Summary
cellules souches du cancer (CCM) sont impliqués dans la rechute de la tumeur en raison de la chimiorésistance. Nous avons optimisé un protocole pour la sélection et l'expansion de la CCF de lignées cellulaires de cancer de l'ovaire. En traitant les cellules avec le cisplatine chimiothérapeutique et la mise en culture d'une cellule souche promotion de médias nous enrichir en cultures SCC non adhérentes.
Abstract
cellules souches du cancer (CCM) sont définies comme un sous-ensemble du cyclisme lente et cellules indifférenciées qui se divisent de façon asymétrique pour générer hautement proliférante, envahissante, et les cellules tumorales chimiorésistantes. Par conséquent, les CSC sont une population intéressante de cellules à cibler thérapeutique. CCM sont prédits pour contribuer à un certain nombre de types de tumeurs malignes, y compris celles dans le sang, le cerveau, les poumons, le tractus gastro-intestinal, de la prostate et de l'ovaire. Isoler et enrichir une population de cellules tumorales pour les CSC permettra aux chercheurs d'étudier les propriétés, la génétique, et la réponse thérapeutique des CSC. Nous avons généré un protocole qui enrichit de manière reproductible pour CCM de cancer ovarien de lignées cellulaires de cancer de l'ovaire (SKOV3 et OVCA429). Les lignées cellulaires sont traitées avec 20 uM de cisplatine pendant 3 jours. Les cellules survivantes sont isolées et mises en culture dans un milieu de cellules souches sans sérum contenant des cytokines et des facteurs de croissance. Nous démontrons un enrichissement de ces CSC purifiés par l'analyse des cellules isolées pour known marqueurs de cellules souches Oct4, Nanog, et PROM1 (CD133) et de l'expression de surface cellulaire de CD177 et CD133. L'exposition CSC a augmenté chimiorésistance. Cette méthode pour l'isolement des CSC est un outil utile pour étudier le rôle des CSC dans la chimiorésistance et la tumeur récidive.
Protocol
1. Culture cellulaire et Marquage fluorescent de lignées cellulaires de cancer de l'ovaire
- Préparer SKOV3 médias: médias McCoy complété avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 0,1 mM de L-glutamine, 50 U / ml de pénicilline, et 50 pg / ml de streptomycine. Maintenir OVCA429 cellules dans un milieu minimal essentiel (MEM) supplémenté avec 10% de FBS, du pyruvate de sodium 1 mM, 0,1 mM de L-glutamine, 50 U / ml de pénicilline et 50 pg / ml de streptomycine.
- Propager des lignées de cellules SKOV3 et OVCA429 dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec 5% de CO 2. Cultiver des cellules à 40-50% de confluence.
- Génération des cellules exprimant la protéine fluorescente rouge (RFP) dans le but de surveiller la viabilité in vitro et in vivo.
- Pour générer des cellules exprimant RFP SKOV3, ajouter des particules lentiviraux exprimant RFP et 10 ug / ml de polybrène à SKOV3 support en l'absence de pénicilline et de streptomycine pendant 72 heures.
- Après 72 heures, sélectionnez pour DP cellules positives par cellulaire activé par fluorescence Sorting (FACS) comme suit: Trypsiniser DP et non des cellules exprimant RFP, centrifuger à 125 g pendant 5 min, remettre les cellules à 10 7 cellules / ml dans du PBS contenant 0,1% de BSA. Sur un trieur de cellules, en utilisant des cellules non-DP pour déterminer les paramètres de tri. Puis prélever des cellules qui expriment haut DP en utilisant un laser 561 nm.
- Par ailleurs, si le plasmide lentiviral exprime une cassette de résistance aux antibiotiques, sélectionner les cellules de la DP exprimant par culture dans l'antibiotique approprié (par exemple 10 mg / ml blasticidine). REMARQUE: La quantité de particules lentiviraux qui doit être utilisée peut varier en fonction du lot et selon le type de cellule. Lentiviral titre correct doit être déterminée pour chaque type de cellule.
2. enrichissement des cellules souches du cancer
- Traiter SKOV3, SKOV3-DP, ou OVCA429 lignées cellulaires avec 20 uM de cisplatine pendant 72 heures. ATTENTION: Le cisplatine est toxique. Utilisez des gants de protection / des vêtements et éviter tout contact avec peau et des membranes muqueuses. Ne jetez pas de cisplatine in eaux usées.
- Préparer SCC médias: sans sérum milieu DMEM / F12 supplémenté avec 5 pg d'insuline / ml, 10 ng / ml de facteur de croissance épidermique humain recombinant (EGF), 10 ng / base ml de facteur de croissance des fibroblastes (bFGF), 12 ng / ml de facteur inhibiteur de leucémie , et 0,4% d'albumine de sérum bovin (BSA).
- Cellules Trypsiniser. Culture des cellules survivant au SCC médias.
NOTE: Après 2 jours de culture sphéroïdes non adhérentes se forment. - Changer de support tous les 2 jours en recueillant les médias contenant des cellules et centrifugation à 125 g pendant 5 min. Puis remettre le culot dans les médias SCC frais. Vérifiez cellules pour la viabilité tous les 2 jours en comptant les cellules et effectuer exclusion au bleu trypan.
- Puis CCF pour recueillir d'autres expériences par centrifugation 129 x g pendant 5 minutes et remise en suspension du culot dans du phénol contenant du thiocyanate de guanidine (ARN), solution saline tamponnée au phosphate (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, et 11,9 mM de tampon phosphate, pH 7,4) avec 0,1% de BSA (pour la cytométrie de flux), ou SCC médias continuentla culture des cellules.
- Surveiller SCC morphologie des cellules à l'aide d'un microscope optique à 20X et 40X grossissement.
3 Caractérisation SCC par l'analyse de l'expression génique de marqueurs de cellules souches
- Récupérer des trois préparations de CCF en recueillant des milieux contenant des cellules, une centrifugation à 129 g pendant 5 min, et la remise en suspension du culot dans une solution de phénol contenant du thiocyanate de guanidine (d'autres méthodes d'extraction de l'ARN peuvent être utilisés).
- Préparation de l'ARN total en utilisant TRIzol selon le protocole du fabricant. Synthétiser de l'ADN complémentaire (ADNc) de 0,1 à 1 ug d'ARN en utilisant un kit de transcription inverse d'ADNc disponible dans le commerce.
- Effectuer une transcription inverse quantitative réaction en chaîne de la polymérase (QRT-PCR).
- Maquillage master mix pour chaque ensemble d'amorces contenant mélange QRT-PCR, les amorces, et de l'eau pour un total de 8 pi par échantillon (amorces avec différents fluorophores peuvent être amplifiés dans le même puits). Par exemple, générerun mélange maître pour Oct4-FAM, Nanog-Hex, et GAPDH-CY5. Générer master mix distincts pour Nestin et PROM1. Ajouter 2 ul de matrice d'ADNc par échantillon.
NOTE: Pour cette étude, QRT-PCR a été réalisée en utilisant les amorces énumérées dans le tableau 1. - Effectuer toutes QRT-PCR en double pour chaque échantillon en utilisant un thermocycleur PCR en temps réel capable de détecter de multiples fluorophores. Inclure les contrôles sans matrice.
- Normaliser tige expression génique des cellules à l'expression de GAPDH pour chaque échantillon en utilisant la méthode ΔΔC T.
- Maquillage master mix pour chaque ensemble d'amorces contenant mélange QRT-PCR, les amorces, et de l'eau pour un total de 8 pi par échantillon (amorces avec différents fluorophores peuvent être amplifiés dans le même puits). Par exemple, générerun mélange maître pour Oct4-FAM, Nanog-Hex, et GAPDH-CY5. Générer master mix distincts pour Nestin et PROM1. Ajouter 2 ul de matrice d'ADNc par échantillon.
| Oct-4-FAM | L'amorce 1: 5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 ' |
| Amorce 2: 5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 ' | |
| sonde FAM: 5'-CTTCCAAGC / ZEN / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 ' | |
| Nanog-HEX | L'amorce 1: 5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 ' |
| Amorce 2: 5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 ' | |
| sonde HEX: 5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 ' | |
| GAPDH-CY5 | L'amorce 1: 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 ' |
| Amorce 2: 5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 ' | |
| sonde CY5: 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 ' | |
| Nestine-FAM | L'amorce 1: 5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 ' |
| Amorce 2: 5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 ' | |
| sonde FAM: 5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 ' | |
| CD133-HEX | L'amorce 1: 5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 ' |
| Amorce 2: 5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 ' | |
| sonde HEX: 5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3 |
Tableau 1: Amorces utilisées pour le SCC caractérisation par QRT-PCR.
e_title "> 4. Des CSC Analyse de surface cellulaire marqueurs CD117 et CD133- CSC récolte en recueillant les médias contenant des cellules et centrifugation à 125 g pendant 5 min. Ajouter 500 ul d'une solution non-protéolytique détachement des cellules de la débâcle des cellules. Centrifuger les cellules à 125 g pendant 5 min pour éliminer la solution de détachement cellulaire. Ensuite, laver les cellules deux fois avec du PBS froid.
- Incuber dans un milieu de croissance normale pendant 1 heure avant de cellules d'étiquetage. Isoler les cellules pendant 5 min à 129 x g. Remettre en suspension les cellules dans du PBS avec 0,1% de BSA avec un anti-CD133-PE et anti-CD117-FITC.
- Fixer les cellules pendant la nuit dans 1% de paraformaldéhyde. Attention: Paraformaldéhyde est toxique (cancérogène suspecté). Faire dans une hotte et d'utiliser moins d'une semaine.
- Effectuer la cytométrie en flux pour analyser le CD117 (avec un anticorps anti-CD117 conjugué à FITC) et CD133 (avec anti-CD133 conjugué à PE) l'expression de surface cellulaire sur un cytomètre de flux. Recueillir des données sur les cellules de la FL1 (pour FITC) et FL3 (PE) pour les canaux. Générer portes pour les cellules exprimant à la foisFITC et PE. Générer un tracé de points avec 4 quadrants (FITC et PE, FITC + PE, PE FITC +, et + FITC et PE +) et de déterminer le nombre de cellules dans chaque quadrant.
5 Analyse CSC pour les interventions thérapeutiques
- Plaque de 5000 cellules par puits (SKOV3, SKOV3-DP, SKOV3 SCC et SKOV3-DP CCM) sur des plaques à 96 puits pendant la nuit.
- Traiter avec le cisplatine (0, 1, 10, 100 et 1000 pM) ou le paclitaxel (0, 0,01, 0,1, 1, 10 et 100 uM) pendant 96 heures.
- Effectuer MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium) dosage de la viabilité cellulaire.
- Plate 5.000 cellules par 100 ul par puits sur une plaque de 96 puits (cellules de la plaque en double et comprennent les médias ne contrôlent puits).
- Après 24 h, ajouter 10 ul de 10 mg / ml de MTT. Incuber à 37 ° C pendant 2-4 heures (jusqu'à ce que les formes précipité).
- Ajouter 100 ul de HCl mM MTT solvant 4, 0,1% de NP-40 dans l'isopropanol. Incuber pendant 15 min dans l'obscurité.
- Lire les plaques à 570 nm sur une plaque reader.
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Representative Results
Pour démontrer que nous avons isolé CCF de lignées cellulaires de cancer ovarien épithélial en utilisant un traitement à la cisplatine, nous avons fait l'acquisition des images des lignées de cellules avant le traitement et après la sélection. Nous avons utilisé la microscopie optique pour capturer des images de adhérent (non traité) SKOV3 et OVCA429 cellules et SKOV3 et OVCA429 CSC (Figure 1). CCM apparaissent tour et qui n'est pas attaché à des plaques de culture tissulaire (figures 1 et 2). Nous montrons en outre que les cellules SKOV3 transduction avec DP conservent leur fluorescence après isolement des CCF démontrant que les cellules sont viables (figure 2B).
Cultures SCC viables ont été évalués pour leur réponse au traitement médicamenteux. CCM a montré une résistance accrue à la cisplatine (en particulier à 100 uM) et du paclitaxel (10 pM) (figure 3). CCM sont souvent caractérisées par leur expression de gènes de cellules souches. L'expression de CD133 (également connu sous le nom PROM1), La nestine, Nanog, Oct4 et a été examiné. CD133 a été induite de manière significative dans des cultures SKOV3 SCC par rapport aux cellules non traitées (témoins) (Figure 4A). CD133 a également été induite dans les cultures du SCC par rapport à des témoins non traités par 16 fois et 13 fois dans les cellules OVCA429 et OVCA429-DP (données non présentées). Dans des expériences initiales Oct4, Nanog, et la nestine ont été élevés dans les cultures par rapport à SKOV3 SCC non traitée, mais les résultats n'étaient pas statistiquement significatives (figure 4A). Lors de la répétition de ces expériences Oct4 et Nanog augmenté dans SKOV3 CCF par rapport à des cellules de contrôle parental (figure 4B). Oct4 a été augmentée de 4,7 fois et 8 fois dans les cellules et OVCA429 OVCA429-DP suivant le protocole d'enrichissement SCC (non représenté). Enfin, SKOV3 CSC exposition augmentation de l'expression de surface de la cellule de la CSC marqueur CD117 (figure 5). En conclusion, cette méthode permet de sélectionner des CSC viables sphéroïde (exprimant des marqueurs de cellules souches) en cancer de l'ovairedes lignées de cellules par sélection avec le cisplatine et la croissance dans un milieu de cellules souches.
Figure 1: Morphologie de SKOV3 et OVCA429 cellules et les cellules souches du cancer (CSC) choisi parmi SKOV3 et OVCA429 cellules. Microscope à contraste de phase dépeint SKOV3 et OVCA429 cellules (adhérentes) qui ne sont pas traitées et ont été sélectionnés pour CSC (ellipsoïde).
Figure 2: L'enrichissement CSC donne sphéroïdes non-adhérentes. Cellules (A) SKOV3 non traité et enrichi pour CSC (grossissement 60x). (B) de cellules SKOV3-DP ne sont pas traités (a et b) ou enrichi pour CSC (c d). Les graphes de gauche représentent des images de contraste de phase et de panneaux de droite représentent la fluorescence. Grossissement 40X origine. Barre d'échelle = 400 microns.
Figure 3 CSC exposition a augmenté par rapport à la chimiorésistance des lignées de cellules non traitées. SKOV3 (A et B) et SKOV3-DP (C et D), SKOV3 CCM (A et B) et SKOV3-DP CSC (C et D) ont été traités avec divers Les concentrations de cisplatine (A et C) ou le paclitaxel (Taxol) (B et D). Test post-traitement de MTT 96 h a été réalisée. Les expériences ont été effectuées dans n ≥ 3 et les statistiques ont été calculées en utilisant Two Way ANOVA; * P <0,05, *** p < ;. 0,0005 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 souches expression du marqueur de cellules en CCM par rapport aux cellules non traitées. D'analyse QRT-PCR a été réalisée pour SKOV3 (témoin) et SKOV3 CCM (A). CD133 (PROM1), la nestine, Nanog, et OCT4 (normalisé à la GAPDH). ( B) Une expérience supplémentaire qui démontre que les CSC SKOV3-DP obtenus à partir de ces cellules protocole de rendement avec OCT4 élevée et Nanog par rapport aux cellules non traitées. Les résultats ont été normalisés à l'expression de GAPDH. N = 3 et les statistiques ont été calculées en utilisant test t de Student; ** P <0,02, *** p <0,002.
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Figure 5 cytométrie en flux des marqueurs de cellules souches en cellules SKOV3 et SKOV3 CSC seul ou transduites ou sans appel d'offres. CD133, CD117 et CD133 / de l'expression de CD117 dans (A) SKOV3 de cellules (non traitée / contrôle), (B) SKOV3 CSC, (C) SKOV3-DP cellules non traitées, et (D) de CSC SKOV3-DP. Des expériences ont été réalisées en triple. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
CSC qui sont résistantes à la thérapie peuvent être tenus responsables de rechute après le traitement de la tumeur primitive. Caractérisation des CSC peut conduire à l'amélioration des thérapies pour le cancer de l'ovaire. Les paramètres critiques dans la mise en place de CCF chimiorésistantes utilisant le protocole ci-dessus sont des chronogrammes de la durée du traitement avec la chimiothérapie et la concentration de la chimiothérapie. Lorsque vous utilisez le protocole de Ma et al. il a été constaté que, après 7 jours de traitement avec le cisplatine et le paclitaxel, le pas de cellules viables restés 4. En réduisant le traitement de 3 jours (avec 20 uM cisplatine au lieu de 40 uM cisplatine et 10 uM paclitaxel), les cellules et les CSC de chimiorésistantes viables développés. La longueur et la dose de traitement peuvent avoir besoin d'être modifié pour différentes lignées cellulaires de cancer de l'ovaire.
La principale limite de ce protocole est la longueur que les CSC restent viables. En utilisant ce protocole, les CSC restent viables pendant moins d'une semaine. Par conséquent, etypes d'expériences et d'analyses pour la CSC e doivent être soigneusement planifiées.
Une caractérisation plus poussée de la CSC doit être menée. Il serait utile de comparer cette méthode de CSC à d'autres méthodes de génération SCC pour déterminer la similitude et de la différence entre ces deux types de cellules. Comparaison des marqueurs de cellules souches, la réponse au traitement, et le meilleur système pour l'analyse in vivo doit être menée entre les différentes méthodes de génération / sélection des CSC. Il a été suggéré qu'il existe différents types de CSC avec différents profils d'expression de marqueurs de cellules souches et le pronostic différent pour les patients 10-12, donc une définition plus précise de ce type de CSC sont générés par ce protocole peut aider à déterminer comment ils se rapportent à la malignité humaine . Enfin, afin de démontrer rigoureusement que les CSC isolées à partir de ce protocole sont les CSC définitives, cellules doivent être injectées dans des souris immunodéprimées dans un essai de dilution limite. Ceessai démontre que les CCF sont capables de générer des tumeurs de l'ovaire à une faible densité.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy | Life Technologies | 16600-108 | Warm to 37 °C prior to use |
| DMEM / F12 serum free | Life Technologies | 11320-033 | Warm to 37 °C prior to use |
| Minimal Essential Media | Life Technologies | 42360032 | Warm to 37 °C prior to use |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Blasticidin | Life Technologies | R21001 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | T7402-5MG | Caution: Toxic. Use precautions |
| pLenti-suCMV-Rsv | Gentarget | LVP023 | BSL2 approval needed |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Human Recombinant EGF | Cell Signaling Technology | 8916LC | |
| bFGF | BD biosciences | 354060 | |
| LIF | Santa Cruz | sc-4988A | |
| Bovine Serum Albumin | Roche | 03 116 956 001 | |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| IQ Multiplex Powermix | BioRad | 1725849 | |
| Accumax | Millipore | ||
| Primers | Integrated DNA Technology | individually designed and ordered (see protocol for sequnces) | |
| Anti-CD133 PE | Milenyl | 130-098-826 | Primer/probe sets are light sensitive |
| CD117-Biotin | Miltenly | 130-098-570 | |
| AntiBiotin-FITC | Miltenly | 130-098-796 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh. |
| Trypsin | Life Technologies | 25300062 | |
| MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) | Sigma-Aldrich | 25200-072 | |
| EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope | Advanced Microscopy Group | ||
| Biorad CFX96 C1000 System | Biorad | ||
| Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Spectramax 340PC384 | Molecular Devices |
References
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