Summary
कैंसर स्टेम कोशिकाओं (सीएससी) के कारण chemoresistance को ट्यूमर पतन में फंसा रहे हैं. हम चयन गर्भाशय के कैंसर कोशिका लाइनों से सीएससी के विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल अनुकूलित है. Chemotherapeutic सिसप्लैटिन साथ कोशिकाओं के इलाज और हम गैर पक्षपाती सीएससी संस्कृतियों के लिए बेहतर मीडिया को बढ़ावा देने के लिए एक स्टेम सेल में संवर्धन द्वारा.
Abstract
कैंसर स्टेम कोशिकाओं (सीएससी) धीमी साइकिल और अत्यधिक, proliferative आक्रामक उत्पन्न करने के लिए asymmetrically कि विभाजन undifferentiated कोशिकाओं, और chemoresistant ट्यूमर कोशिकाओं के एक सबसेट के रूप में परिभाषित कर रहे हैं. इसलिए, सीएससी therapeutically लक्षित करने के लिए कोशिकाओं का एक आकर्षक आबादी हैं. सीएससी रक्त, मस्तिष्क, फेफड़े, जठरांत्र संबंधी मार्ग, प्रोस्टेट, और अंडाशय में उन सहित कैंसर के प्रकार के एक नंबर के लिए योगदान करने के लिए भविष्यवाणी कर रहे हैं. अलग और सीएससी के लिए एक ट्यूमर सेल आबादी सीएससी के गुण, जेनेटिक्स, और चिकित्सीय प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए सक्षम शोधकर्ताओं जाएगा समृद्ध. हम reproducibly डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों (SKOV3 और OVCA429) से डिम्बग्रंथि के कैंसर सीएससी के लिए समृद्ध करती है कि एक प्रोटोकॉल उत्पन्न. सेल लाइनों 3 दिन के लिए 20 माइक्रोन सिसप्लैटिन के साथ व्यवहार कर रहे हैं. जीवित कोशिकाओं साइटोकिन्स और वृद्धि कारकों युक्त सीरम मुक्त स्टेम सेल मीडिया में पृथक और सुसंस्कृत हैं. हम कश्मीर के लिए अलग कक्षों का विश्लेषण करके इन शुद्ध सीएससी की एक संवर्धन का प्रदर्शनNown सेल मार्कर Oct4, Nanog, और Prom1 (CD133) और CD177 और CD133 की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति स्टेम. सीएससी प्रदर्शनी chemoresistance वृद्धि हुई. सीएससी के अलगाव के लिए इस विधि chemoresistance और ट्यूमर पतन में सीएससी की भूमिका के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण है.
Protocol
1 सेल डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिका लाइनों की संस्कृति और फ्लोरोसेंट लेबलिंग
- SKOV3 मीडिया तैयार: 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक मैककॉय मीडिया, 0.1 मिमी एल glutamine, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 50 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन. 10% FBS, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 0.1 मिमी एल glutamine, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन के साथ पूरक न्यूनतम आवश्यक मीडिया (सदस्य) में OVCA429 कोशिकाओं, और 50 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन बनाए रखें.
- 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में SKOV3 और OVCA429 सेल लाइनों प्रचार. 40-50% confluency के लिए कोशिकाओं को विकसित.
- इन विट्रो में और vivo में व्यवहार्यता पर नजर रखने के क्रम में लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) व्यक्त कोशिकाओं को उत्पन्न.
- , आरएफपी व्यक्त SKOV3 कोशिकाओं को उत्पन्न 72 घंटे के लिए पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के अभाव में SKOV3 मीडिया के लिए आरएफपी और 10 माइक्रोग्राम / एमएल polybrene व्यक्त lentiviral कणों को जोड़ने के लिए.
- 72 घंटे बाद, आरएफपी के लिए प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल sorti द्वारा सकारात्मक कोशिकाओं का चयनएनजी (FACS) इस प्रकार है: Trypsinize आरएफपी और गैर आरएफपी व्यक्त कोशिकाओं, 5 मिनट के लिए 125 XG पर अपकेंद्रित्र, 0.1% बीएसए युक्त पीबीएस में 10 7 कोशिकाओं / एमएल में resuspend कोशिकाओं. एक सेल सॉर्टर पर, छँटाई मानकों का निर्धारण करने के लिए गैर आरएफपी कोशिकाओं का उपयोग करें. फिर एक 561 एनएम लेजर का उपयोग उच्च आरएफपी व्यक्त कि कोशिकाओं को इकट्ठा.
- Lentiviral प्लाज्मिड एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट व्यक्त यदि वैकल्पिक रूप से, उचित एंटीबायोटिक में संवर्धन द्वारा आरएफपी व्यक्त कोशिकाओं के लिए चयन (जैसे 10 मिलीग्राम / एमएल blasticidin). नोट: बैच से और सेल प्रकार से भिन्न हो सकते हैं इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है कि lentiviral कणों की राशि. उचित lentiviral अनुमापांक प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए.
कैंसर स्टेम कोशिकाओं के 2 संवर्धन
- 72 घंटे के लिए सिसप्लैटिन के 20 माइक्रोन से SKOV3, SKOV3-आरएफपी, या OVCA429 सेल लाइनों समझो. चेतावनी: Cisplatin विषैला होता है. सुरक्षात्मक कपड़े / दस्ताने का प्रयोग करें और त्वचा और म्यूकस झिल्ली के साथ संपर्क से बचें. सिसप्लैटिन मैं के निपटान मतn अपशिष्ट.
- सीएससी मीडिया तैयार: सीरम मुक्त DMEM / F12 मीडिया 5 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन, 10 एनजी / एमएल मानव पुनः संयोजक epidermal वृद्धि कारक (EGF), 10 एनजी / एमएल बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF), 12 एनजी / एमएल ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक के साथ पूरक , और 0.4% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए).
- Trypsinize कोशिकाओं. संस्कृति सीएससी मीडिया में कोशिकाओं के जीवित.
नोट: संस्कृति गैर पक्षपाती spheroids में 2 दिन बनेगी बाद. - मीडिया कोशिकाओं से युक्त और 5 मिनट के लिए 125 XG पर centrifuging इकट्ठा करके हर 2 दिनों मीडिया बदलें. फिर ताजा सीएससी मीडिया में गोली resuspend. कोशिकाओं की गिनती और trypan नीले बहिष्कार प्रदर्शन से हर 2 दिन व्यवहार्यता के लिए कोशिकाओं की जाँच करें.
- (: 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, और 11.9 मिमी फॉस्फेट बफर, पीएच 7.4 पीबीएस) के साथ फिर 5 मिनट के लिए 129 XG centrifuging और फिनोल युक्त guanidinium thiocynate (आरएनए), फॉस्फेट बफर खारा में गोली resuspending द्वारा आगे के प्रयोगों के लिए सीएससी इकट्ठा (फ्लो के लिए) 0.1% बीएसए, या सीएससी मीडिया जारी रखने के लिएसंवर्धन कोशिकाओं.
- 20X और 40X आवर्धन पर एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग सीएससी सेल आकारिकी मॉनिटर.
स्टेम सेल मार्कर के लिए जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण के माध्यम से 3 सीएससी विशेषता
- मीडिया 5 मिनट के लिए 129 XG पर centrifuging, कोशिकाओं से युक्त एकत्रित करना, और फिनोल युक्त guanidinium thiocynate के समाधान में गोली resuspending द्वारा सीएससी की 3 की तैयारी को ले लीजिए (शाही सेना निकासी के लिए अन्य तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है).
- निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार TRIzol का उपयोग कर कुल शाही सेना तैयार करें. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीडीएनए रिवर्स प्रतिलेखन किट का उपयोग कर शाही सेना के 0.1-1 माइक्रोग्राम से पूरक डीएनए (सीडीएनए) synthesize.
- मात्रात्मक रिवर्स लिखित पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (QRT पीसीआर) को पूरा करें.
- नमूना प्रति 8 μl कुल QRT- पीसीआर मिश्रण, प्राइमरों, और पानी युक्त प्राइमरों के प्रत्येक सेट के लिए मास्टर मिश्रण अप (विभिन्न fluorophores साथ प्राइमरों एक ही कुएं में परिलक्षित किया जा सकता है). उदाहरण के लिए, उत्पन्नOct4-परिवार, Nanog-हेक्स, और GAPDH-Cy5 के लिए एक मास्टर मिश्रण. Nestin और Prom1 के लिए अलग मास्टर घोला जा सकता है उत्पन्न करता है. नमूना प्रति सीडीएनए टेम्पलेट के 2 μl जोड़ें.
नोट: इस अध्ययन के लिए, QRT पीसीआर 1 टेबल में सूचीबद्ध प्राइमरों उपयोग किया गया था. - कई fluorophores पता लगाने में सक्षम एक वास्तविक समय पीसीआर thermocycler का उपयोग प्रत्येक नमूने के लिए दो प्रतियों में सभी QRT- पीसीआर प्रदर्शन करना. कोई टेम्पलेट नियंत्रण शामिल हैं.
- ΔΔC टी पद्धति का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के लिए GAPDH अभिव्यक्ति के लिए स्टेम सेल जीन अभिव्यक्ति मानक के अनुसार.
- नमूना प्रति 8 μl कुल QRT- पीसीआर मिश्रण, प्राइमरों, और पानी युक्त प्राइमरों के प्रत्येक सेट के लिए मास्टर मिश्रण अप (विभिन्न fluorophores साथ प्राइमरों एक ही कुएं में परिलक्षित किया जा सकता है). उदाहरण के लिए, उत्पन्नOct4-परिवार, Nanog-हेक्स, और GAPDH-Cy5 के लिए एक मास्टर मिश्रण. Nestin और Prom1 के लिए अलग मास्टर घोला जा सकता है उत्पन्न करता है. नमूना प्रति सीडीएनए टेम्पलेट के 2 μl जोड़ें.
| Oct-4-परिवार | प्राइमर 1: 5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG -3 ' |
| प्राइमर 2: 5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG -3 ' | |
| परिवार जांच: 5'-CTTCCAAGC / ज़ेन / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 ' | |
| Nanog-हेक्स | प्राइमर 1: 5'-CCTTCTGCGTCACACCATT -3 ' |
| प्राइमर 2: 5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC -3 ' | |
| हेक्स जांच: 5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ -3 ' | |
| GAPDH-Cy5 | प्राइमर 1: 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG -3 ' |
| प्राइमर 2: 5'-ACATCGCTCAGACACCATG -3 ' | |
| Cy5 जांच: 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP -3 ' | |
| Nestin-परिवार | प्राइमर 1: 5'-AGGACCTGAGCGATCTGG -3 ' |
| प्राइमर 2: 5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG -3 ' | |
| परिवार जांच: 5'-AACTTTTCA / ज़ेन / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 ' | |
| CD133-हेक्स | प्राइमर 1: 5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC -3 ' |
| प्राइमर 2: 5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG -3 ' | |
| हेक्स जांच: 5'-ACAATCACT / ज़ेन / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ -3 |
QRT- पीसीआर द्वारा सीएससी लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया तालिका 1 प्राइमरों.
e_title "> 4. कोशिका की सतह मार्करों CD117 और CD133 के लिए विश्लेषण सीएससी- मीडिया कोशिकाओं से युक्त और 5 मिनट के लिए 125 XG पर centrifuging इकट्ठा करके फसल सीएससी. ब्रेक अप के लिए कोशिकाओं एक गैर proteolytic सेल टुकड़ी समाधान के 500 μl जोड़ें. 5 मिनट के लिए 125 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं सेल टुकड़ी समाधान निकालने के लिए. फिर ठंडे पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें.
- पूर्व लेबलिंग कोशिकाओं के लिए 1 घंटे के लिए सामान्य विकास मीडिया में सेते हैं. 129 x जी पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन. विरोधी CD133 पीई और विरोधी CD117-FITC के साथ 0.1% BSA के साथ पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend.
- 1% paraformaldehyde में रातोंरात कोशिकाओं को ठीक करें. सावधानी: Paraformaldehyde विषाक्त (संदिग्ध कैसरजन) है. धूआं हुड में बनाने के लिए और एक सप्ताह के भीतर का उपयोग करें.
- (पीई संयुग्मित विरोधी CD133 के साथ) और CD133 कोशिकामापी एक प्रवाह पर कोशिका की सतह अभिव्यक्ति (एक FITC संयुग्मित विरोधी CD117 के साथ) CD117 का विश्लेषण करने के लिए प्रवाह cytometry प्रदर्शन करना. चैनल (पीई के लिए) (FITC के लिए) FL1 और FL3 में कोशिकाओं पर डेटा इकट्ठा. दोनों व्यक्त कोशिकाओं के लिए फाटक उत्पन्नFITC और पीई. 4 quadrants (FITC- और पीई, FITC + पीई, FITC- पीई +, और FITC + और पीई +) के साथ एक डॉट साजिश उत्पन्न और प्रत्येक चक्र में कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते हैं.
5 चिकित्सीय प्रतिक्रिया के लिए सीएससी का विश्लेषण
- प्लेट रातोंरात 96 अच्छी तरह प्लेटें पर 5,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से (SKOV3, SKOV3-आरएफपी, SKOV3 सीएससी और SKOV3-आरएफपी सीएससी).
- 96 घंटे के लिए सिसप्लैटिन (0, 1, 10, 100, और 1000 माइक्रोन) या Paclitaxel (0, 0.01, 0.1, 1, 10, और 100 माइक्रोन) के साथ इलाज.
- MTT (3 (4,5-Dimethylthiazol-2-YL) -2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड) सेल व्यवहार्यता परख प्रदर्शन.
- एक 96 अच्छी तरह से थाली पर अच्छी तरह से प्रति 100 μl प्रति प्लेट 5,000 कोशिकाओं (दो प्रतियों में थाली कोशिकाओं और मीडिया केवल कुओं नियंत्रण शामिल हैं).
- 24 घंटे के बाद, 10 मिलीग्राम / एमएल MTT के 10 μl जोड़ें. (वेग रूपों तक) 2-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- MTT विलायक 4 मिमी एचसीएल के 100 μl, isopropanol में 0.1% एनपी 40 जोड़ें. अंधेरे में 15 मिनट के लिए सेते हैं.
- एक प्लेट आर पर 570 एनएम पर प्लेटें पढ़ेंeader.
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Representative Results
हम सिसप्लैटिन उपचार का उपयोग उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों से सीएससी पृथक दिखाना है कि, हम पहले पूर्व उपचार के लिए और चयन के बाद सेल लाइनों की छवियों का अधिग्रहण किया. हम पक्षपाती (इलाज) SKOV3 और OVCA429 कोशिकाओं और SKOV3 और OVCA429 सीएससी (चित्रा 1) की छवियों पर कब्जा करने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया. सीएससी टिशू कल्चर प्लेटों से जुड़ी दौर और नहीं दिखाई देते हैं (आंकड़े 1 और 2). हम आगे आरएफपी के साथ transduced SKOV3 कोशिकाओं कोशिकाओं (चित्रा 2B) व्यवहार्य हैं कि प्रदर्शन सीएससी के अलगाव के बाद उनके प्रतिदीप्ति बनाए रखने बताते हैं कि.
व्यवहार्य सीएससी संस्कृतियों दवा उपचार के लिए उनकी प्रतिक्रिया के लिए मूल्यांकन किया गया. सीएससी सिसप्लैटिन (विशेष रूप से कम 100 माइक्रोन) और Paclitaxel (10 माइक्रोन) (चित्रा 3) के लिए बढ़ा प्रतिरोध का प्रदर्शन किया. सीएससी अक्सर स्टेम सेल जीन की उनकी अभिव्यक्ति की विशेषता है. CD133 की अभिव्यक्ति (भी Prom1 के रूप में जाना जाता है), Nestin, Nanog, और Oct4 जांच की गई थी. CD133 काफी अनुपचारित (नियंत्रण) कोशिकाओं (चित्रा -4 ए) की तुलना में SKOV3 सीएससी संस्कृतियों में प्रेरित किया गया था. CD133 भी 16 गुना और OVCA429 और OVCA429-आरएफपी कोशिकाओं में 13 गुना से अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में सीएससी संस्कृतियों में प्रेरित किया गया था (नहीं दिखाया डेटा). प्रारंभिक प्रयोगों में Oct4, Nanog, और nestin इलाज की तुलना में SKOV3 सीएससी संस्कृतियों में ऊपर उठाया गया, लेकिन परिणाम सांख्यिकीय महत्वपूर्ण (चित्रा -4 ए) नहीं थे. दोहरा करने पर इन प्रयोगों Oct4 और Nanog माता पिता का नियंत्रण कोशिकाओं (चित्रा 4 बी) की तुलना में SKOV3 सीएससी में वृद्धि हुई है. Oct4 4.7 गुना और सीएससी संवर्धन प्रोटोकॉल के बाद OVCA429 और OVCA429-आरएफपी कोशिकाओं में 8 गुना की वृद्धि हुई थी () नहीं दिखाया. अंत में, SKOV3 सीएससी प्रदर्शनी (चित्रा 5) सीएससी मार्कर CD117 की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति की वृद्धि हुई. अंत में, इस विधि डिम्बग्रंथि के कैंसर में व्यवहार्य अंडाकार आकृति सीएससी (व्यक्त स्टेम सेल मार्कर) के चयन के लिए अनुमति देता हैस्टेम सेल मीडिया में सिसप्लैटिन और विकास के साथ चयन द्वारा सेल लाइनों.
SKOV3 और OVCA429 कोशिकाओं. चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी SKOV3 और OVCA429 कोशिकाओं इलाज कर रहे हैं और सीएससी (अंडाकार आकृति) के लिए चयनित किया गया है कि (अनुयायी) को दर्शाया गया है से चयनित SKOV3 और OVCA429 कोशिकाओं और कैंसर स्टेम कोशिकाओं की संख्या 1 आकृति विज्ञान (सीएससी).
सीएससी के लिए चित्रा 2 संवर्धन गैर पक्षपाती spheroids पैदावार. (ए) SKOV3 कोशिकाओं (60x बढ़ाई). (बी) के इलाज कर रहे हैं कि SKOV3-आरएफपी कोशिकाओं अनुपचारित और सीएससी के लिए समृद्ध (ए और बी) या सीएससी के लिए समृद्ध (C घ). वाम पैनल चरण विपरीत छवियों को दर्शाती है और सही पैनल प्रतिदीप्ति दर्शाती. मूल बढ़ाई 40X. स्केल बार = 400 माइक्रोन.
चित्रा 3 सीएससी प्रदर्शनी अनुपचारित सेल लाइनों की तुलना chemoresistance वृद्धि हुई. SKOV3 (ए और बी) और SKOV3-आरएफपी (सी और डी), SKOV3 सीएससी (ए और बी) और SKOV3-आरएफपी सीएससी (सी और डी) विभिन्न साथ इलाज किया गया सिसप्लैटिन (ए और सी) या Paclitaxel (Taxol) (बी और डी) की सांद्रता. 96 घंटे इलाज के बाद MTT परख प्रदर्शन किया गया था. प्रयोगों n≥3 में प्रदर्शन किया गया और आंकड़े दो मार्ग एनोवा का उपयोग कर की गणना की गई; * पी <0.05, *** पी < ;. 0.0005 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में सीएससी में चित्रा 4 स्टेम सेल मार्कर अभिव्यक्ति. QRT- पीसीआर विश्लेषण (ए) CD133 (Prom1), nestin, Nanog,. SKOV3 (नियंत्रण) और SKOV3 सीएससी के लिए प्रदर्शन किया था और OCT4 (GAPDH के लिए सामान्यीकृत). ( बी) SKOV3-आरएफपी सीएससी अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में ऊंचा OCT4 और Nanog के साथ इस प्रोटोकॉल उपज कोशिकाओं से प्राप्त प्रदर्शन है कि एक अतिरिक्त प्रयोग. परिणाम GAPDH अभिव्यक्ति के साथ सामान्यीकृत थे. एन = 3 और आंकड़े छात्रों टी परीक्षण का उपयोग कर की गणना की गई; ** पी <0.02, *** पी <0.002.
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SKOV3 कोशिकाओं में स्टेम सेल मार्कर की चित्रा 5 फ्लो विश्लेषण और SKOV3 सीएससी अकेले या transduced या आरएफपी के बिना. CD133, CD117, और CD133 (ए) SKOV3 में / CD117 अभिव्यक्ति (अनुपचारित / नियंत्रण) कोशिकाओं, (बी) SKOV3 सीएससी, (सी) SKOV3-आरएफपी अनुपचारित कोशिकाओं, और (डी) SKOV3-आरएफपी सीएससी. प्रयोगों तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया गया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
उपचार के लिए प्रतिरोधी रहे हैं कि सीएससी प्राथमिक ट्यूमर के इलाज के बाद पतन के लिए जिम्मेदार हो सकता है. सीएससी की विशेषता डिम्बग्रंथि के कैंसर के लिए सुधार के उपचारों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग chemoresistant सीएससी की स्थापना में महत्वपूर्ण पैरामीटर कीमोथेरेपी के साथ उपचार की लंबाई और कीमोथेरेपी की एकाग्रता समय कर रहे हैं. मा एट अल में प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय. यह सिसप्लैटिन और Paclitaxel के साथ इलाज के 7 दिनों के बाद, कोई व्यवहार्य कोशिकाओं 4 बने रहे कि पाया गया था. (20 माइक्रोन सिसप्लैटिन के बजाय 40 माइक्रोन सिसप्लैटिन और 10 माइक्रोन Paclitaxel साथ) 3 दिनों तक उपचार को कम करके, व्यवहार्य chemoresistant कोशिकाओं और सीएससी का विकास किया. लंबाई और उपचार की खुराक अलग डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों के लिए परिवर्तित करने की आवश्यकता हो सकती है.
इस प्रोटोकॉल के प्रमुख सीमा सीएससी सक्षम रहते हैं कि लंबाई है. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, सीएससी एक सप्ताह से भी कम समय के लिए व्यवहार्य रहते हैं. इसलिए, वेंसीएससी के लिए प्रयोगों और विश्लेषण के ई प्रकार के ध्यान से समय पर किए जाने की जरूरत है.
सीएससी के आगे लक्षण वर्णन आयोजित किया जाना चाहिए. यह इन प्रकार की कोशिकाओं के बीच समानता और अंतर को निर्धारित करने के लिए सीएससी पीढ़ी के अन्य तरीकों के लिए सीएससी की इस पद्धति की तुलना करने के लिए उपयोगी होगा. इन विवो विश्लेषण के लिए स्टेम सेल मार्कर, चिकित्सा के जवाब, और सबसे अच्छी प्रणाली की तुलना सीएससी का सृजन / चयन के लिए विभिन्न तरीकों के बीच आयोजित किया जाना चाहिए. यह स्टेम सेल मार्कर के विभिन्न अभिव्यक्ति पैटर्न और रोगियों 10-12 के लिए विभिन्न रोग का निदान, मदद मिल सकती है इस प्रोटोकॉल के द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं सीएससी की किस प्रकार से इस प्रकार आगे परिभाषा के साथ सीएससी के विभिन्न प्रकार वे मानव द्रोह से संबंधित हैं कैसे निर्धारित कर रहे हैं कि सुझाव दिया गया है . अंत में, क्रम में कड़ाई से कोशिकाओं एक सीमित कमजोर पड़ने परख में immunocompromised चूहों में इंजेक्शन करने की आवश्यकता है, इस प्रोटोकॉल से अलग सीएससी निश्चित सीएससी हैं कि प्रदर्शित करने के लिए. इसपरख सीएससी एक कम घनत्व पर डिम्बग्रंथि ट्यूमर उत्पन्न करने में सक्षम हैं कि यह दर्शाता है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy | Life Technologies | 16600-108 | Warm to 37 °C prior to use |
| DMEM / F12 serum free | Life Technologies | 11320-033 | Warm to 37 °C prior to use |
| Minimal Essential Media | Life Technologies | 42360032 | Warm to 37 °C prior to use |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Blasticidin | Life Technologies | R21001 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | T7402-5MG | Caution: Toxic. Use precautions |
| pLenti-suCMV-Rsv | Gentarget | LVP023 | BSL2 approval needed |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Human Recombinant EGF | Cell Signaling Technology | 8916LC | |
| bFGF | BD biosciences | 354060 | |
| LIF | Santa Cruz | sc-4988A | |
| Bovine Serum Albumin | Roche | 03 116 956 001 | |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| IQ Multiplex Powermix | BioRad | 1725849 | |
| Accumax | Millipore | ||
| Primers | Integrated DNA Technology | individually designed and ordered (see protocol for sequnces) | |
| Anti-CD133 PE | Milenyl | 130-098-826 | Primer/probe sets are light sensitive |
| CD117-Biotin | Miltenly | 130-098-570 | |
| AntiBiotin-FITC | Miltenly | 130-098-796 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh. |
| Trypsin | Life Technologies | 25300062 | |
| MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) | Sigma-Aldrich | 25200-072 | |
| EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope | Advanced Microscopy Group | ||
| Biorad CFX96 C1000 System | Biorad | ||
| Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Spectramax 340PC384 | Molecular Devices |
References
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