Introduction
overekspresyonu teknolojilerin tanıtılması düşük kopya sayısı enzimlerin biyokimyasal çalışmalar ve farmakolojik olarak aktif proteinlerin (örneğin, insülin) sanayi üretimi ya artırdı. Bu teknolojilerin gelişiyle bu yana, önemli gelişmeler rekombinant proteinlerin verim ve kaliteyi artırmak için elde edilmiştir. Buna ek olarak, prokaryotik ve ökaryotik 1,2 3 ekspresyonu sistemleri, protein biyoteknoloji, yani, Escherichia coli "iş atı" yararlı alternatifler sunan, yıllar içinde geliştirilmiştir. E. alternatif platformların Özellikle, kullanılabilirlik E. coli rekombinant peptitler veya post-translasyonel modifikasyonlar taşıyan proteinlerin üretimine yol açtı. Bununla birlikte, söz edilmelidir E. E. coli halen yeniden birleştirici protein üretimi için tercih edilen bir organizmayı ifade eder. Bu en alakalı olabilir aralarında çeşitli faktörler, nedeniylekabul: i) ekspresyonu sistemleri (ifade vektörleri ve suşları oldukça bir dizi kullanılabilirlik) E. için E. coli 1,2; E. ii) Kısa nesil süreleri ve yüksek biyokütle verimi, Zengin ve sentetik medya çeşitli coli; iii) biyokimyasal olarak ve bu mikroorganizmanın genetik düzeyde ya uyduruk manipülasyon; iv), toksik proteinlerin 4 üretebilen suşlarının izole edilmesi; v) nüfus düzeyinde 5,6 homojen indüksiyon sahip suşlar yapımı. Buna ek olarak, son zamanlarda, E. üretimi için uygun olan bu ifade sistemleri gördü translasyon sonrası modifiye edilmiş proteinlerin E. coli tasarlanmış ve 2 yapılabilir.
Şu anda, proteini aşırı ekspresyonu esas olan hypersynthesis uygun bir plasmid içine klonlanmış tek bir gen ile yapılabilir monomerik ya da homo-oligomerik proteinler elde etmek için kullanılır. Bununla birlikte, dikkat son zamanlardaE. inşaat ödenen coli proteini birlikte ifade sistemleri, bir hetero-oligomerik kompleksleri 2, in vivo olarak, üretim zorlu. İlginç bir şekilde, protein, birlikte-ifade edilme daha önceki deneylerde, siyanobakteri ribuloz-1,5-bisfosfat karboksilazın / oksijenaz 7,8 arasında büyük ve küçük alt birimleri ve türler arası düzeneği, ve HIV-1 kesik ve tam uzunluktaki formları arasındaki ilişkiyi ele transkriptaz 9 ters. Bu öncü çalışmalar, protein ko-ifadesi in vitro yeniden geleneksel güçlü bir alternatif temsil ettiğini göstermiştir. E. koli içinde ilave olarak, protein, ko-ekspresyonu E. coli doğal olmayan amino asitler 2 ihtiva eden proteinler elde etmek için, post-translasyonel modifikasyonlar 2 taşıyan çeşitli proteinleri üretmek için ve Süreksprese membran proteinlerinin 2 verimini artırmak için kullanılmıştır. Ayrıca, bir araç olarak bir protein birlikte-ifade edilme potansiyel E. kazandırma coli rekabetProtein salgılanması nce aktif soruşturma 2 altında.
E. Protein birlikte-ifade edilme iki temel strateji coli takip edilebilir: Farklı genleri barındırmak için tek bir plazmid kullanımı aşın i); ii) tek bir hücre içinde birden fazla plasmidlerin kullanımı hedef proteinlerin yardımcı şekilde ifade etmek. Tandem promotör / operatör elemanları ihtiva eden, özellikle plazmidler ko-ekspresyonu 10 oluşturulmuştur, ancak ilk durumda, plazmid seçimi için kriterler, geleneksel tek bir protein aşın deney olanlardan farklı değildir. Bu ilk yaklaşım bu nedenle oldukça basittir. Bununla birlikte, farklı proteinler yardımcı şekilde ifade etmek tek plazmidin kullanılması, sağlamanın iki büyük bir zorlukla karşı karşıya olduğu belirtilmelidir: i) eş ifade edilen proteinlerin sayısının sınırlandırılması barındırılan genlerin sayısı ile vektör artar, moleküler kütlesi; ii) birden fazla gen, tek bir promotörün kontrolü altında klonlandı zaman, polarite gerilemenin olabilirpromoterinden distal genlerin ifadesi e. Tek E., ikili veya çoklu plasmidlerin kullanımı coli hücreleri, bu nedenle plazmid uygun kombinasyonlarla kısıtlamalar getiren, seçilen vektörler uyumluluğunu gerçekleştirmek zorundadır. Bununla birlikte, bu ikinci eş ifade stratejisinin vektörlerinin molekül kütlesi ihtiva eden bir avantaj sahiptir, ve polarite sınırlar. Son zamanlarda birlikte ekspresyon plazmidleri 11 arasında gen mekik kolaylaştırmak için tasarlanmış bir protein ko-ifade sistemi inşa edilmiştir. Özellikle, pGOOD vektörleri serisi inşa ilgili özellikler elde edilmiştir: i) bir replikasyon orijini p15A, ticari vektörler (ör pBAD seri 12) ColE1 orijini içeren pGOOD plazmid uyumluluğunu sağlamak; ii) bir tetrasiklin direnç kasedi; iii) lac varlığı düzenleyici unsurları, yani Yarışmayı-Operatörü (O 1) çift ve IacI -türevli q geni. Uygun bir pBAD-pGOOD çift kullanarak, E. katalitik çekirdeğini aşırı ifade başardık üç farklı alt üniteden oluşan coli DNA polimeraz III, yani α (5'-3 'polimeraz), ε (3'-5' eksonükleaz) ve (stabilize edici ε) 13 θ. Özellikle, αεθ kompleksinin birlikte ifadesi, E. ek sıkı sıkıya bağlı olduğunu göstermiştir IPTG ve arabinoz hem de E. coli kültür ortamı, pGOOD ve pBAD sırasıyla (Şekil 1A), tetikleyici aşırı ekspresyonu.
Mevcut yazıda, proteinin birlikte ifadesi, etkin bir şekilde bir protein kompleksi alt biriminin çözünürlüğünün kötü bağlantılı zorlukların üstesinden nasıl göstermektedir. Buna ek olarak, ne kadar in vivo proteinin tamamlama testlerinde gerçekleştirilebilir göstermektedir, ve nihayet E. ayar mutasyon sıklığı protein ko-ifade edilmesi için rapor dağ geçidii. Bu amaçla, her vaka çalışması ilgili örnekler göstermek için uygun pGOOD-pBAD çiftler kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
E. 1. izolasyonu E. coli Eş transformantlar
- Uygun E. elektro-yetkili hücreleri hazırlayın coli suşu transforme edilecek. LB ortamı, 1 ml (tripton, maya ekstresi, 10 NaCl, 5, ve 10 g / l'lik konsantrasyonlarda kullanılır) tercih edilen soyunun tek bir koloni, ve transfer 180 rpm çalkalama koşulları altında, 37 ° C'de inkübe edin. Ön-kültür 1 seyreltin: 500, taze LB ortamında 25 ml ve 37 ° C'de kültür inkübe edin.
- Log-faz (0.6 OD) içinde 20 dakika için 5000 xg) bir hücre süspansiyonu santrifüj ve orijinal kültür hacminin yarısı% 10, h / h buz soğukluğunda steril gliserol-su içinde pelletini. Her seferinde tabanda hacmi yarıya, bu adımı 4 kez tekrarlayın. Son olarak, gliserol / su içinde tekrar süspansiyon pelet ve 50 ul alikolar içinde hücre süspansiyonu bölün. 6 ay -80 ° C de alikotları saklayın.
- 0.5 mM EDTA ile takviye edilmiş, steril su içinde arzu edilen plazmid çözülür. Ic üzerinde çözülmeE elektro-kompetan hücrelerin bir tümböleni ve vektör uygun bir miktar (2.5-5 ng) ile karıştırılır. Elektroporasyon için uygun olan bir 0.1 cm küvet içine karışımı koyun ve 1.8 kV uygulanır.
- Hemen SOC ortamında 1 ml 'ye elektroporatlanmıştır hücreleri transferi (LB ortamı% 0.2 / h glukoz, 10 mM MgCl2, 2.5 mM KCI ile takviye edilmiş), çalkalama altında 1 saat boyunca inkübe edilir ve son olarak da içeren Petri kapları 100 ul alikotları aktarmak Uygun antibiyotik ile LB agar. 37 ° C'de O / N inkübe edin.
- Petri kapları tek koloniler çizgiler ile transformantlann arındırın.
- Birincil Transformantların elektro-yetkili hücreleri hazırlayın ve tekrar ileri plazmidlerle dönüştürmek için 1,1-1,5 adımları.
- Ko-transformantların gliserol stokları hazırlayın. Uygun antibiyotikler ile takviye edilmiş LB içinde tek bir koloni transfer, çalkalanarak 37 ° C'de inkübe ve log-faz (0.6 OD) santrifüj 20 dakika boyunca 5000 x g'de hücre süspansiyonu. ROrta% 15 h / h gliserol ihtiva eden LB-antibiyotikler pelet esuspend. Alikotları koyun ve en saklayın - 80 ° C.
E. α ve ε Altbirimlerin 2. birlikte ifadesi, E. coli DNA polimeraz III
- Steril bir çerçevenin bulunduğu uygun soy gliserol stokundan bir miktar transfer LB ortamı ve antibiyotikler içeren bir Petri kutusu içine (örneğin, TOP10 / pGOOD-ε243 ve TOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160, Şekil 1 'e bakınız). Hücreler damlacık hücreler süspansiyon Petri kabı üzerine kuru ve çizgi edelim. 37 ° CO / N inkübe edin.
- Steril kürdan LB-antibiyotikler ortamı, 1 ml için tek bir koloni ile Aktarım. 37 ° C'de 8 saat inkübe edin. Taze ortam içinde 500 ve 15 saat boyunca 30 ° C'de inkübe: kültür öncesi 1 seyreltin.
- IPTG, arabinoz veya arabinoz ve IPTG, 1 mM her ekleyin. 2.5 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edilir. Hücreler toplanır ve -20 ° C 'de pelet saklayın.
- Liziz tamponu (50 mM Tris-HCI, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA, 2.5 mM ditiyotreitol, 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF), pH 8) 'de buz ve tekrar süspansiyon ile çözülme peletler. Yavaşça soğuk cam çömlekçi olan hücreler süspansiyon homojenize.
- 15 sn soğutma aralığı (4 kür) takip 15 sn 15 W, bir sonikasyon.
- Çözünür fraksiyonu geri kazanmak için, 4 ° C'de, 20 dakika boyunca 10,000 x g'de toplam protein ekstreleri santrifüjleyin.
- SDS-PAGE (% 12.5 akrilamid) her çözünür protein ekstresi alikolar ile analiz edin. Bu amaçla, H2O 60 ul ve yükleme tamponu (250 mM Tris-HCI, pH 20 ul ihtiva eden Eppendorf tüplerine her çözünür protein ekstresi 20 ul transfer 6.8, 10 mM β-merkaptoetanol,% 10 (ağ / hac) SDS,% 50 (h / h) gliserol,% 0.25, mavi (ağ / hac) bromofenol) ve 5 dakika kaynatılır. Yük, her numune için 18 ul ila yaklaşık 1.5 saat için 140 V'ta elektroforez gerçekleştirin.
Deinococ arasında α alt birimi 3. birlikte ifadesi,cus radiodurans DNA Polimeraz III ε E. Alt Birim E. coli DNA polimeraz III
- E. ön kültür hazırlanması E. coli suşu TOP 10 / Dr pBAD-α / LB-ampisilin, tetrasiklin ortamı, 1 ml pGOOD-ε243 ve 37 ° C 'de 8 saat daha inkübe edilir. Taze ortam içinde, 1.000 ve 37 ° C 'de O / N inkübe: 1 seyreltin.
- 1 seyreltin: taze ortam, 100, 200 içine mi, daha sonra arabinoz ve IPTG, 1 mM her biri 3 saat; özellikle, 3 saat süre ile 37 ° C'de inkübe edin. Hücreler hasat ve -20 ° C 'de pelet saklayın.
- 50 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF içinde pelletini. Homojenize ve 2.4 ve 2.5 de tarif edildiği gibi hücreler bozabilir.
- Hemen hücreler 20 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj lizata. Pelet atın. Kağıt filtre 3 kat ile donatılmış bir Buchner hunisi ile süpernatant filtre. Nazik vakum uygulayın. Aşırı köpüklenme önlemek için, filtrasyon sırasında buz üzerinde vakum Erleni tutun.
- Bradford 14 göre protein konsantrasyonu belirleyin.
4. Jel Filtrasyon Kromatoarafisi
- 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH kolonuna 8. Yük çözünür protein ekstresi ile bir su ceketli 16x70 (200) jel süzme sütunu dengelenmesi. En uygun çözünürlük için, 1 ml örnek döngü kullanmak. / Dakika 0.6 ml kromatografisi yapın. Boyunca 4 ° C'de kolon sıcaklığı muhafaza edin.
- 0.9 ml kesirler toplayın ve SDS-PAGE ile analiz. Aktarım H2O 60 ul ve yükleme tamponu (250 mM Tris-HCI pH 6.8, 10 mM β-merkaptoetanol,% 10 (a / h) SDS, w% 50 20 ul ihtiva eden Eppendorf tüplerine ilgili her fraksiyonun 20 ul ( h / h) gliserol,% 0.25 (mavi ağırlık / hacim) bromofenol) ve 5 dakika kaynatılır. Yük, her numune için 18 ul ila yaklaşık 1.5 saat için 140 V'ta elektroforez gerçekleştirin.
- 3'-5 'ekzonükleaz ve her bir fraksiyonun DNA polimeraz aktivitesi 96 biz de belirlerll mikroplakalar. Alt-tabaka 15 olarak timidin 5'-monofosfat, p-nitrofenil ester (p NP TMP) ile eksonükleaz aktivitesi deneyi. PPX (pirofosfataz, purin nükleosit fosforilaz, ksantin oksidaz) enzim-bağlı deney 16 ve DNA polimeraz aktivitesi tahmin 2- (4-İyodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-2H-tetrazolyum klorid (INT) Elektron alıcı 16 gibi.
Popülasyonlarının E. Yabani tip ε alt biriminin birlikte ifade 5. Mutasyon Analizi E. coli DNA Polimeraz III ve mutajenik εD12A Variant
- E. tek bir koloni transfer pBAD-ε ve LB-antibiyotikler ortamın 1 ml pGOOD1-εD12A 11 vektörleri içeren E. coli TOP 10. 37 ° C'de O / N inkübe edin.
- (Arabinoz, IPTG veya arabinoz ve IPTG, 1 mM), uygun indükleyicileri eklemek, taze ortam (10 mi) ihtiva eden 250 3 şişeleri ve 37 ° C'de inkübe: Ön-kültür 1 seyreltin8 saat karıştırıldı. Paralel olmayan kaynaklı kültürlerde hazırlayın.
- 1 ml'lik alikolar toplamak, daha sonra 1 sulandırmak taze ortam (10 mi) ihtiva eden yeni şişelere 500 uygun indükleyicileri ile takviye edilmiş ya da. 37 ° C'de O / N inkübe edin.
- Tekrar 1 ml 5.2 ve 5.3 ve toplamak alikotları adımları.
- Nesillerin sayısı her kültürde meydana belirleyin. LB plakaları, inokulum ve kültür uygun seri dilüsyonları 100 ul üzerine aktarın. 37 ° C'de O / N inkübe edin. LB plakaları üzerine kolonileri sayın ve büyüme (C log) sonunda aşı içinde mevcut (I log) ve kültürde hücre sayısının kaydını hesaplar. Nesillerin sayısını belirlemek için, formülü kullanın: (C log - I log) /0.301.
- 20 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüj ve 50 mM Tris-HCI, pH 7.6, 50 mM NaCI, 1 ml süspansiyon hücrelerin. Hücreleri geçirgenliği, 20 saniye kloroform ve vorteks 2-3 damla ekleyin.
- Β- belirleyinSubstrat olarak p-nitrofenil-β-D-glukopiranosid (PNPGluc) kullanılarak 96 çukurlu bir mikrolevhadaki her bir kısım bir glukosidaz aktivitesi. Her çukuruna geçirgen hücrelerin 100 ul ve alt-tabaka 100 ul (16 mg / H2 O ml stok çözelti) eklenir. Kuyularda hava kabarcıklarını önlemek için özen gösterin. Bir mikrolevha okuyucu ve uygun bir filtre kullanılarak, 420 nm'de absorbansı okumak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
E. ε alt birimi E. coli DNA polimeraz III 243 amino asitten oluşur ve kalıntılar 187-243 17 silinir sürece, zayıf çözünürlüğe 17,18 bulunmaktadır. Bununla birlikte, daha önce tam uzunlukta α, ε ve θ alt birimlerinin birlikte ifadesi, çözünür bir DNA polimeraz III katalitik çekirdek (Şekil 1) elde edilir ki 11 göstermiştir. I) α ve ε alt birimden fazla sentezlenmesi, bağımsız olarak arabinoz ve IPTG sırasıyla (Şekil 1A) ile kontrol edilebilir;: Özellikle, pBAD-pGOOD ko-ifade sistemi kullanılarak, bunu gösterdi ii) tam uzunluktaki ε alt birimi E izole çözünür protein ekstrelerinde saptanabilir E. coli hücreleri, ε, α aşırı ifade ve θ ve jel filtrasyon (Şekil 1B) tabi tutulmuştur. Bu durumda, eksonükleaz aktivitesi 3 ana tepe noktaları (Şekil 1B, dolu daireler) içine dağıtıldı ve tepe frac merkezlisiyon 23 αεθ katalitik çekirdek (Şekil 1C ve 1D) içerdiği gösterilmiştir. ε stabilitesinin önemli ölçüde α ve θ bağlanması üzerine yükseltilir. Daha önce E. tam uzunlukta ε aşın zaman E. coli, serbest ε düşük bir miktarda çözünür bir protein, western lekeleme ile tespit edilmiştir 19 (Şekil 2A) çıkartır. Ε-186 aralarında o ilginçtir, aynı koşullar altında, her zaman, ε serbest C-ter kesik formlar (ε-234, ε-228,-ε 213 veya ε-186) yüksek miktarlarda tespit yapılan daha 19 (Şekil 2A). Ayrıca ε C-terminal proteolizi α bağlanma ve θ alt birimden 19 tarafından önlenir göstermektedir etmedi. etkisi varsa, ε çözünürlüğüne birlikte-ifade edilme kolaylıkla test edilebilir. Şekil 2B'de de belirtildiği gibi, çözünür protein ekstreleri aşırı ifade hücrelerinden izole edilenα, ε, α ve ε veya total protein ekstrelerindeki kıyasla uygun bir SDS-PAGE ile analiz edildi ve edilebilir. Bu durumda, elektroforetik analizi tek başına aşırı ekspreyonlandıkları zaman, ε alt birim özellikleri zayıf çözünürlüğü (kuşak 1 karşılaştırmak ve 2) α birlikte ifadesi büyük ölçüde çözünür protein ekstrelerinde ε konsantrasyonunu artırır ise, (kuşak 3 ve 4 karşılaştırma belirtir, ).
Eş ifadesi de türler arası tamamlama testlerini gerçekleştirmek için kullanılabilir. Buna göre, biz Gram + ve Gram replikatif makine ait alt birimlerin arasındaki etkileşimi değerlendirmek için ilgi olabileceğini düşündüm -. Bakteri Deinococcus radiodurans büyük bir α altünitesini (1,335 amino asitler, 150 kDa) özelliğine sahip Gram + bakteri, ve 197 amino asit ihtiva eden bir farazi ε alt-birimi. İlginç bir şekilde, D. radiodurans ε alt-birimi olan E. C-terminal alanı mevcut yoksundur coli E. arasında Yine, kimlik ve benzerlik E. coli ve D radiodurans ε alt birimleri sırasıyla% 29 ve% 59, eşit (bölge 1-178 dikkate D. radiodurans koordinatları). D. yetkinlik tahlil için E. bağlama radiodurans polimeraz III α alt birimi (Dr α) coli ε alt-birimi, biz pBAD vektörüne Dr α kodlayan bir sentetik gen klonlanmış ve biz, E. co-dönüştürmüştür pBAD-α Dr ve pGOOD-ε ile coli. Kültür ortamına eşzamanlı IPTG eklenmesi ve arabinoz Dr ve ε (Şekil 3A) α ko-ifadesini kışkırtır. Bu 2 proteinlerinin ilişki jel süzme ile test edilmiştir. Hücreler sonikasyonla kesilmiş liziz tamponu içinde süspanse III α Dr. ve ε alt-birimleri, santrifüjleme (5000 x g, 20 dakika) ile toplandı, DNA polimerazı, birlikte ifade ve çözülebilir proteinleri ani olanly bir Superdex 200 kolonu (Şekil 3B) üzerine yüklendi. Şekil 3C gösterildiği gibi toplanan fraksiyonlar 3'-5 'eksonükleaz ve DNA polimeraz aktivitesi deneyleri tabi tutulduğunda, etkinlik zirveleri anlamlı tespit edilmiştir Dr α E. bağlayıcı yetkili olmadığını düşündürmektedir, yer değiştiren coli ε alt birimi. Kısımların 32, 36 ve 52 tam bölünen miktarları, SDS-PAGE ile konsantre edildi ve analiz edildi, bu teyit edilmiştir. Fraksiyon 36 α Dr. içeren ve E yoksun olduğu bulunmuştur coli ε alt birim kısmı 52 E. ihtiva ederken coli ε ama Dr (Şekil 3D) α yoksun.
Çoğaltma sadakat öncelikle DNA uzantısı sırasında hatalı baz eşleşmeleri karşı ayrımcılık DNA polimerazların yeteneklerine bağlıdır. Bununla birlikte, uyumsuz deoksinükleotidler 10 -4 frekansta 20 dahil ve eylem olabilir3'-5 'egzonükleazlardan yeni sentezlenmiş DNA ipliğinden tashih esastır. Ayrıca, bu DNA düzenleme eylem büyüklüğü 20 3 emriyle çoğaltma sadakat arttırdığı tahmin edilmiştir. Bu duruma göre, mütasyon suşları koşullu E. mutajenik varyantını ifade ile, örneğin, DNA, redaksiyon bozarak yapılabilir E. coli DNA polimeraz III ε alt birimi. Bu α ancak düzeltme aktiviteden yoksun bağlayıcı ve uygun ekspresyon sistemleri ile mutajenik ε üretimini kontrol ε yetkin olan bir varyantını oluşturarak elde edilebilir. Bu strateji kullanılarak, gösterilmiştir E. ε 11,21 mutajenik varyantları, indüksiyon koşullan altında E. coli mutasyon sıklığı artar. Bununla birlikte, mutasyon sıklığının ince ayar bu yolla gerçekleştirilmiştir. Protein birlikte ifadesi, mütasyon suşları daha iyi bir kontrol elde etmek için kullanılabilir. Bu amaçla, biz E. dönüştürülmüş eş ile E. colipBAD-ε ve pGOOD1-εD12A, yabani tip ve sırasıyla arabinoz ve IPTG ile ε mutajenik D12A varyantının ifadesini uyarmak için. Yabani-tip E. olarak - (Bgl) fenotipik testi olarak, şifreli bir β-glukosidaz aktivitesi görünümünü tespit coli 22,23. Karbon kaynakları (Bgl +) halinde β-glikozitler kullanmak mümkün spontan mutantlar olarak zenginleştirilmiş ya da sırasıyla 23, sıvı ya da katı ortam 24 kullanılarak izole edilebilir. Hücreler D12A mutajenik varyantını eksprese etmek için uyarılan edildi, β-glukosidaz aktivitesi ca. satın alındı 20 jenerasyon (Şekil 4A). Benzer bir eğilim transkripsiyonel kontrol pGOOD1 üzerine uygulanan, çünkü büyük olasılıkla uyarılmamış hücrelerde (Şekil 4A), gözlendi unutulmamalıdır 11 oldukça sızan. Bununla birlikte, yabani-tür ε alt birimi indüklendi, tek başına ya da D12A varyantı ile bağlantılı olarak, β-glukosidazetkinlik E. tarafından satın alındı orta düzeyde (Şekil 4A) bir E. coli. Bgl + mutantların β-glukosidaz aktivitesi 3 ila 40 uM / dak 23 kadar değiştiği rapor edilmiştir. seviye E. burada belirlenen εD12A ifadesi tabi coli popülasyonları çok daha düşük olduğunu, ancak biz katı ortam üzerinde Bgl + mutantlar izole girişiminde olmadığı dikkate alınmalıdır.
Şekil 1. E. Co-sentezleme E. coli DNA polimeraz III katalitik çekirdek. (A), E. ekstrakte edilen toplam proteinlerinin SDS-PAGE E. coli TOP 10 / pBAD-α1160 / pGOOD-ε243 arabinoz sadece mevcudiyetinde, indükleyicilerin bulunmaması durumunda yetiştirilir, orta arabinoz ve IPTG (sırası ile, kulvarlar 1-4), her iki ile takviye edilmiş IPTG yalnızca, ya da. (BJel filtrasyon için E. ekstre edilmiş çözünür proteinleri tabi tutulması ile izole fraksiyonların) absorbans (boş daireler) ve ekzonükleaz aktivitesi (karalanmış daireler) coli TOP10 ε, α aşırı ifade ve E. θ alt birimleri E. coli DNA Pol-III. (Sırasıyla, kuşak 1-5) kısımların 6, 12, 23, 31 (C), SDS-PAGE ve 41 ekzonükleaz aktivitesi ve elektroforetik fraksiyon 23 konsantre edilmiş bir alikot, (D), SDS-PAGE, Pand B'de bildirilmiştir model, sırasıyla paneller B ve C, rapor edilmiştir. . Biyoteknoloji Edebiyat, 33, Conte ve ark izni ile yayımlanmaktadır: "pGOODs: Escherichia coli proteinlerin ortak ifadesi için yeni plazmidler"., 1815-1821 (2011) , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
E. Şekil 2. Proteoliz E. coli DNA polimeraz III ε alt birimi. E. ekstre proteinlerin western blotting ile ortaya monomerik (A) Parçalanma E. coli TOP 10 tam boy veya ε kesik formları aşırı ifade; ok uçları 25 ve 19 kDa ön-lekeli moleküler markörlerin konumunu göstermektedir. . Et Biophvsica Acta Proteinler ve Proteomik, 1794, Bressanin ark Elsevier izni ile yayımlanmaktadır: "redaksiyon alt biriminin Proteoliz Escherichia coli DNA polimeraz III katalitik çekirdek montajını kontrol", 1606-1615 (2009). (B) E. α ve ε alt birimlerinin birlikte ifadesi, E. coli DNA polimeraz III katalitik çekirdek. Toplam SDS-PAGE (kulvarlar 1 ve 3) ve çözülebilir (hat 2 ve 4) proteininin ilaveε alt birimini aşırı ifade hücrelerinden izole CTS (kuşak 1 ve 2), ya da α ve ε alt birimi (sütun 3 ve 4).
DNA polimeraz, sırasıyla Deinococcus radiodurans ve Escherichia coli'den gelen III α ve ε alt-birimlerinin Şekil 3. birlikte ifadesi. (Şerit 1) ile uyarılan ya da α Dr. aşın sunmak için neden, ε veya Dr ve ε (şerit sırasıyla 2-4), α olmayan hücrelerinden izole edilmiş total protein ekstrelerinin, (A), SDS-PAGE üzerinde akıtıldı. (B) kromatogramı (boş daireler, sol eksen) ve kısımların protein konsantrasyonu (dolu daireler, sağ eksen) E. ekstre edilmiş çözünür proteinler ile yüklenmiş (Superdex 200), bir jel filtrasyon kolonu oluşturan elüt coli α Dr bir fazla sentezleyenND ε alt birimi. (C), Düzeltme (boş daireler, sol eksen) ve DNA polimerazı (içi dolu daireler, sağ eksen) Panel B fraksiyonları 32, 36, ve 52 konsantre alikotları (D), SDS-PAGE içinde bildirilen fraksiyonların faaliyetleri. tıklayın Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
E. Şekil 4. Mutasyon frekansı coli hücreleri tabi veya ko-ekspresyonu için, yabani-tip ve DNA polimeraz III ε alt biriminin mutajenik varyant D12A arasında. Yeni plazmid pFINE haritası da gösterilir. E. (A), β-glukosidaz aktivitesi E. coli TOP 10 (Resim Ind) neden olduğu ya da vahşi tip ε alt biriminin aşırı ifadesi (tabiAra), mutajenik varyant D12A (IPTG) ya da her ikisi de vahşi tip ve D12A ε alt birimi (Ara + IPTG). β-glukosidaz aktivitesi nesillerin bir fonksiyonu olarak rapor edilir. Yeni ifade vektörü pFINE (B) Harita. Bu plazmidinin çok sayıda klonlama bölgesi (MCS) aralarında genlerin kolay mekik izin uyumlu pBAD ve pGOOD vektörlerde var olan kişilerce aynıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proteinler olan üçüncül yapı uyumlarının 25 arasında, sınırlı sayıda sınırlı değildir bölgeleri içeren, doğal olarak düzensiz olabilir. Bu düzensiz proteinler toplama 25 genellikle eğilimli, ve onların izolasyon ve karakterizasyonu zor bir görev temsil edebilir. E. ε alt birimi coli DNA polimeraz III iki farklı etki yani 26,27, özellikleri: i) N-ter etki, θ alt birimini bağlama 3'-5 'ekzonükleaz aktivitesini taşıyan ve yetkin; ii) Cı-tert etki, α (polimeraz) alt birimine bağlanma sorumludur. Ε C-tert etki alanının toplanmasını teşvik, bu protein için düşük çözünürlük veren bilinmektedir. Gerçekten ε-186, C-tert domeninden yoksun proteinin budanmış biçimi, çözünür, ve yüksek verimlerle 17 saflaştırılabilir olduğu gösterilmiştir. Ancak, kantitatif incelenmesi gereken α ile ε etkileşimi zaman(Örneğin, αε kompleksi K belirlemek D), tam uzunlukta ε saflaştırılması zor bir biyokimyasal görev ima gereklidir. Bu çerçevede, protein birlikte ifadesi, α için ε bağlanmasının niteliksel tahminlerini içerir. Bu αεθ kompleksi, yüksek verimleri ε alt biriminin zayıf çözünürlüğe atlayarak ko-ekspresyonu (Şekil 1) ile in vivo olarak elde edilebilir olduğunu göstermiştir. Dikkate değer bir şekilde, aşırı eksprese αεθ kompleksinin saflaştırılması 28,29 bildirilmiştir. ko-ifade stratejisi aynı zamanda etkileşim ortaklarından biri site-spesifik mutasyonlar sokma kompleks oluşumunu bozar olup olmadığını test etmek için de kullanılabilir. Bu duruma göre, protein, ko-ekspresyonu, protein-protein etkileşimi kalitatif testler yapmak için uygun ve hızlı bir aracı ifade eder. Ayrıca, co-ekspresyon sistemi 2 farklı indükleyiciler, yani, arabinoz ve IPTG bağlı olduğu not edilmelidir. Örneğin, bakteri büyüme ortamından (Şekil 1A), bir indükleyici atlama bir protein kompleksinin oluşumunu test, bu nedenle, uygun şekilde kontrol kolayca gerçekleştirilebilir.
Bu α ko-ekspresyonu ve E. ε alt birimleri için optimize edilmiş bir işlem sunulmaktadır E. coli DNA polimeraz III. Bu protokol tasarlanmış ve test edildiğinde aşağıdaki parametreler eş sentezleme deneylerin başarısı için kritik olarak tanımlandı: indüksiyon gerçekleştirildiği i) sıcaklığı; ii) indüksiyon süresi uzunluğu; indükleyici (ler) iii) konsantrasyonu. Özellikle, biz bağımsız indüksiyon süresi, 37 ° C'de kaynaklı hücrelerin karmaşık 11 αεθ çözünür elde koyamadık. Bu nedenle, indüksiyon aşaması için farklı sıcaklıklara test etmek için, ve zamanın bir fonksiyonu olarak proteinlerin aşırı ekspresyonunu kontrol etmektedir. Buna ek olarak, diff birlikte-ifade edilme paralel değerlendirmeerent E. Hedef proteinlerin orta verim bakarken coli suşları yardımcı olabilir.
Biz burada farklı türlerden proteinlerin bağlama test etmek için yapılan bir temsili deney bildirdi, ve biz bu proteinin birlikte ifadesi hızla melez fonksiyonel kompleksi içine 2 heterolog proteinlerin ilişkiyi test etmek için yararlıdır göstermiştir. Jel filtrasyon kromatografisi kompleks oluşumunu (Şekil 3) değerlendirmek üzere kullanılmıştır. Ancak, etkileşim ortaklarından birine uygun bir etiket ekleme afinite yakalama yöntemlerinin kullanımını sağlayarak, bu değerlendirmeyi kolaylaştırabilir. Protein-protein etkileşimleri ile etiketin girişimi önlemek için, etkileşen ortaklarından biri için gen kodlaması, pBAD içine paralel olarak ilave edilebilir / His ve pBAD sırasıyla N- ve C de bir hekzahistidin motifi kazandıran / myc-His vektörler Hedef proteinin -terminus.
E. coli mutator suşları kendi vahşi tip muadilleri daha yüksek mutasyon frekansları bulunmaktadır. Mutator suşları hızla roman, istenen, fenotipleri doğru bir hedef gerginlik gelişmeye, örneğin biyoteknoloji 30, ilgi vardır. Burada co-sentezleyen kanıtlar, vahşi tip ve E. mutajenik ε alt birimini Resim E. coli DNA polimeraz III bakteriyel bir konağın mutasyon frekansı yeterli rahatlığı ile ayarlanabilir. Bundan başka, bu teknolojiyi geliştirmek için, sıkı bir şekilde düzenlenmiş ifade vektörleri ε alt biriminin güçlü mutajenik D12A varyant ekspresyonu mümkün olduğu kadar bastırmak için gereklidir. Özellikle, E. mutasyon frekansı test etmek için ilginç olabilir coli yani pBAD-εD12A ve pGOOD1-ε, burada sunulan bu yapılandırma alternatifi ile dönüştürülmüş. pBAD vektörleri gerçekten sıkı 12 düzenlendiği bilinmektedir ve bu özellik εD12A taban konsantrasyonunu tutmaya yardımcı olabilirdüşük seviyelerde.
Protein birlikte-ifade edilme örnekler burada bildirilen bu tekniğin çok yönlü doğası kanıtlamaktadır. Bununla birlikte, tek bir E uyumlu bir plazmid olarak kullanan dikkat etmek önemlidir coli hücreleri büyük ölçüde protein ko-ifadesi tarafından alınabilir zorlukları genişletebilirsiniz. Son yıllarda, yoğun çalışma proteini ko-ekspresyonu için kullanılmak üzere uygun plazmidlerin repertuar genişletmek için ayrıldı. Özel olarak, replikasyon ColE1, p15A ve pSC101 kaynağını taşıyan uygun plazmidler dayanarak üçlü bir sistem eş-ifade ya da bakteriyel ve memeli proteinlerinin 31 için kullanıldı. Son zamanlarda, bir kuaterner ko-ifade sistemi rapor edilmiştir. Bu durumda, 13, heterolog genler, E. co-ifade edildi E. coli ColE1, p15A, CloDF13 ve replikasyon 32 RSF kaynağını ihtiva eden, 4 uyumlu sentezleme vektörleri ile birlikte-dönüştürüldüğünde. Bu ko-ifade sistemi başarılı bir şekilde üretilmesi için kullanılanE. Pyrococcus furiosus'tan 32 fonksiyonel olarak aktif çözünür hidrojenaz I coli. Eğer ikili sistem büyütmek için, replikasyon pSC101 orijini, bir neomisin-direnç kasedi ve lak düzenleyici elemanları (Şekil 4B) içeren yeni bir sentezleme vektörünü pFINE inşa edilmiştir. Bu plazmid, bu şekilde üst-sentezleme sistemi 3 bileşenleri arasında mekik geni kolaylaştıran pBAD ve pGOOD vektörleri aynı poli-bağlayıcı mevcut bulunmaktadır. PFINE düşük kopya plazmid sayısı da, stabilitesi açısından zengin bir ortam içinde test edildiği zaman tatmin edici olduğu bulunmuştur. Şu anda bizim üçlü ortak ifadesi sisteminin daha da genişlemesi ilgileniyoruz. Bu amaçla, bir kloramfenikol direnç kasetini içeren bir pBAD türevi inşa, ve biz ColE1, p15A ve pSC101 ile uyumlu biriyle replikasyon orijini ColE1 alışverişinde yolda. Gerçekten tek E. birden plazmitlerin kullanımı bizim görüşü coli hücreleri temsilcisiFarklı alt biriminden oluşan bir çok bileşenden müteşekkildir protein kompleksleri, in vivo olarak ifade meydan için güçlü bir araç bakmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
rakamları yeniden yazdırmak için Springer ve Elsevier tarafından izin ölçüde kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| INT | Sigma-Aldrich | I8377 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PNP-gluc | Sigma-Aldrich | N7006 | |
| pNP-TMP | Sigma-Aldrich | T0251 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 95039 | |
| Yeast extract | Fluka | 70161 | |
| Acrylamide solution 30% | BioRad | 161-0158 | For gel electrophoresis |
| Ammonium persolphate | BioRad | 161-0700 | For gel electrophoresis |
| Glycine | BioRad | 161-0718 | For gel electrophoresis |
| SDS | BioRad | 161-0302 | For gel electrophoresis |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | For gel electrophoresis |
| Tris | BioRad | 161-0719 | For gel electrophoresis |
| Cuvettes 0.1 cm | BioRad | 1652089 | For electroporation |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Centrifuge Allegra 21R | Beckman | ||
| Chromatography apparatus GradiFrac | Pharmacia Biotech | ||
| Gene Pulser II electroporation | BioRad | ||
| Microplate Reader 550 | Biorad | ||
| MiniProtean 3 cell | BioRad | ||
| Power Supply | BioRad | ||
| Sonicator 3000 | Misonix |
References
- Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids. Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).
- Hochkoeppler, A. Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).
- Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. Eukaryotic expression systems: a comparison. Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
- Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).
- Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).
- Tabita, F. R., Small, C. L. Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).
- Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli. EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).
- Amann, E., Brosius, J. ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).
- Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins. Nucleic Acids Res. 35 (6), e43 (2007).
- Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).
- Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- McHenry, C. S. DNA replicases from a bacterial perspective. Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Hamdan, S., et al. Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III. Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).
- Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes. BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).
- DeRose, E. F., et al. Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data. Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).
- Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker. Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).
- Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core. Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).
- Schaaper, R. M. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12. Nature. 293, 625-629 (1981).
- Schaeffer, S. Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides. J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).
- Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. Direct selection for mutators in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).
- Dunker, A. K., et al. The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins. BMC Genomics. 9, Suppl 2. (2008).
- Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site. J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).
- Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III. Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).
- Kim, D. R., McHenry, C. S. In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits. J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).
- Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp. Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).
- Greener, A., Callahan, M. XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain. Strategies. 7, 32-34 (1994).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E. Jr, McTernan, P. M., Adams, M. W. W. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PloS One. 5 (5), (2010).
