Abstract
Intracellulære bakterielle patogener kan replikere i cytosolen eller i specialiserede patogen-holdige vakuoler (PCVs). For at nå cytosolen, bakterier som Shigella flexneri og Francisella novicida nødt til at inducere brud på fagosomet. I modsætning hertil Salmonella typhimurium replikerer i en vakuolær rum, kendt som Salmonella holdig vacuole (SCV). Men visse mutanter af Salmonella undlader at opretholde SCV integritet og således frigives i cytosolen. Procentdelen af cytosolisk vs. vakuolære bakterier på niveauet af enkelte bakterier kan måles ved differentiel permeabilisering, også kendt som fagosom-beskyttelse assay. Tilgangen gør brug af ejendommen vaskemiddel digitonin til selektivt at binde kolesterol. Da plasmamembranen indeholder mere kolesterol end andre cellulære membraner, kan digitonin anvendes til selektivt permeabilisere plasmamembranen mens intracellulære membranerintakt. Kort fortalt, efter infektion med patogenet udtrykker et fluorescerende markør-protein (f.eks mCherry blandt andre), er plasmamembranen af værtsceller permeabiliseret med en kort inkubering i digitonin buffer. Cellerne vaskes derefter og inkuberes med et primært antistof (koblet til en fluorophor valg) rettet mod bakterien valg (f.eks anti Salmonella FITC) og vasket igen. Hvis der anvendes umarkerede bakterier, kan et yderligere trin ske, ved hvilken alle membraner permeabiliseret og alle bakterier farves med et tilsvarende antistof. Efter farvningen, kan procentdelen af vakuolære og cytosoliske bakterier kvantificeres ved FACS eller mikroskopi ved at tælle enkelt eller dobbelt-positive begivenheder. Her giver vi eksperimentelle oplysninger om brug af denne teknik med bakterien Salmonella typhimurium. Fordelen ved dette assay er, at i modsætning til andre assay, giver det en kvantificering af niveauet af enkelt bacteria, og hvis analyseres ved mikroskopi giver det nøjagtige antal cytosolisk og vakuolære bakterier i en given celle.
Introduction
Intracellulære bakterielle patogener replikere enten direkte i værtscellen cytosolen eller i specialiserede vakuolære rum 1. I den indledende fase af infektionen fleste patogener bliver internaliseret enten ved fagocytose af specialiserede celler (såsom makrofager) eller ved aktivt at fremme deres egen optagelse i ikke-fagocytiske celler. I fagocytiske celler, normalt fagosomet sikringer med lysosomer til dannelse af en nedbrydende rum, hvor fagocyterede partikler fordøjes. Specialiserede cytosoliske bakterier, såsom Francisella novicida eller Shigella flexneri, flugt phagosomal nedbrydning ved at inducere brud på fagosomet og efterfølgende slipper ud i cytosolen 2,3. Dette kræver virulens-associerede mekanisme som Francisella patogenicitetsindeks Island (FPI) eller Shigella flexneri T3SS, som tilfører effektor proteiner, der fremmer vakuolær brud 2-4. Værtscellen cytosol funktioneret antal konserverede mønstergenkendelse receptorer, der normalt genkender tilstedeværelsen af patogener og inducerer medfødte immunreaktion signalering 5. Derudover xenophagy, kan en antimikrobiel form af autophagy nedbryde bakterier, der kommer ind i cytosolen. Cytosoliske bakterier er normalt godt tilpasset til sløve eller omgå disse svar ved hjælp af forskellige strategier. F.eks Francisella ændrer sine LPS at undgå vært anerkendelse og Shigella forhindrer autophagy rekruttering hjælp secernerede effektorproteiner 6,7.
En anden strategi for at undslippe lysosomal nedbrydning er ansat af modellen vakuolær patogen Salmonella enterica serovar Typhimurium, herefter benævnt Salmonella typhimurium. Salmonella bruger en T3SS at injicere effektorer, der remodel den indledende fagosom i sin intracellulære niche, Salmonella -indeholdende vakuolen (SCV) 8,9. Kontinuerlig manipulation af værten pathways ernødvendigt at opretholde denne vacuole ved at rekruttere lipider og andre næringsstoffer til vacuolen. Faktisk en SIFA mutant af Salmonella ikke bibeholder vakuolær stabilitet, og kommer ind i cytosolen af værtsceller inden for timer efter infektion, hvilket resulterer i aktivering af medfødte immune veje og autophagy rekruttering 8. Vakuolær udslip af Salmonella varierer afhængigt af celletype, der er undersøgelser, og flere rapporter har vist, at selv WT Salmonella i epitelceller kan undslippe SCV og hyperreplicate i cytosolen 10. Nylige rapporter viser, at medfødte immunforsvar påvisning af vakuolære patogener afhænger også af evnen af værten til at genkende og destabilisere patogen-holdige vakuoler (PCVs) 11-14.
Eftersom både værten eller bakterier genotype kan påvirke fordelingen af intracellulære bakterier mellem vakuolær og cytosoliske rum, er det nødvendigt at kvantificere antallet af vakuolær vs.cytosoliske bakterier. Da det i de fleste forsøgsopstillinger værtsceller inficeret med mere end én bakterie, og efterfølgende kan harbor flere bakterier i forskellige subcellulære afsnit er der behov for en teknik, der muliggør kvantificering af niveauet af enkelte bakterier. Differential permeabilisering (også kendt som phagosomal beskyttelse assay) giver denne beslutning 2,4,10,12. Bestemmelsen er baseret på selektiv permeabilisering af værtscellen plasmamembranen med detergent digitonin, som efterlader vakuolære membraner intakt og tillader således selektiv farvning af cytosoliske bakterier med antistoffer. Her giver vi to protokoller til kvantificering af cytosolisk og vakuolær Salmonella typhimurium ved hjælp af forskellen permeabilisering. Princippet i denne metode er beskrevet i figur 1: knoglemarv afledte makrofager (BMDMs) inficeres med stationær fase mCherry-udtrykkende Salmonella. Stationær fase Salmonella brug to anvendes, fordi de nedregulerer ekspressionen af SPI-1 T3SS, hvis aktivitet ellers ville blive anerkendt af NLRC4 inflammasome og inducere hurtig celledød (pyroptosis) i BMDMs 15. Efter infektionen celler vaskes og behandles med 50 ug / ml digitonin i 1 minut. Celler vaskes straks igen og inkuberet med anti Salmonella antistoffer koblet til FITC at markere bakterier med adgang til cytosolen. Efter yderligere vask smarte Cellerne lyseres og procentdelen af mCherry + (vakuolær) og FITC + / mCherry + (cytosol) bakterier bestemmes ved FACS. Vi rapporterer også en tilpasning af denne fremgangsmåde, som kan anvendes, hvis der ikke fluorescerende protein-udtrykkende stammer er tilgængelige (figur 2). Yderligere trin introduceres efter FITC mærkning, hvor cellerne er faste og helt permeabiliseres. Derefter alle bakterier farves med anti Salmonella antistoffer og tilsvarende sekundære antistoffer. Detfdeling derpå gjort ved mikroskopi i stedet for FACS-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Digitonin Assay med mCherry-udtrykkende Salmonella (FACS-baserede Analysis)
- Forberedelse bakterier
Bemærk: Salmonella vildtype SL1344 (streptomycin resistent), der udtrykker mCherry fra et plasmid (pFPV koder mCherry under rpsM promotoren) anvendes i dette assay. Bakteriel fagocytose og spredning, hvor ikke ændret ved konstitutiv ekspression af mCherry (data ikke vist) 16.- Inokulering stammen 1 dag før infektionen i 3 ml LB-medium suppleret med streptomycin (90 ug / ml) og ampicillin (100 ug / ml, mCherry udtrykkende vektor) i et rysteapparat ved 37 ° CO / N.
- Plating celler til infektion.
- Frø vildtype BMDMs i en plade med 24 brønde ved en densitet på 1,25 x 10 5 celler / brønd i 1 ml primær makrofag-medium (DMEM suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS, varmeinaktiveret, 56 ° C, 30 min ), 1% HEPES, 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 1% L-glutamin og 10% L929 supernatant (konditioneret medium fra makrofag koloni-stimulerende faktor (M-CSF) fremstilling L929-celler). Seed brønde ifølge tabel 1 at tage højde for de individuelle forhold. Tilføj dækglas til brøndene, der anvendes som kontroller (tabel 1).
- Inkubere cellerne natten over i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
| Permeabilisering | Farvning | ||||||
| Dækglas | Salmonella | Digitonin | Saponin | anti-Salmonella | anti-calnexin | anti-PDI | |
| A1 (prøve) | - / + * | + | + | + | |||
| A2 (prøve) | - / + * | + + | + | ||||
| A3 (prøve) | - / + * | + | + | + | |||
| A4 (ingen permeabilisering kontrol) | - / + * | + | + | ||||
| A5 (komplet permeabilisering kontrol) | - / + * | + | + | + | |||
| B1 (farvet for calnexin) | + | + | |||||
| B2 (farvet for calnexin) | + | + | + | ||||
| B3 (farvet for calnexin) | + | + | + | ||||
| C1 (farvesfor PDI) | + | + | |||||
| C2 (farvet for PDI) | + | + | + | ||||
| C3 (farvet for PDI) | + | + | + | ||||
Tabel 1: Plating ordning for knogle-marv afledte makrofager (BMDMs) i en 24-brønds format for efterfølgende infektion med Salmonella, permeabilisering og farvning * Afhængigt af, om protokol 1 eller protokol 2 er gjort..
- Forberedelse bakterierne for infektion.
- Den næste dag, bestemme koncentrationen af Salmonella i overnatskulturen ved fortynding af kulturen 1:10 i PBS og måling af OD600 mod en eneste PBS-kontrol. Dette sikrer, at OD600 måles i linear vifte af spektrofotometer.
- Beregning af koncentrationen af Salmonella per ml. En OD600 på 1 svarer til 1 x 10 9 bakterier.
- Fortynd bakterierne i makrofag medium for at nå en Salmonella koncentration på 1,25 x 10 6 celler / ml.
- Infektion af celler med Salmonella.
- Fjern mediet fra BMDMs. Der tilsættes 1 ml makrofag medium til ikke-inficerede kontrolbrønde (B1-B3, C1-C3). Der tilsættes 1 ml Salmonella suspension til hul A1 - A5 at nå en infektionsmultiplicitet (moi) på 10 bakterier per celle.
- Centrifugeres pladen i 15 minutter ved 300 xg ved 37 ° C for at synkronisere infektionen. Overføre pladen i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Killing ekstracellulær Salmonella med Gentamicin.
- Efter 1 time efter infektion, fjerne pladen fra inkubatoren, og der tilsættes 0,1 ml af makrofag medium indeholdende 0,1 mg / ml gentamicinat dræbe ekstracellulære bakterier. Tilføj Gentamicin til alle brønde, selv til ikke-inficerede kontroller, at sikre, at alle celler behandles på samme måde. Overføre pladen i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vask af cellerne.
- Ved 2 timer efter infektion, fjerne pladen fra inkubatoren og vaske alle brønde 2x med 1 ml almindelig DMEM (forvarmet til 37 ° C) og erstatte den med makrofag medium (forvarmet til 37 ° C) indeholdende 10 ug / ml Gentamycin for at forhindre væksten af eventuelle resterende ekstracellulære bakterier. Overføre pladen i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Forberedelse friske buffere med rengøringsmidler og antistoffer.
- Lige før det ønskede tidspunkt for analyse fremstilles en frisk stamopløsning af digitonin ved 1 mg / ml i KHM Buffer (110 mM kaliumacetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,3). Filter bestanden og fortyndes i KHM buffer til en fungerende koncentration50 ug / ml digitonin. Desuden forbereder en opløsning af 0,1% Saponin i KHM Buffer, anti Salmonella antistof koblet til FITC (CSA-1-FITC) ved 1/500, anti-calnexin på 1/100 eller anti-PDI på 1/100 i KHM puffer suppleret med 3% BSA.
- Celle permeabilisering.
- Fjern pladen fra inkubatoren og vask brøndene 3 gange med 0,5 ml KHM Buffer (forvarmet til 37 ° C). Fjern KHM Buffer og tilsæt 0,25 ml almindeligt KHM Buffer til brønde A4 og B1 / C1, KHM Buffer med digitonin til brønde A1 - A3 og B2 / C2 eller KHM Buffer med saponin til brønde A5 og B3 / C3 (i henhold til tabel 1). Der inkuberes i nøjagtig 1 minut ved stuetemperatur og vaske alle brønde 3x med 0,5 ml KHM Buffer (forvarmet til 37 ° C).
- Primært antistof-farvning.
- Fjern KHM Buffer og tilføje de primære antistof-opløsninger (gede-anti Salmonella-FITC, 250 pl / brønd, 0,1 ug / ml) til de passende brønde (figur 1 tabel 1). Inkubér pladen i 15 minutter i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vask cellerne 1x med 1 ml PBS.
- Inficerede celler (brønde A1 - A5): FACS-analyse
- Vask cellerne 3x med PBS og tilsæt 0,5 ml iskold PBS indeholdende 0,1% Triton. Overførsel til en 5 ml FACS rør med cellefilter hætten til at bryde op celleaggregater. Hold prøver på is.
- Analysere prøver af en FACS. Brug af fuldt permeabiliserede kontroller, skal du indstille porten for den samlede bakterier baseret på forward og sidespredning (FSC / SSC) først, og mCherry signal (610 nm ± 20 nm filter).
- Dernæst analysere FITC signal i den samlede bakteriepopulation ved hjælp af de fuldt permeabiliseret og ikke permeabiliserede knapperne til at bestemme portene for cytosoliske bakterier (FITC +, mCherry +) og vakuolære bakterier (FITC-, mCherry +) (figur 3).
- Med portene sæt, analysere prøverne og bestemme den procentdel af cytosolisk vs.vakuolære bakterier bruger FlowJo software ifølge producentens protokol.
- Inficerede permeabilisering kontroller (brønde B1 - B3, C1 - C3): mikroskopi
- Fiksering
- Fjern PBS og tilsættes 250 pi PFA 4% i PBS. Der inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C.
- Vask brøndene 2x med 1 ml PBS, og der tilsættes 250 pi 0,1 M glycin i PBS i 10 minutter til standsning af fiksativ. Vask brøndene 2x med 1 ml PBS.
- Sekundært antistof-farvning.
- Stain permeabilisering styringer til 1 time ved stuetemperatur med passende sekundære antistoffer koblet til fluoroforer i PBS suppleret med 0,1% Saponin og 3% BSA til fuldt permeabilisere celler.
- Vask Dækglas 3x med 1 ml PBS og montere dækglas til analyse i montering medium med DAPI (1,5 ug / m).
- Mikroskopi-analyse.
- Analysere dækglas med kontrollen ved en 40X eller 63X forstørrelse med anvendelse en konfokal fluorescence mikroskop. Hvis permeabilisering har arbejdet, bør der ikke være nogen farvning for ikke-permeabiliserede celler, calnexin farvning for både digitonin- og Saponin-permeabiliserede celler og PDI farvning kun for saponin-permeabiliserede celler (figur 4).
- Fiksering
2. Digitonin Assay med Umærket Salmonella (Mikroskopi-baserede Analysis)
- Forberedelse bakterier for O / N kulturer.
- Inokulere umærket Salmonella vildtype SL1344 (streptomycin resistent) 1 dag før infektionen i 3 ml LB-medium suppleret med streptomycin (90 ug / ml) i et rysteapparat ved 37 ° CO / N.
- Plating celler til infektion.
- Seed BMDMs i en 24-brønds plade indeholdende sterile dækglas med en densitet på 1,25 x 10 5 celler / brønd i 1 ml makrofag medium (DMEM suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS, de-suppleret, 56 ° C,30 min), 1% HEPES, 1% L-ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 1% L-glutamin og 10% L929 supernatant). Seed brønde ifølge tabel 1 at tage højde for de individuelle forhold.
- Inkubere cellerne O / N i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Forberedelse bakterierne for infektion.
- Den næste dag, bestemme koncentrationen af Salmonella i O / N-kulturen ved fortynding af kulturen 1:10 i PBS og måling af OD600 mod en eneste PBS-kontrol. Dette sikrer, at OD600 måles i det lineære område af spektrofotometer.
- Bestemme koncentrationen af Salmonella per milliliter. En OD600 på 1 svarer til 1 x 10 9 bakterier.
- Fortynd bakterierne i makrofag medium for at nå en Salmonella koncentration på 1,25 x 10 6 celler / ml.
- Infektion af celler med Salmonella.
- Centrifugeres pladen i 15 minutter ved 300 xg ved 37 ° C for at synkronisere infektionen. Overføre pladen i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Killing ekstracellulær Salmonella med gentamycin.
- Efter 1 time efter infektion, fjerne pladen fra inkubatoren, og der tilsættes 0,1 ml af makrofag medium indeholdende 1 mg / ml Gentamycin at dræbe ekstracellulære bakterier til alle brønde. Overføre pladen i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vask af cellerne.
- Ved 2 timer efter infektion, fjerne pladen fra inkubatoren og vask hver brønd 3 x med 1 ml frisk makrofag medium indeholdende 10 ug / ml Gentamycin for at forhindrevækst af de resterende ekstracellulære bakterier. Overføre pladen i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Forberedelse friske buffere med rengøringsmidler og antistoffer.
- Lige før det ønskede tidspunkt for analyse fremstilles en frisk stamopløsning af digitonin ved 1 mg / ml i KHM Buffer (110 mM kaliumacetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,3). Filter bestanden og fortyndes i KHM Buffer til en arbejdsgruppe koncentration på 50 ug / ml af digitonin.
- Derudover fremstilles en opløsning af 0,1% Saponin i KHM Buffer, anti- Salmonella-FITC (CSA-1, 0,1 ug / ml), anti-calnexin på 1/100 eller anti-PDI på 1/100 i KHM puffer suppleret med 3% BSA (se materialer tabel for antistofkoncentration).
- Celle permeabilisering.
- Fjern pladen fra inkubatoren og vask brøndene 3 gange med 0,5 ml KHM Buffer (forvarmet til 37 ° C). Fjern KHM Buffer og tilsæt 0,25 ml almindeligt KHM Buffertil brønde A4 og B1 / C1, KHM Buffer med digitonin til hul A1 - A3 og B2 / C2 eller KHM Buffer med saponin til hul A5 og B3 / C3 (ifølge tabel 1). Der inkuberes i nøjagtig 1 minut ved stuetemperatur og vaske alle brønde 3x med 0,5 ml KHM Buffer (forvarmet til 37 ° C).
- Primært antistof-farvning.
- Fjern KHM Buffer og tilføje de primære antistof-opløsninger (gede-anti Salmonella CSA1-FITC, 250 pl / brønd, 0,1 ug / ml) til de passende brønde (figur 2, tabel 1). Inkubér pladen i 15 minutter i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Vask 3 x med 1 ml PBS.
- Fiksering.
- Fjern PBS og tilsættes 250 pi PFA 4% i PBS. Der inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C.
- Vask brøndene 2x med 1 ml PBS, og der tilsættes 250 pi 0,1 M glycin i PBS i 10 minutter til standsning af fiksativ. Vask brøndene 2x med 1 ml PBS.
- TotalSalmonella-farvning af inficerede prøver.
- Vask Dækglas 3x med PBS med 0,1% Saponin / 3% BSA og inkuber prøverne med et anti-CSA1 antistof (gede-anti-CSA1, 0,1 ug / ml, muse-anti-LPS fungerer så godt, 0,1 ug / ml) i 1 time ved stuetemperatur i PBS med 0,1% Saponin / 3% BSA.
- Wash 3x i PBS med 0,1% Saponin / 3% BSA. Inkuber din prøver med et sekundært anti-ged antistof koblet til fluoroforen valg i PBS med 0,1% Saponin / 3% BSA i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Vask Dækglas 3x med 1 ml PBS og montere dækglas til analyse i montering medium med DAPI (1,5 ug / m).
- Mikroskopi-analyse.
- Erhverve data med et konfokalt mikroskop ved at tælle cytosolisk Salmonella (anti Salmonella-FITC positive) og total Salmonella (dobbelt positiv) (figur 5). Permeabilisering kontroller skal vise: ingen farvning for ikke-permeabilized celler, calnexin sTaining for digitonin-permeabiliserede celler og PDI farvning for saponin-permeabiliserede celler (figur 4). Wells A4 og A5 vil tjene som interne kontroller for salmonella farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 og figur 2 viser skematisk i digitonin assay beskrevet i protokol 1 og protokol 2 illustrerer de kritiske trin i protokollen og de opnåede resultater. Figur 3 viser typiske FACS resultater. Positive og negative kontroller bruges til at indstille portene for mCherry + / FITC- bakterier (vakuolær salmonella) og mCherry + / FITC + bakterier (cytosol Salmonella). Baseret på disse porte procentdelen af cytosoliske og vakuolære bakterier kan bestemmes i de eksperimentelle prøver. I dette eksempel har vi sammenlignet vildtype- og ΔsifA Salmonella. Figur 3 viser repræsentative data opnået med mCherry + Salmonella typhimurium vild-type og en ΔsifA mutant i knoglemarv-afledte murine makrofager. Figur 4 viser den sædvanlige calnexin (A) og PDI (B) farvning, der opnås i permeabilisering kontrol treated med digitonin eller saponin. Da calnexin er en ER membranprotein, kan calnexin farvning ses på hele cytosolen og omkring kernen i både digitonin- og saponin-permeabiliserede celler. I digitonin permeabiliserede kontroller ingen PDI-farvning (ER lumen) er synlig, mens farvning kan observeres i saponin-permeabiliserede celler. Figur 5A viser anti Salmonella farvning resultat i celler, der er blevet permeabiliseret med digitonin. Total bakterier er i rødt, mens cytosoliske bakterier er i grøn (farves med anti Salmonella FITC). FITC-positive population er Salmonella med adgang til cytosolen, mens FITC-negative population er bakterier, der er bosiddende i en intakt Salmonella holdig vacuole (SCV) og blev derfor beskyttet mod Salmonella FITC mærkning. Vi har også sammenlignet vildtype Salmonella til en ΔsifA mutant stamme. Da SIFA er nødvendig for Salmonella at opretholde SCV integritet en forøget procentdel af Salmonella er cytosolisk. I figur 5B viser vi en kontrol, hvor cellerne ikke blev digitonin permeabiliseret før tilsætning anti Salmonella-FITC. Følgelig kan ingen FITC-positive bakterier ses.
Figur 1. Skematisk fremstilling af protokollen 1. Inficerede celler indeholdende mCherry-positive Salmonella enten i intakte vacuoler eller cytosolen er forskelligt permeabiliseres med digitonin. Cytosoliske Salmonella farves med anti Salmonella koblet til FITC. Celler vaskes og lyseres med Triton X-100 for FACS-analyse. Negative kontrolceller ikke permeabiliseret, mens positive kontrolceller er fuldstændig permeabiliseret før antistoffarvning.
Figur 2. Skematisk fremstilling af protokol 2. Inficerede celler indeholder umærket Salmonella enten i intakte vacuoler eller cytosolen er forskelligt permeabiliseres med digitonin. Cytosoliske Salmonella farves med anti Salmonella koblet til FITC. Celler vaskes og fikseret med 4% PFA. Celler helt permeabilzed og farvet med anti Salmonella-antistoffer, efterfulgt af farvning med sekundære antistoffer koblet til Alexa 568. Mikroskopi bruges til at tælle FITC + / Alexa568 + Salmonella (cytosol) og Alexa568 + Salmonella (vakuolær).
Figur 3. FACS-analyse af fuldt permeabiliserede, unpermeabilized eller differentielt permeabiliserede prøver inficeret i 6 timer med mCherry + vildtype eller & #916; Sifa Salmonella i 6 timer.
Figur 4. Anti-calnexin (A) og anti-PDI (B) farvning af ikke-inficerede BMDMs permeabiliseret med digitonin eller saponin. Skalapanelerne 10 um.
Figur 5. Repræsentative billeder af en differentiel permeabilisering assay med Salmonella typhimurium vildtype og ΔsifA mutantstamme ved 6 timer efter infektion. Cytosoliske Salmonella og samlede Salmonella er angivet. Celler blev enten digitonin permeabiliseret (A) eller til venstre unpermeabilized (B) før farvning med anti Salmonella-FITC for cytosolisk Salmonella. Efter dette farvningstrin, calen blev permeabiliseret med Saponin og total Salmonella blev farvet med anti Salmonella antistoffer efterfulgt af sekundært antistof-farvning (rød). Scale barer 10 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskellen permeabilisering er en let og robust metode til at analysere og kvantificere den subcellulære fordeling af bakterielle patogener mellem vakuolære rum og cytosolen. Det samme assay er blevet anvendt med succes med bakterier såsom Francisella novicida 2,4 og Shigella flexneri 12. Men da mange intracellulært patogen ændre eller modificere værten endomembrane strukturer, vil robustheden af digitonin permeabilisering skal bestemmes på et individuelt grundlag. Finjustering af assayet i forhold til patogen eller anvendte cellelinie kan være nødvendigt. Assayet er ikke kun begrænset til infektion biologi, men kan også anvendes til andre celler biologisk program, der, ligesom celledød signalering 17,18.
Nøglen til dette assay er, at plasmamembranen og intracellulær membran har en anden lipidsammensætning, især intracellulære membraner indeholder mindre chokoleste. Digitonin kan komplekse cholesterol og fører således til differential permeabilisering, effektivitet og selektivitet afhænger af længden af digitonin behandling og koncentrationen af detergentet. For at kontrollere for dette er det vigtigt at kontrollere permeabiliserede celler ved farvning for markørproteiner med defineret intracellulær lokalisering, såsom cytosoliske hale calnexin eller ER luminale protein PDI.
Mens forskellen permeabilisering er ikke ny, denne protokol giver desuden en hurtig og objektiv kvantificering af cytosoliske og vakuolære bakterier baseret på FACS. For FACS-analyse er det vigtigt at medtage to kontroller, som er ikke-permeabiliserede og fuldt permeabiliserede celler. Baseret på disse kontrolprøver portene for ufarvet og fuldt farvede dvs vakuolær og cytosoliske bakterier vil blive sat.
Et kritisk trin i protokollen er permeabilisering og de efterfølgende vasketrin. Freshly tilberedte buffer- og detergentopløsninger skal anvendes. Alle løsninger skal være forberede lige før brug. Et andet kritisk punkt er timingen af permeabilisering. Her 1 minut ved en digitonin koncentration på 50 pg / ml har vist sig at fungere godt for knogle-marv afledte makrofager. Ved brug af forskellige cellelinjer, kan koncentrationen arbejdsmiljø skal bestemmes empirisk. Høje koncentrationer af digitonin eller inkubationstider over 1 min kan føre til permeabilisering af interne membraner og falske positive resultater. Digitonin opløsninger er kun stabile til 1 - 2 timer. Forberedelse af en frisk opløsning af digitonin lige før er helt afgørende. Også kapacitet digitonin at permeabilze membraner kan variere fra parti til parti og mellem forskellige leverandører.
Derfor hvis mange prøver der skal behandles, er det tilrådeligt at opdele disse op i mindre grupper, der kan være let og hurtigt behandlet. Endelig har alle vasketrin efter permeabilization skal gøres meget omhyggeligt, da digitonin behandling svækker cellemembraner. Tilsætning af buffer og aspiration bør ske forsigtigt på siden af brønden og ikke i midten af brønden.
Som påpeget, at andre teknikker analysere den subcellulære fordeling af bakterier mellem cytosolen og vakuolære rum findes, såsom anvendelsen af b-lactamase-spaltning FRET reporter CCF4-AM 19. Mens CCF4-AM-metoden har den fordel at måle vakuolær brud i realtid, det mangler opløsning på enkelt bakterie-niveau og kan kun give oplysninger om den fælles værtscelle niveau. Således en kombination af begge analyser er ideel til at få oplysninger om niveauerne af enkelte bakterier / værtsceller over tid. Vigtigt er det, kan begge assays anvendes ikke blot i forbindelse med bakterielle infektioner, men også i forbindelse med andre cellebiologiske undersøgelser, der tager sigte på at bestemme den subcellulære lokalisering af mål-proteins 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende Mathias S. Dick, Roland F. Dreier og Sebastian Rühl til diskussion. Dette arbejde blev støttet af en SNSF professorat PP00P3_139120 / 1 og en University of Basel projekttilskud ID2153162 til PB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50 μg/ml |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100 μg/ml and 10 μg/ml |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63X | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
- Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
- Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
- Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
- Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
- Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
- Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
- Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
- Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
- Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
- Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
- Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
- Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
- Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
- Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
- Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).
