Abstract
Intracellulära bakteriepatogener kan replikera i cytosolen eller i specialiserade patogen innehåller vakuoler (PCVs). För att nå cytosolen, bakterier som Shigella flexneri och Francis novicida måste inducera brott på phagosome. Däremot replikerar Salmonella typhimurium i en vakuolär utrymme, kallad Salmonella innehållande vacuole (SCV). Men vissa mutanter av Salmonella inte upprätthålla SCV integritet och därmed frigörs i cytosolen. Andelen cytosoliskt vs. vakuolära bakterier på nivån av enstaka bakterier kan mätas genom differentiell permeabilization, även känd som phagosome-skyddsanalys. Tillvägagångssättet gör användningen av fastigheten av tvättmedel digitonin att selektivt binda kolesterol. Eftersom plasmamembranet innehåller mer kolesterol än andra cellulära membran, kan digitonin användas för att selektivt permeabilisera plasmamembranet medan intracellulära membranintakt. I korthet, efter infektion med patogenen som uttrycker ett fluorescerande markörprotein (t ex mCherry bland andra), är plasmamembranet hos värdceller permeabiliserades med en kort inkubering i digitonin innehållande buffert. Celler tvättas sedan och inkuberas med en primär antikropp (kopplad till en fluorofor val) riktad mot bakterien av val (t.ex. mot Salmonella -FITC) och tvättades igen. Om omärkta bakterier används, kan ett ytterligare steg utföras, där alla membran permeabiliseras och alla bakterier färgas med en motsvarande antikropp. Efter färgning, kan den procentuella andelen av vakuolära och cytosola bakterier kvantifieras genom FACS eller mikroskopi genom att räkna enkel- eller dubbel positiva händelser. Här ger vi experimentella detaljer för användning av denna teknik med bakterien Salmonella typhimurium. Fördelen med denna analys är att, i motsats till annan analys, ger det en kvantifiering på nivån av enda bacteria, och om analyserades genom mikroskopi ger det exakta antalet cytosoliskt och vakuolära bakterier i en given cell.
Introduction
Intracellulära bakteriepatogener replikera antingen direkt i värdcellen cytosolen eller i specialiserade vakuolära fack 1. Under det inledande skedet av infektionen flesta patogener får internaliseras antingen genom fagocytos av specialiserade celler (såsom makrofager) eller genom att aktivt främja sin egen upptag i icke-fagocytiska celler. I fagocytceller, den phagosome säkringar normalt med lysosomer för att bilda en nedbrytande fack, där fagocyterade partiklarna smälts. Specialized cytosoliska bakterier, såsom Francis novicida eller Shigella flexneri, fly phagosomal nedbrytning genom att inducera bristning av phagosome och därefter undkomma in i cytosolen 2,3. Detta kräver virulens-associerad mekanism såsom Francis patogenitetsindex Island (FPI) eller Shigella flexneri T3SS, som injicerar effektorproteiner som främjar vakuolär bristning 2-4. De värdcell cytosol funktionerett antal bevarade mönsterigenkänningsreceptorer som normalt känner igen närvaron av patogener och inducerar medfödda immun signalering 5. Dessutom xenophagy, kan ett antimikrobiellt form av autophagy nedbryta bakterier som kommer in i cytosolen. Cytosoliska bakterier normalt väl anpassade till trubbiga eller kringgå dessa svar med hjälp av olika strategier. Till exempel, Francis modifierar sina LPS för att undvika värd erkännande och Shigella förhindrar autophagy rekrytering med hjälp av utsöndrade effektorproteiner 6,7.
En annan strategi för att undkomma lysosomal nedbrytning är anställd av modellen vakuolär patogenen Salmonella enterica serovar Typhimurium, därefter kallas Salmonella typhimurium. Salmonella använder en T3SS att injicera effektenheter som renovera den ursprungliga phagosome i sin intracellulära nisch, Salmonella innehållande vacuole (SCV) 8,9. Kontinuerlig manipulation av värdvägar ärnödvändigt att behålla denna vakuolen genom att rekrytera lipider och andra näringsämnen till vakuolen. Faktiskt en sifa mutant av Salmonella inte upprätthåller vakuolär stabilitet, och kommer in i cytosolen hos värdceller inom timmar efter infektion, vilket resulterar i aktivering av medfödda immunvägar och autophagy rekrytering 8. Vakuolär utsläpp av Salmonella varierar beroende på den celltyp som är studier, och flera rapporter har visat att även WT Salmonella i epitelceller kan fly SCV och hyperreplicate i cytosolen 10. Färska rapporter visar att medfödda immun detektion av vakuolära patogener beror också på förmågan hos värd att erkänna och destabilisera patogen innehåller vakuoler (PCVs) 11-14.
Med tanke på att både värd eller bakterier genotyp kan påverka fördelningen av intracellulära bakterier mellan vakuolära och cytosoliska utrymmet, är det nödvändigt att kvantifiera antalet vakuolär vs.cytosoliska bakterier. Eftersom det i de flesta experimentella uppställningar värdceller infekteras med mer än en bakterie, och därefter kan hysa flera bakterier i olika subcellulära avdelningar, krävs en teknik som tillåter kvantifiering av nivån av enskilda bakterier. Differential permeabilisering (även känd som phagosomal skyddsanalys) ger denna resolution 2,4,10,12. Analysen är baserad på selektiv permeabilisering av värdcellens plasmamembran med detergenten digitonin, vilket lämnar vakuolära membran intakt och medger sålunda selektiv färgning av cytosoliska bakterier med antikroppar. Här ger vi två protokoll för kvantifiering av cytosoliska och vakuolär Salmonella typhimurium med hjälp av differential permeabilization. Principen för denna metod beskrivs i figur 1: Bone-märg härledda makrofager (BMDMs) infekteras med stationär fas mCherry uttryck Salmonella. Stationär fas Salmonella behöver to användas eftersom de nedreglera uttryck av SPI-1 T3SS, vars verksamhet annars skulle erkännas av NLRC4 inflammasome och inducerar snabb celldöd (pyroptosis) i BMDMs 15. Efter infektion tvättas cellerna och behandlades med 50 ^ g / ml av digitonin för en minut. Celler tvättas omedelbart igen och inkuberades med anti-Salmonella-antikroppar kopplade till FITC att markera bakterier med tillgång till cytosolen. Efter ytterligare tvättsteg cellerna lyseras och den procentuella andelen av mCherry + (vakuolär) och FITC + / mCherry + (cytosolisk) bakterier bestäms genom FACS. Vi rapporterar också en anpassning av denna metod som kan användas om inga fluorescerande proteinuttryckande stammar är tillgängliga (Figur 2). Ytterligare steg införs efter FITC märkning där cellerna är fasta och helt permeabilized. Därefter alla bakterier färgas med anti-Salmonella antikroppar och motsvarande sekundära antikroppar. Detektion görs sedan genom mikroskopi i stället för FACS-analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Digitonin Analys med mCherry-uttryckande Salmonella (FACS-baserad analys)
- Förberedelse bakterier
Obs: Salmonella av vildtyp SL1344 (streptomycin resistent) som uttrycker mCherry från en plasmid (pFPV kodande mCherry under rpsM promotor) användes vid denna analys. Bakteriell fagocytos och spridning där inte ändrats genom konstitutivt uttryck av mCherry (data ej visade) 16.- Inokulera stammen ett dygn före infektionen i 3 ml LB-medium kompletterat med streptomycin (90 | ig / ml) och ampicillin (100 | ig / ml, mCherry uttrycker vektor) i en skakapparat vid 37 ° CO / N.
- Utstrykning av celler för infektion.
- Seed vildtyp BMDMs i en 24-brunnsplatta vid en densitet av 1,25 x 10 5 celler / brunn i 1 ml primär makrofag-medium (DMEM kompletterat med 10% fetalt kalvserum (FCS, värmeinaktiverat, 56 ° C, 30 min ), 1% HEPES, 1% icke-essentiella aminosyror (NEAA) 1% L-glutamin och 10% L929-supernatanten (konditionerat medium från makrofag kolonistimulerande faktor (M-CSF) som producerar L929-celler). Seed brunnar enligt tabell 1 för att redogöra för de individuella förutsättningar. Lägg täckglas till brunnarna som användes som kontroller (tabell 1).
- Inkubera cellerna över natt i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
| Permeabilisering | Färgning | ||||||
| Glas täck | Salmonella | Digitonin | Saponin | anti-Salmonella | anti kalnexin | anti-PDI | |
| A1 (prov) | - / + * | + | + | + | |||
| A2 (prov) | - / + * | + + | + | ||||
| A3 (prov) | - / + * | + | + | + | |||
| A4 (ingen permeabilization kontroll) | - / + * | + | + | ||||
| A5 (komplett permeabilization kontroll) | - / + * | + | + | + | |||
| B1 (färgas för kalnexin) | + | + | |||||
| B2 (färgas för kalnexin) | + | + | + | ||||
| B3 (färgas för kalnexin) | + | + | + | ||||
| C1 (målatför PDI) | + | + | |||||
| C2 (färgas för PDI) | + | + | + | ||||
| C3 (färgas för PDI) | + | + | + | ||||
Tabell 1: Plätering system för benmärgs härledda makrofager (BMDMs) i ett 24-brunnsformat för efterföljande infektion med Salmonella, permeabilisering och färgning * Beroende på om protokoll 1 eller protokoll 2 görs..
- Förberedelse bakterierna för infektion.
- Nästa dag, bestämma koncentrationen av salmonella i natten kulturen genom att späda kulturen 1:10 i PBS och mätning av OD 600 mot en enda PBS kontroll. Detta säkerställer att OD 600 mäts i linear spektrofotometerns.
- Beräkna koncentrationen av Salmonella per ml. Ett OD600 på 1 motsvarar en x 10 9 bakterier.
- Späd bakterierna i makrofag-medium för att nå en Salmonella-koncentration av 1,25 x 10 6 celler / ml.
- Infektion av celler med salmonella.
- Ta bort mediet från BMDMs. Tillsätt 1 ml makrofag medium till oinfekterade kontrollbrunnar (B1-B3, C1-C3). Tillsätt 1 ml av Salmonella suspension till brunnarna A1 - A5 för att nå en infektionsmultiplicitet (moi) av 10 bakterier per cell.
- Centrifugera plattan i 15 minuter vid 300 xg vid 37 ° C för att synkronisera infektionen. Överför plattan i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Killing extracellulär Salmonella med Gentamicin.
- Vid en timme efter infektion, ta bort plattan från inkubatorn och tillsätt 0,1 ml av makrofag-medium innehållande 0,1 mg / ml gentamicinför att döda extracellulära bakterier. Lägg Gentamicin till alla brunnar, även till icke-infekterade kontroller, för att säkerställa att alla celler behandlas på samma sätt. Överför plattan i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Tvättning av cellerna.
- Vid 2 timmar efter infektion, ta bort plattan från inkubatorn och tvätta alla brunnarna 2x med 1 ml vanligt DMEM (värmts upp till 37 ° C) och ersätta det med makrofager medium (värmts upp till 37 ° C) innehållande 10 pg / ml Gentamycin att förhindra tillväxt av eventuella kvarvarande extracellulära bakterier. Överför plattan i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Förbereda färska buffertar med tvättmedel och antikroppar.
- Strax före den önskade tidpunkten för analys, bereda en färsk stamlösning av digitonin vid 1 mg / ml i KHM buffert (110 mM kaliumacetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,3). Filtrera lager och späd i KHM buffert till en fungerande koncentrationav 50 pg / ml digitonin. Dessutom förbereda en lösning av 0,1% Saponin i KHM buffert, anti- Salmonella antikropp kopplad till FITC (CSA-1-FITC) vid 1/500, anti-kalnexin på 1/100 eller anti-PDI på 1/100 i KHM buffert kompletterad med 3% BSA.
- Cell permeabilization.
- Ta bort plattan från inkubatorn och tvätta brunnarna 3x med 0,5 ml KHM Buffer (värmts upp till 37 ° C). Ta KHM buffert och tillsätt 0,25 ml vanlig KHM Buffer till brunnar A4 och B1 / C1, KHM buffert med digitonin till brunnar A1 - A3 och B2 / C2 eller KHM buffert med saponin till brunnar A5 och B3 / C3 (enligt tabell 1). Inkubera exakt 1 min vid RT och omedelbart tvätta alla brunnar 3x med 0,5 ml KHM Buffer (värmts upp till 37 ° C).
- Primär antikropp färgning.
- Ta bort KHM buffert och tillsätt den primära antikroppslösningar (get anti Salmonella -FITC, 250 ul / brunn, 0,1 mikrogram / ml) till lämpliga brunnar (Figur 1 tabell 1). Inkubera plattan i 15 min i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Tvätta cellerna 1x med 1 ml PBS.
- Infekterade Celler (brunnar A1 - A5): FACS-analys
- Tvätta cellerna 3x med PBS och tillsätt 0,5 ml iskall PBS innehållande 0,1% Triton. Överföring till en 5 ml FACS rör med cell sil lock för att bryta upp cellaggregat. Håll prover på is.
- Analysera prover av en FACS. Använda fullt permeabilized kontroller, ställ in porten för totala bakterier baserade på framåt och sidospridning (FSC / SSC) först, och mCherry signalen (610 nm ± 20 nm filter).
- Därefter analyserar FITC-signalen i den totala bakteriepopulationen med hjälp av helt permeabiliserade och inte permeabiliserade kontroller för att ställa portarna för cytosoliska bakterier (FITC +, mCherry +) och vakuolära bakterier (FITC-, mCherry +) (Figur 3).
- Med portarna in, analysera prover och bestämma andelen cytosoliska vs.vakuolära bakterier använder FlowJo programvara enligt tillverkarens protokoll.
- Oinfekterade Permeabilization kontroller (brunnar B1 - B3, C1 - C3): mikroskopi
- Fixering
- Ta bort PBS och tillsätt 250 pl PFA 4% i PBS. Inkubera i 10 minuter vid 37 ° C.
- Tvätta brunnarna 2x med 1 ml PBS och tillsätt 250 | il av 0,1 M glycin i PBS under 10 min för att släcka fixativ. Tvätta brunnarna 2x med 1 ml PBS.
- Sekundär antikroppsfärgning.
- Fläck Permeabilization kontroller för en timme vid RT med lämpliga sekundära antikroppar kopplade till fluoroforer i PBS supplementerat med 0,1% saponin och 3% BSA för att helt permeabilisera celler.
- Tvätta täckglas 3x med 1 ml PBS och montera täckglas för analys i monteringsmedium med DAPI (1,5 | ig / ml).
- Mikroskopi analys.
- Analysera täck med kontrollerna på en 40X eller 63X förstoring med ett konfokalt fluorescence mikroskop. Om permeabilization har fungerat, bör det inte finnas någon färgning för icke-permeabilized celler, kalnexin färgning för både digitonin- och Saponin-permeabiliserade celler och PDI färgning endast för saponin-permeabilized celler (Figur 4).
- Fixering
2. Digitonin analys med Omärkt Salmonella (mikroskopi baserad analys)
- Förbereda bakterier för O / N kulturer.
- Inokulera omärkt Salmonella av vildtyp SL1344 (streptomycin resistent) ett dygn före infektionen i 3 ml LB-medium kompletterat med streptomycin (90 | ig / ml) i en skakapparat vid 37 ° CO / N.
- Utstrykning av celler för infektion.
- Seed BMDMs i en 24-brunnsplatta innehållande sterila glastäckglas med en täthet av 1,25 x 10 5 celler / brunn i 1 ml makrofag-medium (DMEM kompletterat med 10% fetalt kalvserum (FCS, de-kompletterat, 56 ° C,30 min), 1% HEPES, 1% L-Icke-essentiella aminosyror (NEAA), 1% L-glutamin och 10% L929 supernatant). Seed brunnar enligt tabell 1 för att redogöra för de individuella förutsättningar.
- Inkubera cellerna O / N i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Förberedelse bakterierna för infektion.
- Nästa dag, bestämma koncentrationen av salmonella i O / N-kulturen genom att späda kulturen 1:10 i PBS och mätning av OD 600 mot en enda PBS kontroll. Detta säkerställer att OD 600 mäts i det linjära området av spektrofotometer.
- Bestäm koncentrationen av salmonella per milliliter. En OD 600 av en motsvarar en x 10 9 bakterier.
- Späd bakterierna i makrofag-medium för att nå en Salmonella-koncentration av 1,25 x 10 6 celler / ml.
- Infektion av celler med salmonella.
- Centrifugera plattan i 15 minuter vid 300 xg vid 37 ° C för att synkronisera infektionen. Överför plattan i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Killing extracellulär Salmonella med Gentamycin.
- Vid en timme efter infektion, ta bort plattan från inkubatorn och tillsätt 0,1 ml av makrofag-medium innehållande 1 mg / ml gentamycin för att döda extracellulära bakterier till alla brunnar. Överför plattan i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Tvättning av cellerna.
- Vid 2 h efter infektion, ta bort plattan från inkubatorn och tvätta varje brunn 3x med 1 ml färskt makrofag medium innehållande 10 | ig / ml Gentamycin att förhindratillväxten av eventuella kvarvarande extracellulära bakterier. Överför plattan i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Förbereda färska buffertar med tvättmedel och antikroppar.
- Strax före den önskade tidpunkten för analys, bereda en färsk stamlösning av digitonin vid 1 mg / ml i KHM buffert (110 mM kaliumacetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,3). Filtrera lager och späd i KHM buffert till en arbetskoncentration av 50 | ig / ml av digitonin.
- Dessutom förbereda en lösning av 0,1% Saponin i KHM buffert, anti- Salmonella -FITC (CSA-1, 0,1 mikrogram / ml), anti-kalnexin på 1/100 eller anti-PDI på 1/100 i KHM buffert kompletterad med 3% BSA (se material tabell för antikroppskoncentrationen).
- Cell permeabilization.
- Ta bort plattan från inkubatorn och tvätta brunnarna 3x med 0,5 ml KHM Buffer (värmts upp till 37 ° C). Ta KHM buffert och tillsätt 0,25 ml vanlig KHM Buffertill brunnarna A4 och B1 / C1, KHM buffert med digitonin till brunnar A1 - A3 och B2 / C2 eller KHM buffert med saponin till brunnar A5 och B3 / C3 (enligt tabell 1). Inkubera exakt 1 min vid RT och omedelbart tvätta alla brunnar 3x med 0,5 ml KHM Buffer (värmts upp till 37 ° C).
- Primär antikropp färgning.
- Ta bort KHM buffert och tillsätt den primära antikroppslösningar (get anti Salmonella CSA1-FITC, 250 ul / brunn, 0,1 mikrogram / ml) till lämpliga brunnar (Figur 2, Tabell 1). Inkubera plattan i 15 min i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2. Tvätta 3x med 1 ml PBS.
- Fixering.
- Ta bort PBS och tillsätt 250 pl PFA 4% i PBS. Inkubera i 10 minuter vid 37 ° C.
- Tvätta brunnarna 2x med 1 ml PBS och tillsätt 250 | il av 0,1 M glycin i PBS under 10 min för att släcka fixativ. Tvätta brunnarna 2x med 1 ml PBS.
- TotaltSalmonella färgning av infekterade prover.
- Tvätta täckglas 3x med PBS med 0,1% Saponin / 3% BSA och inkubera proverna med en anti-CSA1 antikropp (get-anti-CSA1, 0,1 ^ g / ml, mus-anti-LPS fungerar lika bra, 0,1 | ig / ml) under 1 h vid RT i PBS med 0,1% Saponin / 3% BSA.
- Tvätta 3x i PBS med 0,1% Saponin / 3% BSA. Inkubera proverna med en sekundär anti-get-antikropp kopplad till fluorofor val i PBS med 0,1% Saponin / 3% BSA under 30 min vid RT i mörker.
- Tvätta täckglas 3x med 1 ml PBS och montera täckglas för analys i monteringsmedium med DAPI (1,5 | ig / ml).
- Mikroskopi analys.
- Skaffa data med en konfokalmikroskop genom att räkna cytosoliskt Salmonella (anti- Salmonella -FITC positiv) och total Salmonella (dubbel positiv) (Figur 5). Permeabilization kontroller bör visa: ingen färgning för icke-permeabilized celler, kalnexin slande för digitonin-permeabilized celler och PDI färgning för saponin-permeabiliserade celler (Figur 4). Wells A4 och A5 kommer att fungera som interna kontroller för salmonella färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 och Figur 2 visar schemat av digitonin analysen som beskrivs i protokoll 1 och protokoll 2 visar de kritiska stegen i protokollet och de resultat som uppnåtts. Figur 3 visar typiska FACS resultat. Positiva och negativa kontroller används för att ställa portarna för mCherry + / FITC- bakterier (vakuolär Salmonella) och mCherry + / FITC + bakterier (cytosolisk Salmonella). Baserat på dessa portar andelen cytosoliska och vakuolära bakterier kan bestämmas i de experimentella proverna. I detta exempel har vi jämfört vildtyp och ΔsifA Salmonella. Figur 3 visar representativa data som erhållits med mCherry + Salmonella typhimurium av vildtyp och en ΔsifA mutant i benmärgshärledda murina makrofager. Figur 4 visar den vanliga kalnexin (A) och PDI (B) färgning som erhålls i Permeabilization kontroller treated med digitonin eller saponin. Eftersom kalnexin är en ER membranprotein, kan kalnexin färgning ses i hela cytosolen och runt kärnan i både digitonin- och saponin-permeabilized celler. I digitonin permeabilized kontroller ingen PDI färgning (ER lumen) är synlig, medan färgning kan observeras i saponin-permeabilized celler. Figur 5A visar anti- Salmonella färgning resulterar i celler som har permeabiliserade med digitonin. Totalt bakterier är i rött, medan cytosoliska bakterier i grönt (färgas med anti Salmonella -FITC). FITC-positiva befolkningen Salmonella med tillgång till cytosolen, medan FITC-negativ befolknings är bakterier som var bosatta i en intakt Salmonella innehållande vacuole (SCV) och därför skyddas från Salmonella -FITC märkning. Vi har också jämfört vildtyp Salmonella till en ΔsifA mutant stam. Eftersom Sifa är nödvändigt för salmonella att upprätthålla SCV integritet en ökad andel av salmonella är cytosoliskt. I fig 5B visar vi en kontroll, i vilket cellerna inte var digitonin permeabilized före tillsats mot Salmonella -FITC. Följaktligen kan inga FITC-positiva bakterier ses.
Figur 1. Schematisk bild av protokoll 1. Infekterade celler som innehåller mCherry-positiva Salmonella antingen i intakta vakuoler eller cytosolen differentiellt permeabiliserades med digitonin. Cytosolisk Salmonella färgas med anti- Salmonella kopplat till FITC. Celler tvättas och lyseras med Triton X-100 för FACS-analys. Negativa kontrollceller inte permeabiliseras, medan positiva kontrollceller är helt permeabiliseras innan antikroppar färgning.
Figur 2. Schematisk bild av protokoll 2. Infekterade celler innehållande omärkt Salmonella antingen i intakta vakuoler eller cytosolen differentiellt permeabiliserades med digitonin. Cytosolisk Salmonella färgas med anti- Salmonella kopplat till FITC. Celler tvättades och fixerades med 4% PFA. Celler helt permeabilzed och färgas med anti-Salmonella-antikroppar, följt av färgning med sekundära antikroppar kopplade till Alexa 568. Mikroskopi används för att räkna FITC + / Alexa568 + Salmonella (cytosoliskt) och Alexa568 + Salmonella (vakuolär).
Figur 3. FACS-analys av helt permeabiliserade, unpermeabilized eller differentiellt permeabiliserade prover infekterades i 6 timmar med mCherry + vildtyp eller & #916; SIFA Salmonella i 6 timmar.
Figur 4. Anti-kalnexin (A) och anti-PDI (B) färgning av oinfekterade BMDMs permeabiliserades med digitonin eller saponin. Skalstrecken 10 um.
Figur 5. Representativa bilder av en differential permeabilization analys med Salmonella typhimurium av vildtyp och ΔsifA mutantstammen vid 6 h efter infektion. Cytosolisk Salmonella och totala Salmonella indikeras. Cellerna var antingen digitonin permeabiliseras (A) eller vänster unpermeabilized (B) innan infärgning med anti Salmonella -FITC för cytosoliskt salmonella. Efter detta färgningssteg, calnar permeabiliserades med saponin och total Salmonella färgades med anti-Salmonella-antikroppar följt av sekundär färgning antikropp (röd). Skalstrecken 10 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Differential permeabilization är en enkel och robust metod för att analysera och kvantifiera subcellulära fördelningen av bakteriella patogener mellan vakuolära fack och cytosolen. Samma analys har använts med framgång med bakterier såsom Francis novicida 2,4 och Shigella flexneri 12. Men eftersom många intracellulär patogen ändra eller modifiera värd endomembrane strukturer kommer robustheten i digitonin permeabilization måste fastställas på individuell basis. Fininställning av analysen med avseende på patogenen eller cellinje som används kan vara nödvändigt. Analysen är inte bara begränsat till infektionsbiologi, men kan också användas för andra cellbiologiska program som, som celldöd signalering 17,18.
Nyckeln till denna analys är att plasmamembranet och intracellulära membran har en annan lipidkomposition, speciellt intracellulära membran innehåller mindre cholesterol. Digitonin kan komplexa kolesterol och därmed leder till differential permeabilization, effektivitet och selektivitet som beror på längden av digitonin behandling och koncentrationen av rengöringsmedel. För att kontrollera om detta är det viktigt att kontrollera permeabiliserade celler genom färgning för markörproteiner med definierad intracellulär lokalisering, såsom cytosoliska svansen av kalnexin eller ER luminala protein PDI.
Även differential permeabilization är inte ny, ger detta protokoll dessutom en snabb och objektiv kvantifiering av cytosoliska och vakuolära bakterier baserade på FACS. För FACS-analys är det viktigt att inkludera två kontroller, som är icke-permeabiliserade och fullt permeabiliserade celler. Baserat på dessa kontrollprover portarna för ofärgade och helt färgade dvs. vakuolär och cytosoliska bakterier kommer ställas in.
Ett kritiskt steg i protokollet är permeabilisering och efterföljande tvättsteg. Freshly beredda buffert och detergentlösningar måste användas. Alla lösningar ska vara förbereda strax före användning. En annan kritisk punkt är tidpunkten för permeabilization. Här 1 min vid en digitonin koncentration av 50 | ig / ml har visat sig fungera bra för benmärgs härledda makrofager. När man använder olika cellinjer, kan arbetskoncentrationen måste bestämmas empiriskt. Höga halter av digitonin eller inkubationstider över 1 minut kan leda till permeabilisering av interna membran, och falska positiva resultat. Digitonin lösningar är endast stabila under 1 - 2 tim. Förbereda en färsk lösning av digitonin precis innan är helt avgörande. Även förmåga digitonin att permeabilze membran kan variera från sats till sats och mellan olika leverantörer.
Därför, om många prover måste behandlas är det lämpligt att dela upp dessa i mindre grupper som kan vara lätt och snabbt behandlas. Slutligen, alla tvättsteg efter permeabilization måste göras mycket noggrant eftersom digitonin behandling försvagar cellmembran. Tillsats av buffert och aspiration bör göras försiktigt på sidan av brunnen och inte i mitten av brunnen.
Som påpekats, att andra tekniker analysera subcellulära fördelningen av bakterier mellan cytosolen och vakuolära fack finns, såsom användning av b-laktamasklyvning FRET reporter CCF4-AM 19. Medan CCF4-AM-metoden har fördelen att mäta vakuolär bristning i realtid, saknar den upplösning på den inre bakterien nivå och kan bara ge information om den enda värdcellnivå. Sålunda kan en kombination av båda analyserna är idealisk för att få information om nivåerna av enskilda bakterier / värdceller över tiden. Viktigt kan båda analyserna kan användas inte bara i samband med bakteriella infektioner, men också i samband med andra cellbiologiska studier som syftar till att fastställa sub-cellulära lokalisering av mål proteins 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka för Mathias S. Dick, Roland F. Dreier och Sebastian Rühl för diskussion. Detta arbete stöddes av en SNSF professur PP00P3_139120 / 1 och universitetet i Basel projektbidrag ID2153162 till PB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50 μg/ml |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100 μg/ml and 10 μg/ml |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63X | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
- Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
- Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
- Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
- Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
- Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
- Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
- Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
- Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
- Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
- Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
- Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
- Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
- Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
- Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
- Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).
