Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Использование флуоресцентных целевых массивов для оценки Т-клеточные ответы Published: June 19, 2014 doi: 10.3791/51627
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

Summary

Способность контролировать Т-клеточные реакции в деталях в естественных условиях имеет важное значение для развития нашего понимания иммунного ответа. Здесь мы опишем использование люминесцентных целевых массивов (ССТ) в в естественных условиях Т-клеток анализа, который оценивает> 250 параметров одновременно с помощью проточной цитометрии.

Abstract

Способность контролировать Т-клеточные реакции в естественных условиях имеет важное значение для развития нашего понимания иммунного ответа и разработке иммунотерапии. Здесь мы опишем использование люминесцентные целевого массива технологии (FTA), которая использует жизненные красители, такие как карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловым эфиром (CFSE), фиолетовый лазерных возбудимых красителей (CellTrace Фиолетовый: CTV) и красный лазер возбудимых красителей (пролиферации клеток Краска eFluor 670: CPD ) в комбинаторно этикеток лимфоциты мыши в> 250 различимых кластеров люминесцентных клеток. Сотовые кластеры внутри этих ССТ может быть импульсным с главного комплекса гистосовместимости (МНС) связывающие пептиды класса I и МНС класса-II и тем самым выступать в качестве клеток-мишеней для CD8 + и CD4 + Т-клеток, соответственно. Эти FTA клетки остаются жизнеспособными и полностью функциональным, и, следовательно, могут быть введены мышам с целью оценки CD8 + Т-клеточно-опосредованного убийства ССТ клеток-мишеней и CD4 + Т-клеток-медитировал Хельр FTA B клетки-мишени клеток в реальном времени в естественных условиях с помощью проточной цитометрии. С> 250 клеток-мишеней может быть оценена сразу, техника позволяет контролировать Т-клеток ответов против нескольких антигенных эпитопов в нескольких концентрациях и в нескольких повторах. Таким образом, способ может измерять Т-клеточные реакции как на количественном (например, совокупный величины ответа) и качественными (например, функциональной. Авидности и эпитоп-перекрестной реактивности в ответ) уровне. В данном случае мы описываем, как эти ССТ построены и дают пример того, как они могут быть применены для оценки Т-клеточные реакции, вызванные рекомбинантной вакцины вируса оспы.

Introduction

Т-клетки играют центральную роль в адаптивного иммунного ответа и часто становятся мишенью для манипуляций в иммунотерапии. CD4 + эффекторные Т клетки реагируют на чужеродный антиген по секреции цитокинов, которые регулируют многие аспекты иммунитета, а также может напрямую помочь В-клеток для производства антител. CD8 + цитотоксические Т-клетки (CTL) также может реагировать на чужеродный антиген по секреции цитокинов, а также играет центральную роль в непосредственно убивает клетки выражая чужеродный антиген. Фундаментальное взаимодействие, которое инициирует эти функции эффекторных Т-клеток включает взаимодействие Т-клеточного рецептора (TCR) с иностранными пептидов, отображаемых на молекул МНС на поверхности клеток. CD4 + Т-клетки распознают пептиды, представленные на молекул МНС класса-II на антиген-представляющих клеток и CD8 + Т-клетки распознают пептиды, представленные на молекул МНС класса-I, которые обычно отображаются на микробных клеток, инфицированных.

В порядкеоценить роль Т-клетки играют в иммунного ответа, важно, что их эффекторные функции измеряются надежных и чувствительных методов. Общие методы оценки отклика клеток T включают в себя: МНС class-I/II/peptide тетрамером реактивность; продукция цитокинов по ELISPOT и внутриклеточного окрашивания цитокинов; и убивая мощности на 51 Cr-релиз анализов. Эти анализы, однако, как правило, выполняются экс виво со стимуляцией в пробирке, или обеспечивают ограниченное понимание функции Т-клеток. В идеале, при измерении Т-клеточные ответы, было бы полезно, чтобы оценить их на месте, в естественных условиях, как они происходят, без манипулирования Т-клеток с тем, чтобы избежать изменений в функциональных параметров, которые могут возникнуть через стимуляцию в пробирке. Некоторые из наиболее часто используемых в естественных Т-клеток функциональных анализов, основанный на измерении CTL, опосредованного умерщвление клетки-мишени импульсных с МНС класса I-связывающих пептидов, которые перечислены в естественных условияхчерез их обнаружения через флуоресцентного мечения витальных красителей, таких как CFSE. Хотя эти типы анализов может контролировать CTL, опосредованного убийство целей, когда они происходят в живом организме, они ранее были сравнительно ограниченные возможности для оценки убийства нескольких целей, представляющих различные концентрации и различных типов пептидных эпитопов, который необходим, чтобы позволить качественные параметры, такие как функциональные алчность и Эпитоп вариант перекрестной реактивности в оценке. Эти анализы также не дает никакой информации о CD4 + Т-клеток опосредованных реакций.

Чтобы преодолеть многие из ограничений с нынешних методов, используемых для оценки Т-клеточные реакции, мы недавно разработали многозальный анализа на основе флуоресцентных целевых массивов (ССТ), которая позволяет осуществлять мониторинг Т-клеточного ответа против> 250 клеток-мишеней одновременно в одном животного проточной цитометрии 1, 2. ССТ состоят из лимфоцитов, меченных нескольконцентрации Eral и комбинации витальных красителей, как CFSE, CTV и ДСП, позволяющих> 250 клеток кластеры уникальной флуоресценции, которые будут созданы. Так как эти клетки остаются жизнеспособными и полностью функциональным, они могут быть введены в животных, чтобы обеспечить контроль за их взаимодействие с эффекторных Т-клетках в естественных условиях 3. Например, клеточные кластеры FTA может быть импульсным с МНС класса пептидов-I-связывания, чтобы позволить оценку антиген-специфических ЦТЛ, опосредованной гибели клеток-мишеней 1. Кроме того, кластеры клеток FTA также может быть импульсным с МНС класса-II-связывающих пептидов, позволяя оценка антигена специфические Т-хелперных клеток (T H) путем оценки активности активацию (по оценке маркеров активации CD69, таких как CD44, и / или CD62L) В-клеток в пределах ЗСТ несущих родственный пептид 2. Поскольку более 250 мишени могут быть обнаружены одновременно, можно измерить ЦТЛ и Т H ответы против многих кластеров клеток-мишеней с п импульсныхumerous пептиды в различных концентрациях и включение многих повторов. FTA анализ, следовательно, обеспечивает беспрецедентный уровень Т-клеточного эффекторной оценки реакции в естественных условиях.

Здесь мы опишем подробно строительство ЗСТ и показать, как они могут быть применены к оценке Т-клеточные реакции в естественных условиях. Процедура описывает конструкцию ЗСТ, состоящей из 252 различимых кластеров клеток за счет использования трех жизненно важных красителей, состоящих из 6 повторами 42 кластеров клеток импульсных с МНС класса-I и II-связывающих пептидов. Маркировка 42 кластеров клеток происходит в 10 мл коническую дном трубки и это полезно, чтобы заложить эти в стойке трубки, как показано в таблице 1. Этот метод может быть отрегулирован для меньшим числом различаемых кластеров в соответствии с требованиями уменьшения количества маркировки каждого красителя производится 1.

Мы подчеркиваем полезность анализа, показывая, как он может измерять отвэс генерируемые рекомбинантного оспа-вирусной вакцинации против нескольких эпитопов в небольшой группе мышей. Это показывает, насколько этот анализ FTA может быть использован для измерения кумулятивные ответы и функциональный алчность через, соответственно, использование площади под кривой (AUC) оценки и измерения эффективной концентрации пептида, необходимого для генерации половиной ответов максимальные (EC 50).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Мыши, используемые в рамках этого протокола были обработаны в соответствии с рекомендациями австралийского Комитета по этике Национального университета экспериментов на животных и мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков.

1. Краситель и пептид Подготовка

  1. Подготовка краски
    Примечание: Красители разведенных в различных концентрациях, чтобы позволить маркировки клеток в дискретных интенсивности флуоресценции. CFSE используется в семи концентрациях, сделанные через 3,5-кратных серийных разведений, и CTV и CPD используются в шести различных концентрациях, сделанные через 3,7-кратных серийных разведений (см. таблицы 2-4). Маточные концентрации красителей, перечисленных в таблицах 2-4 будут использоваться для обозначения клетки-мишени в концентрации конечных красителей, перечисленных в таблицах 2-4. Красители реагировать при воздействии водного раствора. Поэтому важно, что флаконы быть доведены до комнатной температуры перед открытием, чтобы минимизировать воздействие красителей конденсации.
    1. CFSE
      Примечание: CFSE приобретается как карбоксифлуоресцеин Диацетат сукцинимидиловым эфиром (CFDA, SE; МВт 557,47), как правило, на 25 мг / флакон.
      1. Ресуспендируют 25 мг CFSE в 4,48 мл ДМСО с получением исходного раствора 10 мМ.
      2. Серийно разбавить CFSE: Добавить 35 мкл 10 мМ CFSE складе в 87,5 мкл ДМСО и повторить это разбавленной маточного раствора, чтобы дать концентрацию каждого красителя в таблице 3.
    2. CTV
      Примечание: КТВ обычно приобрести в упаковках по 9 флаконов, каждый из которых может быть восстановлена ​​с 10 мкл ДМСО для генерирования 10 мМ раствора красителя.
      1. Восстановить и объединить все 9 флаконов CTV 90 мкл ДМСО для получения раствора 10 мм.
      2. Серийно разбавить CTV: Добавить 11 мкл 10 мМ CTV складе в 29,7 мкл ДМСО и повторить это разбавленной маточного раствора, чтобы дать концентрацию каждого красителя в таблице 2.
    3. CPD
      Примечание: КПИ (МВт 792,6) характернолы приобрести как 0,5 мг / флакон.
      1. Ресуспендируйте 0,5 мг НПР в 63 мл ДМСО, чтобы получить решение 10 мм.
      2. Серийно разбавить ДСП: Добавить 11 мкл 10 мМ CPD складе в 29,7 мкл ДМСО и повторить это разбавленной маточного раствора, чтобы дать концентрацию каждого красителя в таблице 4.
        Примечание: запасы Dye можно хранить при -20 ° С в течение нескольких месяцев и может быть несколько раз размораживали и замораживать без значительной потери функции.
  2. Пептидный препарат
    Примечание: МНС класса-I-связывающие пептиды, как правило, используется для импульса клетки-мишени в 6 различных концентраций с использованием 10-кратное разведений из исходного концентрации 1 мкМ (табл. 5). МНС класса II-связывающие пептиды, как правило, используется для импульса клетки-мишени в 6 различных концентрациях с использованием 3 кратные разбавления от исходной концентрации 400 мкм (табл. 5). Каждый пептид производится при конечной концентрации 2 раза в PBS такой тхат каждый концентрация пептид имеет минимальный объем 250 мкл. Запасы пептид может быть подготовлен до FTA строительства и хранили при -20 ° С без значительной потери функции.
    1. Подготовка акции МНС класса-Я-связывающие пептиды
    2. Подготовка самую высокую концентрацию каждого пептида эпитопа до 2 мкм маточных растворов (2x 1 мкм)
    3. Серийно разбавить МНС пептиды класса-Я-связывающий: добавить 44,4 мкл 2 мкМ пептида раствора в 400 мкл PBS. Повторите этот разбавленной маточного раствора, чтобы дать каждому концентрации пептида в таблице 5.
    4. Подготовка акции МНС класса-II-связывающие пептиды
    5. Подготовка самую высокую концентрацию каждого пептида эпитопа 800 мкМ растворов (2x 400 мкм).
    6. Серийно разбавить МНС класса II-связывающих пептидов: добавить 150 мкл 800 мкМ раствора пептида в 300 мкл PBS. Повторите это разбавленной маточного раствора, чтобы дать каждому концентрации пептида в таблице 5

2. FTA Подготовка

Примечание: Описанная ниже процедура описывает строительство ЗСТ, состоящей из клеток импульсных с 7 разных пептидных эпитопов в 6 различных концентрациях (т.е. 42 кластеров клеток.) ​​Неоднократные 6 раз, чтобы генерировать 252 заметных кластеры клеток. В каждом повторе, клетка кластера не импульсно любой эпитопа (ноль), включен в качестве контроля. Это полезно для ССТ иметь разницу CD45 аллотип от животных-хозяев, чтобы их дискриминации со стороны клеток-реципиентов по маркировке антител в момент анализа. В противном случае ССТ могут быть помечены с другими красителями, такими как PKH-26 для этой цели (описано в шаге 2.6). Как правило, процедура подготовки FTA осуществляется от начала до конца в течение одного заседания.

  1. Этикетка 42, 10 мл конические пластиковые пробирки дном 1-42 (как в таблице 1, например).
  2. Подготовка клеток
    1. Изолировать селезенку и / или lymphnodes от мышей. Подготовка суспензии отдельных клеток из тканей, делая пюре через 70 мкм корпели сито с 5 мл поршень шприца и подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
    2. Ресуспендируют лимфоциты со скоростью до 200 х 10 6 клеток / мл в 11,5 мл Rochester Park Memorial института 1640 (RPMI или эквивалент), содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS). Примечание: Важно использовать буфер с высоким содержанием амина, чтобы минимизировать токсичность к клеткам краситель 3.
  3. CTV маркировки
    Примечание: Клетки изначально помечены 6 концентраций CTV.
    1. Тщательно ресуспендирования клеток путем обращения трубки несколько раз. Добавить 1,9 мл клеточной суспензии на 6 из 10 мл пробирок меченых 37-42, стараясь не намочить верхнюю половину трубы.
    2. Чтобы пометить клетки с CTV, снимите трубку крышку и положите трубку горизонтально.
    3. Добавить 83 мкл PBS к не смачиваемой части в верхней части трубки, и к этому добавляют 17 мкл фондовом КТВ (см. таблле 2, для которых исходный раствор назначены каким трубка). Примечание: несмачиваемые трубка важно, чтобы предотвратить движение суспензии клеток и преждевременное смешивание раствора клеток с раствором красителя.
    4. Закрывают пробирку и перемешивают суспензию клеток с красителем быстро и тщательно при интенсивном перемешивании.
    5. Повторите шаги 2.3.2-2.3.4 для фондовых решений CTV в назначенных труб, описанных в таблице 2.
    6. Инкубируйте клетки для минимум 5 мин при комнатной температуре (20 ° C).
  4. CFSE маркировки
    1. После КТВ маркировки, добавляют 5 мл RPMI, содержащей 5% FCS в каждую пробирку и тщательно ресуспендирования клеток на вортексе.
      1. От трубки 37 передачи 1 мл клеточной суспензии в пробирки 31, 25, 19, 13, 7 и 1.
      2. От трубки 38 передачи 1 мл клеточной суспензии в пробирки 32, 26, 20, 14, 8 и 2.
      3. От трубки 39 передачи 1 мл клеточной суспензии в пробирки 33, 27, 21, 15, 9 и 3.
      4. Из трубки 40 передачи 1 мл ячейкиподвеска для труб 34, 28, 22, 16, 10 и 4.
      5. От трубки 41 передачи 1 мл клеточной суспензии в пробирки 35, 29, 23, 17, 11 и 5.
      6. От трубки 42 передачи 1 мл клеточной суспензии в трубах 36, 30, 24, 18, 12 и 6
        Примечание: Будьте осторожны, чтобы не замочить верхнюю половину труб во время шагов 2.4.1.1-2.4.1.6.
    2. Чтобы пометить клетки с CFSE, снимите трубку крышку и положите трубку горизонтально.
    3. Добавить 103 мл PBS тем, что не смачиваемой части в верхней части трубки, и к этому добавляют 7 мл бульона CFSE (см. таблицу 3, для которых исходный раствор, назначенный который трубки).
    4. Закрывают пробирку и перемешивают суспензию клеток с красителем быстро и тщательно при интенсивном перемешивании.
    5. У шаги 2.4.2-2.4.4 для фондовых решений CFSE в обозначенных труб, описанных в таблице 3.
    6. Инкубируйте клетки для минимум 5 мин при комнатной температуре (20 ° C).
    7. Вымойте клеток: Развести клеточной суспензии с 9 мл 20 ° CRPMI, содержащей 5% FCS, осадок центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при 20 ° С и супернатанты удалить аспирацией с пипетки.
  5. Пептид пульсирующий и стиральная клеток
    Примечание: После клетки были помечены CTV и CFSE, они пульсируют с МНС класса-I и / или МНС класса-II связывающие пептиды (подготовленные в 1,2). Один из клеточных популяций не должно также быть импульсным с пептидом (например. Всухую в таблице 1) и использовали в качестве отрицательного контроля для расчета Т-клеточные ответы.
    1. Пептид пульсирующий
      1. Ресуспендируют клеток в общем объеме 250 мкл RPMI, содержащей 5% FCS. Примечание: Обычно 50 мкл клеточной суспензии остается после аспирации супернатант в конце стадии 2.4.7, поэтому добавить 200 мкл среды для клеточного осадка.
      2. Добавить 250 мкл предварительно подготовленных запасов пептид (как в таблице 5), чтобы соответствующим образом обозначены трубы (как в Таблице 1) а Sur бытье включать контрольную трубку PBS добавлены отдельно без пептида в качестве контроля нулю.
      3. Смешайте клеточные суспензии с вихрем. Примечание: Очень важно, чтобы каждый пептид Эпитоп и каждая концентрация пептида присваивается одной пробирке и это записано четко исходя из ожидаемого флуоресценции клеток в эту трубу, так как флуоресценция подпись этого кластера будет определять этот пептид (как в таблице 1, например).
      4. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 1 часа.
    2. Стиральная Сотовый
      1. Добавить 5 мл охлажденного льдом (4 ° С) RPMI, содержащей 5% FCS в суспензию клеток и ресуспендирования клеток путем обращения трубки. Осторожно легли в основу клеточной суспензии с 3 мл охлажденного льдом (4 ° С) FCS.
      2. Осадок клеток путем центрифугирования при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Использование медленно ускорение и торможение, чтобы обеспечить интерфейс FCS и клеточную суспензию раствор поддерживают.
      3. Тщательно аспирата от RPMI, а затемФТС с пипетки, оставляя промытых ячейки гранул спокойно. Примечание: Использование подложки FCS мыть клетки помогает обеспечить столько раствор пептид удаляется из клеток, как это возможно, и тем самым ограничения воздействия клеточных популяций на нескольких свободных пептидов, когда клетки объединяли.
      4. Промыть клетки снова: Ресуспендируют клеточный пеллет в 10 мл 4 ° C RPMI, содержащей 5% FCS. Осадок клеток путем центрифугирования при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Вылейте супернатантами.
      5. Бассейн все сотовые населения вместе в одной пробирке с помощью пипетки с использованием 6 мл 4 ° C RPMI, содержащей 5% FCS. Осадок собирали клетки центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Аспирируйте от супернатант с пипетки.
  6. CPD сотовый маркировки
    Примечание: На данный момент шесть внутрирегиональные повтора анализов могут быть получены путем маркировки пептидных импульсных клеток с 6 различными концентрациями ДСП.
    1. Добавить 11,4 мл 20 ° CRPMI, содержащей 5% FCS в объединенной осадок клеток ресуспендируют и тщательно с помощью пипетки.
    2. Добавить 1,9 мл клеточной суспензии до 6, 10 мл трубки помечены AF, стараясь не намочить верхнюю половину трубы.
    3. Чтобы пометить клетки с ДСП, снимите трубку крышку и положите трубку горизонтально.
    4. Добавить 92 мкл PBS к не смачиваемой части в верхней части трубки, и к этому добавляют запаса ДСП (см. таблицу 4 для количества маточного раствора, назначенного каждой пробирки).
    5. Закрывают пробирку и перемешивают суспензию клеток с красителем быстро и тщательно при интенсивном перемешивании.
    6. . Ли шаги 2.6.3-2.6.5 для фондовых решений ДСП в назначенных труб, описанных в таблице 4 Примечание: В отличие CFSE и CTV, концентрация CPD ​​маркировка точно не в линейной зависимости от полученной интенсивности флуоресценции меченых клеток, и поэтому концентрация маркировка используется для получения эквидистантных пиков флуоресценции меченых нескольких популяций былопределяют эмпирически (см. таблицу 4).
    7. Инкубируйте клетки для минимум 5 мин при комнатной температуре (20 ° C).
    8. Промыть клетки дважды: ресуспендирования клеток до 10 мл при 20 ° C RPMI, содержащей 5% FCS. Осадок клеток путем центрифугирования при 300 х г в течение 10 мин при 20 ° С. Аспирируйте от супернатант с пипетки. Повторите.
    9. Бассейн все клетки вместе в одной пробирке с использованием 8 мл 4 ° C RPMI, содержащей 5% FCS с помощью пипетки. Осадок собирали клетки центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С и аспирации от супернатанта с пипетки.
  7. (Необязательно) PKH-26 сотовый маркировки
    Примечание: Если ССТ не могут быть построены с клеток, экспрессирующих allotypic разницу CD45 для размещения мышей, они могут быть помечены рКН-26, чтобы позволить их дискриминации со стороны клеток-реципиентов.
    1. Добавить 2,9 мл 20 ° C в PBS Объединенные осадок клеток и тщательно ресуспендируют с помощью пипетки.
    2. Добавить клеточной суспензии к никакомун смачивается 10 мл трубку, стараясь не намочить верхнюю половину трубы.
    3. Снимите трубку крышку и положите трубку горизонтально.
    4. Добавить 58 мкл разбавителя С (в комплекте с красителем РКН-26) к не смачиваемой части в верхней части трубки, и к этому добавляют 42 мкл 1 мМ исходного PKH-26.
    5. Закрывают пробирку и перемешивают раствор клеток с красителем тщательно при интенсивном перемешивании.
    6. Инкубируйте клетки в течение как минимум 10 мин при комнатной температуре (20 ° С).
    7. Промыть клетки дважды: ресуспендирования клеток до 10 мл при 20 ° C RPMI, содержащей 5% FCS. Осадок клеток путем центрифугирования при 300 х г в течение 10 мин при 20 ° С. Аспирируйте от супернатант с пипетки. Повторите.
  8. Потребители инъекционных ССТ в животных-хозяев
    Примечание: Для измерения Т-клеточные реакции в живом организме, ССТ вводятся в животных, которые имеют активную иммунную реакцию и остались на месте на срок до 24 часов. Очень важно, что ССТ также вводят в наивной животного в качестве отрицательного контроля.
    1. Граф и ресуспендирования клеток в 2,5 х 10 8 клеток на мл в PBS. Введите 200 мкл клеток мышам внутривенно принимающих, в том числе наивным животного в качестве контроля.

3. Проточной цитометрии

  1. 18-24 ч после FTA впрыска урожая крови или селезенке (или других тканей интересов) от мышей-хозяев.
  2. Подготовка суспензии отдельных клеток из тканей, делая пюре через 70 мкм корпели сито с 5 мл поршень шприца.
  3. Ресуспендируют клеток со скоростью до 65 × 10 6 клеток / мл в PBS, содержащем 0,1% БСА.
  4. 100 мкл аликвоты клеточной суспензии в лунки планшета для микротитрования для маркировки антител.
  5. Этикетка клетки с флуорохромом меченые антитела и флуоресцентные жизнеспособности зондов с спектрально совместимый флуоресценции к CFSE, CTV и ДСП. Примечание: Антитела к В-клеток маркеры, такие как B220 и маркеров активации, таких как CD69 необходимы для измерения активации В-клеток при использовании FTДля измерения реакции Т Н клеток 2. Включите антитела к CD45.1 и / или CD45.2 если ССТ и мыши хозяева имеют allotypic разницу CD45.
  6. Добавьте 100 мкл 2х исходного раствора антител / жизнеспособности красителей (в PBS, содержащем 0,1% BSA) в 100 мкл аликвоты клеток, хорошо перемешать и инкубировать на льду (4 ° C) в течение 30 мин.
  7. Промыть клетки: засыпные клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С и удалить супернатант. Ресуспендируют клеток в 200 мкл PBS, содержащего 0,1% БСА, осадка клеток путем центрифугирования при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С и удалить супернатант.
  8. Ресуспендируют клеток в общем объеме 400 мкл PBS, содержащего 0,1% BSA, клетки фильтруют через 70 мкм меш и анализируют методом проточной цитометрии в проточном цитометре способен обнаруживать соответствующие флуоресцентные красители и конъюгатов. Соберите до 3 х 10 6 событий лимфоцитов в целях урегулирования каждый сотовый кластер FTA и получить достаточно клеток для статистическикал анализ. Примечание: Убедитесь, что все типичные элементы управления (такие как одинарные окрашенных управления) для проточной цитометрии заняты. Как правило, CFSE требуется возбуждение от синей лазерного источника (обычно на 488 нм) и обнаружения с полосовых фильтров по центру над 520 нм; CTV требуется возбуждение от фиолетового лазерного источника (обычно на 405 нм) и обнаружения с полосовых фильтров по центру над 450 нм; и CPD требуется возбуждение из красного лазерного источника (как правило, на 633 нм или 640 нм) и обнаружения с полосовых фильтров по центру над 670 нм.

4. Анализ данных

  1. Анализ проточной цитометрии данных с использованием стандартного программного обеспечения проточной цитометрии (см. представительный результат для примера типа используемой стратегии стробирования).
  2. Для% конкретного убийства, подсчитать количество клеток в каждой клеточной кластера FTA импульсного с МНС пептидов класса-Я-связывающий и кластеров FTA, которые не были пептида импульсных ("Нил") и, используя следующую формулу для расчета% Удельный Убийство.
    % Удельный Убийство Формула
    Примечание: В приведенной выше формуле "загрунтовать" относится к целям от животных, которые, как считается, имеют иммунный ответ против целевых пептидов, "наивным" относится к целям от наивных животных, "пептид" относится к целям импульсных пептидами и "ноль" относится к целям не импульсных с любыми пептидов.
  3. Для активации В-клеток в качестве меры активности T H, вычислить среднее геометрическое интенсивности флуоресценции (GMFI) из CD69 антител флуоресценции от FTA В-клеток пульсировали с МНС класса-II-связывающих пептидов в "примированных" животных и из этого вычесть из GMFI CD69 выражение на соответствующих FTA В-клеток в "наивной" животных, чтобы дать меру T H деятельности.
  4. Из статистики генерируемых с шагом 4,2 и 4,3, использованияматематическое обеспечение электронной таблицы, таких как GraphPad Prism для расчета других количественных и качественных параметров, таких как площадь под кривой и ЕС 50 (в подробное описание того, как эти расчеты проведены для AUC можно найти на
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, а для ЕС50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. HTM? reg_the_ec50.htm).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В качестве примера использования анализа FTA, BALB / C мышей иммунизировали рекомбинантным вирусом коровьей оспы (VV), выражающей эпитопы ВИЧ-I (VV-ВИЧ) и ответы на эпитопов ВИЧ-I ЦТЛ, Gag, Gag MUT, Env и Pol, В.В. CTL эпитопы F2, F2, и MUT, и клеточный эпитоп ВИЧ-I T H, Gag Th (как описано в пункте 2) были оценены с использованием параметра 252 FTA анализ (Фигура 1В). Варианты эпитопом Gag Gag (МУТ) и F2L (F2, Мут) не выражены в векторе ВВ-ВИЧ и, следовательно, ответы против этих эпитопов отражают Эпитоп поперечных вариант ответов Т-клеток реактивной. Наивные мышей вводили также ССТ в качестве отрицательного контроля. FTA было отличить от клеток-хозяев мыши по PKH-26 маркировки и FTA В-клеток размеченного окрашиванием антителами B220 через проточной цитометрии (фиг.1А и 1В). Каждый из 6 внутригосударственных повторах животных был закрытый на основе CPD флуоресценции (рис. 1в (рис. 1D). % Удельный Умерщвление каждой повторности оценивали сравнением FTA гибель клеток кластера в грунтованные животных относительно соответствующих FTA кластеры в наивных животных (фиг. 1D). T H активность оценивали путем сравнения FTA В-клеток позитивную регуляцию CD69 в загрунтованных животных относительно соответствующих кластеров клеток FTA B в наивных животных (рис. 1E).

Из этого анализа, VV-ВИЧ-инфекции генерируется сильные реакции ЦТЛ против эпитопа иммунодоминантном В.В. F2L, со 100% ССТ клеток-мишеней с импульсным 0,001 мм или более эпитопа удаляется из селезенки (рис. 2а). Был также сильный ответ, создаваемый против вариантной формы F2L, F2L Мут, с 100% FTA клеток-мишеней импульсных 0,01 мм или более эпитопа удаляется из селезенки. СF2, MUT нет в заражение вирусом, этот ответ указывает на эпитоп вариант перекрестно-реактивный ответ. Был также относительно умеренным ответа, против целей, выражающих эпитоп ВИЧ Gag и небольшое кросс реактивный ответ против варианта формы этого эпитопа, ВИЧ Gag Мут. Там, как представляется пренебрежимо ответы, полученные в эпитопов ВИЧ Pol и ВИЧ Env CTL.

В дополнение к ответов CTL, FTA пример анализа показали также измеряли Т ответов H путем оценки активацию FTA-клетки, выражающей ВИЧ MHC класса II-связывающий эпитоп ВИЧ Gag Th (рис. 2В). Это показало активации клеток антиген-специфическая B произошли в загрунтованных животных предлагая поколение ВИЧ Gag че-специфических клеточных эффекторов Т Н.

Эти меры Т-клеточного ответа величины можно резюмировать, генерируя площадь под кривой значений (AUC) для каждого из эпитопов (рис. 2C), что МЭАSures совокупный величину отклика.

В дополнение к величине антиген-специфических и эпитоп варианта перекрестно реагирующих откликов, анализ FTA позволяет измерять функциональные авидности быть сделаны. Например, эффективные концентрации пептидов, используемые пульсировать FTA клетки-мишени, необходимые, чтобы дать половину ответов максимальные (EC 50), показана для эффекторов CTL (рис. 2D). Это показало функциональную авидности к эпитопов F2L Mut, ВИЧ Gag и Gag ВИЧ Mut, были приблизительно 10, 100 и 4000 раз ниже, соответственно, чем ответов, полученных с доминирующим В.В. эпитопа F2L.

Таблица 1
Таблица 1. Макет из 252 параметр ЗСТ. Типичная схема одной репликации о 252 ЗСТ состоит из 42 образцов / трубок импульсных с 7 разных пептидных эпитопов в 6 дифт концентрации и в том числе в ООН импульсный (Нил) образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Трубка Количество Объем (мкл) Краска материалов (мм CTV) Конечная концентрация (мкМ)
37 0 0 0
38 17 0.053 0.451
39 17 0,197 1.48
40 17 0,73 6.21
41 17 2.7 23
42 17 10 85

Таблица 2. Запасы CTV используется для обозначения клетки. Объем перечисленныхCTV складе используется для обозначения клеток в 2 мл, чтобы дать концентрацию окончательного маркировка красителя.

Трубка Количество Объем (мкл) Краска материалов (мм CFSE) Конечная концентрация (мкМ)
37 - 42 0 0 0
31 - 36 7 0.022 0.139
25 - 30 7 0,078 0.492
19 - 24 7 0.23 1.45
13 - 18 7 0.82 5.17
7 - 12 7 2.9 18.3
1 - 6 7 10 63.1

Таблица 3. Запасы CFSE используется для обозначения клетки. Объем перечисленных CFSE складе насред маркировать клетки в 1,11 мл, получая концентрацию окончательного маркировка красителя.

Трубка Количество Объем (мкл) Краска материалов (мм ДСП) Конечная концентрация (мкМ)
0 0 0
B 4 0.053 0.106
С 6.3 0,197 0.62
D 7.5 0,73 2.74
E 7.3 2.7 9.86
F 7.7 10 38.5

Таблица 4. Запасы CPD используется для обозначения клетки. Объем перечисленных CPD складе, используемого для клеток этикеток в 2 мл с получением конечного labelinконцентрация красителя г.

Концентрации пептида (мкМ)
Пептиды МНС класса I-связывающий 0 0.00002 0.0002 0.002 0.012 0,2 2
МНС класса II-связывающие пептиды 0 3.29 9.88 29,6 88.9 266 800

Таблица 5. MHC-класс я и II-связывающий пептид фондовые концентрации. Типичные концентрации фондовые 1 из пептидных эпитопов, используемых для построения ЗСТ 1. Эти концентрации 2x конечных концентраций, используемых для импульса клетки-мишени.

Рисунок 1 Рисунок 1. Типичный проточной цитометрии анализа ССТ. Спленоциты от мышей BALB / с мышей были использованы для построения 252 параметров FTA, как описано в тексте. FTA кластеры импульсно 6 концентрациях (как указано в таблице 5) из 7 различных вирусных эпитопов, в том числе МНС класса-Я-связывающих эпитопов, F2L (SPYAAGYDL, в L D-ограничен коровьей оспы вируса (VV) эпитопной); F2, мут (SP G AAGYDL, вариант F2L), Gag (AMQMLKETI, Уб ограничением ВИЧ Gag Эпитоп 4), Gag мут (AMQMLK D Т.И., вариант ВИЧ Gag 5), Пол (VGPTPVNII, D D -ограничен пол Эпитоп ВИЧ 6), Env (RGPGRAFVTI, D D-ограничен ВИЧ окр Эпитоп 7); и МНС класса-II-связывающий пептид Gag T H (PVGEIYKRWIILGLN, Н-2 г-ограничен ВИЧ Gag Эпитоп 4). ССТ вводили внутривенно. в линии BALB / C мышей, которые были инфицированы интраназально (в). 6 дней раньше, с RECombinant В.В. выражая эпитопы ВИЧ (ВВ-ВИЧ, загрунтовать животных). FTA был также введен в наивных мышей в качестве контроля. Через 18 часов в естественных условиях, FTA клетки, присутствующие в спленоцитов суспензий от мышей принимающих были проанализированы с помощью проточной цитометрии.) Типичный прогрессивная стратегия стробирования определить FTA клетки, показывающие ворота для лимфоцитов, фуфайки и PKH-26 + FTA клеток (это также полезно решить живых клеток с использованием красителя жизнеспособность как Hoechst 33258, не показаны). B) 3D график, показывающий все FTA кластеров от наивных принимающей мыши. C) гистограммы, показывающие участки FTA флуоресценции CPD маркировки каждого из животных внутри 6 репликацию. D) 2D участки, показывающие один из ячейки 6 внутри животного FTA B копирует представляя различные типы и концентрации эпитопов от наивного и загрунтованную животного. Это показывает отсутствие FTA клеток в загрунтованную животного по отношению к наивной животного, открывая "Killing события"по ЦТЛ, которые формируют основу FTA убийства анализа 1. Е) Гистограмма анализа FTA В-клеток выражения активации маркера CD69 в загрунтованных животных по отношению к наивным животных, который формирует основы ЗСТ Т-хелперов анализа 2. Пожалуйста, нажмите здесь чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. ССТ позволяет измерять величины и жадностью Т-клеточного ответа в естественных условиях. 252 параметр FTA была использована для оценки Т-клеточные реакции у мышей, инфицированных VV-ВИЧ, как описано на рисунке 1.)% Удельный убийства была рассчитана для всех эпитопов CTL и результаты каждого из 6 реplicates показано (левая панель), а также средства и стандартную ошибку средств (правая панель) показано на рисунке. B) T отклика H оценивали путем измерения активации FTA-клеток представляя эпитоп ВИЧ Gag Th для каждого из 6 внутригосударственных повторах животных ( левая панель) и средства и стандартная ошибка помощью (правая панель) рассчитывается. C) AUC измерения для% конкретного убийства (а) и Т-хелперов ответов (б) была рассчитана в качестве меры совокупного величины. D) EC 50 измерений были рассчитаны для% Конкретные данные убийства (а) в качестве меры функциональной жадностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Преимущество анализов РИФ-основе, что они позволяют дискриминацию> 250 населения жизнеспособным и полностью функциональный клеток-мишеней с одного животного-хозяина с помощью проточной цитометрии. Это обеспечивает уровень сложности для естественных условиях проточной цитометрии на основе анализов в том, что не удалось раньше. Это подчеркивается в экспериментах 2 животных было показано выше, где ответы на 7 различных вирусных эпитопов на 6 концентраций можно было наблюдать в повторах 6 одновременно в одном животного, позволяя параметры, такие как AUC и ЕС 50, которые будут определены для Т-клеточного ответа в естественных условиях .

В дополнение к измерению Т-клеточные реакции в живом организме, анализы, основанные на FTA может быть модифицирован для измерения реакции в пробирке 1. В сущности, это включает в себя добавление ССТ Т-клеткам в культуре для измерения реакции в течение нескольких часов в пробирке. Одним из потенциальных ограничений в анализах пробирке основе при помощи ССТ является тон тенденция меченых клеток в ЗСТ для передачи маркировочную краску для окружающих клеток 1, 3. Это может привести к снижению разрешения клеточных кластеров FTA также их флуоресценции становится менее выраженной между каждой популяции. Это более очевидными в анализах ин витро по сравнению с Исследования in vivo, потому что клетки находятся в непосредственной близости для более длительных периодов времени в анализах ин витро. Эта потеря в резолюции популяций FTA клеток могут быть минимизированы в анализах в пробирке путем сокращения времени культуры ССТ с эффекторных Т-клеток и с помощью ССТ, что имеют менее популяции клеток-мишеней, которые имеют большее количество «флуоресцентной пространства" между ними так что перенос красителя оказывает меньшее воздействие.

Мы также отметили потерю в резолюции популяций FTA клеток при ССТ были размещены в естественных условиях в течение 48 ч 1. Это, казалось, быть результатом целевой В-клеток в PROLIFE FTAРейтинг и тем самым снижая интенсивность флуоресценции красителя. Это, вероятно, является результатом В-клеток, представляющих родственный антиген антиген-специфические эффекторные CD4 + Т-клеток, которые привели к стимуляции В-клеток. Поэтому рекомендуется, что анализ ограничивается ~ 24 час или меньше, когда находятся под наблюдением цели В-клеток.

Возможность маркировать несколько (> 96) уникальные кластеры клеток флуоресцентно сообщалось ранее с использованием фиксированных нежизнеспособных клеток 8. Окрашивание живых клеток, однако, было более проблематичным при наличии совместимых жизненно важных красителей, и только 8-12 жизнеспособных клеток кластеры было достигнуто ранее 9. Способность генерировать> 250 однозначно флуоресцентно меченных жизнеспособных и функционирующих клеток представленные здесь, зависит от свойств CFSE-подобных жизненно важных красителей. Некоторые из этих красителей, таких как CTV и ДСП, только недавно стали доступны. Эти красители имеют характеристики способенмаркировка клетки с высокой интенсивности флуоресценции, который долго жил и низкой дисперсией 3. Эти свойства в сочетании с тем, что есть линейная зависимость (особенно в случае CFSE и CTV) между концентрацией красителя, используемого для маркировки и интенсивности флуоресценции меченых клеток, означает, что клетки могут быть помечены несколько (до до 7 показано здесь) интенсивности каждого красителя, что можно легко отличить с помощью проточной цитометрии. Кроме того, поскольку флуоресцентное излучение CFSE, КПИ и КТВ имеют минимальный спектральный перекрываются, они могут быть использованы в сочетании, чтобы маркировать клетки, тем самым позволяя до> 250 флуоресцентные подписи клеточные быть обнаружены с помощью проточной цитометрии. Следует отметить, что для достижения маркировки клеток с этим числом различаемых флуоресцентных подписей, важно, чтобы мечения клеток быстро выполнена 10, 11 (для генерации низкую дисперсию флуоресценции) и в соответствующем буфере, содержащемсвободные амины 3 (в буфер красителя токсичности, которые могут в противном случае с этими красителями при высоких концентрациях). Важно также, что в ходе приобретения ССТ с помощью проточной цитометрии, что ошибочные колебаний флуоресценции событий отслеживаются (например, посредством измерения CFSE, CTV и / или CPD интенсивность флуоресценции с течением времени). Это важно, потому что такие колебания флуоресценции событий, которые из-за машины введены ошибки могут привести к неправильной интерпретации правильного позиционирования кластера клетки-мишени, что в свою очередь может привести к ошибкам в конечных мер функции эффекторных Т-клеток. Такой проточный цитометр, введенных ошибок может быть ограничено путем обеспечения высокого качества образцы получают (в частности, обращая внимание на фильтрацию клеток через 70 мкм меш чтобы свести к минимуму закупорки жидкостных линий в проточном цитометре крупными клеточных агрегатов), и что проточный цитометр поддерживается на высокий уровень.

Измерение Т-клеточного ответа в естественных условияхбыла выполнена в течение многих лет, используя жизненные красители, такие как CFSE контролировать клеток-мишеней смерть в естественных условиях 12. Как правило, эти анализы, однако, были только способны отслеживать до 7-8 различных клеток-мишеней сразу 13 и так предоставляют ограниченный потенциал для оценки убийства мишеней, экспрессирующих несколько концентрации нескольких эпитопов, которые обычно требуют, чтобы создать детальную оценку параметры, такие как функционального авидности Т-клеточные ответы. В этом отношении тетрамер диссоциации анализы могут быть использованы для обеспечения меру Т-клеток авидности от свежеизолированных эффекторных Т-клеток 14-16. Этот метод, однако, измеряет МНС / TCR связывания алчность, и так не полное отражение функциональной жадностью, которая также может зависеть от изменений в структуре иммунологических синапсов и состояния клеточных сигнальных компонентов Т 17. Таким образом, в идеале, функциональный авидности требуется Эксперименты доза-отклик должны быть выполнены. Этобыло достигнуто ранее с использованием методов в пробирке, такие как Cr анализе высвобождения 51, внутриклеточное окрашивание цитокинов анализа 18, 19 или ELISPOT анализа 20, 21. Эти методы, однако, часто требуют эффекторные Т-клетки, чтобы быть стимулированы в пробирке, который может изменить общую функциональную авидности населения 22. ССТ анализы, таким образом, предлагает улучшение по сравнению с существующими методами, измерение CD4 + Т-клеток и CD8 + Т-клеток от дозы ответов на месте, в режиме реального времени с несколькими эпитопами одновременно, и таким образом обеспечивая ценным дополнением к существующим методам для измерения Т-клеток эффекторной функции. Мы ожидаем, что использование технологии FTA может стать ценным в стратегии иммунотерапии скрининга, предназначенных для генерирования качества ответов высокие Т-клеток, таких как вакцины, направленных против ВИЧ-1 и гепатита С.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана проекта грантов # 1010395 (BQ и СР) и # 525431 (CR), а также грантовой программы # 455395 (СР) из Национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии, австралийский Центра гепатита и ВИЧ вирусологии ВЗ 2012 грант (CR и RJJ) и грант от Гордона и Гретель Волопаса Foundation (BQ и CR). Мы хотели бы поблагодарить Harpreet Вохра и Майкл Devoy за отличную поддержания лаборатории JCSMR FACS, Фонд Австралии онкологический научный фонд Биомолекулярная ресурсов, JCSMR, АНУ, для синтеза пептидов, и д-р Дэвид Бойл, CSIRO животных лаборатории здоровья, Джилонг, Австралия для обеспечения запасов вакцин против ВИЧ родительские.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Sigma R8758
Fetal calf serum Serana FCS-500
CTV Invitrogen C34557
CFDA, SE Invitrogen C1157
CPD eBioscience 65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5 eBioscience 110730
anti-CD69 brilliant violet 605 Biolegend 104529
PKH-26 Sigma PKH26GL-1KT
Vortex Scientific Industries Inc
Centrifuge Eppendorf
Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) BD Bioscience

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
  2. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
  3. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
  4. Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
  5. Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
  6. Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
  7. Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
  8. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
  9. Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
  10. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
  11. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
  13. Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
  14. Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
  15. Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
  16. Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
  17. von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
  18. Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
  19. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
  20. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
  21. Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  22. Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).

Tags

Иммунологии выпуск 88 методов расследования Т-клеточный ответ проточной цитометрии Мультипараметрический CTL анализа Карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфир (CFSE) CellTrace Фиолетовый (ТКЭ) пролиферации клеток Краска eFluor 670 (CPD)
Использование флуоресцентных целевых массивов для оценки Т-клеточные ответы<em&gt; В естественных условиях</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quah, B. J. C., Wijesundara, D. K.,… More

Quah, B. J. C., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo. J. Vis. Exp. (88), e51627, doi:10.3791/51627 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter