Summary
وتورط خلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية) في ورم الانتكاس بسبب مقاومة كيميائية. لقد الأمثل بروتوكول للاختيار والتوسع في الخلايا الجذعية السرطانية من خطوط الخلايا السرطانية في المبيض. عن طريق علاج الخلايا مع سيسبلاتين العلاج الكيميائي وزرع الخلايا الجذعية في تعزيز وسائل الإعلام أننا إثراء للثقافات CSC غير ملتصقة.
Abstract
وتعرف الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية)، ومجموعة فرعية من الدراجات بطيئة والخلايا غير المتمايزة التي تقسم غير متماثلة لتوليد التكاثري للغاية، الغازية، والخلايا السرطانية chemoresistant. ولذلك، الخلايا الجذعية السرطانية هي الخلايا السكان جذابة لاستهداف علاجيا. ومن المتوقع الخلايا الجذعية السرطانية إلى المساهمة في عدد من أنواع الأورام الخبيثة بما في ذلك تلك الموجودة في الدم والدماغ والرئة والجهاز الهضمي والبروستاتا والمبيض. عزل وإثراء ويبلغ عدد سكانها الخلايا السرطانية عن الخلايا الجذعية السرطانية تمكين الباحثين من دراسة خصائص وعلم الوراثة، والاستجابة العلاجية الخلايا الجذعية السرطانية. ولدت لدينا البروتوكول الذي يثري بتكاثر الخلايا الجذعية السرطانية لسرطان المبيض المبيض من خطوط الخلايا السرطانية (SKOV3 وOVCA429). يتم التعامل مع خطوط الخلايا مع 20 ميكرومتر سيسبلاتين لمدة 3 أيام. الخلايا على قيد الحياة هي معزولة ومثقف في وسائل الاعلام الخلايا الجذعية خالية من مصل يحتوي على السيتوكينات وعوامل النمو. علينا أن نبرهن على إثراء هذه الخلايا الجذعية السرطانية أكثر نظافة من خلال تحليل خلايا منعزلة لكnown وقف علامات خلية Oct4، NANOG، وProm1 (CD133) والتعبير سطح الخلية من CD177 وCD133. زاد المعرض الخلايا الجذعية السرطانية مقاومة كيميائية. هذه الطريقة لعزل الخلايا الجذعية السرطانية هي أداة مفيدة لدراسة دور الخلايا الجذعية السرطانية في الورم مقاومة كيميائية والانتكاس.
Protocol
1. خلية الثقافة والفلورسنت وصفها من سرطان المبيض خطوط الخلايا
- إعداد SKOV3 وسائل الإعلام: وسائل الإعلام مكوي تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 0.1 مم L-الجلوتامين، 50 U / البنسلين مل، و 50 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. الحفاظ على OVCA429 الخلايا في الحد الأدنى الضروري وسائل الإعلام (MEM) تستكمل مع 10٪ FBS، 1 ملي البيروفات الصوديوم، 0.1 ملي L-الجلوتامين، 50 U / البنسلين مل، و 50 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.
- نشر خطوط الخلايا SKOV3 وOVCA429 في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. تنمو الخلايا على 40-50٪ confluency.
- توليد الخلايا معربا عن بروتين فلوري الأحمر (RFP) من أجل رصد الجدوى في المختبر وفي الجسم الحي.
- على توليد خلايا SKOV3 معربا عن طلب تقديم العروض، إضافة جزيئات lentiviral معربا عن RFP و 10 ميكروغرام / مل polybrene إلى SKOV3 سائل الإعلام في غياب البنسلين والستربتومايسين لمدة 72 ساعة.
- بعد 72 ساعة، حدد لطلب تقديم العروض خلايا الإيجابية التي الإسفار خلية المنشط Sortiنانوغرام (FACS) على النحو التالي: يعرض للتريبسين RFP وغير RFP، معربا عن الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي في 125 x ج لمدة 5 دقائق، Resuspend الخلايا في 10 7 خلية / مل في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA. على فارز الخلية، واستخدام خلايا غير RFP لتحديد معالم الفرز. ثم جمع الخلايا التي تعبر عن RFP عالية باستخدام الليزر 561 نانومتر.
- بدلا من ذلك، إذا البلازميد lentiviral يعبر عن مقاومة المضادات الحيوية كاسيت، حدد لخلايا معربا عن RFP بواسطة زراعة في المضادات الحيوية المناسبة (مثل 10 ملغ / مل blasticidin). ملاحظة: كمية من الجسيمات lentiviral التي تحتاج إلى استخدامها يمكن أن تختلف من دفعة وحسب نوع الخلية. ينبغي تحديد lentiviral السليم عيار لكل نوع من الخلايا.
2. إثراء الخلايا الجذعية للسرطان
- علاج SKOV3، SKOV3-RFP، أو OVCA429 خطوط الخلايا مع 20 ميكرومتر من سيسبلاتين لمدة 72 ساعة. تنبيه: سيسبلاتين غير السامة. استخدام ملابس واقية / قفازات وتجنب الاتصال مع الجلد والأغشية المخاطية. لا تتخلص من سيسبلاتين طن مياه الصرف الصحي.
- إعداد CSC وسائل الإعلام: وسائل الإعلام الحرة المصل DMEM / F12 تستكمل مع 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 10 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة البشري المؤتلف (EGF)، و 10 نانوغرام / مل الأساسي عامل نمو الخلايا الليفية (bFGF)، 12 نانوغرام / مل عامل مثبط اللوكيميا ، و 0.4٪ ألبومين المصل البقري (BSA).
- خلايا يعرض للتريبسين. ثقافة البقاء على قيد الحياة في خلايا CSC سائل الإعلام.
ملاحظة: بعد 2 أيام في الثقافة الكروية غير ملتصقة ستشكل. - تغيير وسائل الاعلام كل يوم 2 من خلال جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا والطرد المركزي في 125 x ج لمدة 5 دقائق. ثم resuspend الكرية في وسائل الإعلام CSC الطازجة. تحقق الخلايا للبقاء كل أيام 2 عن طريق عد الخلايا وأداء استبعاد أزرق التريبان.
- ثم جمع الخلايا الجذعية السرطانية لمزيد من التجارب بواسطة الطرد المركزي 129 x ج لمدة 5 دقائق وإعادة التعليق على بيليه في الفينول التي تحتوي على guanidinium thiocynate (RNA)، والفوسفات مخزنة المالحة (PBS: 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، و 11.9 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4) مع 0.1٪ BSA (للالتدفق الخلوي)، أو CSC سائل الإعلام لمواصلةزراعة الخلايا.
- مراقبة مورفولوجيا الخلايا CSC باستخدام المجهر الضوئي في 20X 40X وتكبير.
3. CSC توصيف عبر تحليل التعبير الجيني للعلامات الخلايا الجذعية
- جمع 3 الاستعدادات الخلايا الجذعية السرطانية من خلال جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا الطرد المركزي في 129 x ج لمدة 5 دقائق، وإعادة التعليق بيليه في محلول الفينول التي تحتوي على guanidinium thiocynate (أساليب أخرى لاستخراج الحمض النووي الريبي يمكن استخدامها).
- إعداد الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام TRIzol وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. توليف الحمض النووي التكميلي ([كدنا]) 0،1-1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي باستخدام المتاحة تجاريا [كدنا عكس نسخ عدة.
- أداء الكمي كتب الاتجاه المعاكس رد فعل البلمرة المتسلسل (PCR-QRT).
- تشكل مزيج الرئيسي لكل مجموعة من الاشعال تحتوي على QRT-PCR مزيج، الاشعال، والماء ليبلغ 8 ميكرولتر لكل عينة (الاشعال مع fluorophores مختلفة يمكن تضخيمه في نفس البئر). على سبيل المثال، وتوليدمزيج الرئيسي واحد لOct4-FAM، NANOG-عرافة، وGAPDH-CY5. يمزج توليد رئيسية منفصلة للNestin وProm1. إضافة 2 ميكرولتر من قالب [كدنا] لكل عينة.
ملاحظة: للحصول على هذه الدراسة، تم تنفيذ QRT-PCR باستخدام بادئات المدرجة في الجدول 1. - أداء جميع QRT-PCR في نسختين لكل عينة باستخدام PCR الوقت الحقيقي thermocycler قادرة على اكتشاف fluorophores متعددة. تشمل أي ضوابط القالب.
- تطبيع الجذعية التعبير الجيني للخلية GAPDH التعبير عن كل عينة باستخدام طريقة ΔΔC T.
- تشكل مزيج الرئيسي لكل مجموعة من الاشعال تحتوي على QRT-PCR مزيج، الاشعال، والماء ليبلغ 8 ميكرولتر لكل عينة (الاشعال مع fluorophores مختلفة يمكن تضخيمه في نفس البئر). على سبيل المثال، وتوليدمزيج الرئيسي واحد لOct4-FAM، NANOG-عرافة، وGAPDH-CY5. يمزج توليد رئيسية منفصلة للNestin وProm1. إضافة 2 ميكرولتر من قالب [كدنا] لكل عينة.
| أكتوبر 4-FAM | التمهيدي 1: 5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 " |
| التمهيدي 2: 5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 " | |
| FAM التحقيق: 5'-CTTCCAAGC / ZEN / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 " | |
| NANOG-HEX | التمهيدي 1: 5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 " |
| التمهيدي 2: 5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 " | |
| HEX التحقيق: 5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 " | |
| GAPDH-CY5 | التمهيدي 1: 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 " |
| التمهيدي 2: 5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 " | |
| CY5 التحقيق: 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 " | |
| NESTIN-FAM | التمهيدي 1: 5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 " |
| التمهيدي 2: 5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 " | |
| FAM التحقيق: 5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 " | |
| CD133-HEX | التمهيدي 1: 5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 " |
| التمهيدي 2: 5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 " | |
| HEX التحقيق: 5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3 |
الجدول 1. الاشعال تستخدم لتوصيف CSC بواسطة QRT-PCR.
e_title "> 4. تحليل الخلايا الجذعية السرطانية لخلية السطح علامات وCD117 CD133- الخلايا الجذعية السرطانية الحصاد من خلال جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا والطرد المركزي في 125 x ج لمدة 5 دقائق. إضافة 500 ميكرولتر من حل مفرزة الخلايا غير بروتين لتفكك الخلايا. خلايا الطرد المركزي في 125 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة حل مفرزة الخلية. ثم يغسل خلايا مرتين مع PBS الباردة.
- احتضان وسائل الإعلام في النمو الطبيعي لمدة 1 ساعة قبل خلايا وضع العلامات. تدور باستمرار خلايا لمدة 5 دقائق في ز × 129. الخلايا resuspend في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ BSA مع مكافحة CD133-PE ومكافحة CD117-FITC.
- إصلاح الخلايا خلال الليل في 1٪ امتصاص العرق. الحذر: غير سامة لامتصاص العرق (يشتبه مسرطنة). جعل في غطاء الدخان واستخدامها في خلال أسبوع.
- أداء التدفق الخلوي لتحليل CD117 (مع مضاد للCD117 مترافق إلى FITC) وCD133 (مع مكافحة CD133 مترافق إلى PE) التعبير سطح الخلية على تدفق عداد الكريات. جمع بيانات عن الخلايا في FL1 (لFITC) وFL3 (لPE) القنوات. توليد بوابات للخلايا التعبير عن كلFITC و PE. توليد مؤامرة نقطة مع 4 الأرباع (FITC- وPE-، FITC + PE-، FITC- PE +، وFITC و+ + PE) وتحديد عدد الخلايا في كل رباعي.
5. تحليل الخلايا الجذعية السرطانية للاستجابة العلاجية
- لوحة 5،000 خلايا لكل بئر (SKOV3، SKOV3-RFP، SKOV3 CSC وSKOV3-RFP الخلايا الجذعية السرطانية) على لوحات 96 جيدا بين عشية وضحاها.
- علاج مع سيسبلاتين (0، 1، 10، 100، و 1،000 ميكرومتر) أو باكليتاكسيل (0، 0.01، 0.1، 1، 10، و 100 ميكرومتر) لمدة 96 ساعة.
- أداء MTT (3- (4،5-Dimethylthiazol-2-YL) بروميد -2،5-diphenyltetrazolium) بقاء الخلية الفحص.
- لوحة خلايا 5،000 في 100 ميكرولتر لكل بئر على لوحة 96 جيدا (خلايا لوحة من نسختين وتشمل وسائل الإعلام السيطرة على الآبار فقط).
- بعد 24 ساعة، إضافة 10 ميكرولتر من 10 ملغ / مل MTT. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعة (حتى أشكال متعجلة).
- إضافة 100 ميكرولتر من MTT المذيبات 4 ملم حمض الهيدروكلوريك، 0.1٪ NP-40 في الأيزوبروبانول. احتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام.
- قراءة لوحات في 570 نانومتر على طبق صeader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لإثبات أننا عزل الخلايا الجذعية السرطانية من المبيض خطوط الخلايا السرطانية الظهارية باستخدام العلاج سيسبلاتين، حصلنا على أول صور للخطوط الخلايا قبل العلاج وبعد الاختيار. استخدمنا المجهر الضوئي لالتقاط الصور من ملتصقة (غير المعالجة) SKOV3 وOVCA429 الخلايا وSKOV3 وOVCA429 الخلايا الجذعية السرطانية (الشكل 1). الخلايا الجذعية السرطانية تظهر جولة وليس تعلق على لوحات زراعة الأنسجة (الشكلان 1 و 2). وتبين لنا كذلك أن خلايا SKOV3 transduced مع RFP مضان تحتفظ بهم بعد عزل الخلايا الجذعية السرطانية مما يدل على أن الخلايا هي قابلة للحياة (الشكل 2B).
تم تقييم الثقافات CSC قابلة للحياة لاستجابتها للعلاج المخدرات. أظهرت زيادة الخلايا الجذعية السرطانية المقاومة للسيسبلاتين (خاصة عند 100 ميكرومتر) وباكليتاكسيل (10 ميكرون) (الشكل 3). وغالبا ما تتميز الخلايا الجذعية السرطانية بواسطة التعبير عنها من الجينات في الخلايا الجذعية. التعبير عن CD133 (المعروف أيضا باسم Prom1)، تم فحص Nestin، NANOG، وOct4. كان المستحث CD133 بشكل كبير في الثقافات SKOV3 CSC مقارنة مع غير المعالجة (السيطرة) الخلايا (الشكل 4A). كان المستحث CD133 أيضا في الثقافات CSC مقارنة مع الضوابط غير المعالجة بنسبة 16 أضعاف و 13 ضعفا في الخلايا OVCA429 وOVCA429-RFP (لا تظهر البيانات). في التجارب الأولية كانت مرتفعة Oct4، NANOG، وNestin في الثقافات SKOV3 CSC مقارنة دون علاج، ولكن النتائج لم تكن ذات دلالة إحصائية (الشكل 4A). على تكرار هذه التجارب وOct4 NANOG زادت في SKOV3 الخلايا الجذعية السرطانية مقارنة مع الخلايا السيطرة الأبوية (الشكل 4B). تم زيادة Oct4 بنسبة 4.7 أضعاف و 8 أضعاف في خلايا OVCA429 وOVCA429-RFP بعد بروتوكول تخصيب CSC (لا يظهر). وأخيرا، ارتفع SKOV3 الخلايا الجذعية السرطانية معرض التعبير سطح الخلية من CSC علامة CD117 (الشكل 5). في الختام، يسمح هذا الأسلوب لاختيار الخلايا الجذعية السرطانية قابلة للحياة كروي (التعبير عن علامات الخلايا الجذعية) في سرطان المبيضخطوط الخلايا عن طريق الانتقاء مع سيسبلاتين والنمو في وسائل الاعلام الخلايا الجذعية.
الرقم 1. مورفولوجية SKOV3 وOVCA429 الخلايا والخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية) مختارة من SKOV3 وOVCA429 الخلايا. المرحلة النقيض المجهر يصور SKOV3 وOVCA429 الخلايا (ملتصقة) التي هي دون علاج وتم اختيارها لالخلايا الجذعية السرطانية (كروي).
الشكل 2. تخصيب الخلايا الجذعية السرطانية لينتج الأجسام الشبه الكروية غير ملتصقة. خلايا (A) SKOV3 غير المعالجة والتخصيب لالخلايا الجذعية السرطانية (60X التكبير). (B) خلايا SKOV3-RFP التي هي دون علاج (أ و ب) أو المخصب لالخلايا الجذعية السرطانية (ج ود). لوحات اليسار تصور الصور النقيض المرحلة والألواح الصحيحة تصور مضان. التكبير 40X الأصلي. شريط النطاق = 400 ميكرون.
الرقم ارتفع 3. الخلايا الجذعية السرطانية المعرض مقاومة كيميائية مقارنة مع خطوط الخلايا غير المعالجة. عولجوا SKOV3 (A و B) وSKOV3-RFP (C و D)، SKOV3 الخلايا الجذعية السرطانية (A و B) وSKOV3-طلب تقديم العروض الخلايا الجذعية السرطانية (C و D) مع مختلف تركيزات سيسبلاتين (A و C) أو (تاكسول) (B و D). تم إجراء 96 ساعة بعد العلاج MTT الفحص. أجريت التجارب في n≥3 وحسبت الاحصاءات باستخدام اتجاهين ANOVA. * P <0.05، *** ع < ؛ 0.0005 يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم تنفيذ الشكل 4. علامة الخلية الجذعية التعبير في الخلايا الجذعية السرطانية مقارنة مع الخلايا غير المعالجة. تحليل QRT-PCR لSKOV3 (السيطرة) وSKOV3 الخلايا الجذعية السرطانية. (A) CD133 (Prom1)، Nestin، NANOG، وOCT4 (لتطبيع GAPDH). ( B) تجربة إضافية مما يدل على أن الخلايا الجذعية السرطانية SKOV3-RFP الحصول عليها من هذا البروتوكول خلايا العائد المرتفع مع OCT4 وNANOG مقارنة مع الخلايا غير المعالجة. وكانت النتائج طبيعية مع GAPDH التعبير. تم حساب N = 3 وإحصاءات استخدام الطلاب T-الاختبار؛ ** P <0.02، *** P <0.002.
5 "FO: محتوى العرض =" 5in "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 51891 / 51891fig5highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 5. تحليل التدفق الخلوي من علامات الخلايا الجذعية في الخلايا SKOV3 وSKOV3 الخلايا الجذعية السرطانية وحدها أو transduced أو دون طلب تقديم العروض. CD133، CD117، وCD133 / CD117 التعبير في (A) SKOV3 (غير المعالجة / التحكم) خلايا (B) SKOV3 الخلايا الجذعية السرطانية، (C) SKOV3-RFP الخلايا غير المعالجة، و (D) الخلايا الجذعية السرطانية SKOV3-RFP. أجريت التجارب في ثلاث نسخ. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخلايا الجذعية السرطانية التي تقاوم العلاج قد يكون مسؤولا عن الانتكاس بعد العلاج من الورم الرئيسي. توصيف الخلايا الجذعية السرطانية قد يؤدي إلى تحسن العلاجات لسرطان المبيض. المعلمات الحرجة في تأسيس الخلايا الجذعية السرطانية chemoresistant باستخدام بروتوكول أعلاه وتوقيت طول فترة العلاج مع العلاج الكيميائي وتركيز العلاج الكيميائي. عند استخدام البروتوكول في ما وآخرون. وجد أنه بعد 7 أيام من العلاج مع سيسبلاتين وباكليتاكسيل، ظلت أي خلايا قابلة للحياة 4. عن طريق الحد من العلاج ل3 أيام (20 ميكرومتر مع سيسبلاتين بدلا من 40 ميكرومتر سيسبلاتين وباكليتاكسيل 10 ميكرومتر)، chemoresistant خلايا قابلة للحياة والخلايا الجذعية السرطانية المتقدمة. قد يحتاج طول وجرعة من العلاج لتغييرها لمختلف خطوط الخلايا السرطانية في المبيض.
القيد الرئيسي لهذا البروتوكول هو طول أن تبقى الخلايا الجذعية السرطانية قابلة للحياة. باستخدام هذا البروتوكول، لا تزال قابلة للحياة الخلايا الجذعية السرطانية لأقل من أسبوع. لذلك، الأنواع البريد من التجارب وتحليل لالخلايا الجذعية السرطانية تحتاج إلى توقيتها بعناية.
مزيد من توصيف الخلايا الجذعية السرطانية يحتاج إلى أن تتم. سيكون من المفيد مقارنة هذا الأسلوب من الخلايا الجذعية السرطانية إلى أساليب أخرى من الجيل CSC لتحديد التشابه والاختلاف بين أنواع الخلايا هذه. المقارنة بين علامات الخلايا الجذعية، والاستجابة للعلاج، وأفضل نظام في الجسم الحي لتحليل الاحتياجات تجري بين أساليب مختلفة لتوليد / اختيار الخلايا الجذعية السرطانية. فقد قيل أن هناك أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية السرطانية مع أنماط مختلفة التعبير عن علامات الخلايا الجذعية والتشخيص مختلفة للمرضى 10-12، وبالتالي مزيد من تعريف ما هو نوع من الخلايا الجذعية السرطانية يتم إنشاؤها بواسطة هذا البروتوكول قد تساعد في تحديد كيفية ارتباطها خبيثة البشري . أخيرا، من أجل إثبات أن الخلايا الجذعية السرطانية بدقة معزولة من هذا البروتوكول هي الخلايا الجذعية السرطانية نهائية، تحتاج الخلايا ليتم حقنه في الفئران المناعة في تخفيف الحد مقايسة. هذايوضح فحص أن الخلايا الجذعية السرطانية قادرة على توليد أورام المبيض في مناطق ذات كثافة منخفضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy | Life Technologies | 16600-108 | Warm to 37 °C prior to use |
| DMEM / F12 serum free | Life Technologies | 11320-033 | Warm to 37 °C prior to use |
| Minimal Essential Media | Life Technologies | 42360032 | Warm to 37 °C prior to use |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Blasticidin | Life Technologies | R21001 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | T7402-5MG | Caution: Toxic. Use precautions |
| pLenti-suCMV-Rsv | Gentarget | LVP023 | BSL2 approval needed |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Human Recombinant EGF | Cell Signaling Technology | 8916LC | |
| bFGF | BD biosciences | 354060 | |
| LIF | Santa Cruz | sc-4988A | |
| Bovine Serum Albumin | Roche | 03 116 956 001 | |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| IQ Multiplex Powermix | BioRad | 1725849 | |
| Accumax | Millipore | ||
| Primers | Integrated DNA Technology | individually designed and ordered (see protocol for sequnces) | |
| Anti-CD133 PE | Milenyl | 130-098-826 | Primer/probe sets are light sensitive |
| CD117-Biotin | Miltenly | 130-098-570 | |
| AntiBiotin-FITC | Miltenly | 130-098-796 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh. |
| Trypsin | Life Technologies | 25300062 | |
| MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) | Sigma-Aldrich | 25200-072 | |
| EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope | Advanced Microscopy Group | ||
| Biorad CFX96 C1000 System | Biorad | ||
| Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Spectramax 340PC384 | Molecular Devices |
References
- Pennington, K., Pulaski, H., Pennington, M., Liu, J. R. Too Much of a Good Thing: Suicide Prevention Promotes Chemoresistance in Ovarian Carcinoma. Curr Cancer Drug Targets. 10, 575-583 (2010).
- Thigpen, T. A rational approach to the management of recurrent or persistent ovarian carcinoma. Clin Obstet Gynecol. 55, 114-130 (2012).
- Burgos-Ojeda, D., Rueda, B. R., Buckanovich, R. J. Ovarian cancer stem cell markers: prognostic and therapeutic implications. Cancer letters. 322, 1-7 (2012).
- Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42, 593-602 (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3, 730-737 (1997).
- Alison, M. R., Lim, S. M., Nicholson, L. J. Cancer stem cells: problems for therapy. The Journal of pathology. 223, 147-161 (2011).
- Luo, X., Dong, Z., Chen, Y., Yang, L., Lai, D. Enrichment of ovarian cancer stem-like cells is associated with epithelial to mesenchymal transition through an miRNA-activated AKT pathway. Cell proliferation. 46, 436-446 (2013).
- Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line. Molecular and cellular biochemistry. 363, 257-268 (2012).
- Abubaker, K., et al. Short-term single treatment of chemotherapy results in the enrichment of ovarian cancer stem cell-like cells leading to an increased tumor burden. Molecular cancer. 12, 24 (2013).
- Conic, I., Dimov, I., Tasic-Dimov, D., Djordjevic, B., Stefanovic, V. Ovarian epithelial cancer stem cells. ScientificWorldJournal. 11, 1243-1269 (2011).
- Liu, K. C., et al. Ovarian cancer stem-like cells show induced translineage-differentiation capacity and are suppressed by alkaline phosphatase inhibitor. Oncotarget. 4 (12), 2366-2382 (2013).
- Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncology reports. 23, 1277-1284 (2010).
