Summary
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono implicati nel tumore recidiva a causa di chemioresistenza. Abbiamo ottimizzato un protocollo per la selezione ed espansione di cellule staminali tumorali da linee cellulari di carcinoma ovarico. Trattando le cellule con il cisplatino chemioterapico e coltura in una cellula staminale promuovere media che arricchiscono per le culture CSC non aderenti.
Abstract
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono definiti come un sottoinsieme di ciclismo lento e cellule indifferenziate che si dividono asimmetricamente per generare altamente proliferative, invasive, e le cellule tumorali chemioresistenti. Pertanto, CSC sono una popolazione interessante di cellule a bersaglio terapeutico. CSC si prevede di contribuire a un certo numero di tipi di tumori maligni, compresi quelli nel sangue, cervello, polmoni, tratto gastrointestinale, della prostata e ovaie. Isolare e arricchire una popolazione di cellule tumorali per CSC permetterà ai ricercatori di studiare le proprietà, la genetica, e la risposta terapeutica di CSC. Abbiamo generato un protocollo che arricchisce riproducibile per CSC tumore ovarico da linee cellulari di cancro ovarico (SKOV3 e OVCA429). Linee cellulari sono trattate con 20 mM cisplatino per 3 giorni. Cellule sopravvissute sono isolate e coltivate in un supporto di cellule staminali senza siero contenente citochine e fattori di crescita. Dimostriamo un arricchimento di questi CSC purificati analizzando le cellule isolate per known marcatori di cellule staminali di staminalità Oct 4, Nanog, e Prom1 (CD133) e superficie cellulare espressione di CD177 e CD133. La mostra CSC aumentato chemioresistenza. Questo metodo per l'isolamento di CSC è uno strumento utile per studiare il ruolo di CSC in chemioresistenza e di recidiva del tumore.
Protocol
1 Cella cultura e fluorescente Etichettatura di cancro ovarico linee cellulari
- Preparare SKOV3 supporti: McCoy multimediale integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 0,1 mM L-glutammina, 50 U / ml di penicillina, 50 mg / ml di streptomicina. Mantenere OVCA429 cellule in mezzi essenziale minimo (MEM) supplementato con 10% FBS, 1 mM piruvato di sodio, 0,1 mM L-glutammina, 50 U / ml di penicillina, e 50 mg / ml di streptomicina.
- Propagazione linee cellulari SKOV3 e OVCA429 in un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO 2. Crescere le cellule a 40-50% di confluenza.
- Generare cellule che esprimono la proteina fluorescente rossa (RFP) per monitorare la vitalità in vitro e in vivo.
- Per generare cellule SKOV3 esprimono RFP, aggiungere particelle lentivirali che esprimono RFP e 10 mcg / ml polibrene a SKOV3 media in assenza di penicillina e di streptomicina per 72 ore.
- Dopo 72 ore, selezionare di RFP cellule positive da cellule Fluorescence Attivato Sorting (FACS) come segue: Trypsinize RFP e non RFP cellule che esprimono, centrifugare a 125 xg per 5 minuti, risospendere le cellule a 10 7 cellule / ml in PBS contenente 0,1% di BSA. Su un cell sorter, utilizzare cellule non RFP per determinare i parametri di selezione. Poi raccogliere le cellule che esprimono RFP alta utilizzando un laser 561 nm.
- In alternativa, se il plasmide lentivirale esprime una cassetta di resistenza antibiotica, per selezionare le cellule che esprimono RFP coltivando nel antibiotico appropriato (ad esempio 10 mg / ml blasticidin). NOTA: La quantità di particelle lentivirali che deve essere utilizzato può variare a seconda del lotto e dal tipo di cellula. Lentivirali titolo corretto dovrebbe essere determinato per ciascun tipo di cellula.
2. arricchimento di cellule tumorali staminali
- Trattare SKOV3, SKOV3-RFP, o OVCA429 linee cellulari con 20 mM di cisplatino per 72 ore. ATTENZIONE: Il cisplatino è tossico. Usare indumenti protettivi / guanti ed evitare il contatto con la pelle e le mucose. Non gettare i cisplatinon acque reflue.
- Preparare CSC supporti: siero mezzi DMEM / F12 libera integrato con 5 mcg / ml di insulina, 10 ng / ml di fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF), 10 ng / ml di base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), 12 ng / ml fattore inibitorio di leucemia , e il 0,4% di albumina sierica bovina (BSA).
- Cellule trypsinize. Cultura sopravvivenza delle cellule in CSC media.
NOTA: Dopo 2 giorni di coltura sferoidi non aderenti formeranno. - Modificare i media ogni 2 giorni, raccogliendo i media contenente cellule e centrifugazione a 125 xg per 5 min. Poi risospendere il pellet in mezzi CSC fresco. Controllare le cellule per la vitalità ogni 2 giorni contando le cellule e l'esecuzione di trypan blu.
- Poi raccogliere CSC per ulteriori esperimenti per centrifugazione 129 xg per 5 min e risospendere il pellet in fenolo contenente guanidina thiocynate (RNA), tampone fosfato salino (PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, e 11,9 mM tampone fosfato, pH 7.4) con 0,1% di BSA (per citometria a flusso), o CSC media per continuarecoltivando le cellule.
- Monitorare morfologia cellulare CSC utilizzando un microscopio ottico a 20X e 40X ingrandimenti.
3. CSC Caratterizzazione mediante analisi di espressione genica di cellule staminali Marcatori
- Raccogliere 3 preparazioni di CSC attraverso la raccolta di supporti contenenti cellule, centrifugazione a 129 xg per 5 minuti, e risospendere il pellet in una soluzione di acido contenente guanidina thiocynate (altri metodi per l'estrazione di RNA possono essere utilizzati).
- Preparare RNA totale utilizzando TRIzol secondo il protocollo del produttore. Sintetizzare DNA complementare (cDNA) 0,1-1 mg di RNA utilizzando un kit cDNA Reverse Transcription disponibile in commercio.
- Eseguire quantitativa inversione trascritto reazione a catena della polimerasi (QRT-PCR).
- Make up master mix per ogni set di primer contenenti mix QRT-PCR, primer, e acqua per un totale di 8 microlitri per campione (primer con differenti fluorofori possono essere amplificati nello stesso bene). Ad esempio, generareuna master mix per Oct4-FAM, Nanog-Hex, e GAPDH-CY5. Generare master mix separati per Nestin e Prom1. Aggiungere 2 ml di cDNA modello per campione.
NOTA: Per questo studio, QRT-PCR è stata effettuata utilizzando i primer elencati nella tabella 1. - Eseguire tutte QRT-PCR in duplice copia per ogni campione con un real time PCR termociclatore in grado di rilevare più fluorofori. Includere controlli senza templato.
- Normalizzare l'espressione genica di cellule staminali di espressione GAPDH per ogni campione utilizzando il metodo ΔΔC T.
- Make up master mix per ogni set di primer contenenti mix QRT-PCR, primer, e acqua per un totale di 8 microlitri per campione (primer con differenti fluorofori possono essere amplificati nello stesso bene). Ad esempio, generareuna master mix per Oct4-FAM, Nanog-Hex, e GAPDH-CY5. Generare master mix separati per Nestin e Prom1. Aggiungere 2 ml di cDNA modello per campione.
| Oct-4-FAM | Primer 1: 5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 ' |
| Primer 2: 5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 ' | |
| Sonda FAM: 5'-CTTCCAAGC / ZEN / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 ' | |
| Nanog-HEX | Primer 1: 5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 ' |
| Primer 2: 5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 ' | |
| Sonda HEX: 5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 ' | |
| GAPDH-CY5 | Primer 1: 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 ' |
| Primer 2: 5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 ' | |
| Sonda CY5: 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 ' | |
| Nestina-FAM | Primer 1: 5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 ' |
| Primer 2: 5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 ' | |
| Sonda FAM: 5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 ' | |
| CD133-HEX | Primer 1: 5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 ' |
| Primer 2: 5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 ' | |
| Sonda HEX: 5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3 |
Tabella 1. primer utilizzati per la CSC caratterizzazione mediante QRT-PCR.
e_title "> 4. CSC Analisi per cellulari di superficie marcatori CD117 e CD133- CSC Harvest raccogliendo supporti contenenti cellule e centrifugazione a 125 xg per 5 min. Aggiungere 500 ml di una soluzione di distacco delle cellule non-proteolitico di break-up cellule. Cellule centrifugare a 125 xg per 5 minuti per rimuovere soluzione distacco delle cellule. Poi lavare le cellule due volte con PBS freddo.
- Incubare in normali terreni di coltura per 1 ora prima di celle di etichettatura. Spin le cellule per 5 min a 129 x g. Risospendere le cellule in PBS con 0,1% BSA anti-CD133-PE e anti-CD117-FITC.
- Fissare le cellule durante la notte in 1% paraformaldeide. Attenzione: Paraformaldeide è tossico (sospetto cancerogeno). Fate in cappa e consumare entro una settimana.
- Eseguire la citometria a flusso per analizzare CD117 (con un anti-CD117 coniugato FITC) e CD133 (con anti-CD133 coniugato PE) espressione di superficie cellulare su un citometro a flusso. Raccogliere dati sulle cellule in FL1 (FITC) e FL3 (PE) per i canali. Generare cancelli per cellule che esprimono entrambiFITC e PE. Genera un diagramma a punti con 4 quadranti (FITC e PE, FITC + PE, PE FITC + e + FITC e PE +) e determinare il numero di cellule in ogni quadrante.
5. Analizzando CSC per la risposta terapeutica
- Piastra 5.000 cellule per pozzetto (SKOV3, SKOV3-RFP, SKOV3 CSC e SKOV3-RFP CSC) su piastre a 96 pozzetti durante la notte.
- Trattare con cisplatino (0, 1, 10, 100, e 1.000 mM) o paclitaxel (0, 0.01, 0.1, 1, 10, e 100 mM) per 96 ore.
- Eseguire MTT (3 (4,5-dimetiltiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromuro) test vitalità cellulare.
- Piatto 5.000 cellule per 100 ml per pozzetto su una piastra a 96 pozzetti (cellule piastra in duplicato e comprendono Media Control solo pozzi).
- Dopo 24 ore, aggiungere 10 ml di 10 mg / ml di MTT. Incubare a 37 ° C per 2-4 ore (fino a quando forma un precipitato).
- Aggiungere 100 ml di solvente mM HCl MTT 4, 0,1% NP-40 in isopropanolo. Incubare per 15 min a buio.
- Per saperne di piastre a 570 nm su un piatto reader.
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Representative Results
Per dimostrare che abbiamo isolato cellule staminali tumorali da linee di cellule di cancro ovarico epiteliale mediante trattamento con cisplatino, in primo luogo abbiamo acquisito le immagini delle linee cellulari prima del trattamento e dopo la selezione. Abbiamo usato la microscopia ottica per catturare immagini di aderenti (non trattato) SKOV3 e OVCA429 cellule e SKOV3 e OVCA429 CSC (Figura 1). CSC appaiono rotondo e non attaccato alle piastre di coltura tissutale (figure 1 e 2). Mostriamo inoltre che le cellule SKOV3 trasdotte con RFP mantengono la loro fluorescenza dopo l'isolamento delle CSC dimostrando che le cellule sono vitali (Figura 2B).
Culture CSC vitali sono stati valutati per la loro risposta alla terapia farmacologica. CSC ha dimostrato una maggiore resistenza al cisplatino (in particolare a 100 micron) e paclitaxel (10 mM) (Figura 3). CSC sono spesso caratterizzati da loro espressione di geni di cellule staminali. L'espressione di CD133 (noto anche come Prom1), Nestin, Nanog e Oct4 è stata esaminata. CD133 è stata significativamente indotta in colture SKOV3 CSC rispetto al controllo (cellule non trattate) (Figura 4A). CD133 è stata anche indotta in colture CSC rispetto ai controlli non trattati per 16 volte e 13 volte nelle cellule OVCA429 e OVCA429-RFP (dati non mostrati). Negli esperimenti iniziali Oct4, Nanog, e Nestin sono stati elevati nelle culture SKOV3 CSC rispetto ai non trattati, ma i risultati non erano statisticamente significative (Figura 4A). Su ripetere questi esperimenti di staminalità Oct 4 e Nanog aumentati in SKOV3 CSC rispetto alle cellule di controllo parentale (Figura 4B). Oct4 è stato aumentato di 4,7 volte e 8 volte nelle cellule OVCA429 e OVCA429-RFP seguito il protocollo di arricchimento CSC (non mostrato). Infine, SKOV3 CSC mostra aumentata espressione di superficie cellulare del CSC marcatore CD117 (Figura 5). In conclusione, questo metodo consente la selezione di CSC vitali sferoidali (che esprimono marcatori di cellule staminali) nel carcinoma ovaricolinee cellulari di selezione con cisplatino e la crescita nei mezzi delle cellule staminali.
Figura 1 Morfologia di SKOV3 e OVCA429 cellule e le cellule staminali tumorali (CSC) selezionati da SKOV3 e OVCA429 cellule. Microscopio a contrasto di fase raffigura SKOV3 e OVCA429 cellule (aderenti) che sono trattati e sono stati selezionati per la CSC (sferoide).
Figura 2 arricchimento per CSC produce sferoidi non aderenti. Cellule (A) SKOV3 non trattati e arricchito di CSC (60X di ingrandimento). (B) cellule SKOV3-RFP che sono non trattati (A e B) o arricchito di CSC (c d). Pannelli sinistra raffigurano immagini di contrasto di fase e di pannelli a destra raffigurano fluorescenza. Ingrandimento 40X originale. Barra della scala = 400 micron.
Figura 3 mostra CSC aumentato chemioresistenza rispetto alle linee di cellule non trattate. SKOV3 (A e B) e SKOV3-RFP (C e D), SKOV3 CSC (A e B) e SKOV3-RFP CSC (C e D) sono stati trattati con vari concentrazioni di cisplatino (A e C) o paclitaxel (Taxol) (B e D). È stata effettuata 96 ore test post-trattamento MTT. Gli esperimenti sono stati eseguiti in n≥3 e le statistiche sono state calcolate utilizzando Two Way ANOVA; * P <0.05, *** p < ;. 0.0005 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4 staminali espressione di marker delle cellule in cellule staminali tumorali rispetto alle cellule non trattate. Analisi QRT-PCR è stata effettuata per SKOV3 (controllo) e SKOV3 CSC. (A) CD133 (Prom1), Nestin, Nanog, e OCT4 (normalizzato a GAPDH). ( B) Un esperimento ulteriore dimostrazione che le CSC SKOV3-RFP ottenuti dal presente protocollo cellule di rendimento elevato con OCT4 e Nanog rispetto alle cellule non trattate. I risultati sono stati normalizzati con l'espressione di GAPDH. N = 3 e le statistiche sono state calcolate utilizzando studenti T-test; ** P <0.02, *** p <0.002.
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Figura 5 Citometria a flusso Analisi di marcatori di cellule staminali in cellule SKOV3 e SKOV3 CSC solo o trasdotte o senza RFP. CD133, CD117, CD133 e di espressione / CD117 in (A) SKOV3 cellule (non trattato / controllo), (B) SKOV3 CSC, (C) SKOV3-RFP cellule non trattate, e (D) CSC SKOV3-RFP. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
CSC che sono resistenti alla terapia possono essere responsabili di recidiva dopo il trattamento del tumore primario. Caratterizzazione della CSC può portare a migliori terapie per il cancro ovarico. I parametri critici nella creazione di CSC chemioresistenti utilizzando il protocollo di cui sopra sono cronometrando l'durata del trattamento con la chemioterapia e la concentrazione della chemioterapia. Quando si utilizza il protocollo in Ma et al. si è constatato che dopo 7 giorni di trattamento con cisplatino e paclitaxel, senza cellule vitali sono rimasti 4. Riducendo il trattamento di 3 giorni (con 20 mM cisplatino invece di 40 mM cisplatino e paclitaxel 10 micron), le cellule chemioresistenti vitali e CSC sviluppati. La durata e la dose della terapia può essere necessario essere modificato per le diverse linee di cellule di cancro ovarico.
Il limite maggiore di questo protocollo è la lunghezza che le cellule staminali tumorali rimangono vitali. Usando questo protocollo, i CSC rimangono vitali per meno di una settimana. Pertanto, thE tipi di esperimenti e analisi per il CSC devono essere attentamente cronometrato.
Ulteriore caratterizzazione del CSC deve essere condotta. Sarebbe utile confrontare questo metodo di CSC ad altri metodi di generazione CSC per determinare la somiglianza e la differenza tra questi tipi di cellule. Confronto di marcatori di cellule staminali, la risposta alla terapia, e miglior sistema per l'analisi in vivo deve essere condotta tra diversi metodi per la generazione / selezione di CSC. È stato suggerito che ci sono diversi tipi di CSC con diversi modelli di espressione di marcatori di cellule staminali e la prognosi diversa per i pazienti di 10-12, così ulteriormente la definizione di che tipo di CSC sono generati da questo protocollo può aiutare a determinare il loro rapporto con malignità umana . Infine, al fine di dimostrare rigorosamente che le CSC isolati da questo protocollo sono CSC definitive, le cellule hanno bisogno di essere iniettato in topi immunocompromessi in un test di diluizione limitante. Questotest dimostra che CSC sono in grado di generare tumori ovarici a bassa densità.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy | Life Technologies | 16600-108 | Warm to 37 °C prior to use |
| DMEM / F12 serum free | Life Technologies | 11320-033 | Warm to 37 °C prior to use |
| Minimal Essential Media | Life Technologies | 42360032 | Warm to 37 °C prior to use |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Blasticidin | Life Technologies | R21001 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | T7402-5MG | Caution: Toxic. Use precautions |
| pLenti-suCMV-Rsv | Gentarget | LVP023 | BSL2 approval needed |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Human Recombinant EGF | Cell Signaling Technology | 8916LC | |
| bFGF | BD biosciences | 354060 | |
| LIF | Santa Cruz | sc-4988A | |
| Bovine Serum Albumin | Roche | 03 116 956 001 | |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| IQ Multiplex Powermix | BioRad | 1725849 | |
| Accumax | Millipore | ||
| Primers | Integrated DNA Technology | individually designed and ordered (see protocol for sequnces) | |
| Anti-CD133 PE | Milenyl | 130-098-826 | Primer/probe sets are light sensitive |
| CD117-Biotin | Miltenly | 130-098-570 | |
| AntiBiotin-FITC | Miltenly | 130-098-796 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh. |
| Trypsin | Life Technologies | 25300062 | |
| MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) | Sigma-Aldrich | 25200-072 | |
| EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope | Advanced Microscopy Group | ||
| Biorad CFX96 C1000 System | Biorad | ||
| Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Spectramax 340PC384 | Molecular Devices |
References
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