Abstract
細胞内細菌性病原体は、細胞質ゾル中または特殊な病原体含有液胞（のPCV）で複製することができます。細胞質ゾルに到達するには、 フレクスナー赤痢菌とフランシセラnovicidaなどの細菌は、ファゴソームの破壊を誘導する必要があります。これとは対照的に、 ネズミチフス菌はサルモネラ含有液胞（SCV）として知られている液胞コンパートメントに複製されます。しかし、 サルモネラ菌の特定の変異体は、SCVの完全性を維持することができないので、細胞質ゾル中に放出されます。単一の細菌のレベルで液胞細菌対細胞質ゾルの割合は、ファゴソーム保護アッセイとして知られている、差動透過化することによって測定することができます。アプローチは、選択的にコレステロールを結合するための洗剤ジギトニンの性質を利用しています。細胞膜は、他の細胞膜よりもコレステロールを含んでいるので、ジギトニンが細胞内膜を残して選択的に細胞膜を透過するのに使用することができます無傷。簡潔には、蛍光マーカータンパク質（ 例えば mCherryをとりわけ）を発現する病原体による感染後、宿主細胞の原形質膜は、緩衝液を含むジギトニンで短いインキュベーションで透過されます。次いで、細胞を洗浄し、培養し、任意の細菌に対して向け（お好みの蛍光団に結合された）一次抗体（ 例えば抗サルモネラ -FITC）し、再び洗浄します。マークされていない細菌が使用される場合、追加のステップがあるすべての膜を透過処理され、すべての細菌は、対応する抗体で染色し、実施することができます。染色後、液胞および細胞質細菌の割合は、単一または二重陽性事象をカウントすることによって、FACSまたは顕微鏡により定量することができます。ここでは、菌、ネズミチフス菌でこの技術を使用するための実験の詳細を提供します。このアッセイの利点は、他のアッセイとは対照的に、それは、単一bacteのレベルで定量化を提供することですRIA、顕微鏡で分析した場合に、所定の細胞における細胞質ゾルおよび液胞細菌の正確な数を提供します。
Introduction
細胞内細菌性病原体は、直接宿主細胞サイトゾル中、または特殊な液胞コンパートメント1のいずれかで複製します。感染の初期段階では、ほとんどの病原体は、（マクロファージなど）、または積極的に非食細胞に自分の取り込みを促進することにより、特殊化した細胞による食作用によっていずれかを内在化を受けます。食細胞は、ファゴソームは、通常、貪食粒子が消化される分解室を形成し、リソソームと融合します。このようなフランシセラnovicidaや赤痢菌などの専門サイトゾル細菌は、ファゴソームの破壊を誘導することにより、ファゴソームの劣化を脱出し、続いて細胞質ゾル2,3に逃げ込みます。これは、液胞破裂2-4を促進するエフェクタータンパク質を注入フランシセラ病原性アイランド（FPI）またはフレクスナー赤痢菌 T3SS、などの病原性に関連するメカニズムが必要です。宿主細胞の細胞質ゾルの機能通常、病原体の存在を認識し、5シグナリング自然免疫を誘導する保存されたパターン認識受容体の数。また、xenophagy、オートファジーの抗菌フォームは、細胞質ゾルに入る細菌を分解することができます。細胞質細菌は、通常、十分に平滑または異なる戦略を使用してこれらの応答を回避するように適合されています。例えば、 フランシセラ、ホスト認識を回避するために、そのLPSを変更し、 赤痢菌が分泌エフェクタータンパク質6,7を使用して、オートファジーの動員を防止します。
リソソーム分解をエスケープする別の戦略は、その後、 ネズミチフス菌と呼ばれるモデル液胞病原体サルモネラエンテリカ血清型のネズミチフス菌によって採用されている。 サルモネラ菌はサルモネラ含有液胞（SCV）、その細胞内ニッチに初期ファゴソームを改造エフェクターを注入するT3SSを使用しています8,9。ホスト経路の連続的な操作であります液胞に脂質および他の栄養素を補充することによって、この空胞を維持するために必要。実際、 サルモネラのSIFA変異体は液胞の安定性を維持するために失敗し、先天性免疫経路とオートファジーの動員8の活性化をもたらす感染後時間以内に宿主細胞の細胞質ゾルに入ります。 サルモネラの液胞エスケープ研究である細胞型に依存して変化し、いくつかの報告は、上皮細胞においてさえWT サルモネラ細胞質10にSCVとhyperreplicateを逃れることができることを示しています。最近の報告では、液胞の病原体の自然免疫検出はまた、認識し、病原体含有液胞（のPCV）11-14を不安定化するホストの能力に依存することを示しています。
ホストまたは細菌の遺伝子型の両方が液胞および細胞質コンパートメント間の細胞内細菌の分布に影響を与えることができることを考えると、それは液胞対の数を定量化することが必要ですサイトゾル細菌。以来、ほとんどの実験的な設定で、宿主細胞は、異なる細胞内区画内の複数の細菌を保有することができ、その後、複数の細菌に感染され、この技術は、単一の細菌のレベルで定量化を可能にすることが必要とされます。 （また、ファゴソーム保護アッセイとして知られている）は、差動透過性は、この解像度2,4,10,12を提供します。アッセイは、無傷の液胞の膜を残す洗剤ジギトニン、を有する宿主細胞の原形質膜の選択的透過性に基づいており、したがって、抗体と細胞質の細菌の選択的染色を可能にします。ここでは、差動透過性を使用して、サイトゾルおよび液胞ネズミチフス菌の定量化のための2つのプロトコルを提供します。この方法の原理を図1に記載されている：骨髄由来マクロファージ（BMDMs）は固定相mCherryを発現サルモネラ菌に感染しています。固定相サルモネラトンを必要とします彼らは活動さもなければNLRC4のソームによって認識され、BMDMs 15の急速な細胞死（pyroptosis）を誘発することになるSPI-1 T3SSの発現をダウンレギュレートするため、O使用すること。続いて感染細胞を洗浄し、1分間ジギトニンを50μg/ mlので処理します。細胞を直ちに再び洗浄し、細胞質ゾルへのアクセスを、細菌をマークするためにFITCに結 合された抗サルモネラ抗体と共にインキュベートします。追加の洗浄工程の細胞を溶解しそしてmCherryを+（液胞型）およびFITC + / mCherryを+（サイトゾル）細菌の割合をFACSによって決定された後。また、何の蛍光タンパク質を発現する株は（ 図2）が利用できない場合に使用することができるこの方法の適応を報告しています。追加の手順は、細胞を固定し、完全に透過処理されたFITC標識後に導入されています。その後、全ての細菌は、抗サルモネラ抗体および対応する二次抗体で染色します。 DETectionは、代わりにFACS解析の顕微鏡検査によって行われます。
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Protocol
mCherryを発現するサルモネラ （FACSベースの分析）1.ジギトニンアッセイ
- 細菌の準備
注：プラスミドからmCherryをを発現するサルモネラ野生型SL1344は（ストレプトマイシン耐性）（pFPVがrpsMプロモーター下mCherryををコードする）は、このアッセイで使用されています。 mCherryを（データは示していない）16の構成的発現によって改変されない細菌の食作用及び増殖。- 37°CO / Nでシェーカーにストレプトマイシン（90μgの/ ml）およびアンピシリン（100μgの/ mlの、mCherryを発現するベクター）を補充したLB培地3mlでの感染の前に歪み1日に接種。
- 感染のために細胞をプレーティングします。
- 1.25×10 5細胞の密度で24ウェルプレート内での種子野生型BMDMs /ウェルの一次マクロファージ培地1ml中では（DMEM、10％ウシ胎児血清（FCS、熱不活性化、56℃、30分を補っ）、1％HEPES、1％非必須アミノ酸（NEAA）、1％L-グルタミン及び10％L929上清（マクロファージコロニー刺激因子（M-CSFからの馴化培地）L929細胞を産生します）。シードウェル個々の条件を考慮して、表1に記載の方法。コントロール（ 表1）として使用するウェルにカバースリップを追加します。
- 37℃のインキュベーター中で一晩細胞をインキュベートし、5％CO 2。
| 透過化 | 染色 | ||||||
| ガラスカバースリップ | サルモネラ | ジギトニン | サポニン | 抗サルモネラ | 抗カルネキシン | 抗PDI | |
| A1（サンプル） | - / + * | + | + | + | |||
| A2（サンプル） | - / + * | + + | + | ||||
| A3（サンプル） | - / + * | + | + | + | |||
| A4（無透過性制御） | - / + * | + | + | ||||
| A5（完全透過性制御） | - / + * | + | + | + | |||
| B1（カルネキシンについて染色） | + | + | |||||
| B2（カルネキシンについて染色） | + | + | + | ||||
| B3（カルネキシンについて染色） | + | + | + | ||||
| C1（染色）PDIのため | + | + | |||||
| C2（PDIについて染色） | + | + | + | ||||
| C3（PDIについて染色） | + | + | + | ||||
表1：サルモネラ、透過性、および染色によるその後の感染の24ウェルフォーマットでの骨髄由来マクロファージ（BMDMs）用メッキ方式 *プロトコル1またはプロトコル2が行われているかどうかに応じ。
- 感染細菌の準備。
- 次の日、PBSで文化1:10に希釈し、PBSのみのコントロールに対するOD 600を測定することにより、一晩培養でサルモネラ菌の濃度を決定します。これは、OD 600が Lで測定されることを保証します分光光度計のinear範囲。
- 1ml当たりのサルモネラの濃度を計算します。 1のOD600は、1×10 9細菌に相当します。
- 1.25×10 6細胞/ mlのサルモネラ濃度に達するように、マクロファージ培地中で細菌を希釈します。
- サルモネラ菌による細胞の感染。
- BMDMsからメディアを取り出します。非感染対照ウェル（B1〜B3、C1〜C3）にマクロファージ培地1mlを加えます。ウェルA1にサルモネラ懸濁液1mlを加える- A5は、セル当たり10の細菌の感染（MOI）の多数に到達します。
- 感染を同期させるために37℃、300×gで15分間プレートを遠心。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。
- ゲンタマイシンを有する細胞外サルモネラ菌を殺します。
- 1時間の感染後に、インキュベーターからプレートを除去し、0.1 mg / mlのゲンタマイシンを含むマクロファージ培地の0.1ミリリットルを追加します細胞外細菌を殺すために。すべてのセルが同じように扱われることを保証するために、さらに非感染対照に、すべてのウェルにゲンタマイシンを追加します。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。
- 細胞を洗浄。
- （37℃に予め温めておいた）を10μg/ mlを含む2時間の感染後、インキュベーターからプレートを取り外し、すべてのウェルは、プレーン1mlのDMEMで2回（37℃に予熱した）およびマクロファージ培地と交換し洗う時 残りの細胞外細菌の増殖を防止するためにゲンタマイシン。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。
- 界面活性剤と抗体と、新鮮な緩衝液を調製しました。
- ただ、分析の所望の時点の前に、KHMバッファー（110 mMの酢酸カリウム、20mMのHEPES、2mMのMgCl 2を 、pHが7.3）で1mg / mlとでジギトニンの新鮮なストック溶液を準備します。在庫を濾過し、作業濃度にKHMバッファに希釈しますジギトニンを50μg/ mlの。また、KHMに1/100で1/100または抗PDIで1/500、抗カルネキシンでKHM緩衝液中0.1％サポニンの溶液を調製し、抗FITCに結 合されたサルモネラ抗体（CSA-1-FITC）バッファは、3％BSAを添加しました。
- 細胞透過。
- インキュベーターからプレートを外し、ウェルをKHMバッファー（37℃に予め温めておいた）の0.5ミリリットルで3回洗浄します。 KHM緩衝液を除去し、ウェルA1に井戸A4およびB1 / C1、ジギトニンでKHMバッファにプレーンKHMバッファ0.25ミリリットルを追加-ウェルA5と（ 表1による）B3 / C3にサポニンとA3とB2 / C2またはKHMバッファ。全てのウェルは、KHMバッファの0.5ミリリットルで3回洗浄し、直ちに室温で正確に1分間インキュベートし、（37℃に予熱しました）。
- 一次抗体染色。
- 適切なウェルに一次抗体溶液（ヤギ抗サルモネラ -FITC、250μL/ウェル、0.1μgの/ ml）をKHMバッファを削除し、追加します（ 図1 表1）。 37℃のインキュベーターで15分間、プレートをインキュベートし、5％CO 2。
- 1 mLのPBSで1×細胞を洗浄。
- 感染細胞（ウェルA1 - A5）：FACS分析
- 洗浄細胞をPBSで3倍、0.1％トリトンを含む氷冷PBSの0.5 mLを加え。細胞凝集体を破壊するためにセルストレーナーキャップ付き5mlのFACSチューブに移します。氷上でサンプルを保管してください。
- FACSのサンプルを分析します。完全に透過性にコントロールを使用して、全前方に基づく細菌と第一側方散乱（FSC / SSC）のためのゲートを設定し、mCherryを信号（610 nmの±20 nmのフィルター）。
- 次に、サイトゾル細菌（FITC +、mCherryを+）および液胞細菌（FITC-、mCherryを+）（ 図3）のためにゲートを設定するために、完全に透過処理し、透過性にないコントロールを使用して、全細菌集団におけるFITC信号を分析します。
- ゲートを設定すると、サンプルを分析し、サイトゾル対の割合を決定します製造業者のプロトコルに従ってFlowJoソフトソフトウェアを使用して液胞の細菌。
- 感染していない透過性のコントロール（ウェルB1 - B3、C1 - C3）：顕微鏡
- 固定
- PBSを除去し、PBS中の4％PFAの250μlを添加します。 37℃で10分間インキュベートします。
- ウェルを1mlのPBSで2回洗浄し、固定液をクエンチし、10分間、PBS中の0.1 Mグリシンの250μlを添加します。洗浄ウェルを1mlのPBSで2回。
- 二次抗体染色。
- PBS中のフルオロフォアに結合さ適切な二次抗体と室温で1時間染色透過コントロールは、0.1％サポニンおよび3％BSAを完全に透過性細胞を補充しました。
- 洗浄は、1mlのPBSで3回カバースリップし、DAPI（1.5μgの/ ml）で培地を実装する際に、分析のためにカバースリップをマウントします。
- 顕微鏡分析。
- 共焦点FLUOを使用して、40Xや63X倍率でコントロールでカバースリップを分析rescence顕微鏡。透過性が働いている場合は、非透過性細胞、digitonin-だけサポニン透過処理した細胞（ 図4）のためのサポニン透過処理した細胞およびPDI染色の両方のためのカルネキシン染色のための染色があってはなりません。
- 固定
非標識サルモネラ（顕微鏡ベースの分析）2.ジギトニンアッセイ
- O / N培養に細菌を準備。
- 非標識サルモネラ野生型SL1344を接種する（ストレプトマイシン耐性）37°CO / Nでシェーカーにストレプトマイシン（90μgの/ ml）を補充したLB培地3mlでの感染の前に1日。
- 感染のために細胞をプレーティングします。
- 1.25×10 5細胞の密度で滅菌ガラスカバースリップを含む24ウェルプレート中の種子BMDMs /ウェルマクロファージ培地1ml（DMEMを、10％ウシ胎児血清（FCSをデ補完、56°Cを補給して、30分）、1％HEPES、1％L-非必須アミノ酸（NEAA）、1％L-グルタミン及び10％L929上清）。シードウェル個々の条件を考慮して、表1に記載の方法。
- 37℃のインキュベーター中で細胞をO / Nインキュベートし、5％CO 2。
- 感染細菌の準備。
- 次の日、PBSで文化1:10に希釈し、PBSのみのコントロールに対するOD 600を測定することによって、O / N培養中のサルモネラ菌の濃度を決定します。これは、OD 600は 、分光光度計の直線範囲で測定されることを保証します。
- ミリリットル当たりサルモネラの濃度を決定します。 1のOD 600が 1×10 9細菌に相当します。
- 1.25×10 6細胞/ mlのサルモネラ濃度に達するように、マクロファージ培地中で細菌を希釈します。
- サルモネラ菌による細胞の感染。
- 感染を同期させるために37℃、300×gで15分間プレートを遠心。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。
- ゲンタマイシンを有する細胞外サルモネラ菌を殺します。
- 1時間感染後に、インキュベーターからプレートを除去し、全てのウェルに細胞外細菌を殺すために1 mg / mlのゲンタマイシンを含むマクロファージ培地の0.1ミリリットルを追加します。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。
- 細胞を洗浄。
- 2時間の感染後に、インキュベーターからプレートを取り外しおよび10μg/ mlを含む新鮮なマクロファージ培地1 mlを各ウェル3回洗います 防止するために、ゲンタマイシン残りの細胞外細菌の増殖。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。
- 界面活性剤と抗体と、新鮮な緩衝液を調製しました。
- ただ、分析の所望の時点の前に、KHMバッファー（110 mMの酢酸カリウム、20mMのHEPES、2mMのMgCl 2を 、pHが7.3）で1mg / mlとでジギトニンの新鮮なストック溶液を準備します。在庫を濾過し、50μg/ mlのの作業濃度にKHMバッファーに希釈 ジギトニン。
- また、KHMバッファー中で1/100 1/100または抗PDIでKHM緩衝液中の0.1％サポニンの溶液を調製し、抗サルモネラ -FITC（CSA-1、は0.1μg/ mlで）、抗カルネキシンを補っ3％BSA（抗体濃度のための材料の表を参照）。
- 細胞透過。
- インキュベーターからプレートを外し、ウェルをKHMバッファー（37℃に予め温めておいた）の0.5ミリリットルで3回洗浄します。 KHM緩衝液を除去し、0.25ミリリットルプレーンKHMバッファを追加井戸A4およびB1 / C1、KHMバッファへのウェルA1にジギトニンで-ウェルA5と（ 表1による）B3 / C3にサポニンでA3とB2 / C2またはKHMバッファ。全てのウェルは、KHMバッファの0.5ミリリットルで3回洗浄し、直ちに室温で正確に1分間インキュベートし、（37℃に予熱しました）。
- 一次抗体染色。
- KHM緩衝液を除去し、適切なウェル（ 図2、表1）に、一次抗体溶液（ヤギ抗サルモネラ CSA1-FITC、250μL/ウェル、0.1μgの/ ml）を追加します。 37℃のインキュベーターで15分間、プレートをインキュベートし、5％CO 2。 1mlのPBSで洗浄3回。
- 固定。
- PBSを除去し、PBS中の4％PFAの250μlを添加します。 37℃で10分間インキュベートします。
- ウェルを1mlのPBSで2回洗浄し、固定液をクエンチし、10分間、PBS中の0.1 Mグリシンの250μlを添加します。洗浄ウェルを1mlのPBSで2回。
- 合計感染したサンプルのサルモネラ染色 。
- 洗浄は、0.1％サポニン/ 3％BSAを含むPBSで3回カバースリップ及び抗CSA1抗体とサンプルインキュベート（ヤギ抗CSA1、0.1μgの/ mlで、マウス抗LPS 0.1 / mlの、同様に動作）1時間0.1％サポニン/ 3％BSAを含むPBS中、室温で。
- 0.1％サポニン/ 3％BSAを含むPBSで洗浄3倍。暗所で室温で30分間、0.1％サポニン/ 3％BSAを含むPBS中の選択肢の蛍光団に結合された二次抗ヤギ抗体を使用してサンプルをインキュベートします。
- 洗浄は、1mlのPBSで3回カバースリップし、DAPI（1.5μgの/ ml）で培地を実装する際に、分析のためにカバースリップをマウントします。
- 顕微鏡分析。
- サイトゾルサルモネラ （正の抗サルモネラ -FITC）および全サルモネラ （二重陽性）（ 図5）をカウントすることにより、共焦点顕微鏡を使用してデータを取得します。透過性のコントロールは表示しない必要があります。非透過性細胞、カルネキシンのための染色をサポニン透過処理した細胞（ 図4）のためにジギトニン透過性細胞及びPDI染色にtaining。ウェルズA4とA5は、 サルモネラ染色のための内部コントロールとして機能します。
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Representative Results
図1と図2は、プロトコル1とプロトコル、得られた結果で重要なステップを示すプロトコル2で説明したジギトニンアッセイの概略図を示す。 図3は、典型的なFACSの結果を示しています。正および負の対照は、mCherryを+ / FITC-細菌（液胞サルモネラ ）とmCherryを+ / FITC +細菌（細胞質ゾルサルモネラ ）のためにゲートを設定するために使用されています。これらのゲートに基づいてサイトゾルおよび液胞細菌の割合は、実験試料で決定することができます。この例では、野生型とΔsifA サルモネラを比較した。 図3 mCherryを+ ネズミチフス菌野生型および骨髄由来のマウスマクロファージにおけるΔsifA変異体を用いて得られた代表的なデータを示している。 図4は、通常のカルネキシン（A）及びPDIを示しています（B）透過性を制御するTで得られた染色ジギトニンまたはサポニンでreated。カルネキシンは、小胞体膜蛋白質であるので、カルネキシン染色は細胞質全体とdigitonin-とサポニン透過化細胞の両方における核の周りに見られます。ジギトニンでサポニン透過性細胞で観察することができる染色する間はPDI染色（ER内腔）は、表示されていないコントロールの透過性。 図5Aは、ジギトニンで透過処理した細胞における抗サルモネラ染色結果を示します。サイトゾル細菌は（抗サルモネラ -FITCで染色した）緑色にいる間総細菌は、赤です。 FITC陰性集団は液胞（SCV）を含有無傷のサルモネラに居住したため、 サルモネラ -FITC標識から保護された細菌であるが、人口FITC陽性は、細胞質ゾルへのアクセス権を持つサルモネラです。また、ΔsifA変異株に野生型サルモネラを比較しました。 サルモネラは Sを維持するSIFAが必要であるので、CVの整合性がサルモネラ菌の増加割合は、サイトゾルです。 図5Bにおいて、我々は、細胞は、抗サルモネラ -FITCを追加する前に、透過処理ジギトニンないされたコントロールを示します。したがって、何FITC陽性細菌は見られません。
図1.いずれかの無傷の液胞または細胞質ゾルにおけるmCherryを陽性サルモネラを含む1感染細胞を差動ジギトニンで透過性にされているプロトコルの概略図。サイトゾルサルモネラを、FITCに結 合された抗サルモネラで染色します。細胞を洗浄し、FACS分析のためにトリトンX-100で溶解します。陽性対照細胞は、完全に抗体染色前に透過処理している間陰性対照細胞は、透過処理されていません。
無傷の液胞または細胞質ゾルのいずれかで標識されていないサルモネラ菌を含むプロトコル2.感染した細胞の図2模式図を差動ジギトニンで透過性にしています。サイトゾルサルモネラを、FITCに結 合された抗サルモネラで染色します。細胞を洗浄し、4％PFAで固定されています。細胞が完全にFITC + / Alexa568 + サルモネラ （サイトゾル）およびAlexa568 + サルモネラ （液胞）をカウントするために使用されpermeabilzedおよびAlexa 568顕微鏡に結合された二次抗体で染色した抗サルモネラ抗体で染色します。
mCherryを+野生型または＆＃で6時間感染させ、完全に透過性に、差動でunpermeabilizedまたは透過処理のサンプルの図3. FACS分析916; 6時間SIFA サルモネラ 。
図4.抗カルネキシン（A）及びジギトニン又はサポニンで透過性に感染していないBMDMsの抗PDI（B）染色。スケールバーは10μm。
ネズミチフス菌野生型および6時間感染後にΔsifA変異株との差分透過性アッセイの図5.代表的な画像。細胞質サルモネラ 、全サルモネラが示されています。細胞は、細胞質のどちらジギトニンサルモネラ用抗サルモネラ -FITCで染色する前に、（A）透過性または（B）unpermeabilized放置しました。この染色工程、Cの後ellsはサポニンで透過処理し、全サルモネラは、二次抗体染色（赤）、続いて抗サルモネラ抗体で染色しました。スケールは10μmのバー。
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Discussion
差動透過性は、液胞コンパートメントと細胞質ゾルの間の細菌性病原体の細胞内分布を分析し、定量化するための簡単かつ堅牢な方法です。同じアッセイは、 フランシセラnovicida 2,4および赤痢菌 12のような細菌で正常に使用されています。多くの細胞内病原体が宿主細胞内膜構造を変更したり、変更するので、ジギトニン透過化の堅牢性は、個別に決定する必要があります。使用病原体または細胞株に対してでのアッセイの微調整が必要になる場合があります。アッセイは、単に感染生物に限定されず、細胞死が17,18シグナリングのような、他の細胞生物学的用途のために使用することができます。
このアッセイの鍵は、原形質膜および細胞内膜は、特に、細胞内膜があまり町を含む、異なる脂質組成を有することですlesterol。ジギトニンは、複雑なコレステロール、従って透過性を差動にリード、ジギトニン処理、界面活性剤の濃度の長さに依存するの効率および選択をすることができます。これを制御するには、そのようなカルネキシンのサイトゾルテイルまたはER腔タンパク質のPDIとして定義された細胞内局在、とマーカータンパク質を染色することにより、透過処理した細胞を確認することが重要です。
差動透過化は新しいものではありませんが、このプロトコルは、さらにFACSに基づく細胞質ゾルおよび液胞、細菌を迅速かつ客観的な定量化を可能にします。 FACS分析のためには、非透過性、完全透過化細胞である2つのコントロールを含むことが重要です。これらのコントロールサンプルに基づいて、染色されていない、完全に染色された、すなわち液胞および細胞質細菌のためのゲートが設定されます。
プロトコルの重要なステップは、透過処理およびその後の洗浄工程です。金曜日eshly調製した緩衝液および界面活性剤溶液を使用する必要があります。全ての溶液は、使用直前に準備する必要があります。別の重要な点は、透過性のタイミングです。ここでは、50μg/ mlのジギトニンの濃度で1分は、骨髄由来マクロファージのために働くことが証明されています。異なる細胞株を使用する場合、使用濃度は、経験的に決定する必要があるかもしれません。 1分以上のジギトニンまたはインキュベーション時間の高濃度は、内部の膜の透過性、および偽陽性結果につながることができます。 2時間 - ジギトニンソリューションは、1のみ安定です。直前ジギトニンの新鮮な溶液を調製することは絶対的に重要です。また、膜をpermeabilzeするジギトニンの能力は、バッチからバッチへと異なるサプライヤーの間で変化することができます。
多くのサンプルを処理する必要があればそのため、容易かつ迅速に処理することができる小さなグループにこれらを分割することをお勧めします。パーマ後の最後に、すべての洗浄工程eabilizationはジギトニン処理は、細胞膜を弱くするので、非常に慎重に行う必要があります。バッファおよび吸引の添加は、ウェルの側にではなく、ウェルの中央に静かに行われるべきです。
指摘したように、細胞質ゾルおよび液胞コンパートメント間の細菌の細胞内分布を分析するための他の技術、例えば、B-ラクタマーゼ切断の使用など、存在するレポーターCCF4-AM 19を FRET。 CCF4-AM方式は、リアルタイムで液胞破裂を測定するという利点を提供するが、それは単一の細菌レベルの解像度を欠いており、単一の宿主細胞レベルでの情報を提供することができます。したがって、両方のアッセイの組み合わせは、時間をかけて、単一の細菌/宿主細胞のレベルに関する情報を得るために理想的です。重要なことに、両方のアッセイは、細菌感染症のコンテキストではなく、対象Pの細胞内局在を決定することを目指して、他の細胞生物学的研究の文脈だけでなく使用することができroteins 18。
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Acknowledgments
私たちは、議論のためのマティアス·S.ディック、ローランドF.ドライアとセバスチャンリュールを承認したいと思います。この作品は、PBにSNSF教授職PP00P3_139120 / 1と大学バーゼルのプロジェクトグラントID2153162によってサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50 μg/ml |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100 μg/ml and 10 μg/ml |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63X | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
- Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
- Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
- Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
- Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
- Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
- Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
- Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
- Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
- Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
- Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
- Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
- Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
- Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
- Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
- Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).
