En Reproducerbar edb Metode til Kvantificering af Kapillær Density hjælp nailfold Capillaroscopy

Abstract

Capillaroscopy er en ikke-invasiv, effektiv, relativt billigt og let at lære metode til direkte visualisering af mikrocirkulationen. Den capillaroscopy teknik kan give indsigt i en patients mikrovaskulær sundhed, hvilket fører til en række potentielt værdifuldt dermatologiske, oftalmologisk, reumatologiske og kardiovaskulære kliniske anvendelser. Desuden kan tumorvækst være afhængig af angiogenese, som kan kvantificeres ved måling af mikrokar densitet i tumoren. Men er der i øjeblikket lidt at ingen standardisering af teknikker, og kun én publikation til dato rapporterer pålideligheden af en aktuelt tilgængelige, komplekse computer baserede algoritmer til kvantificering capillaroscopy data. ^1. Dette papir beskriver en ny, enklere, pålidelig, standardiseret kapillær optælling algoritme til kvantificering nailfold capillaroscopy data. En simpel, reproducerbar edb capillaroscopy algoritme som denne vil fremme mereudbredt brug af teknikken blandt forskere og klinikere. Mange forskere i øjeblikket analysere capillaroscopy billeder ved hånden, fremme bruger træthed og subjektivitet af resultaterne. Dette papir beskriver en hidtil ukendt, let-at-bruge automatiseret billedbehandling algoritme foruden en reproducerbar, halvautomatisk optælling algoritme. Denne algoritme gør det muligt analyse af billeder i minutter samtidig reducere subjektivitet; kun en minimal mængde træningstid (i vores erfaring, mindre end 1 time) er nødvendig for at lære teknikken.

Introduction

Mikrovaskulær billedbehandling er et hastigt voksende område med mange potentielle kliniske anvendelser. ^2. For eksempel onkologer bruger mikrokar billeddannelse at bestemme omfanget af tumor angiogenese, hvilket giver værdifulde oplysninger om tilstanden af tumoren og indsigt i mulige behandlingsmuligheder. ^{3 4} Men nailfold capillaroscopy er måske den mest omkostningseffektive og bredt anvendelig form for mikrovaskulære billeddannelse. Forskere ved hjælp af video nailfold capillaroscopy at studere blod flow og undersøge kapillær morfologi. ^{5 6} Både video og still-billede nailfold capillaroscopy er supplementer til at passe til diagnosticering og behandling af Raynauds syndrom og forskellige bindevævssygdomme såsom systemisk sklerose. ²

Nailfold capillaroscopy har forskellige potentielle kardiovaskulære anvendelser som godt. Aktuel forskning ved hjælp nailfold capillaroscopy antyderat type 1 diabetes og type 2 patienter udviser en høj forekomst af unormal kapillær morfologi, alligevel har uændrede kapillære tætheder sammenlignet med ikke-diabetiske individer. ^7-8 Capillaroscopy er også blevet undersøgt eksperimentelt i hypertension. Strukturel kapillær fortynding, der fører til en reduceret kapillær densitet er blevet påvist hos hypertensive personer sammenlignet med ikke-hypertensive individer. ^9-10 I modsætning til disse ældre hypertensive patienter (gennemsnitsalder 40 og derover), der udviser strukturel fortynding, har nyere forskning vist, at yngre hypertensive patienter (gennemsnitsalder under 40 år) har funktionel fortynding uden strukturel fortynding. ¹¹ Dette antyder, at funktionel fortynding sker før og kan udvikle sig over tid til strukturel fortynding.

Interessant, hypertensive patienter behandlet med specifikke antihypertensive lægemidler såsom Perindopril / Indapamide viste normal kapillær densitet og endotel funktion efter behandling, mens de blev behandlet med ACE (angiotensin-konverterende-enzym) hæmmere eller diuretika fastholdt en lav kapillær densitet trods sammenlignelige blodtryk kontrol. ^{12 Dette} tyder på, at nogle antihypertensiv medicin kan normalisere kapillær densitet ved at vende kapillær fortynding forårsaget af hypertension. Desuden har andre forskere vist, at en reduktion af salt indtagelse fører til tilbageførsel af både funktionelle og strukturelle kapillær fortynding i hypertensive individer. ¹³

Trods de forskellige potentielle kliniske anvendelser af denne teknologi, der er lidt standardisering teknik til kvantificering kapillære densitet billeder. ² Til dato har forskere konstateret, at kapillær densitet resultater er reproducerbare fra både en intra-observatør og inter-observatør perspektiv, hvis den nøjagtige samme område, tælles hver gang. ^{1,14 15} 9 16 17 18, som er en langsom og subjektiv proces.

Standardiserede, computer baserede algoritmer for kvantificering af kapillære billeder teorien give mere effektiv og reproducerbar analyse af data med mindre subjektivitet, lette kliniske anvendelser af capillaroscopy. Nogle forskere har faktisk brugt computer-baserede programmer at kvantificere data fra nailfold capillaroscopic billeder. ^{1,6 19 20} Dog kun en publikation til dato beskriver pålideligheden af et komplekst software-program til rådighed til kvantificering capillaroscopy ^data, 1 og dette program er kompliceret som tidligere bemærket ovenfor ved kravet om at tælle nøjagtig samme synsfelt. Her præsenterer vi en enklere, pålidelig protokol for kvantificering kapillærer ved hjælp af en standardiseret algoritme, der giver mulighed forbrugen af ​​flere synsfelter. Anvendelsen af ​​flere synsfelter ikke kun forenkler proceduren, men tillader også en vurdering af normale biologiske variation i kapillær tæller.

Formålet med denne undersøgelse er at beskrive en reproducerbar og effektiv computerbaseret algoritme, der standardiserer kapillær kvantificering processen. Selv om disse metoder ikke er fuldt automatiseret de kræver meget lidt brugerinput, og giver hurtig og pålidelig kvantificering af billederne.

Protocol

Bemærk: Købet fremgangsmåde til opnåelse af kapillære billeder har tidligere været offentliggjort, og opnås ved hjælp af en stadig digitalkamera med en tilsvarende indsamling og analyse billede computerprogram ^{11 21 Denne} lab udnytter stillbilleder til analyse, ikke videoer, forenkle billedoptagelse til analyse.. I det følgende beskrives den nye teknik til kvantificering af kapillærerne fra billederne.

1. Billedforbedring Process

1. Opnå digitale billeder med en monokrom digitalkamera. Kalibrere billederne til et objekt med kendt størrelse ved at tage et billede af et objekt med kendt længde, såsom en lineal med kameraet. Denne proces giver computerprogrammet til at måle og tælle kapillærer præcist efter forarbejdning. Ideelt for den højeste præcision, bør der anvendes en reticule (videnskabeligt fremstillet stykke glas med en lineal ætset ind i det). Måle antallet af pixels i en 1 mm kvadratiskkasse ved hjælp af et computerprogram.
   Bemærk: Nøglen til reproducerbarhed og standardisering af denne protokol i vid udstrækning afhænger korrekt placering af 1 ^mm2 boks, der tælles.
2. Brug ekstraudstyr kontrast værktøjer til at blive mørkere kapillærerne og lysere baggrund, som vil maksimere visualisering af kapillærer. Indledende differentiering af kapillærer fra baggrunden er vigtig for korrekt beskæring af billedet i senere trin. Gør dette ved at justere billedet ved hjælp af et at gøre dette klik på "bedst tilpassede histogram.": Opsamling, intensitet, billede histogram, bedste pasform.
3. Beskær et område af interesse (ROI) til kapillær optælling som et nyt billede (vælg, områder af interesse). Brug en 1 mm ² boks, som blev bestemt ved kalibrering billederne på 530 pixels svarende 1 mm. kontrollere, at beskårne billede placerer spidsen af ​​de kapillære sløjfer på toppen af ​​billedet.
4. Glat billedet, så alle fremtidige justeringer billede vil blive jævnt anvendt påbilledet. For at gøre dette klik her: fanen proces, 2D filtre, flade, BG intensitet "lyse", objekt bredde til "75", anvendelse.
5. Hæv kontrasten i billedet, så kapillærer er maksimalt visualiseres. For at gøre dette skal du klikke på: fanen, display justere, hæve kontrasten til 75.
6. Pletfjerning billedet til at udjævne kanter kapillærerne ved at klikke på fanen proces, 2D filtre, despeckle, kernel størrelse 7 x 7, anvendelse.
7. Færdiggøre billedets kontrast, så kapillærer er sorte og baggrunden er hvid. Udfør dette trin ved at justere histogrammet til den "bedst tilpassede" model.
   Bemærk: Der henvises til figur 2 i Repræsentative resultater for et eksempel på, hvad det behandlede billede skal se ud at følge disse trin.

2. Udførelse Kapillære Tæller / kvantificere Kapillær Density

1. På hvert billede, skal du vælge en del af et veldefineret kapillær ved hjælp af "target objekt" featur manuelte at blive anerkendt som objekter, der skal tælles af programmet. Vælg derefter en lille del af baggrunden, ved hjælp af "baggrund" funktion, som en henvisning til områder, der skal ses bort fra ved optælling algoritme.
   Bemærk: Kombinationen af ​​disse højdepunkter forårsager alle kapillærer at blive fremhævet, mens der ses bort fra baggrundsstøj. Kvantificeringen (optælling) protokol udnytter computerfunktioner at differentiere dele af billedet baseret på farve og morfologi.
2. Brug optælling funktion til øjeblikkeligt tælle alle kapillærer i billedet med imaging udstyr. Indstil den mindste diameter på optalte objekter til 5 pixels for at undgå at tælle baggrundsstøj som kapillærer.
3. For hver enkelt, tæller gennemsnittet af 3 - 4 billeder med henblik på at opnå en mere pålidelig vurdering.
   Bemærk: Der henvises til figur 3 i Repræsentative resultater for et eksempel på, hvad billedet skal se ud under optællingen procedure.
3. Oprettelse og brug af makroer til at automatisere Billedbehandling

Bemærk: For at spare tid, kan der oprettes makroer for at automatisk at udføre en specifik sekvens af processer på en eller mange billeder. Disse sekvenser kan tilpasses for at gøre billedet modifikationer hurtigere. I det væsentlige, disse makroer huske, hvordan billederne behandles, og udføre alle trinene hurtigt og uden brugerinput. Udførelse tæller på 12 kapillære billeder tager dette laboratorium mellem 20 til 30 minutter med makroer (2 til 3 min pr billedet), i modsætning til omkring 8 min pr billede uden makroer. Derfor ved hjælp af makroer er 3 til 5 gange mere effektiv end manuelt behandling hvert enkelt billede.

1. For at skabe en makro, skal du vælge "record makro", og på et billede udføre de trin og processer ønskes, som beskrevet i trin 1 og 2 ovenfor. Navngive makro baseret på hvilken billedbehandling trin blev udført for fremtidig reference. Når USIng makroen på fremtidige billeder, skal du blot klikke på "run makro", og programmet vil automatisk anvende de optagede forbedringer til det ønskede billede (r).
   Bemærk: Denne lab bruger en makro til at udføre alle, men et af de skridt i afdeling 1 i metoderne i et par sekunder. Det eneste skridt, der kræver brugerinput er at vælge, hvor at beskære billedet, trin 1.2.

Representative Results

Målet med denne procedure billedbehandling er at differentiere kapillærer fra baggrundsbilledet, så de kan nøjagtigt kvantificeres. Både ufuldstændig billedbehandling og overdreven billedbehandling er skadelige for programmets evne til at kvantificere kapillærer. Som det ses i figur 3, ufuldstændig billedbehandling gør kapillærerne vanskeligt at skelne fra baggrunden. Det er afgørende, at brugeren være i stand til let at skelne grænsen til et kapillarrør, idet den ovenfor beskrevne optælling metode afhænger af brugerens evne til nøjagtigt at fremhæve nogle kapillærer. På den anden side, som det ses i figur 3, kan anvendelsen af unødvendige billede bearbejdningstrin føre til sløring af kapillærer og kan derfor også være til skade for kvantificering processen.

Et optimalt behandlet billede kan tælles inden for 30 sekunder og klart adskiller kapillærer fra baggrund somsamt individuelle kapillærer fra hinanden. Et eksempel på et behandlet billede ses i figur 2 del D, med det optalte billedet vist i figur 3.

Kapillær densitet varierer afhængigt af placeringen af nailbed blive talt. Tabel 1 viser, at kapillær densitet stiger med afstanden fra den øverste række af kapillærer på nailbed. Standardisering af placering ROI er afgørende at tælle reproducerbarhed. Figur 1 viser hvordan billeder kan ændres med forskellige ROI placeringer.

ID	T1	T2	T3	T4	Mean Top	M1	M2	M3	M4	Mean Mellemøsten	L1	L2	L3	L4	Laveste
Patient A
Baseline	46	45	44	46	45.25	64	62	62	62	62,5	66	67	66	66	66,25
Veneokklusion	51	53	49	59	53	59	61	64	69	63,25	70	70	75	72	71,75
Patient B
Baseline	47	51	48	51	49,25	73	74	75	81	75,75	76	85	81	80	80,5
Veneokklusion	68	57	65	64	63,5	75	78	76	72	75,25	91	89	93	83	89
Patient C
Baseline	51	54	51	56	53	66	59	58	60	60,75	60	61	62	69	63
Veneokklusion	62	66	57	59	61	63	63	73	65	66	83	74	81	77	78,75

. Tabel 1: Variation i kapillar Tæller med Differential Positionering i Fingernegl seng Denne tabel viser de tællinger opnået for tre forskellige patienter (A, B, C), når fokusområdet er trinløst placeret i toppen (tæller T1 - T4), midterste (M1 - M4), og nedre områder (L1 - L4) af negl seng. De gennemsnitlige tællinger øges fra toppen til nedre regioner, hvilket viser behovet for en standardisering af fokusområdet placering for at sammenligne tællinger opnået fra forskellige laboratorier.

Udførelse tællinger i området beskrevet i trin 1.2, bør baseline tællinger i området fra 30 til 60 kapillærer / ^mm2, mens Veneokklusion tæller kan variere alt fra 50 til 100. Som det ses i tabel 1, er disse densities adskiller sig fra anden litteratur. Kapillartæthed tællinger opnået i forfatternes laboratorium er mest sandsynligt lavere, fordi dette laboratorium begynder tællinger på den første række af kapillærer, hvor tætheden er lavest. Som det ses i tabel 1, der udfører tæller i nedre områder af nailbed øge tæller med værdier opnået tidligere af Antonios et al ^{9 og} Debbabi et al. ¹⁶ Denne forskel illustrerer behovet for standardisering kvantificering af nailbed capillaroscopy ved at tælle den første (mest proximale) rækken af ​​kapillærer. Tælling ved den første række af kapillærer er også optimal, fordi kapillærerne er mest tydeligt og fuldstændigt visualiseret i den første række og gradvis blive mindre synlige med efterfølgende rækker.

Blindede reproducerbarhed undersøgelser med n = 10 fag og to uafhængige observatører blev gennemført. Pålidelighed resultater refererer til den gennemsnitlige A, B, og C tæller, fremstillet ved av eraging resultater på tværs 4 billeder for hver. De A, B, og C tæller repræsenterer forskellige fysiologiske tilstande hos samme individ, der bruges til at vurdere mikrovaskulære sundhed, kort sammenfattes her. Detaljer er tidligere blevet ^publiceret 21.. Kapillartæthed defineres som antallet af kapillærer pr kvadratmillimeter ^(mm2) af fingeren nailfold huden. Stage A er en hvilende baseline fase, hvor kapillærerne kontinuerligt perfunderet ^16. Stage B optræder under postocclusive reaktiv hyperæmi. Disse tællinger repræsenterer summen af ​​kontinuerligt perfunderet og intermitterende perfusionerede (funktionel reserve) kapillærer. Denne fase bruges som et mål for kapillær funktion ^16.

Stage C opstår under venøs okklusion, derfor viser maksimal kapillær tætheden herunder både perfunderet (med aktiv røde blodlegemer (RBC) bevægelse) og nonperfused (fyldt med stagnerende, ikke-bevægelige RBC) kapillærer. ²²

Indholdsproduktion "> For intra-rater pålidelighed, den intraclass korrelationer (ICC) var 0,93 for betyde en tæller, 0,93 for gennemsnitlige B-tæller, og 0,94 for gennemsnitlig C tæller. For inter-rater pålidelighed, de ICC'er var 0,94 for betyde en tæller, 0,98 for gennemsnitlige B-tæller, og 0,94 for gennemsnitlig C tæller. Derfor er teknikken beskrevet her demonstrerer fremragende pålidelighed med gode resultater for både intra- og inter-observatør reproducerbarhed.

Figur 1. standardisering af Crop Placering. Dette tal illustrerer, hvordan variabel placering af fokusområdet synligt ændrer det beskårne billede. Til venstre er boksen placeret for lavt, afskære den første række af kapillærer. Det midterste felt er placeret for højt, hvilket medfører en tom plads over den første række af kapillærer. Boksen til højre er optimalt placeret. Dens beskårne billede viser den første række af capillaries på selve toppen af billedet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Stadier af Image Processing (A) Stage A viser den første billede taget fra subjektets nailbed med et monokromt kamera,. (B) Etape B viser det originale billede efter den første forstærkning kontrast. Den grønne boks viser en 530 x 530 pixel kasse, hvilket svarer til 1 x 1 mm boksen til kameraet, (C) Trin C repræsenterer 1 mm boksen beskåret fra billede B, (D) Stage D viser det forbedrede billede efter anvendelse de forbedringer diskuteret ovenfor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Afsluttende Optalt billede. Den forbedrede, tælles billede. Den samlede optælling bestemt for dette billede var 54 kapillærer / mm ^2. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Forkert Image Processing. Klik her for at se en større version af dette tal.

Billedet til venstre viser et foto, der ikke er behandlet tilstrækkeligt. De kapillærer er vanskelige at skelne fra baggrunden og kvantificering proces vil være negativt affecTed. Billedet til højre viser det samme billede efter forkert billedbehandling. Individuelle kapillærer er vanskelige at skelne fra deres naboer og dermed kvantificering proces vil blive negativt påvirket.

Discussion

Nailfold capillaroscopy viser lovende som et klinisk nyttigt redskab i fremtiden for forskellige onkologi, hjerte, og reumatologiske sygdom applikationer. Billedet erhvervelse proces er ret konsekvent blandt forskere, men der er i øjeblikket flere metoder til billedbehandling og analyse. Metoder omfatter i øjeblikket edb og manuelle kapillære tæller. Manuelle tællinger er problematiske, da de er tidskrævende, og med forbehold af brugeren subjektivitet og træthed. Aktuel computerbaserede metoder kræver en høj grad af bruger-input, både i billedforbedring processen og kvantificering processen. Den nye metode er beskrevet her kræver relativt lidt bruger uddannelse eller involvering, som billedet ekstraudstyr skridt helt er automatiseret. Brugerinput er kun nødvendig for stemmeoptællingen i første omgang at skelne kapillær fra baggrund i de behandlede billeder. Brug af automatiske makroer, som beskrevet her er tre til fem gange mere effektive end manuallieret behandle hvert enkelt billede.

Pålidelige standardiserede computer-baserede algoritmer til at kvantificere mangler capillaroscopy data.

Der er behov for pålidelige standardiseret computerbaserede metoder til kvantificering kapillær med henblik på at reducere subjektivitet og fremme effektiviteten. Teknikken er beskrevet her demonstrerer fremragende pålidelighed med gode resultater for både intra- og inter-observatør reproducerbarhed med intraclass korrelationer af 0,93 til 0,98. Vi har tidligere rapporteret korrelationen af resultater opnået via edb vurdering kapillær densitet, i forhold til den gyldne standard for manuel optælling. ²¹ Pearson korrelationer mellem baseline, post-iskæmisk, og venøse overbelastning tæller gjort med softwaren og tilsvarende manuelle tællinger i 10 forsøgspersoner 0,78, 0,78 og 0,71 henholdsvis (alle p <0,05), hvilket indikerer en rimelig aftale mellem de to metoder.

Dette laboratorium imagemanipulation trin udnytte en række edb-værktøjer. Trin 1.3, billede "udfladning", fjerner de forskellige "lag", der findes i hvert billede. Dette skal gøres først, så alle fremtidige billede behandlingsprocedurer vil blive anvendt jævnt på alle dele af billedet. Kontrast justering begge mørkere kapillærerne og blegner ud baggrunden, derfor gør kapillærerne mere synlige. Den "Pletfjerning" proces udjævner kanterne af kapillærer og samtidig bevare deres størrelse og form. Selv om der synes at være nogen forskelle i en despeckled billede til det blotte øje, det er en vigtig proces for at hjælpe med at sikre flere kapillærer ikke blandes sammen under stemmeoptællingen. Færdiggøre billedet ved hjælp af et "bedst tilpassede histogram" udelukker alle pixels på enten ekstrem af histogrammet. Dette hjælper med at definere grænserne for kapillærerne, mens yderligere at fremme kontrasten mellem kapillærer og baggrunden. Samlet er dertre kontrastforstærkende trin, og alle tre er nødvendige for at maksimere klarhed af det endelige billede til kapillær tælling.

Lejlighedsvis, vil programmet tæller for mange eller for få kapillærer. Det første skridt til at løse dette problem er at fortryde fremhævning og bare prøve markeringen processen igen. Hvis kapillærerne bliver fremhævet forkert, kan justere minimum kapillær diameter være nødvendig. Forfatterne anbefaler en standard minimum diameter på 5 pixels. Hvis programmet regner for mange kapillærer eller tælle en kapillær som flere kapillærer brugeren skal øge den minimale diameter af en eller to pixels. På den anden side, hvis programmet ikke regner mørke pixel grupper, som er kapillærer, kan brugeren reducere mindste diameter af en pixel.

Der er også et behov for at standardisere stilling for disse tællinger inden nailbed. Som det ses i tabellen, der tæller i det samme individ er megetposition afhængig, varierer meget baseret på hvilken del af nailbed bliver talt.

Kritiske trin i protokollen omfatter korrekt og optimal visualisering af kapillærerne. Trinene tillader optimal visualisering af kapillærerne i denne protokol er fuldt automatiseret, der giver mulighed for hurtig og præcis billedmanipulation. Selv om disse fremgangsmåder udgør et stort fremskridt i pålidelighed og lethed af forarbejdning og tælle capillaroscopic billede, væsentlig begrænsning af teknikken er halvautomatisk tælleproces. Ideelt set vil en fuldt automatiseret proces blive oprettet i den nærmeste fremtid. Forskerne bør føle sig tilskyndet til at bygge videre på den metode, der er beskrevet i dette papir for at udvikle en fuldt automatiseret klinisk anvendelig teknologi, der tillader hurtig kvantificering af en patients nailfold kapillær densitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-Pro Premier	Media Cybernetics, Inc	9.1	Image processing software