Introduction
Indførelsen af overekspression teknologier boostet enten biokemiske undersøgelser af lav kopital enzymer og industriel produktion af farmakologisk aktive proteiner (f.eks insulin). Siden indførelsen af disse teknologier, har betydelige fremskridt er opnået at øge udbyttet og kvaliteten af rekombinante proteiner. Derudover blev prokaryote 1,2 og eukaryote 3 overekspression systemer udviklet i årenes løb, der tilbyder nyttige alternativer til "arbejdshest" af protein bioteknologi, dvs Escherichia coli. Især tilgængeligheden af alternative platforme til E. coli førte til produktion af rekombinante peptider eller proteiner, der bærer post-translationelle modifikationer. Det bør imidlertid nævnes, at E. coli repræsenterer stadig organismen valg for rekombinant proteinproduktion. Dette skyldes flere faktorer, blandt hvilke de mest relevante kan væreovervejes: i) adgang til en lang række overekspression systemer (ekspressionsvektorer og stammer) for E. coli 1,2; ii) den korte generationstider og stor biomasse udbytter, E. coli i en række rige og syntetiske medier; iii) facile manipulation enten på biokemiske og på det genetiske niveau for denne mikroorganisme; iv) isolering af stammer i stand til produktion af toksiske proteiner 4; v) opførelse af stammer featuring homogen induktion på populationsniveau 5,6. Derudover blev det for nylig vist, at ekspressionssystemer er egnede til produktion i E. coli af posttranslationelt modificerede proteiner kan udtænkes og bygget 2.
På nuværende tidspunkt er proteinoverekspression hovedsagelig anvendes til at opnå monomere eller homo-oligomere proteiner, hvis hypersynthesis kan udføres med et enkelt gen klonet ind i et passende plasmid. Men opmærksomhed var for nyligbetalt til opførelsen af E. coli protein co-ekspressionssystemer, udfordrende produktion in vivo af hetero-oligomere komplekser 2. Interessant tidlige eksperimenter af protein co-ekspression behandlet mellem arterne samling af store og små underenheder af cyanobakteriel ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase / oxygenase 7,8, og sammenslutningen af afkortede og fuld længde former af HIV-1 revers transkriptase 9. Disse banebrydende studier viste, at protein co-ekspression er et effektivt alternativ til traditionelle in vitro rekonstitution. Desuden, protein co-ekspression i E. coli blev anvendt til at fremstille forskellige proteiner bærer posttranslationelle modifikationer 2 til opnåelse af proteiner, der indeholder unaturlige aminosyrer 2, og for at øge udbyttet af overudtrykte membranproteiner 2. Desuden skal potentialet af protein co-ekspression som et redskab bibringer E. coli konkurrerernce i proteinsekretion er under aktiv efterforskning 2.
To hovedstrategier af protein co-ekspression i E. coli kan forfølges: i) brug af et enkelt plasmid at være vært for forskellige gener, der skal overudtrykt; ii) anvendelse af multiple plasmider i enkelte celler at co-udtrykke målproteiner. I det første tilfælde gør kriterierne for valget af plasmidet ikke adskiller sig fra de traditionelle enkelt proteinoverekspression eksperimenter, selvom bestemte plasmider indeholdende tandem promotor / operator elementer blev konstrueret til co-ekspression 10. Denne første fremgangsmåde er derfor ganske enkel. Det bør imidlertid nævnes, at anvendelsen af et enkelt plasmid til at co-udtrykke forskellige proteiner står over for to store problemer: i) den molekylære masse af vektoren stiger med antallet af hostede gener, begrænser antallet af co-udtrykte proteiner; ii) når flere gener klones under kontrol af en enkelt promotor, polaritet kan decrease ekspressionen af generne distalt fra promotoren. Brugen af dobbelte eller flere plasmider i single E. coli-celler har til at udføre foreneligheden af vektorer af valg, derfor pålægge begrænsninger for de støtteberettigede kombinationer af plasmider. Men denne anden co-ekspression strategi indeholder den fordel indeholder den molekylære masse af vektorer, og begrænser polaritet. Vi har for nylig bygget et protein co-ekspression, der er designet til at lette shuttling af gener mellem co-ekspressionsplasmider 11. Især bygget vi pGOOD vektorer serien, de relevante funktioner, som er: i) en p15A replikationsstartområde, at give forenelighed pGOOD plasmider med de kommercielle vektorer indeholdende ColE1 (f.eks pBAD serie 12); ii) et tetracyclin-resistens-kassette; iii) tilstedeværelsen af lac-afledt regulerende elementer, dvs. Ophavsmanden-operatør (O 1) par og lacl q-gen. Ved hjælp af en passende pBAD-pGOOD par, var vi i stand til at overudtrykke den katalytiske kerne af E. coli DNA-polymerase III, som består af tre forskellige underenheder, dvs. α (5'-3 'polymerase), ε (3'-5' exonuclease) og θ (stabiliserende ε) 13. Vi har navnlig vist, at co-ekspression af αεθ komplekset var strengt afhængig af tilføjelsen til E. coli dyrkningsmedium både IPTG og arabinose, udløser overekspression fra pGOOD og pBAD, (figur 1A).
I nærværende rapport, illustrerer vi, hvordan protein co-ekspression effektivt kan løse problemer i forbindelse med ringe opløselighed af et protein kompleks underenhed. Desuden viser vi, hvordan in vivo protein komplementeringsgrupper tests kan udføres, og vi endelig rapport om anvendelsen af protein co-ekspression at tune mutationsfrekvens i E. coli. Til dette formål anvendte vi pGOOD-pBAD par egnede til at illustrere relevante eksempler på hver casestudie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering af E. coli Co-transformanter
- Forbered elektro-kompetente celler af den passende E. coli-stamme, der skal transformeres. Overførsel til 1 ml LB-medium (trypton, gærekstrakt, NaCI ved 10, 5 og 10 g / l) en enkelt koloni af stammen af valg, og inkuberes ved 37 ° C under rystning betingelser på 180 rpm. Fortynd præ-kultur 1: 500 i 25 ml frisk LB-medium og inkuberes kulturen ved 37 ° C.
- Ved log-fase (0,6 OD) centrifugeres cellerne suspensionen ved 5.000 xg i 20 minutter), og pellet resuspenderes i 10% v / v iskold steril glycerol-vand i halvdelen af den oprindelige kultur volumen. Gentag dette trin 4 gange, halvere hver gang ophvirvling volumen. Endelig pellet resuspenderes i glycerol / vand og opdele celler suspension i 50 pi alikvoter. Opbevar de afmålte mængder ved -80 ° C op til 6 måneder.
- Opløs det ønskede plasmid i sterilt vand suppleret med 0,5 mM EDTA. Thaw på ice en alikvot af elektro-kompetente celler og blandes med en passende mængde (2,5-5 ng) af vektoren. Dispenser blandingen i en 0,1 cm kuvette egnet til elektroporering og anvende 1,8 kV.
- Umiddelbart overføre elektroporerede celler i 1 ml SOC-medium (LB-medium suppleret med 0,2% w / v glucose, 10 mM MgCl2, 2,5 mM KCI), inkuberes i 1 time under omrystning, og endelig overføres 100 pi alikvoter til petriskåle indeholdende LB-agar med passende antibiotika. Inkuber O / N ved 37 ° C.
- Oprens transformanterne ved udstrygning enkelte kolonier på petriskåle.
- Forbered elektro-kompetente celler af de primære transformanter, og gentag trin 1,1 til 1,5 for at omdanne yderligere plasmider.
- Forbered glycerol lagre af de co-transformanter. Overfør en enkelt koloni i LB suppleret med passende antibiotika, inkuberes ved 37 ° C under omrystning, og ved log-fase (0,6 OD) centrifuge cellerne suspensionen ved 5.000 xg i 20 min. Resuspend pellet i LB-antibiotika medium indeholdende 15% v / v glycerol. Dispenser i portioner og opbevares ved - 80 ° C.
2. Samarbejdet udtryk for α og ε underenheder af E. coli DNA Polymerase III
- Med en steril loop en lille mængde af den relevante stamme glycerolstamopløsning (f.eks TOP10 / pGOOD-ε243 og TOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160, se figur 1) i en petriskål indeholdende LB-medium og antibiotika. Lad celler suspension tør på petriskålen, og streak cellerne dråbe. Der inkuberes ved 37 ° CO / N.
- Overførsel ved hjælp af en steril tandstikker, en enkelt koloni til 1 ml LB-antibiotika medium. Inkuber 8 timer ved 37 ° C. Fortynd præ-kultur 1: 500 i frisk medium og inkuberes ved 30 ° C i 15 timer.
- Tilføj IPTG, arabinose eller arabinose og IPTG 1 mM hver. Inkuber ved 30 ° C i 2,5 timer. Opsamle cellerne og lagre pellets ved -20 ° C.
- Optø pellets på is og resuspenderes i lysepuffer (50 mM Tris-HCI, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA, 2,5 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), pH 8). Forsigtigt homogenisere celler suspension med et koldt glas potter.
- Soniker ved 15 W i 15 sekunder, efterfulgt af 15 sek køling interval (4 cyklusser).
- Centrifuger de samlede proteinekstrakter ved 10.000 xg i 20 min ved 4 ° C for at genvinde den opløselige fraktion.
- Analyser ved SDS-PAGE (12,5% acrylamid) portioner af hver opløseligt proteinekstrakt. Til dette formål overføres 20 ul af hver opløseligt proteinekstrakt til Eppendorf-rør indeholdende 60 ul H2O og 20 pi loading buffer (250 mM Tris-HCI pH 6,8, 10 mM β-mercaptoethanol, 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) glycerol, 0,25% (w / v) bromphenolblåt) og koges i 5 min. Load 18 pi af hver prøve og udfører elektroforese ved 140 V i ca. 1,5 timer.
3. Co-ekspression af α subunit af Deinococcus radiodurans DNA Polymerase III og ε-underenheden af E. coli DNA Polymerase III
- Forbered en forkultur af E. coli stamme TOP10 / pBAD-α Dr / pGOOD-ε243 i 1 ml LB-ampicillin-tetracyclin medium og inkuberes 8 timer ved 37 ° C. Fortynd 1: 1.000 i frisk medium og inkuberes O / N ved 37 ° C.
- Fortyndes 1: 100 i 200 ml frisk medium, inkuberes ved 37 ° C i 3 timer, derefter inducere i 3 timer med arabinose og IPTG 1 mM hver. Cellerne høstes, og opbevar pellet ved -20 ° C.
- Pelleten resuspenderes i 50 mM Tris-HCI pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF. Homogeniseres og forstyrre cellerne som beskrevet i punkt 2.4 og 2.5.
- Umiddelbart centrifugeres cellerne lysat ved 10.000 xg i 20 min. Kassér pellet. Filtreres supernatanten med en Buchner-tragt udstyret med 3 lag af papir filter. Anvend blid vakuum. For at undgå for meget skum, holde vakuum Erlenmeyerkolbe på is under filtrering.
- Bestem protein koncentrationen i henhold til Bradford 14.
4. Gelfiltrerinqskromatografi
- Ækvilibrer en vandkappeudstyrede 16x70 (200) gelfiltreringssøjle med 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8. Load på søjlen opløseligt protein ekstrakt. For optimal opløsning, brug en 1 ml prøve loop. Udfør kromatografi på 0,6 ml / min. Hold søjletemperatur ved 4 ° C hele vejen igennem.
- Saml 0,9 ml fraktioner og analysere dem ved SDS-PAGE. Transfer 20 pi af hver relevant fraktion til Eppendorf-rør indeholdende 60 ul H2O og 20 pi loading buffer (250 mM Tris-HCI pH 6,8, 10 mM β-mercaptoethanol, 10% (w / v) SDS, 50% ( v / v) glycerol, 0,25% (w / v) bromphenolblåt) og koges i 5 min. Load 18 pi af hver prøve og udfører elektroforese ved 140 V i ca. 1,5 timer.
- Bestem 3'-5'-exonuklease, og DNA-polymerase-aktivitet af hver fraktion i 96-vill mikroplader. Assay exonukleaseaktivitet hjælp thymidin 5'-monophosphat p-nitrophenylester (p NP-TMP) som substrat 15. Skøn DNA-polymeraseaktivitet under anvendelse af PPX (pyrophosphatase, purinnukleosidphosphorylase, xanthin oxidase) enzym-koblet assay 16 og 2- (4-iodphenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazolium-chlorid (INT) som elektronacceptor 16.
5. Mutation Analyse af populationer Co-udtrykkende vildtype-ε-underenheden af E. coli DNA Polymerase III og den mutagene εD12A Variant
- Overfør en enkelt koloni af E. coli TOP10 indeholdende pBAD-ε og pGOOD1-εD12A 11 vektorer til 1 ml LB-antibiotika medium. Inkuber O / N ved 37 ° C.
- Fortynd præ-kultur 1: 250 i 3 kolber indeholdende frisk medium (10 ml), tilsæt passende inducere (arabinose, IPTG eller arabinose og IPTG 1 mM hver) og inkuber ved 37 ° Ci 8 timer. Forbered i parallelle ikke-inducerede kulturer.
- Saml portioner på 1 ml, derefter fortyndet 1: 500 i nye kolber indeholdende frisk medium (10 ml) suppleret eller ikke med de relevante inducere. Inkuber O / N ved 37 ° C.
- Gentag trin 5.2 og 5.3 og indsamle portioner på 1 ml.
- Bestem antallet af generationer fandt sted i hver kultur. Overførsel på LB-plader, 100 pi passende serielle fortyndinger af inokulum og kultur. Inkuber O / N ved 37 ° C. Kolonierne på LB-plader, og beregne logaritmen af antallet af celler til stede i podestoffet (log I) og i kulturen ved slutningen af vækst (log C). For at bestemme antallet af generationer, bruge formlen: (log C - log I) /0.301.
- Centrifuger ved 5.000 xg i 20 minutter, og cellerne resuspenderes i 1 ml 50 mM Tris-HCI pH 7,6, 50 mM NaCl. For at permeabilisere cellerne tilsættes 2-3 dråber chloroform og vortex for 20 sec.
- Bestem β-glucosidase-aktivitet af hver alikvot i en 96-brønds mikroplade, ved anvendelse af p-nitrophenyl-β-D-glucopyranosid (PNPGluc) som substrat. Tilsættes til hver brønd 100 pi permeabiliserede celler og 100 pi substrat (16 mg / ml stamopløsning i H2O). Sørg for at undgå luftbobler i brøndene. Læs absorbans ved 420 nm under anvendelse af en mikropladelæser og passende filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ε-underenheden af E. coli DNA-polymerase III består af 243 aminosyrer og har ringe opløselighed 17,18, medmindre resterne 187-243 slettes 17. Imidlertid har vi tidligere vist, 11 at co-ekspression af fuld længde α, ε og θ underenheder giver opløseligt DNA-polymerase III katalytisk kerne (Figur 1). Især ved anvendelse af pBAD-pGOOD co-ekspressionssystem, vi påvist, at: i) kan overekspression af α og ε underenheder styres uafhængigt af arabinose og IPTG (figur 1A); ii) fuld længde ε subunit kan påvises i opløselige proteinekstrakter isoleret fra E. coli-celler, der overudtrykker α, ε og θ og underkastet gelfiltrering (Figur 1B). I dette tilfælde blev exonukleaseaktivitet fordelt i 3 store toppe (figur 1B, udfyldte cirkler) og top centreret ved fraction 23 blev vist at indeholde αεθ katalytiske kerne (figurerne 1C og 1D). Stabiliteten af ε er stærkt forøget efter binding til α og θ. Når vi tidligere overudtrykt fuld længde ε i E. coli, en lav mængde af fri ε blev detekteret ved western blotting i opløselig proteinekstrakter 19 (figur 2A). Det er interessant at bemærke, at under de samme betingelser, vi altid opdaget højere mængder af frie C-ter trunkerede former af ε (ε-234, ε-228, ε-213, eller ε-186), blandt hvilke ε-186 udføres bedre 19 (figur 2A). Vi viser også, at proteolyse af ε C-terminale domæne forhindres af binding til α og θ underenheder 19. Den eventuelle virkning af co-ekspression på opløseligheden af ε kan let testes. Som rapporteret i figur 2B, opløselige proteinekstrakter isoleret fra celler, der overudtrykkerα, ε, eller α og ε kan analyseres ved SDS-PAGE, og bekvemt forhold til de samlede proteinekstrakter. I dette tilfælde, den elektroforetiske analyse viser, at når overudtrykkes alene, ε subunit funktioner dårlig opløselighed (sammenlign bane 1 og 2), medens co-ekspression af α høj grad øger koncentrationen af ε i opløselige proteinekstrakter (sammenlign bane 3 og 4 ).
Co-ekspression kan også anvendes til at udføre inter-species komplementeringsgrupper tests. Derfor vi troede, det kunne være af interesse at vurdere samspillet mellem underenheder, der tilhører de replikative machineries i Gram + og Gram -. Bakterier Deinococcus radiodurans er en Gram + bakterie, og byder på en stor α-subunit (1.335 aminosyrer, 150 kDa) og en formodet ε underenhed indeholdende 197 aminosyrer. Interessant D. radiodurans ε underenheden mangler det C-terminale domæne til stede i E. coli E. coli og D. radiodurans ε underenheder er lig med 29% og 59%, henholdsvis (overvejer regionen 1-178, D. radiodurans koordinater). For at analysere kompetence D. radiodurans polymerase III α underenhed (α Dr) i binding E. coli ε underenhed, har vi klonet ind i pBAD-vektoren et syntetisk gen, der koder for α DR og vi har co-transformeret E. coli med pBAD-α Dr og pGOOD-ε. Den samtidige tilsætning af IPTG og arabinose til dyrkningsmediet udløser co-ekspression af α DR og ε (figur 3A). Foreningen af disse 2-proteiner blev testet ved gelfiltrering. Celler co-ekspression af DNA-polymerase III α DR og ε underenheder blev opsamlet ved centrifugering (5.000 x g, 20 min), suspenderet i lysisbuffer, sprængt ved sonikering, og de opløselige proteiner blev øjeblikkeligly påsat en Superdex 200-søjle (figur 3B). Som figur 3C viser, når de indsamlede fraktioner blev underkastet 3'-5'-exonuklease og DNA-polymeraseaktivitet assays blev aktivitet toppe detekteres ved betydeligt forskudt positioner, hvilket antyder, at α Dr er ikke kompetent til binding E. coli ε underenhed. Dette blev bekræftet, da portioner af fraktioner 32, 36, og 52 blev koncentreret og analyseret ved SDS-PAGE. Fraktion 36 viste sig at indeholde α dr og være blottet for E. coli ε underenhed, mens fraktion 52 indeholdt E. coli ε men manglede α Dr (figur 3D).
Replication troskab primært bygger på evnen af DNA-polymeraser at diskriminere mod fejlagtige baseparringer under DNA udvidelse. Ikke desto mindre kan uoverensstemmende deoxynucleotider inkorporeres ved 10 -4 frekvens 20, og handlingen3'-5 'exonukleaser er vigtigt at læse korrektur den nysyntetiserede DNA-streng. Desuden blev det anslået, at dette DNA redigering handling øger replikation troskab med 3 størrelsesordener 20. Følgelig kan mutatorstammer konstrueres ved at ændre DNA korrekturlæsning, fx ved konditionelt at udtrykke et mutagen variant af E. coli DNA-polymerase III ε underenhed. Dette kan opnås konstruere en variant af ε kompetent i binding α men blottet for sin korrekturlæsning aktivitet, og kontrollere produktionen af mutagene ε af passende ekspressionssystemer. Ved hjælp af denne strategi, blev det vist, at E. coli mutation stigende frekvens under betingelser, der inducerer mutagene varianter af ε 11,21. Der blev imidlertid ikke finjustering af mutationsfrekvensen opnås ved det betyder. Kan bruges Protein co-ekspression for at opnå en bedre kontrol med mutatorstammer. Til dette formål har vi co-transformeret E. coli medpBAD-ε og pGOOD1-εD12A for at inducere ekspression af vildtype og mutagene D12A variant af ε med arabinose og IPTG hhv. Som en fænotypisk test, vi bestemt udseendet af β-glucosidaseaktivitet, som er kryptisk (Bgl -) i vildtype E. coli 22,23. Spontane mutanter stand til at udnytte β-glucosider som carbonkilder (Bgl +) kan beriges eller isoleres under anvendelse af flydende 23 eller faste medier 24, hhv. Når celler blev induceret til at udtrykke D12A mutagene variant blev β-glucosidaseaktivitet erhvervet i ca. 20 generationer (figur 4A). Det skal bemærkes, at en lignende tendens blev observeret i ikke-inducerede celler (figur 4A), sandsynligvis fordi transkriptionel kontrol udøves på pGOOD1 er temmelig utæt 11. Men når vildtype-ε-underenhed blev induceret, alene eller i forbindelse med D12A variant β-glucosidaseaktivitet blev overtaget af E. coli på et moderat niveau (figur 4A). Den β-glucosidase-aktivitet af Bgl + mutanter blev rapporteret at ligge mellem 3 og 40 pM / min. 23 Niveauet bestemmes her i E. coli befolkninger udsat for ekspressionen af εD12A er meget lavere, men det bør overvejes, at vi ikke har forsøgt at isolere BGL + mutanter på faste medier.
Figur 1. Co-ekspression af E. coli DNA-polymerase III katalytisk kerne. (A) SDS-PAGE af totale proteiner ekstraheret fra E. coli TOP10 / pBAD-α1160 / pGOOD-ε243 dyrket i fravær af inducere, i overværelse af arabinose kun af IPTG kun, eller i medium suppleret med både arabinose og IPTG (bane 1-4, henholdsvis). (B) Absorbans (tomme cirkler) og exonukleaseaktivitet (udfyldte cirkler) af fraktioner isoleret ved at underkaste til gelfiltrering opløselige proteiner udvundet fra E. coli TOP10 overudtrykker α, ε og θ underenheder af E. coli DNA Pol-III. (C) SDS-PAGE af fraktionerne 6, 12, 23, 31 og 41 (bane 1-5, henholdsvis) rapporteret i Panel B. (D) SDS-PAGE af en koncentreret prøve af fraktion 23, hvis exonukleaseaktivitet og elektroforetisk mønster er rapporteret i paneler B og C hhv. Genoptrykt med tilladelse fra Bioteknologi Letters, 33, Conte et al:. "PGOODs: nye plasmider for co-ekspression af proteiner i Escherichia coli.", 1815-1821 (2011) Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. proteolyse af E. coli DNA-polymerase III ε underenhed. (A) Nedbrydning af monomere som afsløret ved Western blotting af proteiner ekstraheret fra E. coli TOP10 overudtrykker fuld længde eller trunkerede former af ε; pilespidser angiver positionen af 25 og 19 kDa pre-farvede molekylære markører. Genoptrykt med tilladelse fra Elsevier fra Biochimica et Biophysica Acta Proteiner og proteomforskning, 1794 Bressanin et al: ". Proteolyse af korrekturlæsning underenheden styrer samling af Escherichia coli DNA-polymerase III katalytisk kerne", 1606-1615 (2009). (B) co-ekspression af α og ε underenheder af E. coli DNA-polymerase III katalytisk kerne. SDS-PAGE af totale (bane 1 og 3) og opløselige (bane 2 og 4) protein ekstracts isoleret fra celler, der overudtrykker ε underenhed (bane 1 og 2), eller α og ε underenheder (bane 3 og 4).
Figur 3. Co-ekspression af DNA-polymerase III α og ε subunits fra Deinococcus radiodurans og Escherichia coli, henholdsvis. (A) SDS-PAGE af de samlede proteinekstrakter isoleret fra celler ikke induceret (bane 1), eller induceret til at overudtrykke α Dr, ε, eller α DR og ε (bane 2-4, henholdsvis). (B) Chromatogram (tomme cirkler, venstre akse) og protein koncentration af fraktioner (udfyldte cirkler, højre akse) elueret danne en gelfiltreringssøjle (Superdex 200) fyldt med opløselige proteiner ekstraheret fra E. coli overekspression α Dr and ε underenheder. (C) Korrekturlæsning (tomme cirkler, venstre akse) og DNA-polymerase (udfyldte cirkler, højre akse) aktiviteter fraktionerne rapporteret i Panel B. (D) SDS-PAGE af koncentrerede portioner af fraktioner 32, 36, og 52. Klik her for et større version af dette tal.
Figur 4. mutationsfrekvens E. coli-celler underkastes eller ikke at co-ekspression af vildtype og mutagene variant D12A af DNA-polymerase III ε underenhed. Kortet over det nye plasmid pFINE er også vist. (A) β-glucosidase-aktivitet i E. coli TOP10 ikke induceret (nr Ind) eller udsættes for overekspression af vildtype-ε underenhed (ARA), mutagene variant D12A (IPTG), eller begge vildtype og D12A ε underenheder (Ara + IPTG). Den β-glucosidase-aktivitet rapporteres som en funktion af generationer. (B) Kort over det nye ekspressionsvektor pFINE. Den kloningssite (MCS) multiplum af dette plasmid er identisk med de tilstedeværende i den kompatible pBAD og pGOOD vektorer lade facile shuttling af gener blandt dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proteiner kan være uløseligt uorganiseret, og byder på regioner, hvis tertiære struktur er ikke begrænset til et begrænset antal konformationer 25. Disse uordnede proteiner er normalt tilbøjelige til aggregering 25 og deres isolering og karakterisering kan udgøre en vanskelig opgave. Den ε-underenheden af E. coli DNA-polymerase III er udstyret med to adskilte domæner 26,27, nemlig: i) N-ter domæne, der er forsynet med 3'-5'-exonukleaseaktivitet, og kompetent i binding af θ underenheden; ii) C-ter domæne, er ansvarlig for binding til α (polymerase) underenhed. C-ter domæne af ε er kendt for at give dårlig opløselighed til dette protein, fremme dens aggregering. Det blev faktisk påvist, at ε-186, en trunkeret form af proteinet uden C-ter domæne, er opløseligt, og kan renses med høje udbytter 17. Men når interaktionen af ε med α skal kvantitativt undersøgt(Fx til at bestemme K D αε kompleks), er oprensning af fuld længde ε påkrævet, hvilket indebærer en vanskelig biokemisk opgave. Inden for denne ramme, protein co-ekspression tilvejebringer kvalitative vurderinger af bindingen af ε at α. Vi har vist, at høje udbytter af αεθ komplekset kan opnås in vivo ved co-ekspression (figur 1), uden om ringe opløselighed ε underenhed. Bemærkelsesværdigt er oprensningen af overudtrykte αεθ kompleks blevet rapporteret 28,29. Den co-ekspression strategi kan også anvendes til at teste, hvorvidt insertionen af stedspecifikke mutationer i en af de interagerende partnere hæmmer kompleksdannelse. Følgelig protein co-ekspression er en praktisk og hurtig værktøj til at udføre kvalitative test af protein-protein-interaktion. Det skal også bemærkes, at vores co-ekspression system bygger på 2 forskellige inducere, dvs. arabinose og IPTG. Derfor kan passende kontrol let udføres ved prøvning dannelse af et protein-kompleks, f.eks udelade en inducer fra det bakterielle vækstmedium (figur 1A).
Vi præsenteres her en optimeret procedure for co-ekspression af den α og ε underenheder af E. coli DNA polymerase III. Når denne protokol blev designet og testet, blev de følgende parametre identificeret som afgørende for succes af co-ekspression eksperimenter: i) den temperatur, ved hvilken induktion udføres; ii) den tid-længde induktion; iii) koncentrationen af inducer (e). Især kunne vi ikke opnå opløseligt αεθ komplekse 11 fra celler induceret ved 37 ° C, uafhængigt af induktion tid. Vi foreslår derfor at afprøve forskellige temperaturer for induktion skridt, og at kontrollere overekspression af proteiner som funktion af tiden. Derudover parallel evaluering af co-ekspression i different E. coli stammer kan være til hjælp, når de står moderate udbytter af målproteinerne.
Vi har rapporteret her et repræsentativt eksperiment udført for at teste binding af proteiner fra forskellige arter, og vi har vist, at protein co-ekspression er nyttig til hurtigt at teste associering 2 heterologe proteiner i en hybrid funktionelt kompleks. Gelfiltreringskromatografi blev her anvendt til at evaluere kompleksdannelsen (figur 3). Indsættelse af en passende tag til en af de samvirkende parter, kan imidlertid lette denne evaluering, så brugen af affinitetsindfangning metoder. For at undgå interferens af tag med protein-protein-interaktioner, kan genet kodende for en af de samvirkende parter blive indsat parallelt i pBAD / His og pBAD / Myc His vektorer henholdsvis giver en hexahistidin motiv ved N- og C terminalen af målproteinet.
E. coli mutator-stammer har mutationsfrekvenser højere end deres vildtype kolleger. Mutatorstammer er af interesse inden for bioteknologi 30, fx til hurtigt at udvikle sig et mål stamme i retning af nye, ønskede, fænotyper. Vi forudsat her bevis for, at co-ekspression af vildtype og mutagene ε underenhed af E. coli DNA-polymerase III, mutationsfrekvensen af den bakterielle vært kan indstilles med tilstrækkelig bekvemmelighed. For yderligere at forbedre denne teknologi er det nødvendigt at undertrykke så meget som muligt ekspressionen af stærkt mutagene D12A variant af ε subunit stramt regulerede ekspressionsvektorer. I særdeleshed ville det være interessant at teste mutationsfrekvensen i E. coli transformeret med pBAD-εD12A og pGOOD1-ε, dvs. konfigurationen alternativ, der præsenteres her. PBAD vektorer er faktisk kendt for at være stramt reguleret 12, og denne funktion kan hjælpe med at holde den basale koncentration af εD12Aved lave niveauer.
Eksempler på protein co-ekspression rapporteret her vidner de mange facetter ved denne teknik. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at ved hjælp af en flerhed af kompatible plasmider i enkelt E. coli-celler kan i høj grad udvide de udfordringer, som kan tages op af protein co-ekspression. I de senere år blev intenst arbejde viet til at udvide det repertoire af kompatible plasmider, der skal anvendes for protein co-ekspression. Især blev et tredelt system, bygger på kompatible plasmider bærer ColE1, p15A og pSC101 replikationsstartsteder bruges til at co-udtrykke enten bakterie- og pattedyrproteiner 31. For nylig blev en kvaternær co-ekspressionssystem rapporteret. I dette tilfælde blev 13 heterologe gener co-udtrykkes i E. coli co-transformeret med 4 kompatible ekspressionsvektorer indeholdende ColE1, p15A, CloDF13 og RSF replikationsoriginer 32. Denne co-ekspression system blev med succes anvendt til at producereE. coli funktionelt aktiv opløselig hydrogenase I fra Pyrococcus furiosus 32. At udvide vores binære system, konstruerede vi en ny ekspressionsvektor, pFINE, indeholdende pSC101 replikationsstartområde, et neomycin-resistens-kassette, og de regulatoriske elementer lac (figur 4B). Dette plasmid indeholder den samme polylinker stede i pBAD og pGOOD vektorer således lette gen shuttling blandt de 3 komponenter i co-ekspressionssystem. Selv pFINE er en lavt kopital blev stabiliteten sig at være tilfredsstillende, når testet i rigt medium. Vi er i øjeblikket involveret i en yderligere udvidelse af vores ternære co-ekspression system. Til dette formål har vi konstrueret en pBAD derivat indeholdende et chloramphenicol-resistens kassette, og vi er på vej til at udveksle ColE1 replikation med en kompatibel med ColE1, p15A og pSC101. Det er faktisk vores opfattelse, at brugen af flere plasmider i single E. coli-celler repsenterer et kraftfuldt værktøj til at udfordre ekspressionen in vivo af protein komplekser sammensat af et væld af forskellige subunits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Den tilladelse fra Springer og Elsevier at genoptrykke tal er stærkt anerkendt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| INT | Sigma-Aldrich | I8377 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PNP-gluc | Sigma-Aldrich | N7006 | |
| pNP-TMP | Sigma-Aldrich | T0251 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 95039 | |
| Yeast extract | Fluka | 70161 | |
| Acrylamide solution 30% | BioRad | 161-0158 | For gel electrophoresis |
| Ammonium persolphate | BioRad | 161-0700 | For gel electrophoresis |
| Glycine | BioRad | 161-0718 | For gel electrophoresis |
| SDS | BioRad | 161-0302 | For gel electrophoresis |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | For gel electrophoresis |
| Tris | BioRad | 161-0719 | For gel electrophoresis |
| Cuvettes 0.1 cm | BioRad | 1652089 | For electroporation |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Centrifuge Allegra 21R | Beckman | ||
| Chromatography apparatus GradiFrac | Pharmacia Biotech | ||
| Gene Pulser II electroporation | BioRad | ||
| Microplate Reader 550 | Biorad | ||
| MiniProtean 3 cell | BioRad | ||
| Power Supply | BioRad | ||
| Sonicator 3000 | Misonix |
References
- Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids. Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).
- Hochkoeppler, A. Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).
- Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. Eukaryotic expression systems: a comparison. Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
- Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).
- Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).
- Tabita, F. R., Small, C. L. Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).
- Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli. EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).
- Amann, E., Brosius, J. ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).
- Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins. Nucleic Acids Res. 35 (6), e43 (2007).
- Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).
- Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- McHenry, C. S. DNA replicases from a bacterial perspective. Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Hamdan, S., et al. Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III. Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).
- Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes. BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).
- DeRose, E. F., et al. Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data. Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).
- Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker. Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).
- Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core. Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).
- Schaaper, R. M. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12. Nature. 293, 625-629 (1981).
- Schaeffer, S. Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides. J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).
- Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. Direct selection for mutators in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).
- Dunker, A. K., et al. The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins. BMC Genomics. 9, Suppl 2. (2008).
- Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site. J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).
- Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III. Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).
- Kim, D. R., McHenry, C. S. In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits. J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).
- Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp. Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).
- Greener, A., Callahan, M. XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain. Strategies. 7, 32-34 (1994).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E. Jr, McTernan, P. M., Adams, M. W. W. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PloS One. 5 (5), (2010).
