Abstract
Hücre içi bakteriyel patojenler sitosolde veya özel patojen içeren vakuol (PCVS) 'de çoğaltabilirsiniz. Sitoplazmada ulaşmak için, Shigella flexneri'ye ve Francisella novicida gibi bakteriler fagozomun rüptürü ikna etmek gerekir. Bunun aksine, Salmonella typhimurium, Salmonella-ihtiva-eden vakuol (SCV) olarak bilinen bir vakuolar bölmesi içinde çoğaltılır. Salmonella Ancak bazı mutantlar SCV bütünlüğünü korumak için başarısız ve böylece sitozolüne salınır. Tek bir bakteri seviyesine vakuolar bakteri genel sitosolik yüzdesi da fagosom-koruma deneyi olarak bilinen, ayırıcı permeabilization ile ölçülebilir. yaklaşım deterjan digitonin mülkiyet kullanımı seçici kolesterol bağlamak için yapar. Plazma membranı diğer hücre membranları daha fazla kolesterol içerdiği, Digitonin hücre içi zarlar bırakırken seçici plazma membran geçirgenliği kullanılabilirbozulmamış. Floresan markör proteinin (diğerleri arasında, örneğin MCherry) ifade patojen ile kısa süreli, enfeksiyona, konakçı hücrelerin plazma membran tampon içeren digitonin kısa bir kuluçkalama permeabilize edilmiştir. Hücreler daha sonra yıkandı ve inkübe tercih bakteriye karşı yönlendirilmiş (seçim bir flüorofora bağlı), bir primer antikor ile (örneğin, anti-Salmonella -FITC) ile tekrar yıkanır. İşaretlenmemiş bakteriler kullanıldığı takdirde, ilave bir aşama olduğu tüm zarlar geçirgen ve tüm bakteri karşılık gelen bir antikor ile boyandı, yapılabilir. Boyama işleminin ardından, vakuolar ve sitosolik bakteri oranı, tek veya çift-pozitif olaylar sayarak, FACS ya da mikroskop ile tayin edilebilir. Burada bakteri Salmonella typhimurium, bu tekniğin kullanımı için deneysel ayrıntıları sunmaktadır. Bu testin bir avantajı, diğer deneyde tersine, tekli bacte düzeyinde bir ölçümü sağlar, kiRia, mikroskopi ile analiz edildi ve eğer belirli bir hücrede sitosolik ve vakuolar bakterilerin tam sayısını içerir.
Introduction
Hücre içi bakteriyel patojenler doğrudan konak hücre sitoplazmada veya uzman vakuoler bölmelerde 1 ya çoğaltmak. Enfeksiyonun başlangıç aşamasında en patojenler (örneğin histiositler gibi) ya da aktif bir fagositik olmayan hücrelere kendi alımını teşvik ederek özel hücreler tarafından fagositoz yoluyla internalize olsun. Fagositik hücrelerde, fagosom normalde fagosite parçacıklar sindirilir bir parçalayıcı bölme oluşturmak için lizozomlar ile sigortalar. Böyle Francisella novicida veya Shigella flexneri gibi özel sitozolik bakteriler, fagozomun rüptürü uyararak phagosomal bozulmasını kaçmak ve daha sonra sitozol 2,3 kaçmasına. Bu tür vakuoler rüptürü 2-4 teşvik efektör proteinleri enjekte Francisella Patojenite Adası (FPI) ya da Shigella flexneri T3SS gibi virülans ilişkili mekanizması gerektirir. konakçı hücre sitosol özellikleriNormalde patojenlerin varlığı tanımak ve 5 sinyal doğuştan gelen bağışıklık neden korunmuş örüntü tanıma reseptörleri bir dizi. Buna ek olarak, xenophagy, otofaji bir anti-mikrobiyal formu sitoplazmada girmek bakteri düşürebilir. Sitozolik bakteriler normalde iyi künt veya farklı stratejiler kullanarak bu yanıtları aşmak için uyarlanmıştır. Örneğin, Francisella konak tanıma önlemek için kendi LPS değiştirir ve Shigella salgılanan proteinler efektör 6,7 kullanarak otofaji işe engeller.
Lizozomal bozulması kaçmak için bir başka strateji modeli vaküoler patojen Salmonella serovar Typhimurium'da tarafından istihdam edilmektedir, bundan sonra Salmonella typhimurium olarak anılacaktır. Salmonella hücre içi niş içine ilk phagosome pişmanlık efektörleri enjekte etmek için bir T3SS kullanır Salmonella vakuol (SCV) içeren 8,9. Ev sahibi yollarının sürekli manipülasyon olduğunuGerekli vaküole lipidler ve diğer besin alımı yoluyla bu çarpıtma korumak için. Gerçekten de, Salmonella şifa mutant vakuolar stabilitesini korumak için başarısız olur ve doğuştan gelen bağışıklık yolları ve Otofaji işe 8 aktivasyonu ile sonuçlanır enfeksiyondan sonra birkaç saat içinde konakçı hücrelerin sitosol girer. Salmonella koful çıkış çalışmaları olduğu hücre tipine bağlı olarak değişir, ve çeşitli epitelial hücrelerinde daha WT Salmonella sitozol 10 SCV ve hyperreplicate kaçabilir göstermiştir. Son raporlar vakuoler patojenlerin doğuştan gelen bağışıklık tespiti de tanımak ve patojen içeren vakuoller (PCVS) 11-14 istikrarsızlaştırmak için konağın yeteneğine bağlıdır göstermektedir.
Ev sahibi ya da bakteri hem genotip vaküoler ve sitozolik bölme arasındaki hücre içi bakteri dağılımını etkileyebilir göz önüne alındığında, bu vaküoler vs sayısını ölçmek için gerekli olansitosolik bakteri. Bu yana, en deney düzeneğinde konakçı hücreler, farklı hücre içi bölmelerde bir çok bakteri barındırabilir, daha sonra fazla bir bakteri ile enfekte edildi ve edilmektedir, bir teknik, tek bakteri seviyesine ölçümü sağlar ihtiyaç vardır. (Ayrıca phagosomal koruma deneyi olarak da bilinir) Diferansiyel permeabilization bu çözünürlük 2,4,10,12 sağlar. deney sağlam vakuolar membranlar bırakır deterjan digitonin ile konakçı hücre, plazma zarının seçici geçirgenliği göre ve böylece antikorlar ile sitosolik bakteri seçici boyanmasını izin verir. Burada diferansiyel permeabilization kullanarak sitozolik ve vakuolar Salmonella typhimurium ölçümü için iki protokol sağlar. Bu yöntemin prensibi, Şekil 1 'de tarif edilmektedir: Kemik iliği türevli makrofajlar (BMDMs) durağan faz Salmonella MCherry-ifade ile enfekte edilir. Sabit faz Salmonella t gerekOnlar faaliyet aksi NLRC4 inflammasome tarafından tanınan ve BMDMs 15 hızlı hücre ölümünü (pyroptosis) neden olacağını SPI-1 T3SS, ifade downregulate çünkü o kullanılır. Hücreler yıkandı ve 1 dakika için digitonin 50 ug / ml ile muamele edilir enfeksiyonu takiben. Hücreler hemen tekrar yıkandı ve sitoplazmada erişimi olan bakteri işaretlemek için FITC bağlanmış anti-Salmonella antikorlar ile inkübe edilir. Adım hücreler parçalanır ek yıkama ve MCherry + (vakuolar) ve FITC + / MCherry + (sitosolik) bakteri yüzdesi sonra FACS ile tespit edilir. Ayrıca herhangi bir floresan proteini eksprese eden suşlar mevcuttur (Şekil 2) ise kullanılabilecek bu yöntemin bir uyarlamasını sunulmuştur. Ek adımlar hücreler, sabit ve tamamıyla geçirgen olan FITC etiketleme sonra katılır. Bundan sonra, tüm bakteriler anti-Salmonella antikorlar ve buna tekabül eden ikincil antikor ile boyandı. Detection daha sonra yerine FACS analizinin mikroskobu ile yapılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Salmonella MCherry-ifade ile 1. Digitonin Deneyi (Analiz FACS tabanlı)
- Hazırlama bakteriler
Not: bir plazmid (pFPV rpsM destekleyicisi altında mCherry kodlayan) için mCherry eksprese Salmonella, vahşi tip SL1344 (Streptomisin dirençli) bu deneyde kullanılır. MCherry konstitütif ekspresyonu ile değişmediğini Bakteriyel fagositoz ve proliferasyon 16 (veriler gösterilmemiştir).- 37 ° CO / N bir çalkalayıcıda streptomisin (90 ug / ml) ve ampisilin (100 ug / ml, MCherry ifade vektörü) ile desteklenmiş LB aracı maddesi içinde 3 ml enfeksiyondan önce soyu 1 gün inoküle.
- Enfeksiyon hücreleri Kaplama.
- 1.25 x 10 5 hücre yoğunluğunda 24 oyuklu bir plaka içerisinde tohum vahşi tip BMDMs / göz birincil makrofaj ortamı, 1 ml (DMEM,% 10 fetal buzağı serumu (FCS, ısı ile inaktive edilmiş, 56 ° C'de, 30 dakika ile desteklenmiş ),% 1 HEPES,% 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA),% 1 L-glutamin ve% 10 L929 süpernatan (makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF şartlanmış ortam) L929 hücrelerini üreten). Tablo 1'e göre Tohum kuyuları tek tek koşullara hesaba. Kontrol (Tablo 1) olarak kullanılan oyuklara lamelleri ekleyin.
- 37 ° C'de bir inkübatör içinde gece boyunca inkübe hücreleri ve% 5 CO2.
| Permeabilizasyon | Boyanma | ||||||
| Cam lamel | Salmonella | Digitonin | Saponin | anti-Salmonella | Anti-calnexin | Anti-PDI | |
| A1 (örnek) | - / + * | + | + | + | |||
| A2 (örnek) | - / + * | + + | + | ||||
| A3 (örnek) | - / + * | + | + | + | |||
| A4 (hayır permeabilization kontrol) | - / + * | + | + | ||||
| A5 (tam permeabilization kontrol) | - / + * | + | + | + | |||
| B1 (calnexin lekeli) | + | + | |||||
| B2 (calnexin lekeli) | + | + | + | ||||
| B3 (calnexin lekeli) | + | + | + | ||||
| C1 (lekeli) PDI için | + | + | |||||
| C2 (PDI için lekeli) | + | + | + | ||||
| C3 (PDI için lekeli) | + | + | + | ||||
Tablo 1: Salmonella, geçirgenliği ve boyama daha sonra, enfeksiyon için 24 oyuklu bir formatta, kemik iliği türevli makrofajlar (BMDMs) için kaplama şeması * Protokol 1 ya da protokol 2 yapılır olup olmamasına bağlı olarak değişir..
- Enfeksiyonu bakteriyi hazırlanması.
- Sonraki gün, PBS içinde kültür 1:10 seyreltilmesiyle ve yalnızca PBS kontrolüne karşı OD 600 ölçülerek, gece boyunca kültürdeki Salmonella konsantrasyonunu belirler. Bu OD 600 l ölçülür sağlarspektrofotometrenin inear aralığı.
- Ml başına Salmonella konsantrasyonu hesaplanır. 1 OD600 1 x 10 9 bakteri karşılık gelir.
- 1.25 x 10 6 hücre / ml'lik bir konsantrasyona ulaşmak için Salmonella makrofaj ortam içinde bakteri ile seyreltilir.
- Salmonella ile hücrelerin enfeksiyonu.
- BMDMs orta çıkarın. Enfekte edilmemiş kontrol çukurları (B1-B3, C1-C3) makrofaj ortamın 1 ml ilave edilir. Kuyu A1 Salmonella süspansiyonu 1 ml ilave edilir - A5, hücre başına 10 bakteri enfeksiyonu (moi) 'in bir çokluğu ulaşmak için.
- Enfeksiyonu senkronize etmek için 37 ° C'de 300 x g'de 15 dakika boyunca plaka santrifüjleyin. 37 ° C'de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2.
- Gentamisin ile hücre dışı Salmonella Killing.
- 1 saat sonrası enfeksiyon, inkübatör plaka kaldırmak ve 0.1 mg / ml gentamisin ihtiva eden makrofaj ortamın 0.1 ml ilaveekstrasellüler bakterileri öldürmek için. Tüm hücreler aynı şekilde muamele olmasını sağlamak için, daha da enfekte olmamış kontrollere göre, tüm oyuklara gentamisin ekleyin. 37 ° C'de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2.
- Hücreleri Yıkama.
- 2 saat sonra enfeksiyondan, inkübatör plaka kaldırmak ve kuyular düz DMEM 1 ml 2x yıkama (önceden ısıtılmış 37 ° C) ve makrofaj ortam ile yerine 10 ug / ml içeren (37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış) Gentamisin kalan dışı bakterilerin gelişimini önlemek için. 37 ° C'de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2.
- Deterjan ve antikorlar ile taze tamponlar hazırlanması.
- Sadece analiz istenilen zaman noktasından önce, 1 mg / KHM Tamponu içinde ml (110 mM potasyum asetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.3) ile digitonin taze bir stok çözelti hazırlayın. Bir çalışma konsantrasyonu tampon stok Filtre ve KHM sulandırmakdigitonin 50 ug / ml. Buna ek olarak, KHM Tamponu, KHM içinde 1/100 1/100 ya da anti-PDI ile 1/500 anti-calnexin de FITC (CSA-1-FITC) bağlı anti-Salmonella antikorda% 0.1 saponin içeren bir çözelti hazırlanması Tampon% 3 BSA ile takviye edilmiştir.
- Hücre permeabilizasyon.
- Inkübatörden plaka çıkarın ve yıkama kuyu KHM Tamponu, 0.5 ml (37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış) 3x. A3 ve kuyular A5 ve B3 saponin ile B2 / C2 veya KHM Tampon / C3 (Tablo 1'e göre) - KHM Buffer çıkarın ve kuyu A1 digitonin kuyu A4 ve B1 / C1, KHM Tampon 0.25 ml düz KHM Tampon ekleyin. Tüm oyuklar KHM Tamponu, 0.5 ml ile 3 kez yıkama hemen oda sıcaklığında tam olarak 1 dakika boyunca inkübe ve (37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış).
- Birincil antikor boyama.
- Uygun oyuklara primer antikor çözeltileri (keçi anti-Salmonella -FITC, 250 ul / göz, 0.1 ug / ml) KHM tamponunu çıkarın ve ekleme (Şekil 1 Tablo 1). 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde, 15 dakika boyunca plaka inkübe ve% 5 CO2.
- 1 ml PBS ile 1x hücreleri yıkayın.
- Enfekte edilen hücreler, (kuyular A1 - A5): FACS analizi
- Yıkama hücreler PBS ile 3 kez yıkandı ve% 0.1 Triton içeren buz soğukluğunda PBS, 0.5 ml. Hücre agrega kırmak için hücre süzgecinden kapağı ile 5 ml FACS tüp aktarın. Buz üzerinde örnekleri tutun.
- Bir FACS örnekleri analiz edin. Tam geçirgen denetimleri kullanarak, toplam ileriye dayalı bakteri ve birinci yan dağılım (FSC / SSC) için kapısı ayarlayın ve mCherry sinyali (610 nm ± 20 nm filtre).
- Sonraki, sitozolik bakteriler için kapıları (FITC + mCherry +) ve vakuolar bakterileri (FITC-, mCherry +) (Şekil 3) ayarlamak için tam geçirgen ve geçirgen olmayan kontrollerini kullanarak toplam bakteri popülasyonunda FITC sinyali analiz.
- Kapıları set sayesinde, örnekleri analiz ve sitozolik vs yüzdesini belirlemeküreticinin protokolüne uygun olarak FlowJo yazılımı kullanılarak vakuolar bakteri.
- Bulaşmamış permeabilization denetimleri (kuyular B1 - B3, C1 - C3): mikroskopi
- Tespit
- PBS çıkarın ve PBS içinde% 4 PFA 250 ul ekleyin. 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edin.
- Kuyular PBS içinde 1 ml 2x yıkayıp fiksatif sönmesi için 10 dakika boyunca PBS içinde 0.1 M glisin 250 ul ilave edin. Yıkama kuyu 1 ml PBS ile 2x.
- İkincil antikor boyama.
- PBS içinde florofor bağlanmış uygun bir ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1 saat için leke permeabilizasyon kontrol,% 0.1 saponin ve% 3 BSA tam Permeabilize hücreleri ile takviye edilmiştir.
- Yıkama 1 ml PBS ile 3 kez lamelleri ve DAPI (1.5 ug / ml) ile orta montaj analiz için lamelleri monte edin.
- Mikroskopi analizi.
- Konfokal FLUO kullanarak 40X veya 63X büyütmede kontroller ile lamelleri analizrescence mikroskop. Permeabilizasyon çalıştığı takdirde, digitonin- ve saponin permeabilize hücrelerin ve PDI saponin permeabilize hücrelerin (Şekil 4) yalnızca boyanma için olmayan permeabilize hücreler için boyama, boyama calnexin olmalıdır.
- Tespit
Etiketsiz Salmonella (Mikroskopi tabanlı Analizi) 2. Digitonin Deneyi
- O / N kültürler için bakteri hazırlanması.
- Etiketlenmemiş Salmonella, vahşi tip SL1344 inoküle (Streptomisin dirençli) 37 ° CO / N bir çalkalayıcıda streptomisin (90 ug / ml) ile desteklenmiş LB aracı maddesi içinde 3 ml enfeksiyondan önce 1 gün.
- Enfeksiyon hücreleri Kaplama.
- 1.25 x 10 5 hücre yoğunluğunda steril cam lamelleri içeren bir 24 oyuklu bir plaka içerisinde tohum BMDMs / oyuk makrofaj ortam 1 ml (DMEM,% 10 fetal buzağı serumu (FCS ile de-tamamlanmaktadır, 56 ° C ilave olarak,30 dakika),% 1 HEPES,% 1 L-olmayan amino asitleri (NEAA),% 1 L-glutamin ve% 10 L929 süpernatant). Tablo 1'e göre Tohum kuyuları tek tek koşullara hesaba.
- 37 ° C'de bir kuluçka hücreleri O / N inkübe ve% 5 CO2.
- Enfeksiyonu bakteriyi hazırlanması.
- Sonraki gün, PBS içinde kültür 1:10 seyreltilmesiyle ve yalnızca PBS kontrolüne karşı OD 600 ölçülerek O / N kültüründe Salmonella konsantrasyonunu belirler. Bu OD 600 spektrofotometre doğrusal aralığı içinde ölçülür sağlar.
- Mililitrede Salmonella konsantrasyonunu belirlemek. 1 bir OD 600, 1 x 10 9 bakteri karşılık gelir.
- 1.25 x 10 6 hücre / ml'lik bir konsantrasyona ulaşmak için Salmonella makrofaj ortam içinde bakteri ile seyreltilir.
- Salmonella ile hücrelerin enfeksiyonu.
- Enfeksiyonu senkronize etmek için 37 ° C'de 300 x g'de 15 dakika boyunca plaka santrifüjleyin. 37 ° C'de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2.
- Gentamycin ile hücre dışı Salmonella Killing.
- 1 saat sonrası enfeksiyon, inkübatör plaka kaldırmak ve tüm oyuklara hücre dışı bakterileri öldürmek için, 1 mg / ml gentamisin ihtiva eden makrofaj ortamın 0.1 ml ekleyin. 37 ° C'de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2.
- Hücreleri Yıkama.
- 2 saat sonrası enfeksiyon, inkübatör plaka kaldırmak ve 10 ug / ml içeren taze makrofaj ortam 1 ml her bir kuyucuğa 3x yıkama Önlemek için gentamisinKalan dışı bakterilerin büyümesi. 37 ° C'de bir inkübatörde plaka aktarın ve% 5 CO2.
- Deterjan ve antikorlar ile taze tamponlar hazırlanması.
- Sadece analiz istenilen zaman noktasından önce, 1 mg / KHM Tamponu içinde ml (110 mM potasyum asetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.3) ile digitonin taze bir stok çözelti hazırlayın. Stok filtre edin ve 50 ug / ml 'lik bir çalışma konsantrasyonu KHM Tamponu içinde seyreltin digitonin evi.
- Buna ek olarak, KHM Tamponu içinde% 0.1 saponin içeren bir çözelti hazırlanması, anti-Salmonella -FITC (CSA-1, 0.1 ug / ml), KHM Tamponu içinde 1/100 1/100 ya da anti-PDI anti-calnexin ile desteklenmiş % 3 BSA (antikor konsantrasyonu için malzeme tabloya bakınız).
- Hücre permeabilizasyon.
- Inkübatörden plaka çıkarın ve yıkama kuyu KHM Tamponu, 0.5 ml (37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış) 3x. KHM Buffer çıkarın ve 0.25 ml düz KHM Tampon ekleyinkuyu A1 digitonin kuyu A4 ve B1 / C1, KHM Tampon için - A3 ve B2 / saponin ile C2 veya KHM Tampon kuyu A5 ve B3 / C3 (Tablo 1'e göre). Tüm oyuklar KHM Tamponu, 0.5 ml ile 3 kez yıkama hemen oda sıcaklığında tam olarak 1 dakika boyunca inkübe ve (37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış).
- Birincil antikor boyama.
- KHM tamponunu çıkarın ve uygun kuyulara (Şekil 2, Tablo 1), birincil antikor çözeltileri (keçi anti Salmonella CSA1-FITC, 250 ul / göz, 0.1 ug / ml) ekleyin. 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde, 15 dakika boyunca plaka inkübe ve% 5 CO2. 1 ml PBS ile yıkayın 3x.
- Fixation.
- PBS çıkarın ve PBS içinde% 4 PFA 250 ul ekleyin. 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edin.
- Kuyular PBS içinde 1 ml 2x yıkayıp fiksatif sönmesi için 10 dakika boyunca PBS içinde 0.1 M glisin 250 ul ilave edin. Yıkama kuyu 1 ml PBS ile 2x.
- ToplamEnfekte örneklerin Salmonella boyama.
- Yıkama,% 0.1 saponin /% 3 BSA içeren PBS ile 3 kez lamelleri ve bir anti-CSA1 antikoru ile inkübe örnekleri 1 saat süre ile (keçi anti-CSA1, 0.1 ug / ml fare anti-LPS, 0.1 ug / ml olarak iyi çalışır) % 0.1 saponin /% 3 BSA ile PBS içinde oda sıcaklığında karıştırıldı.
- % 0.1 saponin /% 3 BSA ile PBS içinde yıkayın 3x. Karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0.1 saponin /% 3 BSA ile PBS içinde tercih edilen flüorofora bağlı ikinci bir anti-keçi antikoru ile inkübe edin.
- Yıkama 1 ml PBS ile 3 kez lamelleri ve DAPI (1.5 ug / ml) ile orta montaj analiz için lamelleri monte edin.
- Mikroskopi analizi.
- Sitozolik Salmonella (pozitif anti Salmonella -FITC) ve total Salmonella (çift pozitif) (Şekil 5) sayarak bir konfokal mikroskop ile veri elde. Permeabilizasyon kontrolleri göstermelidir: non-permeabilize hücrelerin, calnexin s hiçbir boyamaDigitonin permeabilize hücrelerin ve saponin permeabilize hücrelerin için PDI, boyama için taining (Şekil 4). Wells A4 ve A5 Salmonella boyama için iç denetimler görev yapacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 ve Şekil 2, bir protokol 1 ve protokol 2 protokolde önemli adımlar ve elde edilen sonuçları gösteren tarif digitonin tahlilinin şemaları göstermektedir. 3 tipik bir FACS sonuçları göstermektedir. Pozitif ve negatif kontroller mCherry + / FITC- bakteriler (Salmonella vakuolar) ve mCherry + / FITC + bakteri (Salmonella sitozolik) için kapılarını ayarlamak için kullanılır. Bu kapılar göre sitosolik ve vakuolar bakteri yüzdesi deney örneklerinde tespit edilebilir. Bu örnekte, vahşi tip ve ΔsifA Salmonella karşılaştırılmıştır. Şekil 3, MCherry + Salmonella typhimurium vahşi tip ve kemik iliğinden elde edilen murin makrofaj bir ΔsifA mutant ile elde edilen temsili verileri göstermektedir. Şekil 4 normal calnexin (A) ve PDI gösterir (B) geçirgenleştirme kontrol t elde edilir boyamadigitonin veya saponin ile reated. Calnexin bir ER zar proteini olduğu, calnexin boyama sitosol içinde ve digitonin- ve saponin permeabilize hücrelerin hem de çekirdek çevresinde görülebilir. Digitonin olarak saponin permeabilize hücrelerin gözlemlenebilir boyama sırasında herhangi bir PDI boyama (lümen ER) görülebilir kontrol geçirgenleştirildi. Şekil 5A, digitonin permeabilize edilmiştir hücrelerinde anti-Salmonella boyama sonuçları göstermektedir. Sitozolik bakteriler (Salmonella anti -FITC ile boyanmış) yeşil iken toplam bakteri, kırmızı bulunmaktadır. FITC-negatif nüfus vakuol (SCV) içeren sağlam bir Salmonella ikamet ve bu nedenle Salmonella -FITC etiketleme korundu bakteriler ise nüfus FITC pozitif, sitoplazmada erişim Salmonella vardır. Ayrıca, bir ΔsifA mutant için doğal tipte Salmonella karşılaştırılmıştır. Şifa gerektiğinden Salmonella S korumak içinCV bütünlük Salmonella artış yüzdesi sitosolik olduğunu. Şekil 5B biz hücreleri anti-Salmonella -FITC eklemeden önce geçirgen Digitonin bırakılmayan bir kontrol göstermektedir. Bu duruma göre, herhangi bir FITC pozitif bakteriler görülebilir.
Bozulmamış vakuoller veya sitoplazmada ya mCherry-pozitif Salmonella içeren protokol 1. Enfekte hücrelerin Şekil 1. şematik diferansiyel digitonin permeabilize. Sitosolik Salmonella FITC bağlanmış anti Salmonella ile boyandı. Hücreler yıkandı ve FACS analizi için, Triton X-100 ile lize edilmiştir. Pozitif kontrol hücreler tamamen antikor boyama önce geçirgen ise negatif kontrol hücreleri, geçirgenleştirildi değildir.
Bozulmamış vakuoller veya sitoplazmada ya etiketsiz Salmonella içeren protokol 2. Enfekte hücrelerin Şekil 2. şematik diferansiyel digitonin permeabilize. Sitosolik Salmonella FITC bağlanmış anti Salmonella ile boyandı. Hücreler, yıkandı ve% 4 PFA ile sabitlenir. Hücreler, tam FITC + / Alexa568 + Salmonella (sitozolik) ve Alexa568 + Salmonella (vakuolar) saymak için kullanılır permeabilzed ve Alexa 568. Mikroskop bağlanmış ikincil antikor ile boyanarak, ardından anti-Salmonella antikorlar ile lekelendi.
Tam geçirgen, unpermeabilized veya farklı olarak geçirgen örneklerin Şekil 3. FACS analizi MCherry + vahşi tip ya da # ile 6 saat boyunca enfekte916; 6 saat boyunca şifa Salmonella.
Şekil 4. Anti-calnexin (A) ve enfekte edilmemiş BMDMs anti-PDI (B) boyama digitonin veya saponin. Ölçek çubukları 10 um.
Şekil 6, hrs Salmonella typhimurium vahşi tip ve ΔsifA mutant suş ile diferansiyel geçirimli hale deneyi 5. Örnek Çıkan Enfeksiyondan. Sitosolik Salmonella toplam Salmonella gösterilir. Hücreler, ya sitosolik Salmonella anti-Salmonella -FITC ile boyamadan önce digitonin geçirgen (A) ya da sol unpermeabilized (B). Bu boyama aşaması, c sonraarşın saponin ve toplam Salmonella ikincil antikor lekeleme (kırmızı) ve ardından anti-Salmonella antikorları ile boyanmıştır. Ölçek 10 mikron barlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diferansiyel permeabilization analiz ve vakuolar bölmeleri ve sitoplazmada arasındaki bakteriyel patojenlerin hücre içi dağıtım ölçmek için kolay ve sağlam bir yöntemdir. Aynı deney gibi Francisella novicida 2,4 ve Shigella flexneri 12 olarak bakteri başarıyla kullanılmaktadır. Birçok hücre içi patojen değiştirebilir veya ana bilgisayar hücreiçi yapılarını değiştirmek olduğundan Ancak, digitonin permeabilization sağlamlığı bireysel olarak belirlenecek gerekecektir. Gerekli olabilir kullanılan patojen veya hücre hattı açısından tahlil ince ayar. Deney, sadece enfeksiyonun biyolojisi ile kısıtlı değildir, fakat aynı zamanda hücre ölümü 17,18 sinyal gibi diğer hücre Biyolojik uygulama için de kullanılabilir.
Bu deneyde anahtarı, belirli hücre içi zarlar daha cho içeren plazma zarı ve hücre içi membran, farklı lipit bileşimi olmasıdırlesterol. Digitonin kompleksi kolesterol ve bu şekilde yol açar geçirgenliği, Digitonin tedavi süresi ve deterjan konsantrasyonuna bağlıdır olan etkinliği ve seçiciliği diferansiyel olabilir. Bu kontrol etmek için böyle calnexin sitozolik kuyruk veya ER luminal protein PDI olarak tanımlanan hücre içi yerleşimli işaretleyici proteinleri için boyanarak geçirgen hücrelerin kontrol etmek önemlidir.
Ayırıcı permeabilizasyon yeni olmamakla beraber, bu protokol ek olarak FACS göre sitosolik ve vakuolar bakterilerin hızlı ve objektif bir ölçümü sağlar. FACS analizi için, non-geçirgenleştirildi ve tam geçirgen hücreler iki denetim dahil etmek çok önemlidir. Lekesiz ve tamamen lekeli yani vaküoler ve sitozolik bakteriler için kapıları kurulacak bu kontrol numuneleri dayanarak.
Protokol kritik adım permeabilization ve daha sonraki yıkama adım mesafededir. Freshly hazırlanmış bir tampon ve deterjan çözeltileri kullanılabilir olması gerekir. Tüm çözümler kullanımdan hemen önce hazırlanması gerekir. Başka bir kritik nokta permeabilization zamanlaması olduğunu. Burada / ml, kemik iliği türevli makrofajlar için iyi iş 50 ug digitonin konsantrasyonda kullanıldıklarında, 1 dakika kanıtlamıştır. Farklı hücre hatları kullanırken, çalışma konsantrasyonu ampirik olarak tespit edilmesi gerekebilir. 1 dakika boyunca digitonin veya inkübasyon sürelerinde yüksek konsantrasyonları iç zarlarında ve yanlış pozitif sonuçların permeabilization yol açabilir. 2 saat - Digitonin çözeltiler 1 için stabildir. Hemen önce digitonin taze bir çözüm hazırlamak kesinlikle önemlidir. Ayrıca digitonin kapasitesi membranlar partiden diğer partiye göre farklı tedarikçiler arasında değişebilir permeabilze için.
Birçok örnekleri tedavi edilmesi gereken Dolayısıyla eğer kolay ve hızlı işlenebilir olabilir küçük gruplar halinde bu bölmek için tavsiye edilir. Perma sonra son olarak, bütün yıkama aşamalarıdigitonin tedavi hücresel zarlarını zayıflatır beri eabilization çok dikkatli yapılması gerekir. Tampon ve aspirasyon eklenmesi de ortasında hafifçe oyuk kenarındaki olup yapılmalıdır.
Belirttiği gibi, diğer teknikler muhabiri CCF4-AM 19 FRET sitosol ve beta-laktamaz bölünme kullanımı gibi vakuoler bölmeleri var, arasındaki bakterilerin hücre içi dağıtım analiz etmek. CCF4-AM yöntemi gerçek zamanlı olarak vakuoler rüptürü ölçme avantajı sunarken, bu tek bakteri düzeyinde çözünürlüğü yoksun ve sadece tek konak hücre düzeyinde bilgi verebilir. Bu nedenle, her iki deneylerin bir kombinasyonu ile, zaman içinde tek bir bakteri / konakçı hücrelerin düzeyi hakkında bilgi elde etmek için idealdir. Önemli bir şekilde, her iki deneyler, bakteriyel enfeksiyonların bağlamında değil, aynı zamanda, hedef p alt-hücresel lokalizasyonunu belirlemek amacı ile diğer hücre biyolojik çalışmalar bağlamında sadece kullanılabilir18 roteinler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz tartışma için Mathias S. Dick, Roland F. Dreier ve Sebastian Ruhl kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, bir SNSF Profesörlük PP00P3_139120 / 1 ve PB Bir Üniversite Basel proje hibe ID2153162 tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50 μg/ml |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100 μg/ml and 10 μg/ml |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63X | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
- Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
- Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
- Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
- Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
- Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
- Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
- Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
- Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
- Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
- Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
- Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
- Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
- Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
- Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
- Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).
