Abstract
Intracellulære bakterielle patogener kan gjenskape i cytosol eller i spesialiserte patogen-holdige vakuoler (PCVs). For å komme til cytosol, bakterier som Shigella flexneri og Francisella novicida trenger å indusere bruddet i phagosome. I motsetning til dette, replikerer Salmonella typhimurium i et vacuolar kammer, kjent som Salmonella holdig vakuolen (SCV). Men visse mutanter av Salmonella ikke klarer å opprettholde SCV integritet og således frigjøres i cytosol. Prosentandelen av cytosolisk vs. vacuolar bakterier på nivået av enkle bakterier kan måles ved differensiell permeabilization, også kjent som phagosome-beskyttelsestest. Tilnærmingen gjør bruk av eiendommen vaskemiddel digitonin å selektivt binde kolesterol. Siden plasmamembranen inneholder mer kolesterol enn andre cellulære membraner, kan digitonin brukes til selektivt å permeabilisere plasmamembranen samtidig la intracellulære membranerintakt. I korte trekk, etter infeksjon med patogen som uttrykker et fluorescerende markørprotein (f.eks mCherry blant andre), er plasmamembranen av vertsceller permeabilisert med en kort inkubasjon i digitonin holdig buffer. Cellene blir deretter vasket og inkubert med et primært antistoff (koplet til en fluorofor valg) rettet mot bakterien valg (f.eks anti- Salmonella -FITC) og vasket igjen. Dersom umerkede bakterier anvendes, kan et ytterligere trinn utføres, hvor alle membranene permeabilisert og alle bakterier farget med en tilsvarende antistoff. Etter flekker, kan andelen av vacuolar og cytosoliske bakterier kvantifiseres ved FACS eller mikroskopi ved å telle enkle eller doble-positive hendelser. Her gir vi eksperimentelle detaljene for bruk av denne teknikken med bakterien Salmonella typhimurium. Fordelen med denne analyse er at, i motsetning til andre analysen, gir det en kvantifisering av nivået av enkelt bacteria, og hvis analysert ved mikroskopi gir det nøyaktige antall cytosolisk og vacuolar bakterier i en gitt celle.
Introduction
Intracellulære bakterielle patogener replikere enten direkte i vertscellen cytosol, eller i spesialiserte vacuolar kamrene 1. Under den første fasen av infeksjonen fleste patogener blir internalisert enten ved fagocytose av spesialiserte celler (for eksempel makrofager), eller ved aktivt å fremme sin egen opptak i ikke-fagocyttiske celler. I fagocytiske celler, phagosome normalt sikringer med lysosomer å danne en nedbrytende rommet, hvor fagocytterte partiklene er fordøyd. Specialized cytosolic bakterier, for eksempel Francis novicida eller Shigella flexneri, rømme phagosomal degradering ved å fremkalle bruddet i phagosome og deretter flykte inn i cytosol 2,3. Dette krever virulens-forbundet mekanisme som Francis patogenitet Island (FPI) eller Shigella flexneri T3SS, som injiserer effektor proteiner som fremmer vacuolar brudd 2-4. Vertscellen cytosol egenskaperen rekke bevarte mønstergjenkjenning reseptorer som normalt gjenkjenne tilstedeværelsen av patogener og induserer medfødte immunsignale 5. I tillegg xenophagy, kan en antimikrobiell form av autophagy nedbryte bakterier som kommer inn i cytosol. Cytosolic bakterier er normalt godt tilpasset sløv eller omgå disse svarene ved hjelp av ulike strategier. For eksempel endrer Francis sine LPS unngå vert anerkjennelse og Shigella hindrer autofagi rekruttering hjelp utskilte effektor proteiner 6,7.
En annen strategi for å unnslippe lysosomal degradering er ansatt av modellen vacuolar patogen Salmonella ente serovar Typhimurium, deretter kalt Salmonella typhimurium. Salmonella bruker en T3SS å injisere effektorer som renovere den innledende phagosome inn sin intracellulære nisje, Salmonella-holdig vakuole (SCV) 8,9. Kontinuerlig manipulering av verts trasé erer nødvendig for å opprettholde denne vakuole ved å rekruttere lipider og andre næringsstoffer til vakuolen. Faktisk en SIFA mutant av Salmonella ikke klarer å opprettholde vacuolar stabilitet, og går inn i cytosol av vertsceller i løpet av timer etter infeksjon, noe som resulterer i aktivering av medfødte immun trasé og autophagy rekruttering 8. Vacuolar rømning av Salmonella varierer avhengig av celletype som er studier, og flere rapporter har vist at i epitelceller og med WT Salmonella kan unnslippe SCV og hyperreplicate i cytosol 10. Nylige rapporter viser at medfødte immun påvisning av patogener vacuolar er også avhengig av evnen til verten for å gjenkjenne og destabilisere patogen-holdige vakuoler (PCVs) 11-14.
Gitt at både verten eller bakterier genotype kan påvirke fordelingen av intracellulære bakterier mellom vacuolar og cytosolisk rommet, er det nødvendig å kvantifisere antallet vacuolar vs.cytosolic bakterier. Siden, i de fleste forsøksoppsett vertsceller infiseres med mer enn en bakterie, og deretter kan havnen flere bakterier i forskjellige subcellulære avdelinger, er en teknikk som gjør det mulig nødvendig kvantifisering av nivået av enkelt bakterier. Differential permeabilization (også kjent som phagosomal beskyttelsestest) gir dette vedtaket 2,4,10,12. Analysen er basert på selektiv permeabilization av vertscellen plasmamembranen med vaskemiddel digitonin, noe som etterlater vacuolar membraner intakt og tillater således selektiv farging av cytosoliske bakterier med antistoffer. Her gir vi to protokoller for kvantifisering av cytosolisk og vacuolar Salmonella typhimurium hjelp differensial permeabilization. Prinsippet for denne fremgangsmåte er beskrevet i Figur 1: benmarg avledede makrofager (BMDMs) er smittet med stasjonær fase mCherry-uttrykkende Salmonella. Stasjonær fase Salmonella trenger to brukes fordi de nedregulere ekspresjon av SPI-en T3SS, hvis virksomhet ellers ville bli gjenkjent av NLRC4 inflammasome og indusere rask celledød (pyroptosis) av BMDMs 15. Etter infeksjon Cellene vaskes og behandles med 50 ug / ml digitonin i 1 minutt. Celler blir vasket igjen med en gang og inkubert med anti-Salmonella-antistoffer koblet til FITC for å markere bakterier med tilgang til cytosol. Etter et ytterligere vasketrinn ble cellene lyseres og andelen av mCherry + (vacuolar) og FITC + / mCherry + (cytosol) bakterier bestemmes ved hjelp av FACS. Vi rapporterer også en tilpasning av denne metoden som kan benyttes hvis ingen fluorescerende protein-uttrykkende stammer er tilgjengelige (figur 2). Ytterligere trinn er innført etter at FITC merking i hvilke celler er faste og fullstendig permeabilisert. Deretter alle bakterier er farget med anti Salmonella antistoffer og tilhørende sekundære antistoffer. Detection deretter gjøres ved mikroskopi i stedet for FACS analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Digitonin analysen med mCherry-uttrykke Salmonella (FACS basert analyse)
- Forbereder bakterier
Merk: Salmonella villtype SL1344 (streptomycin resistent) som uttrykker mCherry fra et plasmid (som koder pFPV mCherry under rpsM promoter) er brukt i denne analysen. Bakteriell fagocytose og spredning der ikke endret av konstituerende uttrykk for mCherry (data ikke vist) 16.- Inokuler belastningen en dag før infeksjon i 3 ml LB-medium supplert med streptomycin (90 ug / ml) og ampicillin (100 ug / ml, mCherry uttrykker vektoren) i et risteapparat ved 37 ° CO / N.
- Plating celler for infeksjon.
- Seed villtype BMDMs i en 24 brønn plate med en tetthet på 1,25 x 10 5 celler / brønn i 1 ml av primær makrofag medium (DMEM supplementert med 10% føtalt kalveserum (FCS, varme-inaktivert, 56 ° C, 30 min ), 1% HEPES, 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 1% L-glutamin og 10% L929 supernatant (kondisjonert medium fra makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF) som produserer L929-celler). Seed brønner i henhold til tabell 1 til å gjøre rede for de individuelle forhold. Legg Dekk til brønnene anvendt som kontroller (tabell 1).
- Cellene inkuberes over natten i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
| Permeabilization | Farging | ||||||
| Dekkglass | Salmonella | Digitonin | Saponin | anti-Salmonella | anti-calnexin | anti-PDI | |
| A1 (prøve) | - / + * | + | + | + | |||
| A2 (prøve) | - / + * | + + | + | ||||
| A3 (prøve) | - / + * | + | + | + | |||
| A4 (ingen permeabilization kontroll) | - / + * | + | + | ||||
| A5 (komplett permeabilization kontroll) | - / + * | + | + | + | |||
| B1 (farget for calnexin) | + | + | |||||
| B2 (farget for calnexin) | + | + | + | ||||
| B3 (farget for calnexin) | + | + | + | ||||
| C1 (fargetfor PDI) | + | + | |||||
| C2 (farget for PDI) | + | + | + | ||||
| C3 (farget for PDI) | + | + | + | ||||
Tabell 1: Plette ordning for benmargs avledede makrofager (BMDMs) i en 24-brønners format for etterfølgende infeksjon med Salmonella, permeabilization, og flekker * Avhengig av om en protokoll eller fremgangsmåte 2 er gjort..
- Forbereder bakterier for infeksjon.
- Den neste dag, bestemme konsentrasjonen av Salmonella i natten kultur ved å fortynne kulturen 1:10 i PBS og måling av OD 600 mot et bare PBS-kontroll. Dette sikrer at den 600 OD måles i linear utvalg av spektrofotometeret.
- Beregn konsentrasjonen av Salmonella pr ml. En OD600 på 1 tilsvarer 1 x 10 9 bakterier.
- Fortynn bakteriene i makrofag medium for å oppnå en Salmonella-konsentrasjon på 1,25 x 10 6 celler / ml.
- Infeksjon av celler med Salmonella.
- Fjern medium fra BMDMs. Tilsett 1 ml makrofag medium til uinfiserte kontrollbrønner (B1-B3, C1-C3). Tilsett 1 ml Salmonella suspensjon til brønnene A1 - A5 for å oppnå en multiplisitet for infeksjon (MOI) på 10 bakterier pr celle.
- Sentrifuger plate i 15 minutter ved 300 xg ved 37 ° C for å synkron infeksjonen. Overfør platen i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Killing ekstracellulære Salmonella med Gentamicin.
- Ved 1 time etter infeksjon, fjerner platen fra inkubatoren og tilsett 0,1 ml av makrofag medium inneholdende 0,1 mg / ml Gentamicinå drepe ekstracellulære bakterier. Legg Gentamicin til alle brønner, selv til uinfiserte kontroller, for å sikre at alle cellene behandles på samme måte. Overfør platen i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vasking av cellene.
- Ved to timer etter infeksjon, fjerne platen fra inkubatoren og alle brønnene vaskes 2 ganger med 1 ml av ren DMEM (forvarmet til 37 ° C) og erstatte den med makrofag medium (forvarmet til 37 ° C) inneholdende 10 ug / ml Gentamycin å hindre vekst av eventuelle gjenværende ekstracellulære bakterier. Overfør platen i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Forbereder ferske buffere med vaskemidler og antistoffer.
- Like før det ønskede tidspunkt for analyse, fremstille en ny forrådsoppløsning av digitonin ved 1 mg / ml i KHM buffer (110 mM kaliumacetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,3). Filtrere lager og fortynnet i KHM buffer til en fungerende konsentrasjonav 50 ug / ml digitonin. I tillegg utarbeide en løsning på 0,1% saponin i KHM Buffer, anti- Salmonella antistoff koblet til FITC (CSA-1-FITC) på 1/500, anti-calnexin på 1/100 eller anti-PDI på 1/100 i KHM buffer supplert med 3% BSA.
- Cell permeabilization.
- Fjern platen fra inkubatoren og vaske brønnene 3 ganger med 0,5 ml av KHM Buffer (forvarmet til 37 ° C). Fjern KHM Buffer og tilsett 0,25 ml ren KHM buffer til brønner A4 og B1 / C1, KHM Buffer med digitonin til brønner A1 - A3 og B2 / C2 eller KHM Buffer med saponin til brønner A5 og B3 / C3 (i henhold til tabell 1). Inkuber i nøyaktig 1 min ved romtemperatur og vasker alle brønnene 3 ganger med 0,5 ml av KHM Buffer (forvarmet til 37 ° C).
- Primær antistoffarging.
- Fjern KHM Buffer og legge de primære antistoff løsninger (Goat anti Salmonella -FITC, 250 mL / brønn, 0,1 mikrogram / ml) til de aktuelle brønnene (Figur 1 tabell 1). Platen inkuberes i 15 minutter i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vask cellene 1x med 1 ml PBS.
- Infiserte celler (brønner A1 - A5): FACS analyse
- Vask cellene 3x med PBS og tilsett 0,5 ml av iskald PBS inneholdende 0,1% Triton. Overføring til en 5 ml FACS rør med celle sil cap å bryte opp celleaggregater. Hold prøvene på is.
- Analysere prøver av en FACS. Bruke fullt permeabiliserte kontrollene, satt porten for samlet bakterier basert på fremover og side scatter (FSC / SSC) først, og mCherry signal (610 nm ± 20 nm filter).
- Deretter analysere FITC-signalet i den totale bakteriepopulasjon ved hjelp av de fullt permeabiliserte og ikke permeabiliserte kontroller for å angi portene for cytosoliske bakterier (FITC +, mCherry +) og vacuolar bakterier (FITC-, mCherry +) (figur 3).
- Med portene angitt, analysere prøver og bestemme prosentandelen av cytosoliske vs.vacuolar bakterier bruker FlowJo programvaren i henhold til produsentens protokoll.
- Uinfiserte permeabilization kontroller (brønner B1 - B3, C1 - C3): mikroskopi
- Fixation
- Fjern PBS og tilsett 250 mL av PFA 4% i PBS. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C.
- Vask brønnene 2 ganger med 1 ml PBS og tilsett 250 ul 0,1 M glysin i PBS i 10 minutter for å stanse fiksativ. Vask brønnene 2 ganger med 1 ml PBS.
- Sekundært antistoff farging.
- Flekk permeabilization kontroller i 1 time ved RT med egnede sekundære antistoffer koblet til fluoroforer i PBS supplert med 0,1% saponin og 3% BSA i fullt permeabilisere cellene.
- Vask Dekk 3x med 1 ml PBS og montere glassene for analyse i monteringsmedium med DAPI (1,5 ug / ml).
- Mikroskopi analyse.
- Analyser glassene med kontrollene på en 40X eller 63X forstørrelse ved hjelp av en confocal fluorescence mikroskop. Hvis permeabilization har virket, bør det ikke være noen flekker for ikke-permeabilized celler, calnexin farging for både digitonin- og saponin-permeabiliserte celler og PDI farging bare for saponin-permeabilized celler (figur 4).
- Fixation
2. Digitonin analysen med merking Salmonella (mikroskopi-basert analyse)
- Forbereder bakterier for O / N kulturer.
- Inokuler Salmonella umerket villtype SL1344 (streptomycin resistent) en dag før infeksjon i 3 ml LB-medium supplert med streptomycin (90 ug / ml) i et risteapparat ved 37 ° CO / N.
- Plating celler for infeksjon.
- Seed BMDMs i en 24-brønners plate inneholdende sterile dekkglass ved en tetthet på 1,25 x 10 5 celler / brønn i 1 ml av makrofag medium (DMEM supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS, de-supplert, 56 ° C,30 min), 1% Hepes, 1% L-Non-essensielle aminosyrer (NEAA), 1% L-glutamin og 10% L929 supernatant). Seed brønner i henhold til tabell 1 til å gjøre rede for de individuelle forhold.
- Cellene inkuberes O / N i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Forbereder bakterier for infeksjon.
- Den neste dag, bestemme konsentrasjonen av Salmonella i O / N kultur ved å fortynne kulturen 1:10 i PBS og måling av OD 600 mot et bare PBS-kontroll. Dette sikrer at OD 600 blir målt i det lineære området av spektrofotometeret.
- Bestemme konsentrasjonen av Salmonella per milliliter. En OD 600 av en tilsvarende 1 x 10 9 bakterier.
- Fortynn bakteriene i makrofag medium for å oppnå en Salmonella-konsentrasjon på 1,25 x 10 6 celler / ml.
- Infeksjon av celler med Salmonella.
- Sentrifuger plate i 15 minutter ved 300 xg ved 37 ° C for å synkron infeksjonen. Overfør platen i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Killing ekstracellulære Salmonella med Gentamycin.
- Ved 1 time etter infeksjon, fjerner platen fra inkubatoren og tilsett 0,1 ml av makrofag medium inneholdende 1 mg / ml Gentamycin å drepe ekstracellulære bakterier til alle brønnene. Overfør platen i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vasking av cellene.
- Ved to timer etter infeksjon, fjerne platen fra inkubatoren og vask hver brønn 3 ganger med 1 ml friskt medium inneholdende makrofag 10 pg / ml Gentamycin å hindrevekst av eventuelle gjenværende ekstracellulære bakterier. Overfør platen i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Forbereder ferske buffere med vaskemidler og antistoffer.
- Like før det ønskede tidspunkt for analyse, fremstille en ny forrådsoppløsning av digitonin ved 1 mg / ml i KHM buffer (110 mM kaliumacetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,3). Filtrer og fortynn lager i KHM buffer til en arbeidskonsentrasjon på 50 ug / ml av digitonin.
- I tillegg fremstille en oppløsning av 0,1% saponin i KHM buffer, anti- Salmonella -FITC (CSA-1, 0,1 ug / ml), anti-calnexin ved 1/100 eller anti-PDI på 1/100 i KHM buffer supplert med 3% BSA (se tabell materialer for antistoffkonsentrasjon).
- Cell permeabilization.
- Fjern platen fra inkubatoren og vaske brønnene 3 ganger med 0,5 ml av KHM Buffer (forvarmet til 37 ° C). Fjern KHM Buffer og tilsett 0,25 ml ren KHM Buffertil brønner A4 og B1 / C1, KHM Buffer med digitonin til brønner A1 - A3 og B2 / C2 eller KHM buffer med saponin til brønner A5 og B3 / C3 (i henhold til tabell 1). Inkuber i nøyaktig 1 min ved romtemperatur og vasker alle brønnene 3 ganger med 0,5 ml av KHM Buffer (forvarmet til 37 ° C).
- Primær antistoffarging.
- Fjern KHM Buffer og legge de primære antistoff løsninger (Goat anti Salmonella CSA1-FITC, 250 mL / brønn, 0,1 mikrogram / ml) til de aktuelle brønnene (Figur 2, Tabell 1). Platen inkuberes i 15 minutter i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Vask 3 ganger med 1 ml PBS.
- Fiksering.
- Fjern PBS og tilsett 250 mL av PFA 4% i PBS. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C.
- Vask brønnene 2 ganger med 1 ml PBS og tilsett 250 ul av 0,1 M glycin i PBS i 10 minutter for å stanse fiksativ. Vask brønnene 2 ganger med 1 ml PBS.
- TotalSalmonella farging av infiserte prøvene.
- Vask Dekk 3x med PBS med 0,1% saponin / 3% BSA, og inkuber prøvene med et anti-CSA1 antistoff (geite-anti-CSA1, 0,1 ug / ml, som fungerer mus anti-LPS også, 0,1 ug / ml) i 1 time ved RT i PBS med 0,1% saponin / 3% BSA.
- Vask 3 x i PBS med 0,1% saponin / 3% BSA. Inkuber prøvene med en sekundær anti-geit antistoff koblet til fluoroforen av valg i PBS med 0,1% saponin / 3% BSA i 30 minutter ved romtemperatur i mørke.
- Vask Dekk 3x med 1 ml PBS og montere glassene for analyse i monteringsmedium med DAPI (1,5 ug / ml).
- Mikroskopi analyse.
- Innhenting av data med en konfokal mikroskop ved å telle cytosolisk Salmonella (anti Salmonella -FITC positive) og total Salmonella (dobbel positiv) (figur 5). Permeabilization kontroller bør vise: ingen farging for ikke-permeabilized celler, calnexin shold for digitonin-permeabiliserte celler og PDI farging for saponin-permeabiliserte celler (figur 4). Wells A4 og A5 vil fungere som interne kontroller for Salmonella farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 og Figur 2 viser skjematisk av digitonin analysen beskrevet i fremgangsmåte 1 og protokoll 2 illustrerer viktige trinnene i protokollen og de oppnådde resultater. Figur 3 viser typiske FACS resultater. Positive og negative kontroller brukes til å sette portene for mCherry + / FITC- bakterier (vacuolar Salmonella) og mCherry + / FITC + bakterier (cytosolisk Salmonella). Basert på disse portene prosentandelen av cytosoliske og vacuolar bakterier kan påvises ved de eksperimentelle prøver. I dette eksemplet har vi sammenlignet med vill-type og ΔsifA Salmonella. Figur 3 viser representative data oppnådd med mCherry + Salmonella typhimurium vill-type og en ΔsifA mutant i benmarg-avledede murine makrofager. Figur 4 viser den vanlige calnexin (A) og PDI (B) flekker som er innhentet i permeabilization kontroller treated med digitonin eller saponin. Siden calnexin er en ER membran protein, kan calnexin flekker ses hele cytosol og rundt kjernen i begge digitonin- og saponin-permeabilized celler. I digitonin permeabilisert kontroller uten PDI farging (ER lumen) er synlig, mens fargingen kan observeres i saponin-permeabiliserte celler. Figur 5A viser anti- Salmonella farging resultat i celler som er blitt permeabiliserte med digitonin. Totalt bakterier er i rødt, mens cytosoliske bakterier er i grønt (farget med anti- Salmonella -FITC). Det FITC-positive populasjon er Salmonella med tilgang til cytosol, mens FITC-negative populasjon er bakterier som var bosatt i et intakt Salmonella holdig vakuolen (SCV) og ble derfor beskyttet mot Salmonella -FITC merking. Vi har også, sammenlignet villtype Salmonella til en ΔsifA mutantstamme. Siden SIFA er nødvendig for å opprettholde Salmonella SCV integritet en økt andel av Salmonella er cytosolisk. I figur 5B viser vi en kontroll, hvori cellene ikke var digitonin permeabilisert før tilsetning av anti- Salmonella -FITC. Følgelig kan ingen FITC-positive bakterier sees.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av protokollen 1. Infiserte celler inneholder mCherry-positive Salmonella enten i intakte vakuoler eller cytosol er forskjellig permeabilized med digitonin. Cytosolisk Salmonella er farget med anti Salmonella koblet til FITC. Cellene blir vasket og lysert med triton X-100 for FACS-analyse. Negative kontrollceller ikke er permeabilisert, mens positive kontrollceller er fullstendig permeabilisert før antistoffarging.
Figur 2. Skjematisk fremstilling av protokollen 2. Infiserte celler som inneholder umerkede Salmonella enten i intakte vakuoler eller cytosol er forskjellig permeabilized med digitonin. Cytosolisk Salmonella er farget med anti Salmonella koblet til FITC. Cellene vaskes og festes med 4% PFA. Cellene er fullstendig permeabilzed og farget med anti-Salmonella-antistoffer, etterfulgt av farging med sekundære antistoffer koblet til Alexa 568. Mikroskopi anvendes for å telle FITC + / Alexa568 + Salmonella (cytosol) og Alexa568 + Salmonella (vacuolar).
Figur 3. FACS-analyse av fullt permeabiliserte, unpermeabilized eller differensielt permeabiliserte prøver infisert i 6 timer med mCherry + vill-type eller & #916, SIFA Salmonella i 6 timer.
Figur 4. Anti-calnexin (A) og anti-PDI (B) farging av ikke-infiserte BMDMs permeabilisert med digitonin eller saponin. Skala stolpene 10 um.
Figur 5. Representative bilder av en differensial permeabilization assay med Salmonella typhimurium villtype og mutant stamme ΔsifA ved 6 timer etter infeksjon. Cytosolisk Salmonella og total Salmonella er indikert. Celler ble enten digitonin permeabilisert (A) eller venstre unpermeabilized (B) før farging med anti-Salmonella -FITC for cytosoliske Salmonella. Etter dette farging trinnet, calen ble permeabilized med saponin og total Salmonella ble farget med anti Salmonella antistoffer etterfulgt av sekundær antistoffarging (rød). Skala barer 10 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Differensial permeabilization er en enkel og robust metode for å analysere og kvantifisere subcellulære fordelingen av bakterielle patogener mellom vacuolar avdelinger og cytosol. Den samme analysen har vært brukt med hell med bakterier som Francis novicida 2,4 og Shigella flexneri 12. Men siden mange intracellulær patogen endre eller modifisere verts endomembransystemet strukturer, vil robusthet digitonin permeabilization må fastsettes på individuell basis. Finjustering av analysen i forhold til patogenet eller cellelinje som brukes kan være nødvendig. Analysen er ikke bare begrenset til infeksjon biologi, men kan også anvendes for andre celle biologisk program som, i likhet med celledød signale 17,18.
Nøkkelen til denne analyse er at plasmamembranen og intracellulære membran ha en forskjellig lipid sammensetning, spesielt intracellulære membraner inneholde mindre cholesterol. Digitonin kan komplekse kolesterol og dermed fører til differensial permeabilization, effektiviteten og selektiviteten av disse avhenger av lengden av digitonin behandling og konsentrasjonen av vaskemidlet. For å kontrollere for dette er det viktig å sjekke permeabiliserte celler ved farging for markørproteiner med definert intracellulær lokalisering, slik som cytosoliske halen av calnexin eller ER luminale PDI-proteinet.
Mens differensial permeabilization er ikke ny, tillater denne protokollen i tillegg en rask og objektiv kvantifisering av cytosoliske og vacuolar bakterier basert på FACS. For FACS analysen er det viktig å inkludere to kontroller, som er ikke-permeabiliserte og fullt permeabiliserte celler. Basert på disse kontrollprøver portene for unstained og fullt farget dvs. vacuolar og cytosoliske bakterier vil bli satt.
Et kritisk trinn i protokollen er permeabilization og de etterfølgende vasketrinn. Freshly preparerte buffer og vaskemiddelløsninger må brukes. Alle løsninger skal forberede like før bruk. Et annet kritisk punkt er timingen av permeabilization. Her 1 min ved digitonin en konsentrasjon på 50 pg / ml har vist seg å fungere godt for benmargsmakrofager avledet. Ved bruk av forskjellige cellelinjer, kan arbeidskonsentrasjonen må bestemmes empirisk. Høye konsentrasjoner av digitonin eller inkubasjonstider enn 1 min kan føre til permeabilization av interne membraner, og falske positive resultater. Digitonin løsninger er bare stabil i 1 - 2 timer. Forbereder en frisk løsning av digitonin like før er helt avgjørende. Også kapasiteten til å digitonin permeabilze membraner kan variere fra sats til sats, og mellom ulike leverandører.
Derfor, hvis flere prøver skal behandles er det tilrådelig å dele disse opp i mindre grupper som kan være lett og raskt behandlet. Til slutt, alle vasketrinn etter permeabilization må gjøres veldig nøye siden digitonin behandling svekker cellemembraner. Tilsetning av buffer og aspirasjon bør gjøres forsiktig på siden av brønnen, og ikke i midten av brønnen.
Som påpekt, andre teknikker for å analysere fordelingen av subcellulære bakterier mellom cytosol og vacuolar kammere finnes, som for eksempel bruk av B-laktamase spaltning FRET reporter CCF4 AM-19. Mens CCF4-AM metoden har fordelen av å måle vacuolar brudd i sanntid, det mangler oppløsning på enkelt bakterie nivå og kan kun gi informasjon om enkeltvertscellenivå. Således er en kombinasjon av begge analysene er ideelt for å oppnå informasjon om nivået av enkelte bakterier / vertceller over tid. Viktigere, kan begge analysene brukes ikke bare i sammenheng med bakterielle infeksjoner, men også i sammenheng med andre cellebiologiske undersøkelser som tar sikte på å bestemme den sub-cellulære lokalisering av målet proteins 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Mathias S. Dick, Roland F. Dreier og Sebastian Rühl for diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av en SNSF Professorat PP00P3_139120 / 1 og en University of Basel prosjektstøtte ID2153162 til PB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50 μg/ml |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100 μg/ml and 10 μg/ml |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63X | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
- Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
- Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
- Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
- Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
- Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
- Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
- Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
- Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
- Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
- Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
- Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
- Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
- Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
- Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
- Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).
