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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

L'uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte Published: June 19, 2014 doi: 10.3791/51627
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

Summary

La capacità di monitorare le risposte delle cellule T in dettaglio in vivo è importante per lo sviluppo della nostra comprensione della risposta immunitaria. Qui si descrive l'uso di array di destinazione fluorescenti (ALS) in un test in vivo di cellule T in che valuta> 250 parametri contemporaneamente mediante citometria a flusso.

Abstract

La capacità di monitorare le risposte delle cellule T in vivo è importante per lo sviluppo della nostra comprensione della risposta immunitaria e la progettazione di immunoterapie. Qui si descrive l'uso della tecnologia matrice di destinazione fluorescente (FTA), che utilizza coloranti vitali come ester carbossifluoresceina succinimidyl (CFSE), laser viola coloranti eccitabili (CellTrace Violet: CTV) e laser rosso coloranti eccitabili (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD ) per combinatorialmente linfociti del mouse etichette in> 250 distinguibili gruppi di cellule fluorescenti. Gruppi di cellule all'interno di questi ALS possono essere pulsate con maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I e MHC classe II-peptidi leganti e quindi agiscono come cellule bersaglio per CD8 + e CD4 +, rispettivamente. Queste cellule FTA rimangono vitali e pienamente funzionale, e possono quindi essere somministrati in topi per consentire la valutazione della CD8 + T uccisione cellulo-mediata delle cellule bersaglio FTA e CD4 + T hel cell-meditatap delle cellule bersaglio cellule FTA B in tempo reale in vivo mediante citometria a flusso. Da> 250 cellule bersaglio possono essere valutati in una volta, la tecnica consente di monitorare risposte delle cellule T contro diversi epitopi antigenici in diverse concentrazioni e in più replicati. Come tale, la tecnica può misurare le risposte delle cellule T sia un quantitativo (ad esempio la grandezza cumulativo della risposta) e qualitativa (ad es. Avidità funzionale e epitopo-cross reattività della risposta) livello. Qui, descriviamo come tali ALS sono costruiti e danno un esempio di come possono essere applicati per valutare le risposte delle cellule T indotta da un vaccino pox virus ricombinante.

Introduction

Cellule T svolgono un ruolo centrale nella risposta immunitaria adattativa e sono spesso mirati per la manipolazione in immunoterapia. Cellule T effettrici CD4 + rispondono ai antigene estraneo secernendo citochine che regolano molti aspetti di immunità e può anche aiutare direttamente le cellule B a produrre anticorpi. Cellule CD8 + T citotossici (CTL) possono anche rispondere alle antigene estraneo secernendo citochine, così come un ruolo centrale nella uccidere direttamente le cellule che esprimono un antigene estraneo. L'interazione fondamentale che avvia queste funzioni effettrici delle cellule T comporta l'interazione del recettore delle cellule T (TCR) con peptidi estere visualizzati su molecole MHC sulla superficie delle cellule. Cellule CD4 + T riconoscono peptidi visualizzati su molecole MHC di classe II sulle cellule presentanti l'antigene e cellule CD8 + T riconoscono peptidi visualizzati su molecole MHC di classe I che sono tipicamente visualizzati su cellule microbiche infetti.

Al finevalutare il ruolo delle cellule T svolgono in una risposta immunitaria, è essenziale che le loro funzioni effettrici sono misurati con tecniche affidabili e sensibili. Metodi comuni per la valutazione della risposta delle cellule T includono; MHC class-I/II/peptide tetramero reattività; produzione di citochine da ELISPOT e intracellulare di citochine colorazione; e la capacità di uccidere con 51 saggi Cr-rilascio. Questi saggi, però, vengono in genere eseguite ex vivo con la stimolazione in vitro, o forniscono informazioni limitate nella funzione delle cellule T. Idealmente, quando si misurano le risposte delle cellule T sarebbe utile per valutare in situ, in vivo in cui si verificano, senza manipolazione di cellule T in modo da evitare alterazioni dei parametri funzionali che possono verificarsi attraverso la stimolazione in vitro. Alcuni dei più comunemente usato in vivo di cellule T saggi funzionali sono basati sulla misurazione uccisione CTL mediata delle cellule bersaglio pulsate con MHC di classe I peptidi leganti, che vengono enumerati in vivotramite la loro individuazione attraverso l'etichettatura fluorescente con coloranti vitali come CFSE. Anche se questi tipi di test in grado di monitorare l'uccisione CTL mediata di obiettivi quando accadono in vivo, che hanno già avuto una capacità relativamente limitata di valutare uccisione di obiettivi multipli che presentano diverse concentrazioni e diversi tipi di epitopi peptidici, che è necessario per consentire parametri qualitativi quali avidity funzionale e la variante epitopi cross-reattività da valutare. Questi test inoltre non forniscono alcuna informazione sui cellulari mediate risposte T CD4 +.

Per superare molte delle limitazioni con metodi attualmente utilizzati per valutare le risposte delle cellule T, abbiamo recentemente sviluppato un saggio multiplex basato su array fluorescenti bersaglio (ALS), che permette il controllo delle risposte delle cellule T contro> 250 cellule bersaglio contemporaneamente in un animale da citometria a flusso 1, 2. Accordi di libero scambio sono costituiti da linfociti marcati con SEVLe concentrazioni rali e combinazioni di coloranti vitali come CFSE, CTV e CPD permettendo> 250 gruppi di cellule di fluorescenza unico da generare. Poiché queste cellule rimangono vitali e completamente funzionale, possono essere iniettati in animali per consentire il monitoraggio della loro interazione con le cellule T effettrici in vivo 3. Ad esempio, i gruppi di cellule FTA possono essere pulsate con peptidi MHC di classe I-binding per consentire la valutazione di antigene-specifica uccisione CTL mediata delle cellule bersaglio 1. Inoltre, i gruppi di cellule FTA possono essere pulsate con peptidi MHC di classe II-legame, che permetta di valutare antigene specifico per le cellule T helper (T H) L'attività valutando attivazione (mediante la valutazione dei marcatori di attivazione quali CD69, CD44 e / o CD62L) delle cellule B all'interno della zona di libero scambio recanti peptide cognate 2. Da più di 250 obiettivi possono essere rilevati simultaneamente, è possibile misurare le risposte CTL e T H contro molti gruppi di cellule bersaglio pulsate con npeptidi umerous a diverse concentrazioni e l'inclusione di molti replicati. Il test FTA prevede pertanto un livello senza precedenti di T effettrici delle cellule valutazione della risposta in vivo.

Qui si descrive in dettaglio la costruzione di un FTA e mostrare come possono essere applicati a valutare le risposte delle cellule T in vivo. La procedura descrive la costruzione di un FTA composto di 252 gruppi di cellule distinguibili attraverso l'uso di tre coloranti vitali, composti da 6 ripetizioni di 42 gruppi di cellule pulsate con MHC di classe I e II peptidi leganti. L'etichettatura dei 42 gruppi di cellule avviene in 10 ml a fondo conico tubi ed è utile per fissare questi fuori in un rack tubo, come indicato nella Tabella 1. Questo metodo può essere regolata per piccoli numeri di cluster distinguibili come richiesto riducendo la quantità di etichettatura di ciascun colorante eseguita 1.

Si evidenzia l'utilità del test, mostrando come si può misurare responses generati da ricombinante vaccinazione pox virus contro diversi epitopi in una piccola coorte di topi. Questo mostra come il test FTA può essere utilizzato per misurare le risposte cumulative e avidità funzionale attraverso, rispettivamente, l'uso di area sotto la curva (AUC) valutazioni e misurare la concentrazione di peptide efficace necessaria per generare risposte massime mezzo (EC 50).

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Protocol

Nota: I topi utilizzati ai sensi del presente protocollo sono state gestite secondo le linee guida della Australian National University Sperimentazione animale Comitato Etico e topi sono stati sacrificati per dislocazione cervicale.

1. Dye e Peptide Preparazione

  1. Preparazione Dye
    Nota: I coloranti sono prediluiti a diverse concentrazioni per permettere l'etichettatura delle cellule a intensità di fluorescenza discreti. CFSE viene utilizzato a sette concentrazioni effettuate attraverso diluizioni seriali 3.5-fold, e CTV e CPD sono utilizzati in sei diverse concentrazioni effettuate attraverso diluizioni seriali 3.7-fold (vedi tabelle 2-4). Le concentrazioni di stock di coloranti elencate nelle tabelle 2-4 saranno utilizzati per etichettare le cellule bersaglio alle concentrazioni di colorante finali elencate nelle tabelle 2-4. Coloranti reagiscono in seguito all'esposizione alla soluzione acquosa. È quindi importante che i flaconi essere equilibrati a RT prima dell'apertura per minimizzare l'esposizione di coloranti a condensazione.
    1. CFSE
      Nota: CFSE viene acquistato come carboxyfluorescein diacetato succinimidil estere (CFDA, SE; MW 557,47), in genere a 25 mg / flacone.
      1. Risospendere 25 mg di CFSE in 4.48 ml di DMSO per ottenere una soluzione stock 10 mM.
      2. Serie diluire CFSE: Aggiungere 35 ml di 10 mM CFSE magazzino in 87,5 ml di DMSO e ripetere questo con diluito soluzione stock di dare ad ogni concentrazione di colorante nella Tabella 3.
    2. CTV
      Nota: CTV è tipicamente acquistata in confezioni da 9 flaconcini, ognuno dei quali può essere ricostituito con 10 ml di DMSO per generare una soluzione 10 mM di colorante.
      1. Ricostituire e riunire tutti i 9 fiale di CTV con 90 ml di DMSO per dare una soluzione al 10 mm.
      2. Serie diluire CTV: Aggiungere 11 ml di 10 mM CTV magazzino in 29,7 ml di DMSO e ripetere questo con diluito soluzione stock di dare ad ogni concentrazione di colorante nella tabella 2.
    3. CPD
      Nota: CPD (792,6 MW) è tipicoly ha acquistato 0,5 mg / flacone.
      1. Risospendere 0,5 mg di CPD in 63 ml di DMSO per ottenere una soluzione di 10 mm.
      2. Serie diluire CPD: Aggiungere 11 ml di 10 mM CPD magazzino in 29,7 ml di DMSO e ripetere questo con diluito soluzione stock di dare ad ogni concentrazione di colorante in Tabella 4.
        Nota: scorte Dye possono essere conservati a -20 ° C per diversi mesi e possono essere scongelati e ricongelati più volte senza significativa perdita di funzione.
  2. Preparazione Peptide
    Nota: peptidi MHC classe I leganti sono generalmente utilizzati per impulsi cellule bersaglio a 6 concentrazioni differenti effettuate con 10 diluizioni da una concentrazione iniziale di 1 pM (Tabella 5). MHC di classe II-peptidi leganti sono generalmente utilizzati per impulsi cellule bersaglio a 6 concentrazioni differenti fatta utilizzando 3 diluizioni da una concentrazione iniziale di 400 pM (Tabella 5). Ogni peptide è effettuata a concentrazione finale 2x in PBS tale that ogni concentrazione peptide ha un volume minimo di 250 microlitri. Scorte peptidici possono essere preparati prima FTA costruzione e conservati a -20 ° C senza perdita significativa in funzione.
    1. Peptidi Preparazione magazzino MHC di classe I-binding
    2. Preparare la più alta concentrazione di ciascun epitopo peptide a 2 soluzioni micron archivi (2x 1 micron)
    3. Serie diluire MHC peptidi di classe I-binding: aggiungere 44,4 ml di soluzione di 2 stock peptide micron in 400 ml di PBS. Ripetere questa operazione con diluito soluzione stock di dare a ciascuno la concentrazione del peptide nella Tabella 5.
    4. Peptidi Preparazione magazzino MHC di classe II-binding
    5. Preparare la più alta concentrazione di ciascun epitopo peptide a 800 micron soluzioni madre (2x 400 micron).
    6. Serie diluire MHC peptidi classe II-binding: aggiungere 150 ml di soluzione di peptide 800 micron in 300 ml di PBS. Ripetere questa operazione con diluito soluzione stock di dare a ciascuno la concentrazione del peptide nella Tabella 5

2. FTA Preparazione

Nota: La procedura seguente descrive la costruzione di un FTA composto di cellule pulsate con 7 differenti epitopi peptidici a 6 differenti concentrazioni (cioè 42 gruppi di cellule.) Ripetuti 6 volte per generare 252 ammassi cellulari distinguibili. All'interno di ogni ripetizione, un gruppo di cellule non pulsate con qualsiasi epitopo (zero), è incluso come controllo. È utile per ALS di avere una differenza CD45 allotipo da animali ospiti per consentire loro discriminazione da cellule riceventi mediante etichettatura anticorpo al momento dell'analisi. Altrimenti ALS può essere etichettato con altri coloranti come PKH-26 per questo scopo (descritto al punto 2.6). In genere, la procedura di preparazione FTA viene eseguita dall'inizio alla fine durante una seduta.

  1. Etichetta 42, 10 ml a fondo conico tubi di plastica 1-42 (come in Tabella 1 per esempio).
  2. Preparazione delle cellule
    1. Isolare milza e / o lymphnodes da topi. Preparare sospensione singola cella da tessuti da schiacciare con un 70 micron studiato attentamente setaccio a 5 ml stantuffo della siringa e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
    2. Risospendere linfociti fino a 200 x 10 6 cellule / ml in 11,5 ml di Rochester parco Memorial Institute 1640 (RPMI, o equivalente) contenente siero fetale di vitello al 5% (FCS). Nota: È importante usare un buffer con elevato contenuto di ammina per minimizzare la tossicità colorante cellule 3.
  3. Etichettatura CTV
    Nota: Le cellule sono inizialmente etichettati con 6 concentrazioni di CTV.
    1. Risospendere completamente le cellule invertendo la provetta diverse volte. Aggiungere 1,9 ml di sospensione cellulare per 6 dei 10 ml provette etichettate 37-42, facendo attenzione a non bagnare la metà superiore dei tubi.
    2. Per etichettare le celle con CTV, rimuovere il tappo della provetta e gettare il tubo orizzontalmente.
    3. Aggiungere 83 ml di PBS per la parte non bagnata nella parte superiore del tubo, ed a questo aggiungere 17 ml di brodo CTV (vedi TabLe 2 per la quale soluzione stock è assegnato a cui tubo). Nota: Un tubo non umidificato è importante per impedire il movimento sospensione cellulare e rapido mescolamento della soluzione cella con la soluzione colorante.
    4. Chiudere la provetta e miscelare la sospensione cellulare con il colorante rapidamente e accuratamente su vortex.
    5. Ripetere i punti 2.3.2-2.3.4 per le soluzioni stock di CTV nei tubi designati descritti nella tabella 2.
    6. Incubare le cellule per un minimo di 5 minuti a temperatura ambiente (20 ° C).
  4. Etichettatura CFSE
    1. Dopo l'etichettatura CTV, aggiungere 5 ml di RPMI contenente 5% FCS in ogni provetta e accuratamente risospendere le cellule nel vortex.
      1. Dal tubo 37 di trasferimento 1 ml di sospensione cellulare per provette 31, 25, 19, 13, 7 e 1.
      2. Dal tubo 38 di trasferimento 1 ml di sospensione cellulare per tubi da 32, 26, 20, 14, 8, e 2.
      3. Dal tubo 39 di trasferimento 1 ml di sospensione cellulare per provette 33, 27, 21, 15, 9, e 3.
      4. Dal tubo di 40 trasferimenti 1 ml di cellulesospensione per tubi 34, 28, 22, 16, 10 e 4.
      5. Dal tubo 41 di trasferimento 1 ml di sospensione cellulare per provette 35, 29, 23, 17, 11, e 5.
      6. Dal tubo di 42 trasferimenti 1 ml di sospensione cellulare nei tubi 36, 30, 24, 18, 12, e 6
        Nota: Fare attenzione a non bagnare la metà superiore dei tubi durante le fasi 2.4.1.1-2.4.1.6.
    2. Per etichettare le celle con CFSE, rimuovere il tappo della provetta e gettare il tubo orizzontalmente.
    3. Aggiungere 103 ml di PBS per la parte non bagnata nella parte superiore del tubo, e per questo aggiungere 7 ml di magazzino CFSE (vedi Tabella 3 per i quali soluzione stock è assegnato alla quale tubo).
    4. Chiudere la provetta e miscelare la sospensione cellulare con il colorante rapidamente e accuratamente su vortex.
    5. Fare passi 2.4.2-2.4.4 per le soluzioni stock di CFSE nei tubi designati descritti nella Tabella 3.
    6. Incubare le cellule per un minimo di 5 minuti a temperatura ambiente (20 ° C).
    7. Lavare le cellule: Diluire sospensione cellulare con 9 ml di 20 ° CRPMI contenente 5% FCS, sedimento mediante centrifugazione a 300 xg per 10 min a 20 ° C e rimuovere surnatanti per aspirazione con una pipetta di trasferimento.
  5. Peptide pulsare e lavaggio delle cellule
    Nota: Dopo che le cellule sono state etichettate con CTV e CFSE, sono pulsate con MHC di classe I e / o MHC di classe II peptidi leganti (preparati in 1.2). Una delle popolazioni cellulari non deve inoltre pulsate con il peptide (ad es. Nil in tabella 1) e utilizzati come controllo negativo per il calcolo di risposte delle cellule T.
    1. Peptide pulsare
      1. Risospendere le cellule in un volume totale di 250 ml di RPMI contenente 5% FCS. Nota: tipico 50 ml di sospensione cellulare rimane dopo l'aspirazione del supernatante alla fine dello step 2.4.7, quindi aggiungere 200 ml di mezzo alla cella pellet.
      2. Aggiungere 250 ml di scorte peptidici pre preparati (come in tabella 5) per i tubi designato adeguatamente (come in tabella 1) ed essere sure di inserire un tubo di controllo di PBS aggiunto da soli senza peptide come controllo Nil.
      3. Mescolare sospensioni cellulari con un vortice. Nota: è fondamentale che ciascun epitopo peptide e ciascuna concentrazione peptide è assegnato ad un unico tubo e questo registrato chiaramente basato sulla fluorescenza previsto delle cellule in questo tubo, dopo la firma fluorescenza di questo cluster definirà questo peptide (come in Tabella 1 per esempio).
      4. Incubare le cellule a 37 ° C per 1 ora.
    2. Lavaggio delle cellule
      1. Aggiungere 5 ml di ghiaccio freddo (4 ° C) RPMI contenente 5% FCS alla sospensione cellulare e risospendere le cellule invertendo tubo. Underlay cautela la sospensione cellulare con 3 ml di ghiaccio freddo (4 ° C) FCS.
      2. Sedimentare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Utilizzare lenta accelerazione e frenata per assicurare l'interfaccia di FCS e la soluzione sospensione cellulare viene mantenuta.
      3. Aspirare con cautela il RPMI e poile FCS con una pipetta di trasferimento, lasciando i pellet cellulari lavati indisturbati. Nota: L'uso di un sottofondo FCS per lavare le cellule contribuisce ad assicurare soluzione peptide tanto viene rimosso dalle cellule possibile e limitando in tal modo l'esposizione di popolazioni cellulari a più peptidi liberi quando le cellule sono raggruppati.
      4. Lavare nuovamente celle: Risospendere il pellet di cellule in 10 ml di 4 ° C RPMI contenente 5% FCS. Sedimentare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Versare off surnatanti.
      5. Piscina tutte le popolazioni cellulari in un singolo tubo con una pipetta con 6 ml di 4 ° C RPMI contenente 5% FCS. Sedimenti cellule pool mediante centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Aspirare il surnatante con una pipetta di trasferimento.
  6. Etichettatura delle cellule CPD
    Nota: A questo punto sei repliche di analisi intra possono essere generati dalle cellule pulsate etichettatura peptide con 6 diverse concentrazioni di CPD.
    1. Aggiungere 11,4 ml di 20 ° CRPMI contenente 5% FCS al pellet riunite e risospendere accuratamente con una pipetta.
    2. Aggiungere 1,9 ml di sospensione cellulare a 6, 10 ml provette etichettate AF, facendo attenzione a non bagnare la metà superiore dei tubi.
    3. Per etichettare le celle con CPD, rimuovere il tappo della provetta e gettare il tubo orizzontalmente.
    4. Aggiungere 92 ml di PBS per la parte non bagnata nella parte superiore del tubo, e per questa azione stock CPD (vedere Tabella 4 per la quantità di soluzione assegnato a ciascun tubo).
    5. Chiudere la provetta e miscelare la sospensione cellulare con il colorante rapidamente e accuratamente su vortex.
    6. Sei passi. 2.6.3-2.6.5 per le soluzioni stock di CPD nei tubi designati descritti nella Tabella 4 Nota: A differenza di CFSE e CTV, la concentrazione di etichettatura CPD non è proprio linearmente correlata con l'intensità di fluorescenza risultante di cellule marcate, e così la concentrazione etichettatura utilizzata avere picchi fluorescenti equidistanti di diverse popolazioni etichettati statodeterminati empiricamente (cfr. tabella 4).
    7. Incubare le cellule per un minimo di 5 minuti a temperatura ambiente (20 ° C).
    8. Lavare le cellule due volte: Risospendere le cellule a 10 ml con 20 ° C RPMI contenente 5% FCS. Sedimentare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 20 ° C. Aspirare il surnatante con una pipetta di trasferimento. Ripeti.
    9. Pool tutte le celle in un singolo tubo con 8 ml 4 ° C RPMI contenente 5% FCS con una pipetta. Sedimenti cellule pool mediante centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C e aspirare il sopranatante con una pipetta di trasferimento.
  7. (Facoltativo) PKH-26 etichettatura cellulare
    Nota: Se ALS non può essere costruita con cellule che esprimono una differenza allotipici CD45 per ospitare topi, possono essere etichettati con PKH-26 per consentire loro discriminazione da cellule riceventi.
    1. Aggiungere 2,9 ml di 20 ° C PBS al pellet pooled e risospendere accuratamente con una pipetta.
    2. Aggiungi sospensione cellulare a un non bagnata 10 ml di tubo, facendo attenzione a non bagnare la metà superiore del tubo.
    3. Togliere il tappo della provetta e gettare il tubo orizzontalmente.
    4. Aggiungere 58 ml di diluente C (nel kit colorante PKH-26) alla parte non bagnata nella parte superiore del tubo, e per questo aggiungere 42 ml di 1 mM magazzino PKH-26.
    5. Tappare la provetta e mescolare soluzione di cellule con il colorante accuratamente vortex.
    6. Incubare le cellule per un minimo di 10 min a temperatura ambiente (20 ° C).
    7. Lavare le cellule due volte: Risospendere le cellule a 10 ml con 20 ° C RPMI contenente 5% FCS. Sedimentare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 20 ° C. Aspirare il surnatante con una pipetta di trasferimento. Ripeti.
  8. Iniezione di accordi di libero scambio in animali ospiti
    Nota: Per misurare le risposte delle cellule T in vivo, ALS sono iniettati in animali che hanno una risposta immunitaria attiva e lasciato in situ per un massimo di 24 ore. E 'fondamentale che i TLC sono iniettati in animali naive come controllo negativo.
    1. Contare e risospendere le cellule a 2,5 x 10 8 cellule per ml in PBS. Iniettare 200 ml di cellule per via endovenosa in topi ospitanti, tra cui un animale naif come controllo.

3. Citometria a Flusso

  1. 18-24 ore dopo l'iniezione FTA raccolta sangue o milza (o di altri tessuti di interesse) da topi ospitanti.
  2. Preparare sospensione singola cella da tessuti da schiacciare con un 70 micron pori setaccio a 5 ml stantuffo della siringa.
  3. Risospendere le cellule fino a 65 x 10 6 cellule / ml in PBS contenente 0,1% di BSA.
  4. Distribuire aliquote di 100 microlitri di sospensione cellulare nei pozzetti di una micropiastra per l'etichettatura anticorpo.
  5. Celle di etichette con fluorocromo etichettato anticorpi e sonde fluorescenti vitalità con fluorescenza spettralmente compatibile con CFSE, CTV e CPD. Nota: Anticorpi per B marcatori cellulari come B220 e marcatori di attivazione come CD69 sono essenziali per misurare l'attivazione delle cellule B se si utilizza il FTUn misurare le risposte delle cellule T H 2. Includere un anticorpo CD45.1 e / o CD45.2 se gli accordi di libero scambio e topi ospitanti hanno una differenza allotipici CD45.
  6. Aggiungere 100 ml di soluzione madre 2x di coloranti anticorpi / vitalità (in PBS contenente 0,1% BSA) per aliquote di 100 microlitri di cellule, mescolare bene e incubare in ghiaccio (4 ° C) per 30 min.
  7. Lavare le cellule: cellule sedimento mediante centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 200 microlitri di PBS contenente 0,1% BSA, cellule sedimento mediante centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
  8. Risospendere le cellule in un volume totale di 400 microlitri di PBS contenente 0,1% BSA, celle filtranti attraverso una maglia di 70 micron e analisi mediante citometria a flusso in un citometro di flusso in grado di rilevare i coloranti e coniugati fluorescenti pertinenti. Raccogliere fino a 3 x 10 6 eventi linfociti al fine di risolvere ogni cluster di cellule FTA e di ottenere cellule sufficienti per statistianalisi cal. Nota: Assicurarsi che tutti i controlli tipici (come i controlli colorate singoli) per citometria a flusso sono impiegati. Tipicamente, CFSE richiede eccitazione da una sorgente laser blu (tipicamente a 488 nm) e di rilevamento con filtri passa banda centrato su 520 nm; CTV richiede eccitazione da una sorgente laser violetto (tipicamente a 405 nm) e di rilevamento con filtri passa banda centrato su 450 nm; e CPD richiede eccitazione da una sorgente laser rosso (tipicamente a 633 nm o 640 nm) e di rilevamento con filtri passa banda centrato su 670 nm.

4. Analisi dei dati

  1. Analizzare citometria a flusso di dati utilizzando software standard citometria a flusso (vedi risultato rappresentativo per un esempio del tipo di strategia di gating occupati).
  2. Per il% uccisione specifica, calcolare il numero di cellule in ogni cluster di cellule FTA pulsate con peptidi MHC di classe I-binding ei cluster FTA che non sono stati peptide impulsi ("Nil") e utilizzando la seguente formula per calcolare% Uccidere specifico.
    % Uccidere specifica Formula
    Nota: Nella formula precedente "innescato" si riferisce agli obiettivi da animali che si pensa di avere una risposta immunitaria contro i peptidi di destinazione, "ingenuo" si riferisce agli obiettivi da animali naïve, "peptide" si riferisce agli obiettivi pulsate con peptidi e "zero" si riferisce a obiettivi non pulsate con qualsiasi peptidi.
  3. Per l'attivazione delle cellule B come misura dell'attività T H, calcolare la media geometrica intensità di fluorescenza (GMFI) di CD69 anticorpo fluorescenza su cellule FTA B pulsate con peptidi MHC di classe II-binding in animali "innescato" e da questo sottrarre la GMFI di espressione di CD69 sulle celle corrispondenti FTA Breakfast animali "naive" per dare una misura di attività T H.
  4. Dalle statistiche generate nelle fasi 4.2 e 4.3, l'usosoftware di calcolo matematico, come GraphPad Prism per calcolare altri parametri quantitativi e qualitativi, come l'area sotto la curva e EC 50 (una descrizione dettagliata di come questi calcoli vengono eseguiti per l'AUC possono essere trovate all'indirizzo
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, e EC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm).

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Representative Results

Come esempio dell'uso del test FTA, un topo BALB / c è stato immunizzato con il virus vaccinia ricombinante (VV) esprimere epitopi di HIV-I (VV-HIV) e le risposte alle epitopi di HIV-I CTL, Gag, mut Gag, Env e Pol, il VV CTL epitopi F2L e F2L mut, e l'epitopo cellule HIV-I T H, Gag Th (come descritto al punto 2), sono stati valutati utilizzando un parametro di 252 FTA test (Figura 1B). Varianti epitopo Gag (mut Gag) e F2L (F2L MUT) non sono espressi nel vettore VV-HIV e quindi risposte contro questi epitopi sono riflettenti di epitopo variante trasversali risposte delle cellule T reattive. Topi naive sono stati iniettati con il FTA come controllo negativo. L'AFC è stato discriminato da cellule di topo host PKH-26 l'etichettatura e le cellule FTA B discriminati da B220 colorazione anticorpale tramite citometria a flusso (Figure 1A e 1B). Ciascuno dei 6 replicati animali intermedi era gated basato su CPD fluorescenza (Figura 1C (Figura 1D). % Uccisione specifica di ogni replica è stata valutata confrontando FTA morte delle cellule del cluster in animali innescato rispetto al corrispondente cluster FTA negli animali naïve (Figura 1D). Attività di T H è stata valutata confrontando FTA B upregulation cellule di CD69 in animali innescato relativi ai corrispondenti gruppi di cellule FTA Breakfast animali naïve (Figura 1E).

Da questa analisi, l'infezione da HIV-VV generato forti risposte CTL contro l'epitopo immunodominante VV F2L, con il 100% di cellule bersaglio FTA pulsate con 0,001 mm o più dell'epitopo essere rimosso dalla milza (Figura 2A). C'è stata anche una forte risposta generato contro la forma variante di F2L, F2L mut, con il 100% di cellule bersaglio FTA pulsate con 0.01 mM o più dell'epitopo essere rimosso dalla milza. DaF2L mut non è presente nel virus infettante, questa risposta indica una variante epitopo risposta cross-reattiva. C'era anche una risposta relativamente moderato generato contro obiettivi che esprimono l'epitopo HIV Gag e una leggera risposta reattiva croce contro la forma variante di questo epitopo, HIV Gag mut. Ci sembrava di essere risposte trascurabili generati per gli epitopi HIV Pol ed Env di HIV CTL.

Oltre alle risposte CTL, l'esempio test FTA mostrato anche misurato le risposte T H valutando l'attivazione di FTA B cellula che esprime l'HIV MHC epitopo di classe II-binding HIV Gag Th (Figura 2B). Questo ha dimostrato antigene specifico attivazione delle cellule B si è verificato in animali innescate suggerendo generazione di HIV Gag Th-specifici effettori cellule T H.

Queste misure di risposta delle cellule T grandezza possono essere sintetizzate area sotto valori curva (AUC) generando per ciascuno dei epitopi (Figura 2C) che meaSures la grandezza cumulativo della risposta.

Oltre alla grandezza del antigene risposte cross-reattivi specifici e varianti epitopo, il test FTA consente misurazioni avidità funzionali da effettuare. Ad esempio, le concentrazioni di peptide efficaci utilizzati a pulsare cellule bersaglio FTA necessarie per dare risposte massime mezzo (CE 50), è indicato per gli effettori CTL (Figura 2D). Questo ha dimostrato l'avidità funzionale alla epitopi mut F2L, HIV Gag e HIV Gag mut, erano circa 10, 100 e 4.000 volte inferiore, rispettivamente, di risposte generate alla dominante VV epitopo F2L.

Tabella 1
Tabella 1. Layout di un 252 parametro FTA. Tipico il layout di una replica di una 252 FTA composta da 42 campioni / tubi pulsate con 7 differenti epitopi peptidici alle 6 differenLe concentrazioni t e compreso un campione ONU pulsato (Nil). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Numero Tubo Volume (ml) Dye magazzino (CTV mM) Concentrazione finale (micron)
37 0 0 0
38 17 0.053 0,451
39 17 0,197 1.48
40 17 0.73 6.21
41 17 2.7 23
42 17 10 85

Tabella 2. Scorte CTV utilizzato per etichettare le cellule. Volume delle società quotateCTV magazzino usato per etichettare le cellule in 2 ml per ottenere la concentrazione finale di etichettatura colorante.

Numero Tubo Volume (ml) Dye magazzino (CFSE mM) Concentrazione finale (micron)
37-42 0 0 0
31-36 7 0.022 0.139
25 - 30 7 0,078 0,492
19-24 7 0.23 1.45
13-18 7 0.82 5.17
7-12 7 2.9 18.3
: 1 - 6 7 10 63.1

Tabella 3. Scorte CFSE utilizzato per etichettare le cellule. Volume delle società quotate CFSE magazzino di noied etichettare le cellule in 1,11 ml per ottenere la concentrazione finale di etichettatura colorante.

Numero Tubo Volume (ml) Dye magazzino (CPD mM) Concentrazione finale (micron)
La 0 0 0
B 4 0.053 0,106
C 6.3 0,197 0.62
D 7.5 0.73 2.74
E 7.3 2.7 9.86
F 7.7 10 38.5

Scorte CPD Tabella 4. Usato per etichettare le cellule. Volume delle società quotate CPD rotabile utilizzato per le celle di etichette in 2 ml per dare il labelin finaleg concentrazione di colorante.

Concentrazione di Peptide (micron)
Peptidi MHC di classe I-binding 0 0.00002 0.0002 0.002 0.012 0.2 2
MHC di classe II-peptidi leganti 0 3.29 9.88 29.6 88.9 266 800

Tabella 5. MHC di classe I e II vincolanti concentrazioni di archivi peptidici. Concentrazioni di archivi tipici 1 di epitopi peptidici utilizzati per costruire un accordo di libero scambio 1. Queste concentrazioni sono 2x le concentrazioni finali utilizzati a pulsare cellule bersaglio.

Figura 1 Figura 1. Portata tipica analisi di citometria di ALS. Splenociti di topi BALB / c sono stati usati per costruire un parametro FTA 252 come descritto nel testo. Cluster FTA sono state pulsate con 6 concentrazioni (come elencato nella tabella 5), del 7 diversi epitopi virali, tra cui gli epitopi MHC di classe I vincolanti, F2L (SPYAAGYDL, una L d-ristretta virus del vaiolo vaccino (VV) epitopo); F2L mut (SP G AAGYDL, una variante di F2L), Gag (AMQMLKETI, un K d-limitato HIV Gag epitopo 4), mut Gag (AMQMLK D TI, una variante del virus HIV Gag 5), Pol (VGPTPVNII, un D d -ristretto HIV pol epitopo 6), Env (RGPGRAFVTI, un D-d limitato HIV env epitopo 7); e il MHC di classe II-legame peptidico Gag T H (PVGEIYKRWIILGLN, un H-2 d-restricted HIV Gag epitopo 4). Accordi di libero scambio sono stati iniettati iv. in un topo BALB / c che erano stati infettati per via intranasale (in.) 6 giorni prima con recombinant VV esprimere epitopi di HIV (VV-HIV, animali innescato). La FTA stato anche iniettato in topi naive come controllo. Dopo 18 ore in vivo, cellule presenti nelle sospensioni splenocyte da topi ospitanti di libero scambio sono stati analizzati mediante citometria a flusso. A) tipica strategia di gating progressivo per identificare le cellule che mostrano FTA cancelli per i linfociti, canottiere e PKH-26 + cellule FTA (è anche utile per risolvere cellule vive utilizzando un colorante vitalità come Hoechst 33258, non mostrato). B) grafico 3D che mostra tutti i cluster FTA da topo ospite ingenuo. C) Terreni istogramma che mostra FTA CPD fluorescenza marcatura ciascuno dei 6 animali intra replica. D) grafici 2D mostra uno della cella 6 intra-animale FTA B replicati presentando i vari tipi e le concentrazioni di epitopi dall'animale naif e innescato. Ciò dimostra l'assenza di cellule FTA nell'animale innescato relativo all'animale naive, rivelando "eventi" uccidereda CTL che costituiscono la base della ZLS uccidere test 1. E) Analisi Istogramma di espressione cellule FTA B del marcatore CD69 di attivazione di animali innescato rispetto al naïve animali, che forma le basi della FTA T helper saggio 2. cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. ALS consentono di misurare l'entità e avidità di risposte delle cellule T in vivo. Un parametro 252 FTA è stato usato per valutare le risposte delle cellule T in topi infettati con HIV-VV come descritto nella Figura 1. A)% uccisione specifica è stata calcolata per tutti epitopi CTL e risultati di ognuno dei 6 replicates visualizzati (pannello di sinistra) nonché mezzi e errore standard di mezzi (pannello destro) mostrato. B) T H risposta è stata valutata misurando l'attivazione delle cellule B FTA presentando l'epitopo HIV Gag gi per ognuno dei 6 replicati animali intra ( pannello di sinistra) e mezzi e l'errore standard di mezzi (pannello di destra) calcolato. C) AUC di abbattimento specifici% (a) e le risposte T helper (b) è stato calcolato come misura di grandezza cumulativo. D) sono stati calcolati CE 50 misure per% Dati specifici di abbattimento (a) come misura dell'avidità funzionale. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il vantaggio di saggi basati FTA è che permettono la discriminazione di> 250 popolazioni di cellule bersaglio valida e perfettamente funzionante da un unico animale ospite mediante citometria a flusso. Questo fornisce un livello di complessità vivo flusso saggi in base citometria a che non è stato possibile prima. Ciò è evidenziato nei due esperimenti sugli animali indicati sopra, dove le risposte alle 7 epitopi virali distinte a 6 concentrazioni potrebbero essere monitorati in replicati di 6 contemporaneamente in un unico animale che consente parametri come AUC e EC 50 da determinare per le risposte delle cellule T in vivo .

Oltre a misurare le risposte delle cellule T in vivo, i saggi basati FTA possono essere modificati per misurare le risposte in vitro 1. Si tratta essenzialmente aggiungendo ALS alle cellule T in coltura per misurare le risposte per diverse ore in vitro. Una potenziale limitazione ai saggi in vitro basati utilizzando FTA è tegli tendenza delle cellule marcate all'interno della zona di libero scambio per trasferire il colorante di etichettatura per le cellule circostanti 1, 3. Ciò può comportare una diminuzione risoluzione del cluster di cellule FTA come loro fluorescenza diventa meno netta tra ogni popolazione. Questo è più evidente in test in vitro rispetto al test in vivo perché le cellule sono in stretta prossimità per i periodi di tempo in test in vitro. Questa perdita di risoluzione di popolazioni cellulari FTA può essere minimizzato in saggi in vitro, riducendo il tempo di coltura ALS con le cellule T effettrici e utilizzando ALS che hanno un meno popolazioni di cellule bersaglio che hanno una maggiore quantità di "spazio fluorescente" tra loro così tale trasferimento colorante ha un impatto minore.

Abbiamo anche notato perdita di risoluzione delle popolazioni di cellule FTA ALS quando sono stati collocati in vivo per 48 ore 1. Questo sembrava essere il risultato di cellule bersaglio B nel prolife FTAValutazione e riducendo così colorante intensità di fluorescenza. Questo è probabilmente il risultato di cellule B che presentano antigene affine a effettrici antigene-specifica delle cellule T CD4 + che hanno comportato la stimolazione delle cellule B. Si raccomanda pertanto che il saggio limitarsi a ~ 24 ore o meno quando gli obiettivi delle cellule B vengono monitorati.

La possibilità di etichettare multipli (> 96) gruppi di cellule uniche fluorescente è stato segnalato in precedenza utilizzando cellule non vitali fisso 8. La colorazione delle cellule vive, tuttavia, è stato più problematico con la disponibilità di coloranti vitali compatibili, e solo 8-12 cellule vitali cluster è stato raggiunto in precedenza 9. La capacità di generare> 250 univocamente fluorescente cellule vitali e funzionanti qui riportati, si basa sulle proprietà di coloranti vitali CFSE-like. Molti di questi coloranti, come il CTV e CPD, solo di recente resi disponibili. Questi coloranti hanno le caratteristiche di essere in grado dietichettatura celle ad alta intensità di fluorescenza, che è vissuto a lungo e di bassa varianza 3. Queste proprietà, insieme al fatto che esiste una relazione lineare (in particolare nel caso di CFSE e CTV) tra la concentrazione del colorante usato per la marcatura e l'intensità di fluorescenza delle cellule marcate, significa che le cellule possono essere etichettate con vari (fino a 7 qui mostrato) intensità di ciascun colorante che può essere facilmente distinto mediante citometria a flusso. Inoltre, poiché l'emissione di fluorescenza di CFSE, CPD e CTV hanno minima sovrapposizione spettrale, possono essere utilizzate in combinazione per marcare cellule, consentendo così fino a> 250 firme cellule fluorescenti da rilevare mediante citometria a flusso. Va notato che per conseguire etichettatura di cellule con questo numero di firme fluorescenti distinguibili, è importante che l'etichettatura cella è eseguita rapidamente 10, 11 (per generare bassa varianza fluorescenza) e in un tampone appropriato contenenteammine libere 3 (buffer tossicità colorante che può altrimenti verificarsi con questi coloranti a concentrazioni elevate). E 'anche fondamentale che durante l'acquisizione di accordi di libero scambio mediante citometria di flusso che le fluttuazioni errati in caso di fluorescenza sono monitorati (ad esempio misurando CFSE, CTV e / o CPD intensità di fluorescenza nel tempo). Questo è importante perché tali fluttuazioni caso fluorescenza che sono dovuti a macchina introdotti errori possono causare errata del corretto posizionamento del cluster cellula bersaglio che a sua volta può causare errori nelle misure finali della funzione effettrice delle cellule T. Tale citofluorimetro errori introdotti può essere limitato garantendo campioni di alta qualità vengono preparati (particolare attenzione a celle filtranti attraverso una maglia di 70 micron per minimizzare occlusione delle linee fluidiche del citofluorimetro da grandi aggregati di cellule) e che il citofluorimetro viene mantenuta a uno standard elevato.

Misurazione di risposte delle cellule T in vivoè stata eseguita per molti anni utilizzando coloranti vitali come CFSE per monitorare cellule bersaglio morte in vivo 12. In genere questi saggi, però, sono stati solo in grado di monitorare fino a 7-8 diverse cellule bersaglio in una sola volta 13 e quindi fornire una limitata capacità di valutare l'uccisione di obiettivi che esprimono molteplici concentrazioni di più epitopi che sono normalmente necessari per generare una valutazione dettagliata di parametri quali l'avidità funzionale di risposte delle cellule T. A questo proposito, saggi tetramero dissociazione possono essere utilizzati per fornire una misura della T avidità cellule appena isolate da cellule T effettrici 14-16. Questa tecnica, tuttavia, misura MHC / TCR avidità di legame, e quindi non è una riflessione completa di avidità funzionale, che può dipendere anche cambiamenti nella struttura della sinapsi immunologica e lo stato di segnalazione cellulare componenti T 17. Pertanto, idealmente, avidità funzionale richiede esperimenti dose-risposta da eseguire. Questoè stato fatto in precedenza con tecniche in vitro come il saggio 51 Cr-release, la colorazione intracellulare di citochine dosaggio 18, 19 o il saggio ELISPOT 20, 21. Queste tecniche, tuttavia, richiedono spesso le cellule T effettrici essere stimolati in vitro, che può alterare l'avidità funzionale generale della popolazione 22. I saggi FTA, dunque, offre un miglioramento rispetto alle tecniche esistenti, misurando linfociti T CD4 + e CD8 + T cellule di dose-risposta in situ, in tempo reale contro epitopi multipli simultaneamente, e quindi fornendo una preziosa aggiunta alle tecniche esistenti per misurare cellule T funzioni effettrici. Prevediamo che l'uso della tecnologia AFC può diventare preziosi in strategie di immunoterapia di screening volte a generare risposte di alta qualità T cellulari, come vaccini diretti contro HIV-1 ed epatite C.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal progetto Sovvenzioni # 1010395 (BQ e CP) e # 525431 (CR), e un programma di sovvenzioni # 455395 (CP) dalla Salute e medicina Consiglio Nazionale delle Ricerche in Australia, un Centro australiano per l'epatite e HIV Virologia EOI 2012 borsa di studio (CR e RJJ) e una sovvenzione da parte del Bootes Fondazione Gordon e Gretel (BQ e CR). Desideriamo ringraziare Harpreet Vohra e Michael Devoy per la loro eccellente mantenimento del laboratorio JCSMR FACS, Facility australiano Cancer Research Foundation Biomolecolare Resource, JCSMR, ANU, per la sintesi peptidica, e il Dr. David Boyle, CSIRO Laboratories Salute animale, Geelong, Australia per fornire le madri HIV scorte di vaccini.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Sigma R8758
Fetal calf serum Serana FCS-500
CTV Invitrogen C34557
CFDA, SE Invitrogen C1157
CPD eBioscience 65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5 eBioscience 110730
anti-CD69 brilliant violet 605 Biolegend 104529
PKH-26 Sigma PKH26GL-1KT
Vortex Scientific Industries Inc
Centrifuge Eppendorf
Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) BD Bioscience

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References

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Immunologia Numero 88 tecniche investigative la risposta delle cellule T Citometria a Flusso Multiparameter saggio CTL Carbossifluoresceina estere succinimidil (CFSE) CellTrace Violet (CTV) Cell Proliferation Dye eFluor 670 (CPD)
L&#39;uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte<em&gt; In vivo</em
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