Summary
היכולת לעקוב אחר תגובות תא T בפירוט in vivo היא חשובה לפיתוח ההבנה של התגובה החיסונית שלנו. כאן אנו מתארים את השימוש במערכי ניאון יעד (FTAs) בin vivo assay תא T שמעריך> 250 פרמטרים בו זמנית על ידי cytometry זרימה.
Abstract
היכולת לעקוב אחר תגובות תא T in vivo היא חשובה לפיתוח ההבנה של התגובה החיסונית שלנו ואת העיצוב של immunotherapies. כאן אנו מתארים את השימוש בטכנולוגית מערך יעד ניאון (FTA), אשר מנצלת צבעים חיוניים כגון succinimidyl אסתר carboxyfluorescein (CFSE), צבעי לייזר סגול להתרגש (ויולט CellTrace: CTV) וצבעי לייזר אדום להתרגש (Cell הפצת הנשק דיי eFluor 670: CPD ) לcombinatorially ימפוציטים עכבר תווית ל> 250 צבירי תאי ניאון להבחין. צבירי תאים בתוך FTAs אלה ניתן פעמו עם histocompatibility המרכזי (MHC) פפטידים מחייבים ברמה שאני וMHC ברמה השני ובכך לפעול כתאי מטרה לCD8 + ותאים מסוג CD4 + T, בהתאמה. תאי FTA אלה להישאר קיימא ומתפקד באופן מלא, ולכן יכולים להינתן לעכברים כדי לאפשר הערכה של הרג בתיווך תא CD8 + T תאי יעד FTA והל-מדיטציה של תאי CD4 +עמ 'של תאי יעד תא FTA B בזמן אמת in vivo על ידי cytometry זרימה. מאז ניתן להעריך> 250 תאי מטרה בפעם אחת, הטכניקה מאפשרת הניטור של תגובות תא T נגד כמה אפיטופים אנטיגן בכמה ריכוזים ובחזרות מרובות. ככזה, הטכניקה יכולה למדוד את תגובות תא T בשני (למשל גודל המצטבר של התגובה) כמותיים ו( להיטות למשל. פונקציונלית ותגובתיות epitope צולב של התגובה) איכותית ברמה. בזאת, אנו מתארים כיצד FTAs אלה בנויים ולתת דוגמא של איך הם יכולים להיות מיושמים על מנת להעריך את תגובות תא T הנגרמות על ידי נגיף אבעבועות חיסון רקומביננטי.
Introduction
תאי T לשחק תפקיד מרכזי בתגובה החיסונית אדפטיבית ולעתים קרובות יעד למניפולציה באימונותרפיה. תאי T מסוג CD4 + מפעיל להגיב לאנטיגן הזר על ידי הפרשת ציטוקינים המסדירים היבטים רבים של חסינות והוא יכול גם לעזור באופן ישיר תאי B לייצר נוגדנים. תאי CD8 + T ציטוטוקסיים (הרג) יכולים גם להגיב לאנטיגן הזר על ידי הפרשת ציטוקינים כמו גם משחק תפקיד מרכזי באופן ישיר הרג תאי מבטאי אנטיגן זר. האינטראקציה הבסיסית שיוזמת פונקציות מפעיל תא T אלה כרוך באינטראקציה של קולטן תא T (TCR) עם פפטידים זרים המוצגים על מולקולות MHC על פני השטח של תאים. תאים מסוג CD4 + T מכירים חלבונים המוצגים על מולקולות MHC ברמה השניה בתאי המציגים אנטיגנים ותאי CD8 + T מכירים חלבונים המוצגים על מולקולות MHC ברמה שאני שמוצגים בדרך כלל בתאי חיידק נגוע.
על מנתכדי להעריך את תפקיד תאי T לשחק בתגובה חיסונית, זה חיוני כי פונקציות מפעיל שלהם נמדדות על ידי טכניקות אמינות ורגישות. שיטות נפוצות להערכת תגובת תא T כוללות; MHC class-I/II/peptide תגובתיות tetramer; ייצור ציטוקינים על ידי ELISPOT ומכתים ציטוקינים תאיים; והורג את הקיבולת על ידי 51 מבחני Cr-שחרורו. מבחני אלה, לעומת זאת, מבוצעים בדרך כלל ex vivo עם גירוי במבחנה, או לספק תובנה מוגבלת לתפקוד תא T. באופן אידיאלי, כאשר מודדים תגובות תא T זה יהיה מועיל להעריך אותם באתרו, in vivo כפי שהם מתרחשים, ללא מניפולציה של תאי T כדי למנוע שינויים בפרמטרים תפקודיים שעלולים להתרחש באמצעות גירוי במבחנה. חלק הנפוץ ביותר במבחני תא T vivo פונקציונליים מבוססים על מדידת הרג CTL בתיווך של תאי היעד פעמו עם פפטידים אני מחייב כיתת MHC, המנויים בvivoבאמצעות זיהוי שלהם באמצעות תיוג ניאון עם צבעים חיוניים כגון CFSE. בעוד סוגים אלה של מבחני יכולים לפקח על הרג CTL בתיווך של מטרות כשהם קורים in vivo, יש להם יכולת מוגבלת יחסית להעריך הריגתם של מטרות מרובות הצגת ריכוזים שונים וסוגים שונים של אפיטופים פפטיד, אשר נדרש כדי לאפשר לפרמטרים איכותיים כגון בעבר להיטות כפונקציונלית וריאנט epitope תגובתיות צולבת להיות מוערכת. מבחני אלה גם אינם מספקים שום מידע על תגובות תא בתיווך מסוג CD4 + T.
כדי להתגבר על רב מהמגבלות עם שיטות הנוכחיות שימשו להערכת תגובות תא T, שפתחנו לאחרונה זמנית assay המבוסס על מערכי ניאון יעד (FTAs), המאפשר הניטור של תגובות תא T נגד> 250 תאי המטרה בו זמנית בחיה אחת על ידי cytometry זרימת 1, 2. FTAs מורכב של לימפוציטים שכותרתו עם sevריכוזי eral ושילובים של צבעים חיוניים כמו CFSE, CTV ועלות לכל יום ומאפשרים> 250 צבירי תאים של הקרינה ייחודית להיות שנוצרו. מכיוון שהתאים אלה נשארים קיימא ומתפקד באופן מלא, הם יכולים להיות מוזרקים לבעלי חיים כדי לאפשר ניטור של האינטראקציה שלהם עם תאי T מפעיל in vivo 3. לדוגמא, יכולים להיות פעמו צבירי תאי FTA עם פפטידים אני מחייב ברמה MHC כדי לאפשר הערכה של הרג CTL בתיווך אנטיגן הספציפי של תאי יעד 1. בנוסף, יכולים להיות גם פעמו צבירי תאי FTA עם פפטידים MHC ברמה השנייה מחייבים, המאפשרים הערכה של תא T מסייע אנטיגן ספציפי לפעילות (T H) על ידי הערכת הפעלה (על ידי הערכה של סמני הפעלה כגון CD69, CD44 ו / או CD62L) של תאי B בתוך FTA נושאים פפטיד מאותו המקור 2. מאז ניתן לאתר יותר מ -250 מטרות בו זמנית, ניתן למדוד תגובות CTL וT H נגד צבירי תאים רבים יעד פעמו עם nפפטידים umerous בריכוזים שונים וההכללה של משכפל רבים. Assay FTA לכן מספק רמה חסרת תקדים של הערכת תגובת מפעיל תא T in vivo.
כאן אנו מתארים בפירוט את הבנייה של FTA ולהראות עד כמה הם יכולים להיות מיושמים להערכת תגובות תא T in vivo. הנוהל מתאר את בניית FTA המורכב מ252 צבירי תאים ניתן להבחין באמצעות השימוש בשלושה צבעים חיוניים, מורכבים 6 חזרות של 42 צבירי תאים פעמו עם MHC ברמה שאני ופפטידים השני מחייבים. התיוג של 42 צבירי תאים מתרחש ב10 חרוטי מיליליטר עם תחתית צינורות וזה עוזר להוציא אלה במעמד צינור כמתואר בטבלה 1. שיטה זו יכולה להיות מותאמת למספרים קטנים יותר של אשכולות להבחין כפי שנדרשה על ידי הפחתת הכמות של תיוג של כל צבע שבוצע 1.
אנו מדגישים את התועלת של assay על ידי מראה איך זה יכול למדוד responses שנוצר על ידי חיסון אבעבועות וירוס רקומביננטי נגד אפיטופים מרובים במדגם קטן של עכברים. זה מראה כיצד assay FTA יכול לשמש כדי למדוד את התגובות מצטברות ולהיטות פונקציונלית דרך, בהתאמה, את השימוש בשטח תחת עקומת הערכות (AUC) ומדידת ריכוז הפפטיד יעיל נדרש ליצור תגובות מחצית מקסימליים (50 EC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: עכברים המשמשים תחת פרוטוקול זה טופלו על פי ההנחיות של ועדת האתיקה לניסויים בבע"ח האוניברסיטה הלאומית של אוסטרליה והעכברים מורדמים על ידי נקע בצוואר הרחם.
1. דיי ופפטיד הכנה
- הכנה דיי
הערה: צבעים הם prediluted בריכוזים שונים כדי לאפשר תיוג של תאים בעוצמות הקרינה בדידות. CFSE משמש בשבעה ריכוזים נעשו באמצעות דילולים סדרה 3.5 פי, וCTV ועלות לכל יום נמצאים בשימוש בשישה ריכוזים שונים נעשו באמצעות דילולים סדרה 3.7 פי (ראה לוחות 2-4). ריכוזי המניות של צבעים המופיעים בלוחות 2-4 ישמשו לתייג תאי יעד בריכוזי הצבע הסופיים מופיעים בלוחות 2-4. צבעים מגיבים בחשיפה לתמיסה מימית. לכן חשוב שבקבוקונים להיות equilibrated לRT לפני הפתיחה כדי לצמצם את החשיפה של צבעים לעיבוי.- CFSE
הערה: CFSE נרכש כsuccinimidyl אסתר diacetate carboxyfluorescein (CFDA, SE; MW 557.47), בדרך כלל ב25 מ"ג / בקבוקון.- Resuspend 25 מ"ג CFSE ב4.48 מיליליטר DMSO להשיג פתרון מניות 10 מ"מ.
- סדרתי לדלל CFSE: הוסף 35 μl של 10 מניית CFSE מ"מ ל87.5 μl של DMSO ולחזור על זה עם פתרון מניות מדולל לתת לכל ריכוז לצבוע בטבלה 3.
- CTV
הערה: CTV נרכש בדרך כלל באריזות של 9 מבחנות, כל אחת מהן ניתן מחדש עם 10 μl של DMSO לייצר פתרון 10 מ"מ של הצבע.- מחדש וברכה כל 9 הבקבוקונים של CTV עם 90 μl של DMSO לתת פתרון 10 מ"מ.
- סדרתי לדלל CTV: הוסף 11 μl של 10 מניית מ"מ CTV ל29.7 μl של DMSO ולחזור על זה עם פתרון מניות מדולל לתת לכל ריכוז לצבוע בטבלה 2.
- CPD
הערה: עלות לכל יום (MW 792.6) אופייניתly נרכש כ0.5 מ"ג / בקבוקון.- מ"ג resuspend 0.5 של CPD ב63 מיליליטר של DMSO לקבל פתרון 10 מ"מ.
- סדרתי לדלל CPD: הוסף 11 μl של 10 מניית CPD מ"מ ל29.7 μl של DMSO ולחזור על זה עם פתרון מניות מדולל לתת לכל ריכוז לצבוע בטבלה 4.
הערה: ניתן לאחסן מניות דיי ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים ויכולות להיות מופשרת ומקפיא כמה פעמים ללא איבוד משמעותי בתפקוד.
- CFSE
- הכנת פפטיד
הערה: פפטידים MHC ברמה שאני מחייב משמשים בדרך כלל לדופק תאי יעד ב6 ריכוזים שונים נעשה באמצעות 10 דילולים קיפול מריכוז התחלתי של 1 מיקרומטר (לוח 5). פפטידים השני מחייבים כיתת MHC משמשים בדרך כלל לדופק תאי יעד ב6 ריכוזים שונים נעשה באמצעות 3 דילולים קיפול מריכוז התחלתי של 400 מיקרומטר (לוח 5). כל פפטיד מורכב בריכוז סופי 2x בtha כגון PBSיש לא כל ריכוז הפפטיד היקף מינימאלי של 250 μl. ניתן להכין מניות פפטיד לפני בניית FTA ומאוחסנות ב -20 ° C, ללא אובדן משמעותי בתפקוד.- פפטידים מניית הכנת MHC ברמה שאני מחייב
- הכן את הריכוז הגבוה ביותר של כל epitope פפטיד ל2 פתרונות מניות מיקרומטר (2x 1 מיקרומטר)
- סדרתי לדלל פפטידים אני מחייב ברמה MHC: להוסיף 44.4 μl של 2 מניות פתרון פפטיד מיקרומטר ל400 μl של PBS. חזור על פעולה זו עם פתרון מניות מדולל לתת לכל ריכוז הפפטיד בטבלה 5.
- פפטידים מניית הכנת MHC ברמה השנייה מחייבים
- הכן את הריכוז הגבוה ביותר של כל epitope פפטיד ל800 מיקרומטר פתרונות מניות (2x 400 מיקרומטר).
- סדרתי לדלל פפטידים ברמה השנייה מחייבים MHC: להוסיף 150 μl של 800 פתרון פפטיד מיקרומטר ל300 μl של PBS. חזור על פעולה זו עם פתרון מניות מדולל לתת לכל ריכוז הפפטיד בטבלה 5
2. FTA הכנה
הערה: ההליך שלהלן מתאר את הקמתו של אזור סחר חופשי המורכב מתאים פעמו עם 7 אפיטופים פפטיד שונים ב6 ריכוזים שונים (כלומר 42 צבירי תאים.) חוזרים 6 פעמים כדי ליצור 252 צבירי תאים להבחין. בתוך כל חוזר, אשכול תאים לא פעמו עם כל epitope (ניל), נכלל כביקורת. זה מועיל עבור FTAs יש הבדל allotype CD45 מבעלי החיים מארח כדי לאפשר האפליה שלהם מתאי נמען על ידי תיוג נוגדן בזמן הניתוח. אחרת יכול להיות מתויג FTAs עם צבעים אחרים כגון PKH-26 למטרה זו (שמתוארת בשלב 2.6). בדרך כלל, הליך הכנת FTA מתבצע מתחילתו ועד סופו בישיבה אחת.
- תווית 42, 10 חרוטי מיליליטר עם תחתית צינורות פלסטיק 1-42 (כמו בטבלה המס '1 לדוגמא).
- הכנת תאים
- לבודד טחול ו / או lymphnodes מעכברים. הכן את ההשעיה תא בודדת מרקמות על ידי רסוק דרך 70 מיקרומטר התעמק מסננת עם בוכנת מזרק 5 מ"ל ולספור תאים באמצעות hemocytometer.
- Resuspend ימפוציטים בעד 200 x 10 6 תאים / מיליליטר ב11.5 מיליליטר של רוצ'סטר פרק זיכרון מכון 1640 (RPMI, או שווה ערך) המכיל 5% בסרום עוברי עגל (FCS). הערה: חשוב להשתמש חיץ עם תוכן אמין גבוה כדי למזער את רעילות צבע לתאים 3.
- תיוג CTV
הערה: תאים תחילה מסומנים עם 6 ריכוזים של CTV.- יסודיות resuspend התאים על ידי צינור היפוך כמה פעמים. הוספת 1.9 מיליליטר של השעיה תא עד 6 מתוך 10 מיליליטר הצינורות שכותרתו 37-42, נזהרת שלא להרטיב את המחצית העליונה של החצוצרות.
- תווית תאים עם CTV, להסיר את כובע הצינור ולהניח את הצינור בצורה אופקית.
- הוספת 83 μl של PBS לחלק הלא הרטוב בחלקו העליון של הצינור, וזה מוסיף 17 μl של המניה CTV (ראה Table 2 שעבורה פתרון מניות מוקצה שלצינור). הערה: צינור רטוב שאינו חשוב כדי למנוע תנועת השעיה תא וערבוב המוקדם של פתרון התא עם פתרון הצבע.
- שווי הצינור ולערבב את ההשעיה התא עם הצבע במהירות וביסודיות על ידי vortexing.
- חזור על שלבי 2.3.2-2.3.4 עבור מניית הפתרונות של CTV בצינורות המיועדים המתוארים בטבלה 2.
- דגירה תאים למשך התקופה מינימאלית של 5 דקות ב RT (20 מעלות צלזיוס).
- תיוג CFSE
- לאחר תיוג CTV, מוסיף 5 מיליליטר של RPMI FCS המכיל 5% לכל צינור וresuspend ביסודיות את התאים על ידי vortexing.
- מצינור 37 העברה 1 מיליליטר של השעיה תא לצינורות ביום 31 ב, 25, 19, 13, 7 ו 1.
- מצינור 38 העברה 1 מיליליטר של השעיה תא צינורות 32, 26, 20, 14, 8, ו -2.
- מצינור 39 העברה 1 מיליליטר של השעיה תא צינורות 33, 27, 21, 15, 9, ו -3.
- ממיליליטר צינור 40 העברה 1 של תאהשעיה לצינורות 34, 28, 22, 16, 10, ו -4.
- מצינור 41 העברה 1 מיליליטר של השעיה תא צינורות 35, 29, 23, 17, 11, ו -5.
- מצינור 42 העברה 1 מיליליטר של השעיה תא לצינורות 36, 30, 24, 18, 12, ו6
שים לב: יש להיזהר שלא להרטיב את המחצית העליונה של הצינורות במהלך שלבי 2.4.1.1-2.4.1.6.
- תווית תאים עם CFSE, להסיר את כובע הצינור ולהניח את הצינור בצורה אופקית.
- הוספת 103 מיליליטר של PBS לחלק הלא הרטוב בחלקו העליון של הצינור, וזה יוסיף 7 מיליליטר של CFSE המניות (ראה טבלה 3 שעבורה פתרון מניות מוקצה שלצינור).
- שווי הצינור ולערבב את ההשעיה התא עם הצבע במהירות וביסודיות על ידי vortexing.
- האם צעדי 2.4.2-2.4.4 עבור מניית הפתרונות של CFSE בצינורות המיועדים המתוארים בלוח 3.
- דגירה תאים למשך התקופה מינימאלית של 5 דקות ב RT (20 מעלות צלזיוס).
- שטוף תאים: לדלל השעיה תא עם 9 מיליליטר של 20 ° CFCS 5% המכיל RPMI, משקעים ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס ולהסיר supernatants על ידי שאיפה עם טפטפת העברה.
- לאחר תיוג CTV, מוסיף 5 מיליליטר של RPMI FCS המכיל 5% לכל צינור וresuspend ביסודיות את התאים על ידי vortexing.
- פועם פפטיד ושטיפת תא
הערה: לאחר התאים סומנו בתווית עם CTV וCFSE, הם פעמו עם MHC מעמד אני ו / או MHC ברמה השני פפטידים מחייבים (שהוכנו ב1.2). אחת מאוכלוסיות התאים חייב גם לא פעמה עם פפטיד (למשל. Nil בטבלה 1) ושימש כביקורת שלילית לחישוב של תגובות תא T.- פועם פפטיד
- תאי resuspend בהיקף כולל של 250 μl של RPMI FCS המכיל 5%. הערה: בדרך כלל 50 μl של השעיה תא נשאר לאחר השאיפה של supernatant בסוף הצעד 2.4.7, ולכן להוסיף 200 μl של מדיום לתא גלולה.
- הוסף 250 μl של מניות פפטיד מראש מוכנות (כמו בלוח 5) לייעודיים כראוי צינורות (כמו בטבלה המס '1) ולהיות סורדואר לכלול צינור שליטה של PBS הוסיף לבד בלי פפטיד כביקורת Nil.
- מערבבים השעיות תא עם מערבולת. שים לב: זה קריטי, כי כל epitope פפטיד וכל ריכוז הפפטיד מוקצה לצינור ויחיד זה שנרשם באופן ברור המבוסס על הקרינה הצפויה של התאים בצינור זה, שכן חתימת הקרינה של אשכול זה תגדיר הפפטיד הזה (כמו בטבלה 1 לדוגמא).
- דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- שטיפת תא
- הוסף 5 מיליליטר של קרח קר (4 ° C) RPMI FCS המכיל 5% עד ההשעיה התא ותאי resuspend ידי היפוך צינור. בזהירות ביסוד ההשעיה התא עם 3 מיליליטר של קרח קר (4 ° C) FCS.
- משקעי התאים על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C. השתמש בהאצה ובלימה איטיות כדי להבטיח את הממשק של FCS ונשמר פתרון ההשעיה תא.
- בזהירות לשאוב את RPMI ולאחר מכןFCS עם טפטפת העברה, עוזב את כדורי תא נשטפו באין מפריע. שים לב: השימוש ביסוד FCS לשטוף תאים מסייע להבטיח כמה שפתרון פפטיד הוא להסיר את התאים ככל האפשר ובכך מגביל את החשיפה של אוכלוסיות תאים לפפטידים חופשיים מרובים כאשר תאים הם אספו.
- שטוף תאים שוב: Resuspend כדורי התא ב10 מיליליטר של 4 מעלות צלזיוס RPMI FCS המכיל 5%. משקעי התאים על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C. יוצקים את supernatants.
- בריכת כל אוכלוסיות התאים יחד לצינור אחד עם טפטפת באמצעות 6 מיליליטר של 4 מעלות צלזיוס RPMI FCS המכיל 5%. משקעים ונקווה תאים על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C. לשאוב את supernatant עם טפטפת העברה.
- פועם פפטיד
- תיוג תא CPD
הערה: בשלב זה יכול להיות שנוצר שישה משכפל assay התוך ידי תאים פעמו פפטיד תיוג עם 6 ריכוזים שונים של CPD.- הוספת 11.4 מיליליטר של 20 ° CRPMI FCS המכיל 5% לגלולה נקוותה סלולרי ו resuspend באמצעות פיפטה ביסודיות.
- הוספת 1.9 מיליליטר של השעיה תא 6, 10 מיליליטר צינורות שכותרתו AF, נזהרת שלא להרטיב את המחצית העליונה של החצוצרות.
- תווית תאים עם CPD, להסיר את כובע הצינור ולהניח את הצינור בצורה אופקית.
- הוספת 92 μl של PBS לחלק הלא הרטוב בחלקו העליון של הצינור, וזה מוסיף CPD מניות (ראה טבלה 4 לכמות של פתרון מניות שהוקצתה לכל צינור).
- שווי הצינור ולערבב את ההשעיה התא עם הצבע במהירות וביסודיות על ידי vortexing.
- . האם צעדי 2.6.3-2.6.5 עבור מניית הפתרונות של CPD בצינורות המיועדים המתוארים בטבלה 4 הערה: שלא כמו CFSE וCTV, ריכוז תיוג CPD הוא לא בדיוק ליניארי הקשורים לעוצמת הקרינה כתוצאה של תאים שכותרתו, ו כך ריכוז התיוג נעשה שימוש כדי להשיג פסגות ניאון במרחק שווה מכמה אוכלוסיות שכותרתו היהנקבע באופן אמפירי (ראה טבלה 4).
- דגירה תאים למשך התקופה מינימאלית של 5 דקות ב RT (20 מעלות צלזיוס).
- שטוף תאים פעמיים: תאי Resuspend ל10 מיליליטר עם 20 ° C RPMI FCS המכיל 5%. משקעי התאים על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 20 ° C. לשאוב את supernatant עם טפטפת העברה. חזור על פעולה.
- בריכה כל התאים יחד לתוך צינור יחיד באמצעות 8 מיליליטר 4 RPMI C ° FCS המכיל 5% עם טפטפת. משקעים ונקווה תאים על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C ולשאוב את supernatant עם טפטפת העברה.
- תיוג תא (אופציונאלי) PKH-26
הערה: אם FTAs לא ניתן לבנות עם תאים המבטאים את הבדל allotypic CD45 לארח עכברים, הם יכולים להיות מתויגים עם PKH-26 לאפשר האפליה שלהם מתאי נמען.- הוספת 2.9 מיליליטר של 20 ° C PBS לתא גלולה ונקווה ו resuspend ביסודיות עם טפטפת.
- הוסף השעיה תא לשוםn רטוב 10 צינור מיליליטר, נזהר שלא להרטיב את החלק העליון של הצינור.
- הסר את מכסה השפופרת ולהניח את הצינור בצורה אופקית.
- הוספת 58 μl של C diluent (בערכת הצבע PKH-26) לחלק הלא הרטוב בחלקו העליון של הצינור, וזה מוסיף 42 μl של מניית 1 מ"מ PKH-26.
- שווי הצינור ומערבבים פתרון תא עם הצבע באופן יסודי על ידי vortexing.
- דגירה תאים למשך התקופה מינימאלית של 10 דקות ב RT (20 מעלות צלזיוס).
- שטוף תאים פעמיים: תאי Resuspend ל10 מיליליטר עם 20 ° C RPMI FCS המכיל 5%. משקעי התאים על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 20 ° C. לשאוב את supernatant עם טפטפת העברה. חזור על פעולה.
- הזרקת FTAs לבעלי חיים מארח
הערה: כדי למדוד את תגובות תא T in vivo, FTAs מוזרקים לתוך בעלי חיים שיש להם תגובה חיסונית פעילה והשאירו באתר עד 24 שעה. זה קריטי, כי FTAs גם מוזרקים לתוך בעלי חיים תמימים כביקורת שלילית.- רוזן ו resuspend תאים ב2.5 x 10 8 תאים למ"ל ב-PBS. הזרק 200 μl של תאים דרך הווריד לעכברים מארח, לרבות בעלי חיים תמימים כביקורת.
3. Cytometry הזרימה
- 18-24 שעות לאחר הזרקת דם FTA קציר או טחול (או רקמות אחרות של עניין) מעכברים מארחים.
- הכן את ההשעיה תא בודדת מרקמות על ידי רסוק דרך 70 מיקרומטר התעמק מסננת עם בוכנת מזרק 5 מיליליטר.
- Resuspend תאים במהירות של עד 65 x 10 6 תאים / מיליליטר PBS המכיל BSA .0.1%.
- לוותר 100 aliquots μl של השעיה תא לתוך בארות של צלחת microtitre לתיוג נוגדן.
- תאי תווית עם נוגדני fluorochrome כותרת ובדיקות כדאיות ניאון עם הקרינה ספקטרלית תואמת לCFSE, CTV ועלות לכל היום. הערה: נוגדנים ל-B סמני תא כגון B220 וסמני הפעלה כגון CD69 חיוניים למדוד הפעלת תא B אם באמצעות FTכדי למדוד את תגובות תא T H 2. כולל נוגדן לCD45.1 ו / או CD45.2 אם יש לי FTAs ועכברי מארח הבדל allotypic CD45.
- הוספה של פתרון 2x המניה של צבעי נוגדנים / כדאיות 100 μl (PBS המכיל BSA 0.1%) ל100 aliquots μl של תאים, ומערבב היטב ולדגור על קרח (4 מעלות צלזיוס) במשך 30 דקות.
- שטוף תאים: תאי משקעים ידי צנטריפוגה XG 300 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר supernatant. Resuspend תאים ב200 μl של PBS המכיל BSA 0.1%, תאי משקעים ידי צנטריפוגה XG 300 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר supernatant.
- תאי resuspend בהיקף כולל של 400 μl של PBS המכיל BSA 0.1%, תאי סינון דרך רשת 70 מיקרומטר ולנתח ידי cytometry זרימה בזרימה cytometer מסוגל לאתר צבעי ניאון הרלוונטיים וconjugates. לאסוף עד 3 x 10 6 אירועי הלימפוציטים על מנת לפתור כל אשכול תא FTA ולהשיג מספיק תאים לstatistiניתוח קאל. הערה: ודא כי כל הפקדים הטיפוסיים (כגון פקדים צבעוניים יחיד) עבור cytometry זרימה הם מועסקים. בדרך כלל, CFSE דורש עירור ממקור כחול לייזר (בדרך כלל ב488 ננומטר) וזיהוי עם מסננים לעבור להקה במרכז מעל 520 ננומטר; CTV דורש עירור ממקור סגול לייזר (בדרך כלל ב405 ננומטר) וזיהוי עם מסננים לעבור להקה במרכז מעל 450 ננומטר; וCPD דורש עירור ממקור לייזר אדום (ננומטר בדרך כלל ב633 או 640 ננומטר) וזיהוי עם מסננים לעבור להקה במרכז מעל 670 ננומטר.
4. ניתוח נתונים
- ניתוח cytometry זרימת הנתונים באמצעות תוכנת cytometry הזרימה סטנדרטית (ראה תוצאת נציג לדוגמא לסוג של אסטרטגית gating המועסק).
- ל% הרג ספציפי, לחשב את מספר התאים בכל אשכול תא FTA פעמו עם פפטידים אני מחייב ברמה MHC ואשכולות FTA שלא פעמו פפטיד ("אפס") ושימוש בנוסחה הבאה לחישוב% הריגה ספציפית.
% הריגה ספציפית
הערה: בנוסחא לעיל "דרוכה" מתייחסת למטרות מבעלי חיים שהם חשבו שיש תגובה חיסונית נגד פפטידים היעד, "נאיביים" מתייחס למטרות מבעלי חיים תמימים, "פפטיד" מתייחס למטרות פעמו עם פפטידים ו" אפסי " מתייחס למטרות לא פעמו עם כל פפטידים. - להפעלת תא B כמדד לפעילות H T, לחשב את עוצמת הקרינה הממוצעת הגיאומטרית (GMFI) של הקרינה נוגדן CD69 על FTA תאי B פעמו עם פפטידים MHC ברמה השנייה מחייבים בבעלי חיים "דרוכים" ומתוך זה להחסיר GMFI של ביטוי CD69 על תאי B FTA המקבילים בבעלי חיים "נאיביים" לתת מידה של פעילות H T.
- מהסטטיסטיקה שנוצרה בשלבי 4.2 ו4.3, שימושניתן למצוא את תוכנת גיליון אלקטרוני מתמטית כגון GraphPad פריזמה לחישוב פרמטרים כמותיים ואיכותיים אחרים, כגון אזור תחת עקומה ו50 EC (בעומק תיאור של איך חישובים אלה מבוצעים עבור AUC ב
http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, ולEC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדוגמא לשימוש של assay FTA, עכבר BALB / ג היה חוסן בנגיף רקומביננטי vaccinia (VV) להביע HIV-אני אפיטופים (VV-HIV) ותגובות לאפיטופים HIV-CTL, Gag, mut איסור הפרסום, Env ופול, VV CTL אפיטופים F2L וmut F2L, וepitope HIV-T H התא, Gag ה (כפי שמתואר ב2) הוערכו באמצעות assay FTA 252 פרמטר (איור 1). גרסאות Epitope של Gag (mut איסור פרסום) וF2L (mut F2L) אינן באות לידי ביטוי בוקטור VV-HIV ולכן תגובות נגד אפיטופים אלה הן שיקוף של תגובות תא T תגובתי צלב גרסת אפיטופ. עכברים נאיביים גם הוזרקו FTA כביקורת שלילית. FTA שהופל מתאי עכבר מארח ידי PKH-26 תיוג וFTA תאי B מופלה על ידי מכתים נוגדן B220 באמצעות cytometry זרימה (איורים 1 א ו 1 ב '). כל אחד 6 חזרות בעלי החיים התוך היה מגודרת המבוססת על הקרינה CPD (איור 1 ג (1D איור). % הרג ספציפי של כל לשכפל הוערך באמצעות השוואת המוות של תאי אשכול FTA בבעלי חיים דרוכים ביחס למקביל אשכולות FTA בבעלי חיים תמימים (איור 1D). פעילות H T הוערכה באמצעות השוואת upregulation תא FTA ב 'של CD69 בבעלי חיים דרוכים ביחס למקביל צבירי תאי FTA B בבעלי חיים תמימים (איור 1E).
מניתוח זה, זיהום VV-HIV יצר תגובות CTL חזקות נגד F2L epitope VV immunodominant, עם של תאי יעד FTA פעמו עם 0.001 מ"מ או יותר של אפיטופ שהוצא מהטחול (איור 2 א) 100%. הייתה גם תגובה חזקה שנוצרה נגד בצורה וריאנט של F2L, mut F2L, עם של תאי יעד FTA פעמו עם 0.01 מ"מ או יותר של אפיטופ שהוצא מהטחול 100%. מאזmut F2L אינו קיים בנגיף מדביק, התגובה הזאת מצביעה על תגובה צולבת-reactive גרסת אפיטופ. הייתה גם תגובה מתונה יחסית שנוצרה נגד מטרות המבטאות את אפיטופ HIV Gag ותגובה תגובתי צלב קל נגד בצורה וריאנט של epitope זה, mut HIV איסור הפרסום. נראה שיש תגובות זניחות שנוצרו לאפיטופים HIV Pol ו-HIV Env CTL.
בנוסף לתגובות CTL, assay דוגמא FTA הראה גם נמדד תגובות H T על ידי הערכת הפעלה של FTA תא B המבטא את אפיטופ ברמה השנייה מחייב HIV MHC-HIV Gag ה (איור 2). זה הראה הפעלת תא אנטיגן הספציפית B התרחשה בחיות דרוכים מצביעים על דור של effectors תא T H-HIV Gag ה-הספציפית.
צעדים אלה של גודל תגובת תא T ניתן לסכם על ידי יצירת אזור תחת ערכי עקומה (AUC) עבור כל אחד מאפיטופים (איור 2C) מאה שsures הגודל המצטבר של התגובה.
בנוסף לגודל של תגובות צולבות-reactive ספציפיים וריאנט epitope אנטיגן, assay FTA מאפשר מדידות להיטות פונקציונליות להתבצע. למשל, ריכוזי הפפטיד היעילים בשימוש לדופק תאי יעד FTA נדרשו לתת תשובות מחצית מקסימליים (50 EC), מוצגים לeffectors CTL (איור 2 ד). זה הראה הלהיטות הפונקציונלית לmut אפיטופים F2L, HIV Gag וmut HIV איסור הפרסום, היו, כ 10, 100 ו4,000 קפל תחתון, בהתאמה, מאשר תגובות שנוצרו לF2L epitope VV הדומיננטי.
טבלה 1. פריסה של פריסה 252 פרמטר FTA. אופיינית של לשכפל של 252 FTA אחד מורכב מ42 דגימות / צינורות פעמו עם 7 אפיטופים פפטיד שונים ב6 בידולריכוזי t וכולל מדגם בלתי פעם (אפס). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| צינור מספר | נפח (μl) | מניית דיי (מ"מ CTV) | ריכוז סופי (מיקרומטר) |
| 37 | 0 | 0 | 0 |
| 38 | 17 | 0.053 | .451 |
| 39 | 17 | 0.197 | 1.48 |
| 40 | 17 | 0.73 | 6.21 |
| 41 | 17 | 2.7 | 23 |
| 42 | 17 | 10 | 85 |
טבלה 2. מניות CTV משמש תווית תאים. נפח של רשוםמניית CTV משמשת תווית תאים ב2 מיליליטר לתת ריכוז לצבוע תיוג הסופי.
| צינור מספר | נפח (μl) | מניית דיי (מ"מ CFSE) | ריכוז סופי (מיקרומטר) |
| 37-42 | 0 | 0 | 0 |
| 31-36 | 7 | 0.022 | 0.139 |
| 25-30 | 7 | 0.078 | 0.492 |
| 19-24 | 7 | 0.23 | 1.45 |
| 13-18 | 7 | 0.82 | 5.17 |
| 7-12 | 7 | 2.9 | 18.3 |
| 1 - 6 | 7 | 10 | 63.1 |
לוח 3. מניות CFSE משמש תווית תאים. נפח של מניית CFSE הרשוםed לתייג תאים ב1.11 מיליליטר לתת ריכוז לצבוע תיוג הסופי.
| צינור מספר | נפח (μl) | מניית דיי (מ"מ CPD) | ריכוז סופי (מיקרומטר) |
| 0 | 0 | 0 | |
| ב ' | 4 | 0.053 | 0.106 |
| C | 6.3 | 0.197 | 0.62 |
| D | 7.5 | 0.73 | 2.74 |
| E | 7.3 | 2.7 | 9.86 |
| F | 7.7 | 10 | 38.5 |
לוח 4. מניות CPD משמש תווית תאים. נפח של מניית CPD רשומה המשמשת לתאי תווית ב2 מיליליטר לתת labelin הסופיריכוז לצבוע גרם.
| ריכוז פפטיד (מיקרומטר) | |||||||
| פפטידים מחייב בכיתה אני MHC | 0 | 0.00002 | 0.0002 | 0.002 | 0.012 | 0.2 | 2 |
| פפטידים השני מחייבים כיתת MHC | 0 | 3.29 | 9.88 | 29.6 | 88.9 | 266 | 800 |
לוח 5. אני MHC רמה וריכוזי מניית הפפטיד השני מחייבות. ריכוזי המניה אופייניים 1 של אפיטופים פפטיד המשמשים לבניית FTA 1. ריכוזים אלה 2x הריכוזים הסופיים משמשים לדופק תאי יעד.
איור 1. זרימה אופיינית cytometry ניתוח FTAs. Splenocytes מעכברי BALB / ג שימשו לבניית פרמטר FTA 252 כפי שמתואר בטקסט. אשכולות FTA היו פעמו עם 6 ריכוזים (כפי שמופיעים בטבלה 5) של 7 אפיטופים נגיפיים שונים, ובם אפיטופים MHC ברמה שאני מחייב, F2L (SPYAAGYDL, וירוס vaccinia מוגבל ד L (אפיטופ VV)); mut F2L (SP G AAGYDL, גרסה של F2L), איסור הפרסום (AMQMLKETI, epitope HIV איסור הפרסום מוגבל ד K 4), mut Gag (AMQMLK D TI, גרסה של ה-HIV Gag 5), פול (VGPTPVNII, ד D epitope Pol-HIV מוגבל-6), מעטפה (RGPGRAFVTI, epitope D-מוגבל ד HIV env 7); וMHC ברמה השנייה מחייב פפטיד Gag T H (PVGEIYKRWIILGLN, epitope HIV איסור הפרסום מוגבל ד H-2 4). FTAs הוזרק IV. לעכבר BALB / ג שהיה נגוע intranasally (ב.) 6 ימים קודם לכן עם recombinant VV להביע אפיטופים HIV (VV-HIV חיה דרוכה,). FTA גם הוזרק לעכברים נאיביים כביקורת. לאחר 18 שעה in vivo, תאי FTA הווה בהשעיות splenocyte מעכברי מארח נותחו על ידי cytometry זרימה. אסטרטגיה) אופיינית מתקדמת gating כדי לזהות תאי FTA מראים שערים לימפוציטים, גופיות וPKH-26 + תאי FTA (זה גם מועיל חלקות 2D חלקות היסטוגרמה לפתור תאי חיים באמצעות צבע כדאיות כמו Hoechst 33258, לא מוצג). B) עלילת 3D מציגה את כל אשכולות FTA מעכבר מארח נאיבי. C) מראה הקרינה CPD FTA לציון כל אחד מבעלי החיים תוך 6 משכפל. ד ') מראים אחד של תא 6 התוך בעלי החיים FTA B משכפל הצגת סוגים וריכוזים של אפיטופים שונים מבעלי החיים התמימים ודרוכים. זה מראה את היעדרם של תאי FTA בדרוך בעלי החיים ביחס לבעלי החיים התמימים, חושף "אירועי הרג"על ידי הרג שמהווה את הבסיס של FTA הורג assay 1. E ניתוח היסטוגרמה) ביטוי תא FTA ב 'של CD69 סמן הפעלה בבעלי חיים דרוכים ביחס לנאיבי בעלי חיים, אשר מהווה את הבסיס של assay עוזר FTA T 2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. FTAs יאפשר המדידה של הגודל והלהיטות של תגובות תא T in vivo. פרמטר 252 FTA שימש להערכת תגובות תא T בעכברים נגועים בVV-HIV כמתואר באיור 1.)% הרג מסוים חושב לכל אפיטופים CTL ותוצאות מכל אחת מ6 מחדשplicates מוצג (פנל משמאל), כמו גם אמצעים וסטיית התקן של אמצעי (פנל מימין) מוצג. ב ') תגובת H T הוערך על ידי מדידת הפעלה של FTA תא B מציג epitope HIV Gag ה לכל אחד 6 חזרות בעלי החיים התוך ( פנל משמאל) ואמצעים וסטיית התקן של אמצעי (פנל מימין) מחושב. C) מדידות AUC ל% הרג ספציפי (א) ותגובות T מסייע (ב) חושבה כמדד לעצמה מצטברת. ד) EC 50 מדידות חושבו לנתונים הרג ספציפיים% (א) כמדד ללהיטות פונקציונלית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היתרון של מבחני מבוססי FTA הוא שהם מאפשרים אפליה מ> 250 אוכלוסיות תאי יעד קיימא ומתפקד באופן מלא מבעלי חי מארח אחד על ידי cytometry זרימה. זה מספק רמת המורכבות לin vivo מבחני מבוססים cytometry זרימה שלא היו אפשרי בעבר. זה מודגש בניסויים בבעלי החיים 2 הראו לעיל, שבו תגובות ל7 אפיטופים נגיפיים מובחנים בשעה 6 בריכוזים יכולים להיות במעקב במשכפל של 6 בו זמנית בחיה אחת המאפשרת פרמטרים כגון AUC ו50 EC שייקבעו לתגובות תא T in vivo .
בנוסף למדידת תגובות תא T in vivo, ניתן לשנות את מבחני מבוססי FTA כדי למדוד את תגובות במבחנה 1. זה בעצם כרוך הוספת FTAs לתאי T בתרבות כדי למדוד תגובות על פני כמה שעות במבחנה. מגבלה אפשרית אחד למבחנים מבוססי מבחנה בבאמצעות FTAs היא לאהוא הנטייה של תאי שכותרתו בתוך FTA להעביר את הצבע לסימון תאים המקיפים את 1, 3. זה יכול לגרום לירידה ברזולוציה של צבירי תאי FTA כקרינה שלהם הופכת להיות פחות ברורה בין כל אוכלוסייה. זה ברור יותר במבחני חוץ גופייה בהשוואה למבחני in vivo, כי התאים נמצאים בסמיכות לפרקי זמן הארוכים יותר במבחני חוץ גופייה. הפסד ברזולוציה של אוכלוסיות תאי FTA זה יכול להיות ממוזער במבחני חוץ גופייה על ידי צמצום זמן התרבות של FTAs עם תאי T מפעיל ובאמצעות FTAs שיש להם פחות אוכלוסיות תאי יעד שיש להם כמות גדולה יותר של "מרחב ניאון" ביניהם כל כך יש שהעברת הצבע פחות השפעה.
גם רשמנו לפנינו את ההפסד ברזולוציה של אוכלוסיות תאי FTA כאשר FTAs הונח in vivo ל48 1 שעות. זה נראה כתוצאה של יעד תאי B בתוך prolife FTAדירוג וכך להפחית את עוצמת הקרינה צבע. זה עשוי תוצאה של תאי B מציגים אנטיגן מאותו המקור למפעיל אנטיגן הספציפי CD4 + T תאים שהביאו לגירוי תא B. לכן, מומלץ שassay להיות מוגבל ~ 24 שעות או פחות כאשר מטרות תא B נמצאים במעקב.
היכולת לתייג צבירי תאים מרובים (> 96) ייחודיים fluorescently כבר דיווחה על שימוש בעבר תאים שאינם ברי קיימא קבוע 8. הצביעה של תאי חיים, לעומת זאת, הייתה בעייתית יותר עם הזמינות של צבעים חיוניים תואמים, ורק 8-12 אשכולות תאי קיימא הושגו בעבר 9. היכולת ליצור> 250 תאי קיימא ופועלים באופן ייחודי שכותרתו fluorescently דיווחו כאן, מסתמכת על המאפיינים של צבעים חיוניים כמו CFSE. כמה מצבעים אלה, כגון CTV ועלות לכל יום, הפכו זמין רק לאחרונה. יש צבעים אלה מאפיינים של להיות מסוגליםתיוג תאים עם עוצמת הקרינה גבוהה, כי הוא חי זמן רב ושל שונות נמוכות 3. מאפיינים אלה בשילוב עם העובדה כי קיים קשר לינארי (במיוחד במקרה של CFSE וCTV) בין הריכוז של הצבע המשמש לסימון ואת עוצמת הקרינה של התאים שכותרתו, משמעות הדבר היא שיכולים להיות מתויגים תאים עם מספר (עד 7 מוצגות כאן בעוצמות) של כל צבע שניתן להבחין בקלות על ידי cytometry זרימה. יתר על כן, מאז פליטת הקרינה של CFSE, יש עלות לכל יום וCTV חפיפה ספקטרלית מינימאלית, הם יכולים לשמש בשילוב תווית תאים, ובכך מאפשרים ל> 250 חתימות תא ניאון כדי להיות מזוהות על ידי cytometry זרימה. יש לציין כי על מנת להשיג את התיוג של תאים עם מספר כזה של חתימות ניאון להבחין, חשוב שתיוג תא מתבצע במהירות 10, 11 (כדי ליצור שונות הקרינה נמוכות) ובמאגר מתאים המכילאמינים חופשיים 3 (למאגר רעילות צבע אשר אחרת יכול להתרחש עם צבעים אלה בריכוזים גבוהים). זה גם קריטי, כי במהלך הרכישה של FTAs ידי cytometry זרימה כי תנודות שגויות בקרינת אירוע נמצאים תחת פיקוח (לדוגמא על ידי מדידת CFSE, CTV ו / או עוצמת הקרינה CPD לאורך זמן). זה חשוב כי כזה תנודות בקרינת אירוע המגיעות למכונה הציגו שגיאות עלולות לגרום לפירוש לא נכון של מיצוב אשכול תא היעד נכון, כי בתורו יכול לגרום לשגיאות בצעדים הסופיים של פונקצית מפעיל תא T. זרימה כזו cytometer שגיאות הציגו יכולה להיות מוגבלת על ידי הבטחת דגימות באיכות גבוהה מוכנות (במיוחד בשים לב לסינון תאים דרך רשת 70 מיקרומטר כדי למזער את חסימה של קווי fluidic בזרימת cytometer ידי אגרגטים תא גדולים) ושcytometer הזרימה נשמרת ל סטנדרטי. גבוה
מדידה של תגובות תא T in vivoשבוצע במשך שנים רבות שימוש בצבעים חיוניים כגון CFSE לפקח מות תאי יעד in vivo 12. בדרך כלל מבחני אלה, עם זאת, היו מסוגלים ניטור עד 7-8 תאי יעד שונים בבת אחת 13 וכך מספקים קיבולת מוגבלת להעריך הריגתם של יעדים המבטאים ריכוזים מרובים של אפיטופים מרובים שנדרשו בדרך כלל כדי לייצר הערכה מפורטת של רק פרמטרים כגון הלהיטות התפקודית של תגובות תא T. במובן זה, ניתן להשתמש במבחנים דיסוציאציה tetramer לספק מידה של להיטות תא T מתאי T מפעיל מבודד טרי 14-16. טכניקה זו, לעומת זאת, מודדת את הלהיטות מחייבת MHC / TCR, וכך היא לא השתקפות מלאה של להיטות פונקציונלית, אשר יכול להיות תלויה גם בשינויים במבנה של הסינפסה החיסונית והמצב של רכיבי תא איתות T 17. לכן, באופן אידיאלי, להיטות פונקציונלית דורשת ניסויי מנת תגובה שיש לבצע. זההושג באמצעות טכניקות בעבר במבחנה כגון assay 51 Cr-השחרור, assay מכתים ציטוקינים תאיים 18, 19 או assay ELISPOT 20, 21. טכניקות אלה, עם זאת, לעתים קרובות דורשים תאי T מפעיל להיות מגורה במבחנה, אשר יכולה לשנות את הלהיטות התפקודית הכוללת של האוכלוסייה 22. מבחני FTA, ולכן, מציעים שיפור לעומת טכניקות קיימות, מדידה של תאי CD4 + ותא במינון תגובות CD8 + T באתרו, בזמן אמת נגד אפיטופים מרובים בו זמנית, וכן מתן תוספת רבת ערך לטכניקות קיימות כדי למדוד תא T פונקצית מפעיל. אנו צופים כי השימוש בטכנולוגית FTA עשוי להיות בעל ערך באסטרטגיות טיפול חיסוני הקרנה נועדו ליצור תגובות באיכות גבוהות תא T, כגון חיסונים המכוונים נגד ג HIV-1 וצהבת
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מענקים # 1010395 (CP BQ ו) ו# 525,431 (CR), ותכנית # גרנט 455,395 (CP) מהמועצה למחקר הבריאות והרפואה הלאומית של אוסטרליה, מרכז אוסטרלי לצהבת והאיידס וירולוגיה EOI 2012 מענק (CR וRJJ) ומענק מטעם קרן גורדון וגרטל רועת הדובים (BQ ו CR). ברצוננו להודות Harpreet Vohra ומיכאל Devoy לתחזוקה שלהם המעולה של המעבדה JCSMR FACS, המתקן האוסטרלי לחקר סרטן קרן Biomolecular המשאבים, JCSMR, ANU, לסינתזת פפטיד, וד"ר דוד בויל, מעבדות CSIRO לבריאות בעלי חיים, ילונג, אוסטרליה למתן מניות חיסון הורה ה-HIV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |
References
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
- Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
- Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
- Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
- Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
- Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
- Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
- Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
- Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
- Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
- Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
- von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
- Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
- Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).
