素の濃度が得られるように希釈し保存溶液でこれを繰り返します。
- CPD
注：CPD（MW 792.6）が代表的であるLYは0.5mg /バイアルとして購入。- 10 mM溶液を得るために、DMSOの63ミリリットル中のCPDの0.5 mgの再懸濁します。
- シリアルにCPDを希釈：DMSOを29.7μLに10 mMのCPDストックの11μLを加え、 表4の各色素の濃度が得られるように希釈し保存溶液でこれを繰り返します。
注：染料ストックは、数ヶ月間-20℃で保存することができ、機能の有意な損失なしに数回解凍し、再凍結することができる。
- CFSE
- ペプチド製剤
注：1μM（ 表5）の出発濃度から10倍希釈を用いて作製MHCクラス-I結合ペプチドは、一般に、6つの異なる濃度で標的細胞をパルスするために使用される。 400μM（ 表5）の出発濃度から3倍希釈を用いて作製MHCクラスII結合ペプチドは、一般に、6つの異なる濃度で標的細胞をパルスするために使用される。各ペプチドは、PBSなどTHAにおける2X最終濃度で行われるTすべてのペプチド濃度は、250μLの最小容積を有する。ペプチドストックを従来FTA構築物に調製し、機能の有意な損失なしに-20℃で保存することができる。- 株式のMHCクラスI結合ペプチドを調製
- 2μMのストック溶液（2X1μM）に各ペプチドエピトープの最高濃度を準備
- シリアルにのMHCクラスI結合ペプチドを希釈：400μlのPBSに2μMのペプチドストック溶液44.4μlを加える。 表5に、各ペプチド濃度が得られるように希釈した原液をしてこれを繰り返します。
- 株式のMHCクラスII結合ペプチドを調製
- 800μMのストック溶液（2X 400μM）に各ペプチドエピトープの最高濃度を準備します。
- シリアルに、MHCクラスII結合ペプチドを希釈：300μlのPBSに800μMのペプチド溶液150μlを加える。 表5に各ペプチド濃度を与えるように希釈したストック溶液を用いてこれを繰り返し
2。FTAの準備
注：（。 すなわち 42細胞クラスター）は、以下の手順では、6つの異なる濃度での7種類のペプチドエピトープでパルスされたセルからなる自由貿易協定（FTA）の建設を概説252識別可能な細胞クラスターを生成するために、6回繰り返す。各繰り返し、任意のエピトープ（NIL）をパルスしていない細胞塊の中では、対照として含まれている。 FTAの分析の際に抗体標識によってレシピエント細胞からのそれらの識別を可能にするために宿主動物からCD45アロタイプ差を有することが有用である。そうでない場合のFTA（ステップ2.6に記載）は、この目的のためのこのようなPKH-26などの他の色素で標識することができる。典型的には、FTA調製手順は、1つの着座時の最初から最後まで行われる。
- ラベル42は10mlのコニカル（たとえば、表1のように）プラスチックチューブを1-42底。
- 細胞の調製
- 脾臓および/またはlympを隔離マウスからhnodes。 5ミリリットルのシリンジプランジャーでふるいを注ぎ70ミクロンを通じて叩解して組織からの単細胞懸濁液を調製し、血球計数器を用いて細胞を数える。
- 5％ウシ胎仔血清（FCS）を含有するロチェスター·パーク記念研究所の11.5ミリリットル1640（RPMI、または同等のもの）には、最大200×10 6細胞/ mlで再懸濁し、リンパ球。注：これは、セル3に色素の毒性を最小限に抑えるために高いアミン含有量を有する緩衝液を使用することが重要である。
- CTVラベリング
注：細胞は、最初にCTVの6つの濃度で標識される。- 完全にチューブを数回反転させて細胞を再懸濁。チューブの上半分が濡れないように注意しながら、37-42ラベル10ミリリットルチューブの6に細胞懸濁液1.9ミリリットルを追加します。
- CTVで細胞を標識するために、チューブのキャップを外し、水平にチューブを置く。
- （ タブが表示され 、管の上部の非接液部にはPBSを83μl加え、これに株式CTVの17μLを追加ルの原液がどの管）に割り当てられている2。注：非濡れた管は染料溶液と細胞懸濁液運動および細胞溶液の時期尚早な混合を防止することが重要である。
- チューブに蓋をし、ボルテックスで迅速かつ徹底的に色素で細胞懸濁液を混ぜる。
- の手順を繰り返し2.3.2-2.3.4 表2に記載の指定管内でCTVのストック溶液のために。
- RT（20℃）で最低5分間細胞をインキュベートする。
- CFSE標識
- CTV標識後、各チューブに、5％FCSを含有する5mlのRPMIを添加し、ボルテックスして細胞を再懸濁する。
- 管チューブ37転写する細胞懸濁液1mlから31、25、19、13、7、および1。
- 管チューブ38転写する細胞懸濁液1mlから32、26、20、14、8、および2。
- 管チューブ39転写する細胞懸濁液1mlから33、27、21、15、9、および3。
- チューブからの細胞の40移転1ミリリットルチューブ34、28、22、16、10、および図4をサスペンション。
- 管チューブ41転写する細胞懸濁液1ml〜35、29、23、17、11、および5。
- 管42から転写管36、30、24、18、12、および図6に細胞懸濁液1ml
注：手順2.4.1.1-2.4.1.6中にチューブの上半分が濡れないように注意してください。
- CFSEで細胞を標識するために、チューブのキャップを外し、水平にチューブを置く。
- （原液をその管に割り当てられているため、表3参照） をチューブの上部の非接液部にはPBSを103ミリリットルを追加し、これまで株式のCFSE 7ミリリットルを追加します。
- チューブに蓋をし、ボルテックスで迅速かつ徹底的に色素で細胞懸濁液を混ぜる。
- 表3に記載されて指定されたチューブ内でのCFSEストック溶液のための手順を2.4.2-2.4.4やる。
- RT（20℃）で最低5分間細胞をインキュベートする。
- 細胞を洗浄：20℃、9ミリリットルに細胞懸濁液を希釈のRPMI 5％FCS、20℃で10分間300×gでの遠心分離により沈殿物を含む、転送ピペットで吸引して上清を取り除く。
- CTV標識後、各チューブに、5％FCSを含有する5mlのRPMIを添加し、ボルテックスして細胞を再懸濁する。
- ペプチドパルス化および細胞洗浄
注：細胞は、CTVおよびCFSEで標識した後、それらは（1.2に調製）MHCクラスIおよび/またはMHCクラスII結合ペプチドでパルスされる。細胞集団の一つはまた、ペプチド（ 例えば、 表1の無記号）でパルスし、T細胞応答の計算のための陰性対照として使用してはならない。- ペプチドパルス化
- 5％FCSを含むRPMI250μlの総容量に再懸濁細胞。注：通常の細胞懸濁液50μlを、したがって、ペレットをセルに培地200μlを加え、ステップ2.4.7の最後に上清を吸引した後に残る。
- 適切に（ 表1のように）チューブを指定され、シュールであること（ 表5のように）前調製したペプチドの株式の250μLを追加PBSを制御管を含むようにeは無記号コントロールとしてペプチドを含まない単独で添加。
- ボルテックスで細胞懸濁液を混ぜる。注意：これは、クラスタの蛍光署名が表のように（このペプチドを定義するため、このチューブ内のセルの予期された蛍光に基づいて、各ペプチドエピトープ、各ペプチド濃度が単一の管に割り当てられ、これは明らかに記録されていることが重要です例えば1）。
- 1時間37℃で細胞をインキュベートする。
- 細胞洗浄
- チューブを反転させて、細胞懸濁液を再懸濁細胞に、5％FCSを含む氷冷（4℃）のRPMI 5ミリリットルを追加します。慎重に氷冷（4℃）、FCS 3mlで細胞懸濁液をアンダーレイ。
- 4℃で10分間、300×gの遠心分離により細胞を沈降FCSの界面を確実にするために緩加速と制動を使用して、細胞懸濁液が維持される。
- 慎重のRPMIをオフに吸引し、邪魔されずに洗浄した細胞ペレットを残してトランスファーピペットで、FCS、。注：細胞を洗浄するためのFCSアンダーレイの使用は、できるだけ多くのペプチド溶液をできるだけ細胞から除去し、細胞をプールするときに、それによって複数の遊離ペプチドの細胞集団の曝露を制限されていることを確認するのに役立つ。
- 再び細胞を洗浄：5％FCSを含む4℃のRPMI 10ml中に細胞ペレットを再懸濁します。 4℃で10分間、300×gの遠心分離により細胞を沈降上清を捨てる。
- プール一緒に、5％FCSを含む4℃のRPMI 6ミリリットルを使用してピペットで単一のチューブにすべての細胞集団。沈殿物を4℃で10分間、300×gの遠心分離により細胞をプールしホールピペットで上清を吸引除去する。
- ペプチドパルス化
- CPDの細胞標識
注意：この時点で6アッセイ内複製をCPDの6つの異なる濃度の標識ペプチドをパルスした細胞によって生成することができる。- 20℃、11.4ミリリットルを追加RPMIは、プールされた細胞ペレットを、5％FCSを含有し、ピペットを用いて徹底的に再懸濁する。
- チューブの上半分が濡れないように注意しながら、10ミリリットルチューブは、AFのラベル、6に細胞懸濁液1.9ミリリットルを追加します。
- CPDで細胞を標識するために、チューブのキャップを外し、水平にチューブを置く。
- 管の上部の非接液部にはPBSを92μl加え、これに（各チューブに割り当てられた原液の量については、表4を参照）は、株式のCPDを追加します。
- チューブに蓋をし、ボルテックスで迅速かつ徹底的に色素で細胞懸濁液を混ぜる。
- 。CFSEとCTVは異なり、CPDラベリング濃度が正確に直線的に標識された細胞の結果の蛍光強度に関係なく、 表4に記載されて指定されたチューブ内のCPDの原液のための手順は、2.6.3-2.6.5注意ください従って、いくつかの標識された集団の等距離の蛍光ピークを得るために使用される標識の濃度があった（ 表4参照） を実験的に決定。
- RT（20℃）で最低5分間細胞をインキュベートする。
- 細胞を2回洗浄：5％FCSを含む20℃のRPMIで10ミリリットルに細胞を再懸濁します。 20℃で10分間、300×gの遠心分離により細胞を沈降ホールピペットで上清を吸引除去する。繰り返します。
- プールと共にピペットを用いて、5％FCSを含む8ミリリットル4℃のRPMIを使用して単一のチューブ内のすべてのセル。沈殿物を4℃で10分間、300×gの遠心分離によって細胞をプールし、トランスファーピペットで上清を吸引除去する。
- （オプション）PKH-26の細胞標識
注：FTAのマウスをホストするためにCD45アロタイプ差を発現する細胞を用いて構築することができない場合、それらがレシピエント細胞からのそれらの区別を可能にするためにPKH-26で標識することができる。- プールされた細胞ペレットに2.9、20℃のPBSを加え、ピペットで十分に懸濁します。
- なしに細胞懸濁液を追加nは、チューブの上半分が濡れないように注意しながら、10ミリリットルチューブを接液。
- チューブキャップを外し、水平にチューブを置く。
- 管の上部の非接液部には（PKH-26色素キット内）の希釈剤Cの58μl加え、これに1 mMストックPKH-26の42μlを加える。
- チューブに蓋をし、徹底的にボルテックスすることにより色素で細胞溶液を混ぜる。
- RT（20℃）で最低10分間細胞をインキュベートする。
- 細胞を2回洗浄：5％FCSを含む20℃のRPMIで10ミリリットルに細胞を再懸濁します。 20℃で10分間、300×gの遠心分離により細胞を沈降ホールピペットで上清を吸引除去する。繰り返します。
- 宿主動物へのFTAを注入
注：in vivoで T細胞応答を測定するために、FTAが能動免疫応答を有する動物に注入され、最大24時間、 その場に残される。それは、自由貿易協定にもネガティブコントロールとしてナイーブ動物に注射することが重要です。- カウントし、PBS 1ml当たり2.5×10 8個の細胞で細胞を再懸濁。対照として、ナイーブな動物を含めて、静脈内に宿主マウスへの細胞の200μLを注入。
3。フローサイトメトリー
- 宿主マウスからの自由貿易協定（FTA）の注入収穫血液または脾臓（または関心のある他の組織）の後に18〜24時間。
- 70ミクロンを介して叩解することによって組織から単細胞懸濁液を調製5mlのシリンジプランジャーでふるいに注ぎ。
- 0.1％BSAを含有するPBS中で最大65×10 6細胞/ mlで細胞を再懸濁。
- 抗体標識のためのマイクロタイタープレートのウェルに細胞懸濁液の100μlアリコートを分配する。
- CFSE、CTVとCPDのスペクトル的に互換性の蛍光を有する蛍光色素標識抗体と蛍光生存性プローブを用いたラベル細胞。注：FTを使用している場合、例えばB220のようなB細胞マーカーに対する抗体などのようなCD69活性化マーカーは、B細胞の活性化を測定するために不可欠であるT H細胞応答を測定する2。自由貿易協定とホストマウスはCD45アロタイプの違いがある場合CD45.1および/またはCD45.2に対する抗体が含まれています。
- 30分間、細胞を100μlのアリコートに（0.1％BSAを含むPBS中）抗体/生存性色素の2倍のストック溶液100μlを追加し十分に混合し、氷上でインキュベート（4℃）。
- 4℃で5分間300×gで遠心分離することにより土砂細胞と上清を除去：細胞を洗浄。 4℃で5分間、300×gで遠心分離することによって200、0.1％BSAを含有するPBSμlの、堆積物の細胞内で細胞を再懸濁し、上清を除去する。
- 70μmのメッシュを通して0.1％BSA、フィルタ細胞を含むPBSを400μlの全体積で細胞を再懸濁し、関連する蛍光色素と複合体を検出することが可能なフローサイトメーター、フローサイトメトリーにより分析する。各FTAの細胞塊を解決するために、3×10 6リンパ球のイベントを収集し、統計的に十分な細胞を得るCAL分析。注：フローサイトメトリーのために（例えば、単ステンドコントロールなど）は、すべての一般的なコントロールを確認しが使用される。典型的には、CFSEは、青色レーザ光源（典型的には488nm）および520nmの上の中心にバンドパスフィルタによる検出からの励起を必要とする; CTVは、紫色レーザ光源（典型的には405nmで）および450 nmの上に中心をバンドパスフィルタによる検出からの励起を必要とする;およびCPDは、赤色レーザ光源（典型的には633nmまたは640nmの）および670 nmの上に中心をバンドパスフィルタによる検出からの励起を必要とする。
4。データ解析
- 標準的なフローサイトメトリーソフトウェアを用いてフローサイトメトリーデータを分析する（採用ゲート戦略のタイプ、例えば、代表的な結果を参照されたい）。
- ％特異的死滅のため、MHCクラス-I結合ペプチドおよび（「無」）ペプチドパルスされなかった自由貿易協定（FTA）のクラスターをパルスし、各FTA細胞クラスタ内のセルの数を計算し、計算するには、次の式を使用して％特異的死滅。
％特異的死滅
注：「プライミング」は、上記式において標的ペプチドに対する免疫応答を有すると考えられる動物からの標的を意味し、「ナイーブ」は、ナイーブ動物からの標的を意味し、「ペプチド」は、ペプチドおよび「ゼロ」でパルス標的を意味する任意のペプチドでパルスしないターゲットを指します。 - B細胞活性化のためのT H活性の尺度としてのGMFIを引く「プライミング」動物におけるMHCクラスII結合ペプチドにこのからパルス状FTA B細胞上のCD69抗体の蛍光の幾何平均蛍光強度（GMFI）を算出T H活性の尺度を与えるために「ナイーブ」動物における対応するFTA B細胞上のCD69発現。
- ステップ4.2および4.3で生成された統計から、使用このような曲線およびEC 50の下の領域（これらの計算は、AUCのためにどのように実行されるかの深さの説明など他の定量的および定性的なパラメータを計算するようなグラフパッドプリズムのような数学的な表計算ソフトを見つけることができます
http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index：http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm、およびEC50のため。 HTM？reg_the_ec50.htm）。
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Representative Results
FTAアッセイの使用の一例として、BALB / cマウスを、HIV-I CTLエピトープにHIV-Iエピトープ（VV-HIV）と応答を発現する組換えワクシニアウイルス（VV）で免疫化したGag、ギャグたmut、のEnvおよびPol、VV CTLエピトープF2LとのF2Lたmut、およびHIV-I T H細胞エピトープ 、Thをギャグ（2に記載のように）252パラメータFTAアッセイ（ 図1B）を使用して評価した。ギャグ（ギャグのmut）およびF2L（撮影地のmut）のエピトープ変異体は、VV-HIVベクターで発現され、したがって、これらのエピトープに対する応答は、エピトープの変異体交差反応性T細胞応答の反射でもない。ナイーブマウスを、陰性対照としてFTAを注射した。 FTAは、フローサイトメトリー（ 図1Aおよび1B）を介しB220抗体染色によって区別PKH-26標識およびFTA B細胞による宿主マウスの細胞と区別した。 6内の動物の複製物の各々は、CPD蛍光（ 図1Cに基づいてゲートされました図1D）に基づいてゲートされるエピトープの種々の濃度を表現する自由貿易協定（FTA）の対象としています。各反復の％特異的死滅を未処置の動物（ 図1D）での自由貿易協定（FTA）のクラスターの対応と比較してプライムされた動物では、FTAのクラスター細胞死を比較することによって評価した。 T H活性は、ナイーブ動物における対応するFTA B細胞クラスター（ 図1E）に対してプライミングされた動物におけるCD69のFTA B細胞のアップレギュレーションを比較することによって評価した。
この分析から、VV-HIV感染は、脾臓（ 図2A）から削除されるエピトープの0.001 mm以上をパルスした自由貿易協定（FTA）の標的細胞を100％と、免疫優性VVエピトープ撮影地に対する強いCTL応答を生成した。 0.01 mMの脾臓から削除されるエピトープの以上をパルスした自由貿易協定（FTA）の標的細胞を100％との強い撮影地の変異型に対して生成された応答、撮影地MUTもありました。から撮影地MUTは、感染ウイルスに存在しない、この応答は、エピトープバリアント交差反応性応答を示す。 HIV GAGエピトープおよびこのエピトープの変異型、HIV GAG MUTに対する若干の交差反応応答を表現するターゲットに対して生成された比較的緩やかな応答があった。 HIV PolおよびHIV EnvのCTLエピトープに生成されたごくわずかな応答があるように見えた。
CTL応答に加えて、図示FTAの例示的アッセイは、HIV-MHCクラスII結合エピトープHIVのGagのTh（ 図2B）を発現FTA B細胞の活性化を評価することによってT H応答を測定した。これは、抗原特異的B細胞の活性化はHIVのGag特異的ThのT H細胞エフェクターの生成を示唆してプライミングした動物で発生示した。
T細胞応答の大きさのこれらの手段は、エピトープ（ 図2C）の各々についての曲線値（AUC）下面積を発生させることによって要約することができること小節応答の累積大きさをsures。
抗原特異的なエピトープ変異体交差反応性応答の大きさに加えて、FTAアッセイは、機能的な親和性測定を行うことを可能にする。例えば、半最大応答（EC 50）を与えるために必要FTA標的細胞をパルスするために使用される有効なペプチド濃度は、CTLのエフェクター（ 図2D）が示されている。これは、支配的なVVエピトープ撮影地に生成された応答よりも、それぞれ約10、100および4000倍低かった、エピトープF2L MUT、HIV GagおよびHIV GAGのMUTに機能的な結合活性を示した。
252パラメータのFTAの表1。レイアウト。6差動での7種類のペプチドエピトープでパルスした42サンプル/チューブで構成さ252 FTAの1複製の典型的なレイアウト国連にパルス（NIL）のサンプルを含む、T濃度とは。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
| チューブ番号 | 容量（μL） | 染料の在庫（mMのCTV） | 最終濃度（μM） |
| 37 | 0 | 0 | 0 |
| 38 | 17 | 0.053 | 0.451 |
| 39 | 17 | 0.197 | 1.48 |
| 40 | 17 | 0.73 | 6.21 |
| 41 | 17 | 2.7 | 23 |
| 42 | 17 | 10 | 85 |
記載されている表2。CTV株細胞を標識するために使用。ボリュームCTVストックは、最終的な標識色素濃度を得た2mlの細胞を標識するために使用される。
| チューブ番号 | 容量（μL） | 染料の在庫（mMのCFSE） | 最終濃度（μM） |
| 37から42 | 0 | 0 | 0 |
| 31から36 | 7 | 0.022 | 0.139 |
| 25から30 | 7 | 0.078 | 0.492 |
| 19から24 | 7 | 0.23 | 1.45 |
| 13から18 | 7 | 0.82 | 5.17 |
| 7から12 | 7 | 2.9 | 18.3 |
| 1から6 | 7 | 10 | 63.1 |
表3。CFSE株は細胞を標識するために使用されます。リストされたCFSE株私たちのボリューム最終の標識色素濃度を得1.11ミリリットルで細胞を標識するオピニオン。
| チューブ番号 | 容量（μL） | 染料の在庫（mMのCPD） | 最終濃度（μM） |
| A | 0 | 0 | 0 |
| B | 4 | 0.053 | 0.106 |
| C言語 | 6.3 | 0.197 | 0.62 |
| D | 7.5 | 0.73 | 2.74 |
| E | 7.3 | 2.7 | 9.86 |
| F | 7.7 | 10 | 38.5 |
細胞を標識するために使用される表4。CPD株。最終labelinを与えるために2ミリリットル中の細胞を標識するために使用するリストされたCPDの蓄積量グラム色素濃度。
| ペプチド濃度（μM） | |||||||
| MHCクラスI結合ペプチド | 0 | 0.00002 | 0.0002 | 0.002 | 0.012 | 0.2 | 2 |
| MHCクラスII結合ペプチド | 0 | 3.29 | 9.88 | 29.6 | 88.9 | 266 | 800 |
表5。MHCクラスIおよびII結合ペプチドストック濃度。典型的なストック濃度のFTA 1を構築するために使用されるペプチドエピトープの1。これらの濃度は、標的細胞をパルスするために使用される最終濃度の2倍される。
図1 FTAの代表的なフローサイトメトリー分析。BALB / cマウス由来の脾細胞を、本文に記載したように、パラメータ252 FTAを構築した。 FTAクラスタは、MHCクラスI-結合エピトープを含む7種のウイルスエピトープの6つの濃度（ 表5に示すように）、F2L（SPYAAGYDL、L dは制限ワクシニアウイルス（VV）エピトープ）でパルスした;撮影地MUT（SP G AAGYDL、撮影地の変種）、ギャグ（AMQMLKETI、K dは制限されたHIV GAGエピトープ4）、ギャグMUT（AMQMLK D TI、HIV GAG 5の変種）、ポル（VGPTPVNII、DのD制限されたHIV POLエピトープ6）のEnv（RGPGRAFVTIはD d制限のHIV ENVエピトープ7）;およびMHCクラスII結合ペプチドギャグT H（PVGEIYKRWIILGLN、H-2 d制限HIV GAGエピトープ4）。自由貿易協定は、 静脈内注射した。 （ インチ ）鼻腔内に感染していたのBALB / cマウスに6日早くRECとHIVエピトープ（VV-HIVプライム動物）を発現ombinant VV。 FTAはまた、対照として未処置のマウスに注射した。 インビボでの 18時間後、宿主マウスからの脾細胞懸濁液中に存在するFTA細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。A）は、リンパ球、シングレットおよびPKH-26 + FTA細胞（これも参考になるためのゲートを示すFTA細胞を同定するための典型的な進行性のゲーティング戦略図6内の動物のそれぞれに複製をマークする自由貿易協定（FTA）のCPD蛍光を示すナイーブ宿主マウスからのすべての自由貿易協定（FTA）のクラスタを示すヘキスト33258のような実行可能性の色素を用いて生細胞を解決する、）は示されていないB）3Dプロット。C）ヒストグラムプロット。D）2次元プロット6イントラ動物FTA B細胞の一つは、ナイーブ及びプライミングされた動物からのエピトープの異なる種類および濃度を提示する複製する。これは「殺すイベント」を明らかにし、ナイーブ動物にプライミングされた動物の相対的な自由貿易協定（FTA）の細胞が存在しないことを示していますFTA Tヘルパーアッセイ2のベースを形成している未処置の動物と比較してプライミングされた動物における活性化マーカーCD69の自由貿易協定（FTA）のB細胞発現のFTA殺害検定1、E）ヒストグラム解析の基礎を形成するCTLによる。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
図2のFTAは、 インビボで T細胞応答の大きさおよび結合力の測定を可能にする。252パラメータFTAは、図1に記載したようにVV-HIVに感染したマウスにおけるT細胞応答を評価した。A）％特異的死滅を算出した6再のそれぞれからすべてのCTLエピトープと結果のためにplicates示す（左パネル）、ならびに手段および平均の標準誤差（右パネル）に示す。B）は、T H応答は、（6内の動物の反復毎にHIVのGag Thエピトープを提示するFTA B細胞の活性化を測定することによって評価した左パネル）および手段および平均の標準誤差（右パネル）を計算した。C）％特異的死滅（a）およびTヘルパー応答のAUCの測定は、（b）は、累積的な大きさの尺度として計算した。D）EC 50測定値を計算した％のための機能的結合活性の尺度として殺害データ（A）特定。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
FTAに基づくアッセイの利点は、フローサイトメトリーによる単一の宿主動物から> 250生存および完全に機能する標的細胞集団の識別を可能にすることである。これは以前には不可能であったin vivoでのフローサイトメトリーベースのアッセイに複雑さのレベルを提供します。これは、6の濃度で7の異なるウイルスエピトープに対する応答は、AUCおよびEC 50などのパラメータは、インビボで T細胞応答に対して決定されることを可能にする単一の動物において同時に6回繰り返して監視することができる上に示した2動物実験で強調表示され。
in vivoで T細胞応答を測定することに加えて、FTAに基づくアッセイは、インビトロで 1応答を測定するように修飾することができる。これは、本質的に、インビトロで数時間にわたって反応を測定するために、培養中のT細胞へのFTAを添加することを含む。のFTA を用いたin vitroベースのアッセイの一つの潜在的な制限はtである周囲の細胞1、3に標識色素を転送するために、FTA内標識された細胞のために彼は傾向。その蛍光は、各集団間の少ない明瞭なになったので、これは自由貿易協定（FTA）細胞クラスターの減少解像度になることがあります。細胞は、 インビトロアッセイにおいてより長時間近接しているので、これはインビボアッセイと比較して、in vitroアッセイにおいてより明らかである。 FTA細胞集団の解像度におけるこの損失は、エフェクターT細胞と、それらの間に「蛍光スペース」より多くの量を有するより少なく、標的細胞集団を有するのFTAを用いてFTAの培養時間を減少させることによってインビトロアッセイにおいて最小化することができるようにその色素転写は影響が少ない。
FTAには、48時間1のためにインビボで配置した際にもFTA細胞集団の分解能の損失を指摘している。これは、FTAのprolife内の標的B細胞の結果であると思われ評価することにより、色素の蛍光強度を減少させる。これはおそらくB細胞の刺激を生じ、抗原特異的エフェクターCD4 + T細胞に同種抗原を提示するB細胞の結果である。したがって、B細胞標的が監視されているとき、アッセイは〜24時間以下に制限されることをお勧めします。
複数の（> 96）のユニークな細胞クラスターを標識する能力は、蛍光以前に固定非生存細胞8を使用して報告されています。生きている細胞の染色は、しかしながら、生体適合性色素の利用可能性を有するより問題であったが、唯一8-12生存細胞クラスターは、以前9達成された。ここで報告された> 250一意に蛍光標識された実行可能な、機能して細胞を生成する能力は、CFSEのような重要な染料の性質に依存しています。 、このようなCTVとCPDとして、これらの染料のいくつかは、ごく最近利用できるようになった。これらの染料は、することができるという特徴を有する高い蛍光強度を有する細胞を標識し、それは長い間、低分散3の住んれる。標識に用いる色素の濃度および標識細胞の蛍光強度との間の（特に、CFSEとCTVの場合）に直線関係が存在するという事実と相まってこれらの特性は、細胞がいくつかの（最大で標識することができることを意味簡単にフローサイトメトリーによって区別することができる各色素の強度）ここに示す7。 CFSE、CPD及びCTVの蛍光発光が最小のスペクトル重複を有するので、それらはこのようにしてフローサイトメトリーによって検出される> 250蛍光細胞シグネチャまで可能にする、細胞を標識するために組み合わせて使用することができる。これは、識別可能な蛍光シグネチャーのこの数の細胞の標識を達成するためには、細胞標識化が急速に行われることが重要であることに留意すべきである10、11（低蛍光分散を生成する）とを含有する適当な緩衝液中遊離アミン3（特に高濃度で、これらの染料を用いて発生する可能性が染料の毒性をバッファリングする）。これは、イベント·蛍光の変動は、その誤ったフローサイトメトリーによるFTAの取得中に（CFSE、CTVおよび/または経時的CPD蛍光強度を測定することによって）監視されていることも重要である。機械に起因するイベント蛍光のそのような変動は誤差が今度はT細胞エフェクター機能の最終的な尺度でエラーになる場合があり正しいターゲットセルクラスタ測位の誤った解釈をもたらし得る導入ので、これは重要である。導入されたエラーサイトメーターそのような流れは、高品質の試料を調製（特に大きな細胞凝集体によって、フローサイトメーターでの流体ラインの閉塞を最小限にするために70μmのメッシュを通して細胞を濾過するに着目して）、フローサイトメーターに維持されることをしている保証することによって制限することができる高い水準。
in vivoでの T細胞応答の測定12 インビボで標的細胞死をモニターするために、例えばCFSEなどの生体染色色素を使用して、長年にわたって行われてきた。典型的には、これらのアッセイは、しかしながら、一度7-8異なる標的細胞に13を監視することができるだけであったので、通常の詳細な評価を生成するために必要とされる複数のエピトープの複数の濃度を発現する標的の死滅を評価するための限られた容量を提供しているこのようなT細胞応答の機能的結合力などのパラメータ。この点において、テトラマー解離アッセイは、新たに単離したエフェクターT細胞から14-16 T細胞の結合活性の尺度を提供するために使用することができる。しかしながら、この技術は、MHC / TCR結合活性を測定し、これもまた免疫学的シナプスの構造の変化及びT細胞シグナル伝達成分17の状態に依存し得る機能的結合活性を完全に反映ではない。従って、理想的には、機能的結合活性は、実行されるべき用量 - 応答実験を必要とする。この以前は、このような51 Cr放出アッセイ、細胞内サイトカイン染色アッセイ18,19又はELISPOTアッセイ20、21 のようなインビトロ技術を用いて達成されてきた。これらの技術は、しかしながら、多くの場合、人口22の全体的な機能的結合活性を変化させることができ、 インビトロで刺激されるエフェクターT細胞を必要とする。 FTAアッセイは、したがって、同時に複数のエピトープに対するリアルタイムでその場での CD4 + T細胞およびCD8 + T細胞の用量応答を測定する既存の技術に対する改善、などがT細胞を測定するための既存の技術に貴重な追加を提供することを提供していエフェクター機能。我々は、FTA技術の使用は、HIV-1およびC型肝炎に対して向けられたワクチンとして、高品質のT細胞応答を生成するように設計された免疫療法戦略をスクリーニングするのに貴重となり得ることが予想さ
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、オーストラリア国立保健医療研究評議会、肝炎やHIVのウイルス学EOIのためのオーストラリアのセンターから＃1010395（BQとCP）と＃525431（CR）、プログラムグラント＃455395（CP）を付与し、プロジェクトによってサポートされていました2012助成金（CRとRJJ）とゴードンとグレーテルうしかい座財団（BQとCR）からの助成金。我々はJCSMRのFACS研究室のその優れたメンテナンスのためHarpreet Vohra著、マイケルデヴォイに感謝したい、ペプチド合成のためのオーストラリアのがん研究財団生体分子資源施設、JCSMR、ANU、およびデビッド·ボイル、CSIROのアニマルヘルス研究所、ジーロン、オーストラリア親HIVワクチン株を提供するため。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |
References
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