Abstract
Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger können im Cytosol oder in spezialisierten erregerhaltigen Vakuolen (PCV) zu replizieren. Um das Cytosol zu erreichen, Bakterien wie Shigella flexneri und Francis novicida müssen den Bruch der phagosome induzieren. Im Gegensatz dazu repliziert Salmonella typhimurium in einer Vakuole Fach, wie Salmonellen enthaltenden Vakuolen (SCV) bekannt. Jedoch bestimmte Mutanten von Salmonella nicht zu SCV Integrität zu erhalten und somit in das Cytosol freigesetzt. Der Prozentsatz der cytosolischen vs. vakuolären Bakterien auf der Ebene von einzelnen Bakterien können durch differentielle Permeabilisierung gemessen werden, die auch als Phagosomen-Schutzassay bekannt. Der Ansatz nutzt die Eigenschaft des Waschmittels Digitonin, um selektiv binden Cholesterin. Da die Plasmamembran enthält mehr Cholesterin als andere zelluläre Membranen kann Digitonin zur selektiven Permeabilisierung der Plasmamembran, während die intrazelluläre Membranen werdenintakt. Kurz gesagt, nach einer Infektion mit dem Pathogen ein fluoreszierendes Markerprotein (zB mCherry unter anderem) exprimieren, wird die Plasmamembran der Wirtszellen mit einer kurzen Inkubation in Digitonin enthaltenden Puffer permeabilisiert. Die Zellen werden dann gewaschen und inkubiert mit einem primären Antikörper (mit einem Fluorophor gewählt gekoppelt) gegen das Bakterium der Wahl gerichtet (zB Antisalmon -FITC) und erneut gewaschen. Wenn unmarkierte Bakterien verwendet werden, kann ein zusätzlicher Schritt durchgeführt, in dem alle Membranen werden permeabilisiert und alle Bakterien, die mit einem entsprechenden Antikörper gefärbt. Nach der Färbung kann der Prozentsatz der Vakuole und cytosolische Bakterien durch FACS oder Mikroskopie durch Zählen einfach oder doppelt positive Ereignisse quantifiziert werden. Hier bieten wir experimentelle Details für den Einsatz dieser Technik mit dem Bakterium Salmonella typhimurium. Der Vorteil dieses Tests besteht darin, dass im Gegensatz zu anderen Assays, bietet es eine Quantifizierung auf der Ebene einzelner bacteria stellt die genaue Anzahl der cytosolischen und vakuolären Bakterien in einer gegebenen Zelle, und wenn durch Mikroskopie analysiert.
Introduction
Intrazelluläre bakterielle Pathogene replizieren entweder direkt in der Wirtszelle Zytosol oder in spezialisierten Vakuolen-Kammer 1. Während der Anfangsphase der Infektion am meisten Pathogene erhalten entweder durch Phagozytose durch spezialisierte Zellen (Makrophagen) oder aktiv für ihre eigene Aufnahme in nicht-phagozytische Zellen internalisiert. In Phagozyten, Sicherungen Phagosom normalerweise mit Lysosomen, um einen Abbauraum, in dem die phagozytierten Partikel verdaut werden zu bilden. Fach cytosolischen Bakterien wie Francis novicida oder Shigella flexneri, Flucht phagosomalen Abbau durch Induktion der Bruch der Phagosomen und anschließend in das Cytosol 2,3 entkommen. Dies erfordert virulenzassoziierten Mechanismus wie dem Francis Pathogenitätsinsel (FPI) oder der Shigella flexneri T3SS, die Effektor-Proteine, die Vakuole Bruch 2-4 fördern injiziert. Die Wirtszelle Cytosol Funktioneneine Anzahl von konservierten pattern recognition receptors, die normalerweise erkennen das Vorhandensein von Krankheitserregern und induzieren angeborenen Immunsignal 5. Zusätzlich xenophagy, ein antimikrobielles Form autophagy können Bakterien, die in das Cytosol eintreten verschlechtern. Cytosolische Bakterien sind in der Regel gut geeignet, um stumpf oder Umgehung Antworten mit unterschiedlichen Strategien. Zum Beispiel Francis modifiziert seine LPS zu Hosterkennung zu vermeiden und Shigella verhindert Autophagie Rekrutierung mit sezerniert Effektorproteinen 6,7.
Eine weitere Strategie, um den lysosomalen Abbau entweichen durch den Modell vakuolären Pathogen Salmonella enterica Serovar Typhimurium eingesetzt, danach wie Salmonella typhimurium bezeichnet. Salmonellen benutzt eine T3SS Effektoren, die die anfängliche phagosome in seine intrazelluläre Nische umzu einzuspritzen, Salmonella -enthaltende Vakuole (SCV) 8,9. Kontinuierliche Manipulation von Host Wege istnotwendig, diese Vakuole durch Rekrutierung Lipide und andere Nährstoffe zur Vakuole zu halten. In der Tat, eine Sifa Mutante von Salmonella nicht an vakuolären Stabilität zu gewährleisten, und tritt in das Cytosol der Wirtszellen innerhalb von Stunden nach der Infektion, die Aktivierung der angeborenen Immunwege und Autophagie Rekrutierung 8 Ergebnisse. Vakuolären Entweichen von Salmon hängt vom Zelltyp abhängig, dass Studien ist, und mehrere Berichte haben gezeigt, dass in den Epithelzellen auch WT Salmon die SCV und hyperreplicate im Cytosol 10 entkommen. Jüngste Berichte zeigen, dass die angeborene Immun Nachweis von Vakuolen Erreger hängt auch von der Fähigkeit der Aufnahme zu erkennen und zu destabilisieren erregerhaltigen Vakuolen (PCV) 11-14.
Da sowohl der Host oder Bakterien Genotyp kann die Verteilung der intrazellulären Bakterien zwischen vakuolären und Cytosol zu beeinflussen, ist es notwendig, die Anzahl der vakuolären vs. quantifizierencytosolischen Bakterien. Da in den meisten Versuchsaufbauten Wirtszellen werden mit mehr als einem Bakterium infiziert, und anschließend kann einige Bakterien in verschiedenen subzellulären Kompartimenten Hafen wird eine Technik benötigt, die Quantifizierung auf der Ebene der einzelnen Bakterien ermöglicht. Differential Permeabilisierung (auch als phagosomalen-Schutz-Assay bekannt) bietet diese Entschließung 2,4,10,12. Der Test basiert auf selektive Permeabilisierung der Plasmamembran Wirtszelle mit dem Detergens Digitonin, die vakuoläre Membranen intakt lässt und ermöglicht somit die selektive Anfärbung von zytosolischen Bakterien mit Antikörpern. Im Folgenden sollen zwei Protokolle für die Quantifizierung von cytosolischen und vakuolären Salmonella typhimurium durch Differential Permeabilisierung. Das Prinzip dieses Verfahrens ist in Figur 1 beschrieben: Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) mit stationärer Phase mCherry exprimierenden Salmonellen infiziert. Stationäre Phase Salmonellen brauchen to verwendet werden, weil sie die Expression des SPI-1 T3SS, deren Aktivität die ansonsten von der NLRC4 Inflammasoms erkannt und veran schnellen Zelltod (pyroptosis) des BMDMs 15 herunterregulieren. Nach der Infektion Zellen werden gewaschen und mit 50 ug / ml Digitonin für 1 Minute behandelt. Zellen werden sofort wieder gewaschen und mit Anti-Salmonella-Antikörper an FITC gekoppelt, um Bakterien, die mit Zugang zum Cytosol zu markieren inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt Zellen lysiert und der Prozentsatz der mCherry + (vakuoläre) und FITC + / mCherry + (cytosolische) Bakterien durch FACS bestimmt. Wir zusätzlich eine Anpassung der Methode, die verwendet werden können, wenn keine fluoreszierende Protein exprimierenden Stämme sind (Abbildung 2). Zusätzliche Schritte werden nach der Markierung mit FITC bei denen Zellen fixiert und permeabilisiert vollständig eingeführt. Danach alle Bakterien mit anti Salmonellen-Antikörpern und entsprechenden Sekundärantikörper gefärbt. DetReflexion wird dann durch Mikroskopie anstelle von FACS-Analyse durchgeführt.
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Protocol
1. Digitonin Assay mit mCherry-exprimierenden Salmonellen (FACS-basierte Analyse)
- Vorbereiten von Bakterien
Hinweis: Salmonella-Wildtyp SL1344 (Streptomycin resistent) exprimieren mCherry aus einem Plasmid (pFPV mCherry unter der RPSM Promoter kodiert) in diesem Test verwendet. Bakterielle Phagocytose und Proliferation in dem nicht durch die konstitutive Expression von mCherry verändert 16 (Daten nicht gezeigt).- Inokulieren des Stammes 1 Tag vor der Infektion in 3 ml LB-Medium mit Streptomycin (90 ug / ml) und Ampicillin (100 ug / ml, mCherry exprimierenden Vektor) in einem Schüttler bei 37 ° CO / N ergänzt.
- Plating-Zellen für eine Infektion.
- Samen Wildtyp- BMDMs in einer Platte mit 24 Vertiefungen bei einer Dichte von 1,25 x 10 5 Zellen / Vertiefung in 1 ml von primären Makrophagenmedium (DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS, hitzeinaktiviert, 56 ° C, 30 min ), 1% HEPES, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 1% L-Glutamin und 10% L929-Überstand (konditioniertes Medium von Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF) Herstellung L929-Zellen). Samen Vertiefungen entsprechend Tabelle 1 für die einzelnen Bedingungen Rechnung zu tragen. Hinzuzufügen Deck den als Kontrollen (Tabelle 1) verwendet Vertiefungen.
- Die Zellen in einem Inkubator über Nacht inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2.
| Permeabilisierung | Färbung | ||||||
| Deckglas | Salmonellen | Digitonin | Saponin | Anti-Salmonella | Anti-Calnexin | anti-PDI | |
| A1 (Probe) | - / + * | + | + | + | |||
| A2 (Probe) | - / + * | + + | + | ||||
| A3 (Probe) | - / + * | + | + | + | |||
| A4 (ohne Permeabilisierung Steuerung) | - / + * | + | + | ||||
| A5 (komplette Permeabilisierung Steuerung) | - / + * | + | + | + | |||
| B1 (für Calnexin gebeizt) | + | + | |||||
| B2 (für Calnexin gebeizt) | + | + | + | ||||
| B3 (für Calnexin gebeizt) | + | + | + | ||||
| C1 (Buntfür PDI) | + | + | |||||
| C2 (gefärbt für PDI) | + | + | + | ||||
| C3 (gefärbt für PDI) | + | + | + | ||||
Tabelle 1: Plating System für Knochenmark-Makrophagen (BMDMs) in einer 24-Well-Format für die spätere Infektion mit Salmonella, Permeabilisierung und Färbung * Je nachdem, ob Protokoll 1 oder Protokoll 2 ist fertig..
- Vorbereitung der Bakterien für die Infektion.
- Am nächsten Tag, bestimmen die Konzentration von Salmonella in der Übernacht-Kultur durch Verdünnen der Kultur 1:10 in PBS und Messen der OD 600 gegen einen PBS einzige Kontrolle. Dies stellt sicher, dass die OD 600 in der L gemesseninear Bereich des Spektrometers.
- Berechnen der Konzentration von Salmonellen pro ml. Einer OD600 von 1 entspricht 1 x 10 9 Bakterien.
- Verdünne die Bakterien in Makrophagen Medium, um ein Salmonella-Konzentration von 1,25 x 10 6 Zellen / ml zu erreichen.
- Infektion von Zellen mit Salmonella.
- Entfernen Sie Medium aus BMDMs. 1 ml Medium, um nichtinfizierten Makrophagenkontrolle Vertiefungen (B1-B3, C1-C3). 1 ml der Suspension in die Vertiefungen Salmon A1 - A5, um eine Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 Bakterien pro Zelle zu erreichen.
- Zentrifugieren Sie die Platte für 15 Minuten bei 300 g bei 37 ° C, um die Infektion zu synchronisieren. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2.
- Töten extrazellulären Salmonellen mit Gentamicin.
- Bei 1 h nach der Infektion zu entfernen Platte von Inkubator und 0,1 ml von Makrophagen-Medium mit 0,1 mg / ml Gentamicinan extrazelluläre Bakterien zu töten. Hinzuzufügen Amicin zu allen Vertiefungen, auch nicht infizierten Kontrollen, um sicherzustellen, dass alle Zellen die gleiche Weise behandelt. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2.
- Waschen der Zellen.
- Bei 2 h nach der Infektion zu entfernen Platte aus Inkubator und waschen alle Vertiefungen 2x mit 1 ml Klar DMEM (vorgewärmt auf 37 ° C) und ersetzen sie durch Makrophagen-Medium (auf 37 ° C vorgewärmt), das 10 ug / ml Gentamycin, um das Wachstum der verbleibenden extrazellulären Bakterien zu verhindern. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2.
- Vorbereiten von frischem Puffer mit Reinigungsmitteln und Antikörper.
- Kurz vor dem gewünschten Zeitpunkt der Analyse, eine frische Stammlösung von Digitonin bei 1 mg / ml in KHM-Puffer (110 mM Kaliumacetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,3). Filtern Sie die Lager und in KHM verdünnte Puffer auf eine Arbeitskonzentrationvon 50 ug / ml Digitonin. Darüber hinaus wird eine Lösung aus 0,1% Saponin in KHM Buffer, anti- Salmonellen-Antikörper gegen FITC (CSA-1-FITC) bei 1/500, anti-Calnexin in KHM gekoppelt an 1/100 oder anti-PDI bei 1/100 Puffer, ergänzt mit 3% BSA.
- Zellpermeabilisierung.
- Entfernen Platte aus Inkubator und waschen Brunnen 3x mit 0,5 ml KHM Buffer (auf 37 ° C vorgewärmt). Entfernen KHM Buffer und fügen Sie 0,25 ml Klar KHM-Puffer in Vertiefungen A4 und B1 / C1, KHM Buffer mit Digitonin in die Vertiefungen A1 - A3 und B2 / C2 oder KHM Puffer mit Saponin in Vertiefungen A5 und B3 / C3 (nach Tabelle 1). Inkubieren für genau 1 min bei RT und sofort abwaschen alle Vertiefungen 3 x mit 0,5 ml KHM Buffer (auf 37 ° C vorgewärmt).
- Primärantikörperfärbung.
- Entfernen Sie das KHM Buffer und fügen Sie die primären Antikörperlösungen (Ziege anti Salmonellen -FITC, 250 ul / Vertiefung, 0,1 ug / ml) in die entsprechenden Vertiefungen (Abbildung 1 Tabelle 1). Inkubiere die Platte für 15 min in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2.
- Die Zellen 1x mit 1 ml PBS waschen.
- Infizierte Zellen (wells A1 - A5): FACS-Analyse
- Wash Zellen 3x mit PBS und fügen Sie 0,5 ml eiskaltem PBS, das 0,1% Triton. Übertragung auf eine 5 ml FACS-Röhrchen mit Zellsieb Kappe zu brechen Zellaggregate. Halten Sie Proben auf Eis.
- Analysieren Sie die Proben eines FACS. Bei Verwendung des voll durchlässig gemacht Kontrollen, setzen das Tor für insgesamt Bakterien auf der Basis nach vorne und Seitenstreuung (FSC / SSC) erste und die mCherry Signal (610 nm ± 20 nm Filter).
- Als nächstes analysieren die FITC-Signal in der gesamten Bakterienpopulation mit Hilfe der vollständig durchlässig gemacht und nicht permeabilisiert Kontrollen, die Tore für cytosolische Bakterien (FITC +, mCherry +) und vakuoläre Bakterien (FITC-, mCherry +) (Abbildung 3) festgelegt.
- Mit setzen die Tore, die Proben analysieren und bestimmen den Anteil der cytosolischen vs.vakuolären Bakterien mittels FlowJo Software gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Nicht infizierte Permeabilisierung Kontrollen (wells B1 - B3, C1 - C3): Mikroskopie
- Fixierung
- Entfernen PBS und fügen Sie 250 ul 4% PFA in PBS. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C.
- Waschen Vertiefungen 2x mit 1 ml PBS und füge 250 ul 0,1 M Glycin in PBS für 10 min, um die Fixiermittel quenchen. Waschen Vertiefungen 2x mit 1 ml PBS.
- Sekundärantikörperfärbung.
- Flecken Permeabilisierung Steuerungen für 1 Stunde bei RT mit einem geeigneten sekundären Antikörper an Fluorophoren in PBS gekoppelt ergänzt mit 0,1% Saponin und 3% BSA vollständig permeabilisieren Zellen.
- Wash Deckgläser 3x mit 1 ml PBS und montieren Sie die Deckgläser für die Analyse in Eindeckmedium mit DAPI (1,5 ug / ml).
- Mikroskopie-Analyse.
- Analysieren Sie die Deckgläser mit den Kontrollen in einem 40X oder 63X Vergrößerung mit einem konfokalen fluoFluoreszenz Mikroskop. Wenn die Permeabilisierung gearbeitet hat, sollte es keine Färbung für nicht permeabilisierten Zellen Calnexin Färbung sowohl digitonin- und Saponin-permeabilisierten Zellen und PDI Anfärben nur für Saponin-permeabilisierten Zellen (Figur 4) ist.
- Fixierung
2. Digitonin Assay mit unbeschriftet Salmonellen (Mikroskopie-basierte Analyse)
- Vorbereiten von Bakterien, die für O / N Kulturen.
- Impfen unmarkierten Salmonella-Wildtyp SL1344 (Streptomycin resistent) 1 Tag vor der Infektion in 3 ml LB-Medium mit Streptomycin (90 ug / ml) in einem Schüttler bei 37 ° CO / N ergänzt.
- Plating-Zellen für eine Infektion.
- Samen BMDMs in einer 24 Well-Platte mit sterilen Glasdeckgläschen in einer Dichte von 1,25 x 10 5 Zellen / Vertiefung in 1 ml Makrophagen-Medium (DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS, de-komplementiert, 56 ° C,30 min), 1% HEPES, 1% L-Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 1% L-Glutamin und 10% L929-Überstand). Samen Vertiefungen entsprechend Tabelle 1 für die einzelnen Bedingungen Rechnung zu tragen.
- Die Zellen O / N in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Vorbereitung der Bakterien für die Infektion.
- Am nächsten Tag, bestimmen die Konzentration von Salmonella in der O / N-Kultur durch Verdünnen der Kultur 1:10 in PBS und Messen der OD 600 gegen einen PBS einzige Kontrolle. Dies stellt sicher, dass die OD 600 in dem linearen Bereich des Spektrophotometer gemessen.
- Bestimmen Sie die Konzentration von Salmonellen pro Milliliter. Eine OD 600 von 1 entspricht 1 x 10 9 Bakterien.
- Verdünne die Bakterien in Makrophagen Medium, um ein Salmonella-Konzentration von 1,25 x 10 6 Zellen / ml zu erreichen.
- Infektion von Zellen mit Salmonella.
- Zentrifugieren Sie die Platte für 15 Minuten bei 300 g bei 37 ° C, um die Infektion zu synchronisieren. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2.
- Töten extrazellulären Salmonellen mit Gentamycin.
- Bei 1 h nach der Infektion zu entfernen Platte von Inkubator und 0,1 ml von Makrophagen-Medium, das 1 mg / ml Gentamycin auf extrazelluläre Bakterien zu allen Vertiefungen zu töten. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2.
- Waschen der Zellen.
- Bei 2 h nach der Infektion zu entfernen Platte aus Inkubator und waschen Sie jedes Well 3x mit 1 ml frischem Makrophagen-Medium, das 10 ug / ml Gentamicin, um zu verhindern,Wachstum der verbleibenden extrazellulären Bakterien. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2.
- Vorbereiten von frischem Puffer mit Reinigungsmitteln und Antikörper.
- Kurz vor dem gewünschten Zeitpunkt der Analyse, eine frische Stammlösung von Digitonin bei 1 mg / ml in KHM-Puffer (110 mM Kaliumacetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,3). Filtern Sie die Lager und in KHM Puffer verdünnen, um eine Arbeitskonzentration von 50 ug / ml Digitonin.
- Darüber hinaus wird eine Lösung aus 0,1% Saponin in KHM Buffer, anti- Salmonellen -FITC (CSA-1, 0,1 ug / ml), anti-Calnexin auf 1/100 oder anti-PDI auf 1/100 in KHM Puffer, ergänzt mit 3% BSA (siehe Materialtabelle für Antikörperkonzentration).
- Zellpermeabilisierung.
- Entfernen Platte aus Inkubator und waschen Brunnen 3x mit 0,5 ml KHM Buffer (auf 37 ° C vorgewärmt). Entfernen KHM Buffer und fügen Sie 0,25 ml Klar KHM BufferVertiefungen A4 und B1 / C1, KHM Buffer mit Digitonin in Vertiefungen A1 - A3 und B2 / C2 oder KHM Puffer mit Saponin in Vertiefungen A5 und B3 / C3 (gemäß Tabelle 1). Inkubieren für genau 1 min bei RT und sofort abwaschen alle Vertiefungen 3 x mit 0,5 ml KHM Buffer (auf 37 ° C vorgewärmt).
- Primärantikörperfärbung.
- Entfernen Sie das KHM Buffer und fügen Sie die primären Antikörperlösungen (Ziege anti Salmonellen CSA1-FITC, 250 ul / Vertiefung, 0,1 ug / ml) in die entsprechenden Vertiefungen (Abbildung 2, Tabelle 1). Inkubiere die Platte für 15 min in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. Waschen 3x mit 1 ml PBS.
- Fixation.
- Entfernen PBS und fügen Sie 250 ul 4% PFA in PBS. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C.
- Waschen Vertiefungen 2x mit 1 ml PBS und füge 250 ul 0,1 M Glycin in PBS für 10 min, um die Fixiermittel quenchen. Waschen Vertiefungen 2x mit 1 ml PBS.
- GesamtSalmonella-Färbung der infizierten Proben.
- Waschdeckgläser 3x mit PBS mit 0,1% Saponin / 3% BSA und Inkubation der Proben mit einem Anti CSA1-Antikörper (Ziegen-anti-CSA1, 0,1 ug / ml, arbeitet Maus-anti-LPS als auch 0,1 ug / ml) 1 h bei RT in PBS mit 0.1% Saponin / 3% BSA.
- Waschen 3x in PBS mit 0.1% Saponin / 3% BSA. Ihre Proben inkubieren mit einem sekundären anti-Ziege-Antikörper gegen Fluorophor der Wahl in PBS mit 0.1% Saponin / 3% BSA für 30 min bei RT im Dunkeln gekoppelt.
- Wash Deckgläser 3x mit 1 ml PBS und montieren Sie die Deckgläser für die Analyse in Eindeckmedium mit DAPI (1,5 ug / ml).
- Mikroskopie-Analyse.
- Erwerben Sie Daten mit einem konfokalen Mikroskop durch Zählen cytosolische Salmonellen (Salmonella anti -FITC positiv) und insgesamt Salmonellen (Doppel positive) (Abbildung 5). Permeabilisierung Kontrollen sollten zeigen: keine Färbung für nicht-permeabilisierten Zellen, Calnexin sTaining für Digitonin-permeabilisierten Zellen und PDI Färbung für Saponin-permeabilisierten Zellen (Figur 4). Wells A4 und A5 werden als interne Kontrollen für die Salmonellen-Färbung zu dienen.
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Representative Results
Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen die Schaltpläne der Digitonin Assay in Protokoll 1 und Protokoll 2, die die kritische Schritte in dem Protokoll und die erzielten Ergebnisse beschrieben. Abbildung 3 zeigt typische FACS Ergebnisse. Positive und negative Kontrollen werden verwendet, um die Tore für mCherry + / FITC- Bakterien (Salmonellen Vakuolen) und mCherry + / FITC + Bakterien (Salmonellen cytosolische) eingestellt. Basierend auf diesen Toren der Anteil der cytosolischen und vakuoläre Bakterien in den experimentellen Proben bestimmt werden. In diesem Beispiel haben wir Wildtyp und ΔsifA Salmonellen verglichen. Abbildung 3 zeigt mit mCherry + Salmonella typhimurium-Wildtyp und Mutante ΔsifA in aus Knochenmark stamm murine Makrophagen erhalten repräsentative Daten. Abbildung 4 zeigt die üblichen Calnexin (A) und PDI (B), die Färbung in Permeabilisierung Kontrollen t erhalten wird,mit Digitonin oder Saponin reated. Da Calnexin eine ER-Membran-Protein kann Calnexin Färbung im gesamten Cytosol und um den Kern in den beiden digitonin- und Saponin-permeabilisierten Zellen gesehen werden. In Digitonin permeabilisiert Kontrollen keine PDI-Färbung (ER-Lumen) sichtbar, während der Färbung kann in Saponin-permeabilisierten Zellen beobachtet werden. 5A zeigt anti- Salmonellen Färbeergebnis in Zellen, die mit Digitonin permeabilisiert wurden. Insgesamt Bakterien sind in Rot, während cytosolische Bakterien sind in grün (mit Anti-Salmonella -FITC gefärbt). Die FITC-positiven Population, Salmonella mit Zugang zum Cytosol, während die FITC-negativen Population sind Bakterien, die in einem intakten Salmon Wohnsitz wurden -haltigen Vakuole (SCV) und wurden daher aus Salmon -FITC Kennzeichnung geschützt. Wir haben auch zu einer ΔsifA Mutantenstamm verglichen Wildtyp Salmonella. Seit Sifa ist notwendig für Salmonellen zu S zu haltenCV Integrität ein erhöhter Anteil der Salmonellen sind cytosolische. In 5B zeigen wir eine Kontrolle, in der die Zellen nicht permeabilisiert Digitonin bevor anti- Salmon -FITC. Dementsprechend kann keine FITC-positive Bakterien zu erkennen.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des Protokolls 1. Infizierte Zellen enthält mCherry-positive Salmonellen entweder in intakten Vakuolen oder Cytosol differentiell mit Digitonin permeabilisiert. Cytosolische Salmonellen sind mit Anti-Salmonella an FITC gekoppelt gefärbt. Die Zellen werden gewaschen und mit Triton X-100 lysiert für FACS-Analyse. Negativkontrolle Zellen nicht permeabilisiert, während positive Kontrollzellen vollständig, bevor Antikörper-Färbung durchlässig gemacht.
Abbildung 2. Schematische Darstellung des Protokolls 2. Die infizierten Zellen enthalten, nicht markierten Salmonellen entweder in intakten Vakuolen oder Cytosol differentiell mit Digitonin permeabilisiert. Cytosolische Salmonellen sind mit Anti-Salmonella an FITC gekoppelt gefärbt. Zellen werden gewaschen und mit 4% PFA fixiert. Zellen vollständig permeabilzed und mit Anti-Salmonella-Antikörper, gefolgt von Färbung mit Sekundärantikörper Alexa 568. Mikroskopie gekoppelt gefärbt wird verwendet, um FITC + / + Alexa568 Salmonellen (cytosolische) und Alexa568 + Salmonellen (Vakuolen) zählen.
Abbildung 3. FACS Analyse vollständig durchlässig gemacht, permeabilisierten oder differentiell permeabilisiert Proben für 6 Stunden mit mCherry + Wildtyp oder & # infiziert916; SIFA Salmonellen 6 Stunden.
Figur 4. Anti-Calnexin (A) und Anti-PDI (B) Färbung von nicht-infizierten BMDMs permeabilisiert mit Digitonin oder Saponin. Maßstabsbalken 10 & mgr; m.
Abbildung 5. Repräsentative Bilder eines Differenz Permeabilisierung Test mit Salmonella typhimurium-Wildtyp und dem ΔsifA mutierten Stamm zu 6 Stunden nach der Infektion. Cytosolic Salmonellen und Salmonellen insgesamt angegeben. Zellen wurden entweder mit Digitonin durchlässig gemacht (A) oder links permeabilisierten (B) vor der Färbung mit Anti-Salmon -FITC für cytosolische Salmonellen. Nach dieser Färbeschritt cEllen wurden mit Saponin permeabilisiert und Gesamt Salmonellen wurden mit Anti- Salmonellen-Antikörper, gefolgt von sekundären Antikörper-Färbung (rot) gefärbt. Maßstabsbalken 10 um.
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Discussion
Differential Permeabilisierung ist ein einfaches und robustes Verfahren zu analysieren und zu quantifizieren, die subzelluläre Verteilung von bakteriellen Krankheitserregern zwischen vakuolären Fächern und Cytosol. Das gleiche Assay wurde erfolgreich mit Bakterien wie Francis novicida 2,4 und Shigella flexneri 12 verwendet. Da jedoch viele intrazelluläre Pathogen zu verändern oder die Host-endomembrane Strukturen ändern, wird die Robustheit der Digitonin Permeabilisierung haben, um im Einzelfall festgelegt werden. Feinabstimmung des Assays in bezug auf das Pathogen oder Zellinien erforderlich sein. Der Test ist nicht nur auf die Infektionsbiologie beschränkt, sondern kann auch für andere Zell biologischen Anwendung, wie Zelltod Signalisierungs 17,18 verwendet werden.
Der Schlüssel zu dieser Assays ist, dass die Plasmamembran und intrazellulären Membran einen unterschiedlichen Lipidzusammensetzung, insbesondere intrazellulären Membranen enthalten weniger chorin. Digitonin komplexe Cholesterin und somit zu Differential Permeabilisierung der Effizienz und der Selektivität von denen abhängig von der Länge der Behandlungs Digitonin und die Konzentration des Reinigungsmittels. Um dies zu kontrollieren, ist es wichtig, permeabilisierten Zellen durch Färbung auf Markerproteine mit definierten intrazellulären Lokalisierung, wie der cytosolischen Schwanz Calnexin oder ER luminalen Protein PDI überprüfen.
Während Differential Permeabilisierung nicht neu ist, ermöglicht dieses Protokoll zusätzlich eine schnelle und objektiven Quantifizierung von cytosolischen und vakuolären Bakterien anhand von FACS. Für die FACS-Analyse ist es wichtig, zwei Kontrollen, die nicht-durchlässig gemacht und voll permeabilisierten Zellen umfassen. Auf der Grundlage dieser Kontrollproben die Tore für die ungefärbten und vollständig gebeizt dh vakuolären und cytosolische Bakterien gesetzt.
Ein entscheidender Schritt des Protokolls ist die Permeabilisierung und die nachfolgenden Waschschritte. Freshly bereit Puffer und Detergenslösungen verwendet werden müssen. Sollten alle Lösungen vorzubereiten unmittelbar vor der Verwendung. Ein weiterer kritischer Punkt ist der Zeitpunkt der Permeabilisierung. Hier 1 min bei einer Digitonin Konzentration von 50 ug / ml hat, gut für Knochenmark abgeleiteten Makrophagen Arbeit bewährt. Bei der Verwendung von verschiedenen Zelllinien, kann die Arbeitskonzentration muss empirisch ermittelt werden. Hohe Konzentrationen von Digitonin oder Inkubationszeiten über 1 min kann Permeabilisierung der internen Membranen und falsch positiven Ergebnissen führen. Digitonin-Lösungen sind nur für 1 stabil - 2 Stunden. Vorbereiten einer frischen Lösung von Digitonin kurz vor ist absolut entscheidend. Auch die Kapazität Digitonin zu permeabilze Membranen können von Charge zu Charge und von Lieferanten variieren.
Deshalb, wenn viele Proben behandelt werden müssen, ist es ratsam, diese in kleinere Gruppen, die sich einfach und schnell verarbeitet aufgeteilt. Schließlich werden alle Waschschritte nach der Dauerwelleeabilization müssen sehr sorgfältig durchgeführt werden, da die Behandlung mit Digitonin schwächt Zellmembranen. Zugabe von Puffer und Aspiration sollte in der Mitte der Wanne sanft an der Seite des Bohrlochs und nicht durchgeführt werden.
Wie bereits ausgeführt, andere Techniken analysieren die subzelluläre Verteilung von Bakterien zwischen Cytosol und vakuolären Fächer vorhanden sind, wie die Verwendung des B-Lactamase-Spaltung FRET Reporter CCF4-AM 19. Während die CCF4-AM Verfahren bieten den Vorteil der Messung vacuolar Bruch in Echtzeit, es fehlt die Auflösung in der einzigen Bakterium Ebene und kann nur Informationen über die einzelnen Wirtszelle Ebene. So eine Kombination von beiden Tests ist ideal, um Informationen über das Niveau der einzelnen Bakterien / Wirt-Zellen über die Zeit zu erhalten. Wichtig ist, dass beide Testverfahren nicht nur im Zusammenhang mit bakteriellen Infektionen, sondern auch im Zusammenhang mit anderen zellbiologischen Studien, die die subzelluläre Lokalisation des Ziel p bestimmen Ziel verwendet werdenroteins 18.
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Acknowledgments
Wir möchten Mathias S. Dick, Roland F. Dreier und Sebastian Rühl zur Diskussion zu bestätigen. Diese Arbeit wurde von einer SNF-Förderungsprofessuren PP00P3_139120 / 1 und einer Universität Basel Projektzuschuss ID2153162 zu PB unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50 μg/ml |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100 μg/ml and 10 μg/ml |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63X | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
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