Een reproduceerbare geautomatiseerde methode voor kwantificering van capillaire dichtheid gebruik Nailfold Capillaroscopy

Abstract

Capillaroscopy is een niet-invasieve, efficiënte, betrekkelijk goedkoop en gemakkelijk te leren methode voor het direct visualiseren van de microcirculatie. De capillaroscopy techniek kan inzicht verschaffen in microvasculaire gezondheid van een patiënt, waardoor verschillende potentieel waardevolle dermatologische, oogheelkundig, reumatologische en cardiovasculaire klinische toepassingen. Bovendien kan tumorgroei afhankelijk zijn van angiogenese, welke kan worden gekwantificeerd door het meten van de dichtheid van microvaten in de tumor. Er is echter nog weinig tot geen normalisatie technieken, en slechts één publicatie date meldt de betrouwbaarheid van de momenteel beschikbare complexe computer gebaseerde algoritmen voor het kwantificeren capillaroscopy data. ¹ Dit document beschrijft een nieuwe, eenvoudigere, betrouwbare, gestandaardiseerde capillaire tellen algoritme voor het kwantificeren nailfold capillaroscopy data. Een eenvoudige, reproduceerbare geautomatiseerde capillaroscopy algoritme zoals dit meer zou vergemakkelijkenwijdverbreide gebruik van deze techniek bij onderzoekers en clinici. Veel onderzoekers momenteel analyseren capillaroscopy beelden met de hand, het bevorderen van vermoeidheid van de gebruiker en de subjectiviteit van de resultaten. Dit document beschrijft een nieuw, eenvoudig te gebruiken automatische beeldverwerkingsalgoritme naast een reproduceerbare, semi-geautomatiseerde telling algoritme. Dit algoritme maakt analyse van de beelden in minuten, terwijl het verminderen van de subjectiviteit; slechts een minimale hoeveelheid trainingstijd (in onze ervaring, minder dan 1 uur) nodig om de techniek te leren.

Introduction

Microvasculaire beeldvorming is een snel groeiende veld met veel potentiële klinische toepassingen. ² bijvoorbeeld, oncologen gebruikt microvessel beeldvorming om de omvang van de tumor angiogenese, waardoor waardevolle informatie over de stand van de tumor en inzicht in mogelijke behandelingen. ^{3 4} Echter, nailfold capillaroscopy is misschien wel de meest kostenefficiënte en breed toepasbaar vorm van microvasculaire beeldvorming. Onderzoekers zijn met behulp van video nailfold capillaroscopy om de bloedstroom tarieven bestuderen en onderzoeken capillaire morfologie. ^{5 6} Zowel video en foto-foto nailfold capillaroscopy zijn adjuncten om de zorg voor de diagnose en de behandeling van het fenomeen van Raynaud en diverse bindweefselziekten zoals systemische sclerose. ²

Nailfold capillaroscopy heeft verschillende potentiële cardiovasculaire toepassingen. Lopend onderzoek met behulp van nailfold capillaroscopy suggereertdat diabetes mellitus type 1 en type 2 patiënten vertonen een hoge prevalentie van abnormale capillaire morfologie, nog ongewijzigd capillaire dichtheden in vergelijking met niet-diabetische individuen. ^7-8 Capillaroscopy is ook onderzocht experimenteel hypertensie. Structurele capillaire verdunning leidt tot een verminderde capillaire dichtheid is aangetoond bij hypertensieve individuen in vergelijking met niet-hypertensieve individuen. ^9-10 In tegenstelling tot deze oudere hypertensieve patiënten (gemiddelde leeftijd 40 en hoger) die structureel verdunning vertonen, is recenter onderzoek aangetoond dat jongere hypertensieve patiënten (gemiddelde leeftijd onder de 40 jaar oud) hebben een functionele verdunning zonder structurele verdunning. ¹¹ Dit suggereert dat functionele verdunning plaatsvindt vóór en kunnen na verloop van tijd ontwikkelen tot structurele verdunning.

Interessant hypertensieve patiënten die bepaalde antihypertensiva zoals Perindopril / Indapamide getoond normal capillaire dichtheid en endotheel functie na behandeling, terwijl die behandeld werden met ACE (angiotensine-converting-enzym) remmers of diuretica onderhouden een lage capillaire dichtheid ondanks een vergelijkbare controle van de bloeddruk. ^{12 Dit} suggereert dat sommige bloeddrukverlagende medicijnen capillaire dichtheid kan normaliseren door het omkeren van de capillaire verdunning veroorzaakt door hypertensie. Bovendien hebben andere onderzoekers aangetoond dat een verlaging van de zoutinname leidt tot omkering van zowel functionele als structurele capillaire verdunning bij hypertensieve individuen. ¹³

Ondanks de diverse potentiële klinische toepassingen van deze technologie, is er weinig standaardisatie techniek voor het kwantificeren van capillaire beelden density. ² Tot op heden hebben onderzoekers gevonden dat de resultaten capillaire dichtheid reproduceerbaar zowel een intra-observer en inter-observatorperspectief indien de exacte hetzelfde gebied wordt geteld elke keer. ^{1,14 15} 9 16 17 18 dat is een traag en subjectief proces.

Gestandaardiseerde, computer gebaseerde algoritmen voor kwantificering van capillaire beelden theoretisch een efficiëntere en reproduceerbare data-analyse met minder subjectiviteit, het vergemakkelijken van klinische toepassingen van capillaroscopy. Sommige onderzoekers hebben inderdaad gebruikt computergebaseerde's om de gegevens te kwantificeren van nailfold capillaroscopic afbeeldingen. ^{1,6 19 20} Slechts één publicatie actueel beschrijft betrouwbaarheid van een complex softwareprogramma vindt kwantificeren capillaroscopy gegevens ¹ en dit programma wordt bemoeilijkt doordat eerder hierboven vermeld door de eis om de exacte hetzelfde gezichtsveld tellen. Hier presenteren we een eenvoudige, betrouwbaar protocol voor het kwantificeren van capillairen in genormaliseerde algoritme die het mogelijk maakthet gebruik van meerdere gezichtsvelden. Het gebruik van meerdere gezichtsvelden vereenvoudigt niet alleen de procedure, maar maakt ook de beoordeling van normale biologische variatie capillaire tellen.

Het doel van dit onderzoek is om een ​​reproduceerbare en efficiënte gecomputeriseerde algoritme dat de capillaire kwantificering gestandaardiseerd proces te beschrijven. Hoewel deze methoden niet volledig geautomatiseerd zij vereisen zeer weinig invoer van de gebruiker, en snelle en betrouwbare kwantificering van de beelden.

Protocol

Opmerking: De overname proces voor het verkrijgen van capillaire beelden eerder is gepubliceerd en wordt uitgevoerd met behulp van een nog steeds digitale camera met een bijbehorende afbeelding acquisitie en analyse computerprogramma ^{11 21} Dit lab maakt gebruik van stilstaande beelden voor analyse, geen video, vereenvoudigen beeldacquisitie voor analyse.. Het volgende beschrijft de nieuwe techniek voor het kwantificeren van de haarvaten van de beelden.

1. Image Enhancement Process

1. Het verkrijgen van digitale beelden met een monochrome digitale camera. Kalibreren van de afbeeldingen om een ​​object van bekende grootte door het nemen van een foto van een object van bekende lengte, zoals een heerser met de camera. Dit proces maakt het computerprogramma te meten en tellen capillairen nauwkeurig na verwerking. Ideaal voor de hoogste precisie, moet een tasje (wetenschappelijk vervaardigde stuk glas met een liniaal geëtst in het) worden gebruikt. Meet het aantal pixels in een 1 mm vierkantedoos met behulp van een computerprogramma.
   Opmerking: De sleutel tot de reproduceerbaarheid en standaardisatie van dit protocol hangt grotendeels af van de juiste plaatsing van de doos 1 mm ^2, dat wordt geteld.
2. Gebruik contrastverhoging tools om de haarvaten donkerder en lichter de achtergrond, die visualisatie van de haarvaten zal maximaliseren. Initiële differentiatie van capillairen van de achtergrond is belangrijk voor een goede bijsnijden van het beeld in latere stappen. Doe dit door het instellen van het beeld met behulp van een Om dit te doen klik je op "best fit histogram.": Capture, intensiteit, het histogram, de beste pasvorm.
3. Bijsnijden een regio van belang (ROI) voor capillaire tellen als een nieuwe afbeelding (selecteer, regio's van belang). Gebruik een 1 mm ² box, die wordt bepaald door kalibreren beelden in 530 pixels gelijk aan 1 mm. controleer of de bijgesneden afbeelding plaatst de top van de capillaire lussen aan de bovenkant van het beeld.
4. Afvlakken het beeld, zodat alle toekomstige aanpassingen beeld wordt gelijkmatig worden toegepast opDe afbeelding. Om dit te doen klikt u op: proces tabblad, 2D-filters, plat, BG intensiteit van "lichte" object breedte "75," toe te passen.
5. Verhogen van het contrast van het beeld, zodat haarvaten maximaal worden gevisualiseerd. Om dit te doen klik op: passen tabblad, display contrast verhogen naar 75.
6. Ontvlekken het beeld naar de randen van de haarvaten glad door proces tab, 2D-filters, despeckle, kernel maat 7 x 7 op te klikken, toe te passen.
7. Ronden het beeldcontrast zodat haarvaten zijn zwart en de achtergrond is wit. Voer deze stap voor het instellen van de histogram van de "best fit" model.
   Opmerking: zie figuur 2 in Representatieve resultaten voor een voorbeeld van wat de bewerkte beeld eruit moet zien de volgende stappen.

2. Het uitvoeren van capillaire Tellingen / kwantificeren van capillaire dichtheid

1. Op elk beeld, een deel van een goed gedefinieerde capillair met behulp van de "target object" featur selecteren handmatige erkend worden als objecten worden geteld door het programma. Selecteer dan een klein deel van achtergrond, waarbij de "achtergrond" -functie, als verwijzing naar gebieden die moeten worden genegeerd door het tellen algoritme.
   Opmerking: De combinatie van deze highlights worden alle capillairen worden belicht met voorbijgaan aan de achtergrondruis. De kwantificering (tellen) protocol maakt gebruik van computer functies om delen van het beeld op basis van kleur en morfologie differentiëren.
2. Gebruik de telling functie om direct te tellen alle haarvaten in de afbeelding met de beeldvormende apparatuur. Stel de minimumdiameter getelde voorwerpen 5 pixels om te voorkomen achtergrondruis geldend als capillairen.
3. Voor elk individu tel gemiddelde van 3 - 4 afbeeldingen om een ​​betrouwbare beoordeling te verkrijgen.
   Let op: Zie figuur 3 in Representatieve resultaten voor een voorbeeld van hoe het beeld eruit moet zien tijdens het tellen procedure.
3. maken en gebruiken van macro's met Afbeelding Processing Automatiseer

Opmerking: Om tijd te besparen, kan macro's worden gemaakt met het oog op een specifieke volgorde van processen automatisch uit te voeren op een of meerdere beelden. Deze sequenties kunnen worden aangepast om het beeld wijzigingen sneller te maken. In wezen, deze macro's herinneren hoe de beelden worden verwerkt, en snel en zonder input van de gebruiker uit te voeren alle stappen. Het uitvoeren rekent op 12 capillaire beelden duurt dit labo tussen 20 tot 30 min met de macro's (2 tot 3 min per beeld), in tegenstelling tot ongeveer 8 min per beeld zonder de macro. Daarom is het gebruik van de macro's is 3 tot 5 keer efficiënter dan het handmatig verwerken van elk individueel beeld.

1. Om een ​​macro te maken, kies "record macro" en op het ene beeld de stappen en processen gewenst, zoals beschreven in de stappen 1 en 2 hierboven. De naam van de macro op basis waarvan beeldverwerking stappen werden uitgevoerd voor toekomstig gebruik. Wanneer using de macro op toekomstige foto's, klikt u op "Uitvoeren macro" en het programma zal automatisch de opgenomen verbeteringen van toepassing op de foto (s) gewenst.
   Opmerking: Dit lab maakt gebruik van een macro om alle, maar een van de stappen in deel 1 van de methoden in een paar seconden. De enige stap die input van de gebruiker vereist is kiezen waar de afbeelding bij te snijden, Stap 1.2.

Representative Results

Het doel van dit beeldverwerking procedure is om de haarvaten te onderscheiden van de achtergrond, zodat ze nauwkeurig kunnen worden gekwantificeerd. Beide onvolledige beeldverwerking en overmatige beeldverwerking schadelijk zijn voor het vermogen van het programma om de haarvaten te kwantificeren. Zoals blijkt uit figuur 3, incomplete beeldverwerking ziet de capillairen moeilijk te onderscheiden van de achtergrond. Het is essentieel dat de gebruiker in staat om de grens van een capillaire gemakkelijk onderscheiden omdat de telmethode bovenbeschreven afhankelijk van het vermogen van de gebruiker om nauwkeurig markeren enkele capillairen. Anderzijds, zoals getoond in figuur 3, de toepassing van onnodige stappen beeldverwerking kan leiden tot vervaging van de capillairen en daardoor ook nadelig zijn voor de kwantificering proces.

Een optimaal bewerkte beeld kan worden geteld in 30 seconden en duidelijk onderscheidt haarvaten van achtergrond alsen de individuele capillairen van elkaar. Een voorbeeld van een bewerkt beeld wordt gezien in figuur 2 deel D, met het getelde beeld in figuur 3.

Capillaire dichtheid verschilt afhankelijk van de plaats van het nagelbed te tellen. Tabel 1 laat zien dat capillaire dichtheid toeneemt met de afstand van de bovenste rij van capillairen in het nagelbed. Standaardisatie van de ROI plaatsing is cruciaal om de reproduceerbaarheid te tellen. Figuur 1 toont hoe de beelden kan worden gewijzigd met verschillende ROI posities.

ID	T1	T2	T3	T4	Bedoel Top	M1	M2	M3	M4	Bedoel Midden	L1	L2	L3	L4	Laagste
Een patiënt
Baseline	46	45	44	46	45.25	64	62	62	62	62.5	66	67	66	66	66,25
Veneuze Occlusie	51	53	49	59	53	59	61	64	69	63,25	70	70	75	72	71,75
Patiënt B
Baseline	47	51	48	51	49,25	73	74	75	81	75,75	76	85	81	80	80.5
Veneuze Occlusie	68	57	65	64	63.5	75	78	76	72	75,25	91	89	93	83	89
Patiënt C
Baseline	51	54	51	56	53	66	59	58	60	60,75	60	61	62	69	63
Veneuze Occlusie	62	66	57	59	61	63	63	73	65	66	83	74	81	77	78,75

. Tabel 1: Variatie in Capillaire Counts met Differential Positionering in de vingernagel Bed Deze tabel toont de verkregen voor drie verschillende patiënten (A, B, C) ​​wanneer de doos ROI variabel is gepositioneerd aan de bovenkant (telt T1 - T4) telt, midden (M1 - M4), en lagere regionen (L1 - L4) van de nagel bed. De gemiddelde tellingen verhogen van boven naar gebieden verlagen, waaruit de noodzaak van standaardisatie van ROI box plaatsing vergelijken tellingen verkregen uit verschillende laboratoria.

Het uitvoeren tellingen in de in stap 1.2 beschreven is, dient basislijn tellingen variëren van 30 tot 60 capillairen / ^mm2 terwijl veneuze afsluiting tellingen overal kan variëren van 50 tot 100. Zoals blijkt uit tabel 1, die densities verschillen van andere literatuur. Capillaire dichtheid tellingen verkregen in het laboratorium van de auteurs zijn waarschijnlijk lager omdat het lab begint tellingen in de eerste rij van capillairen, waarbij de dichtheid het laagst is. Zoals blijkt uit tabel 1, het uitvoeren van tellingen in lagere regionen van het spijkerbed verhogen telt mee waarden eerder verkregen door Antonios et al ⁹ en Debbabi et al. ¹⁶ Deze discrepantie illustreert de noodzaak van standaardisatie kwantificering van spijkerbed capillaroscopy door het tellen van de eerste (meest proximale) rij van haarvaten. Het tellen van de eerste rij van capillairen is optimaal omdat de capillairen meest volledig en duidelijk zichtbaar in de eerste rij en steeds minder zichtbaar volgende rijen worden.

Verblind reproduceerbaarheid studies met N = 10 vakken en twee onafhankelijke waarnemers werden uitgevoerd. Betrouwbaarheidsresultaten betrekking op de gemiddelde A, B en C tellingen verkregen door av eraging resultaten over 4 beelden voor elk. De A, B en C tellingen vertegenwoordigen verschillende fysiologische toestanden binnen hetzelfde individu die gebruikt worden om microvasculaire gezondheid, hierna kort samengevat beoordelen. Details zijn eerder gepubliceerd ^21. Capillaire dichtheid wordt gedefinieerd als het aantal capillairen per vierkante millimeter ^(mm2) vinger nailfold huid. Fase A is een rust basislijn fase waarin de haarvaten continu doorbloed ^16. Fase B optreedt tijdens postocclusive reactieve hyperemie. Deze tellingen zijn de som van de continue perfusie en intermitterend doorbloed (functionele reserve) haarvaten. Dit stadium wordt gebruikt als maat voor capillaire ¹⁶ werking.

Fase C optreedt tijdens veneuze occlusie, daarom tonen maximale capillaire dichtheid zowel doorbloed (met actieve rode bloedcellen (RBC) beweging) en nonperfused (gevuld met stagnerende, niet-bewegende RBC) haarvaten. ²²

NHOUD "> Voor intra-beoordelaar betrouwbaarheid, de intraclass correlaties (ICC) waren 0,93 voor betekenen telt, 0,93 voor de gemiddelde B telt, en 0,94 voor de gemiddelde C telt. Voor interbeoordelaarsbetrouwbaarheid, de ICC's waren 0,94 voor betekenen A telt, 0,98 voor de gemiddelde B telt, en 0,94 voor de gemiddelde C telt. Derhalve is de hier beschreven techniek toont uitstekende betrouwbaarheid met goede resultaten voor zowel intra- en inter-observer reproduceerbaarheid.

Figuur 1. Standaardiseren de Crop Ligging. Dit cijfer illustreert hoe variabele plaatsing van de doos ROI zichtbaar verandert de bijgesneden afbeelding. Links is de doos geplaatst te laag, afsnijden van de eerste rij van capillairen. De middelste vak te hoog geplaatst, waardoor een lege ruimte boven de eerste rij capillairen. Het vak aan de rechterkant is optimaal geplaatst. De bijgesneden afbeelding toont de eerste rij van capillaries op de top van de afbeelding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Stadia van Image Processing (A) Fase A toont de eerste foto genomen van nagelbed het onderwerp met een monochrome camera,. (B) Fase B toont de oorspronkelijke afbeelding na de eerste contrast enhancement. Het groene vak toont een 530 x 530 pixel doos, die gelijk is aan 1 x 1 mm doos voor de camera; (C) Fase C vertegenwoordigt de doos 1 mm bebouwd van het B; (D) Stage D toont het verbeterde beeld na het aanbrengen de verbeteringen hierboven besproken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Definitieve Geteld Image. De verbeterde, telde afbeelding. Het totale aantal bepaald voor dit beeld was 54 haarvaten / mm ^2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Onjuiste Image Processing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De foto links toont een foto die niet voldoende wordt verwerkt. De capillairen zijn moeilijk te onderscheiden van de achtergrond en de kwantificering proces negatief te affected. De foto rechts toont dezelfde afbeelding na onjuiste beeldverwerking. Individuele capillairen zijn moeilijk te onderscheiden van hun buren en dus de kwantificering proces negatief worden beïnvloed.

Discussion

Nailfold capillaroscopy toont belofte als een klinisch bruikbaar instrument in de toekomst voor verschillende oncologie, cardiovasculaire en reumatologische ziekte toepassingen. Het beeld acquisitie proces is vrij consistent tussen onderzoekers, maar er zijn meerdere methoden voor het verwerken en analyseren. Methoden die momenteel onder meer geautomatiseerd en handmatig capillaire telt. Handmatige tellingen zijn problematisch als ze zijn tijdrovend, en onder voorbehoud van de gebruiker subjectiviteit en vermoeidheid. Huidige computer gebaseerde methoden vereisen een hoge mate van input van de gebruiker, zowel in het beeldverbetering proces en de kwantificering proces. De nieuwe hier beschreven methode vereist relatief weinig opleiding van de gebruikers of betrokkenheid, zoals de beeldverbetering stappen volledig worden geautomatiseerd. Gebruikersinvoer is alleen vereist voor het telproces aanvankelijk capillaire onderscheiden van achtergrond in de verwerkte beelden. De geautomatiseerde macros zoals hier beschreven 3 om 5 keer efficiënter dan manubondgenoot de verwerking van elk individueel beeld.

Betrouwbare gestandaardiseerde computer gebaseerde algoritmen te kwantificeren capillaroscopy gegevens ontbreken.

Betrouwbare gestandaardiseerde computer gebaseerde methoden zijn nodig voor capillaire kwantificatie om subjectiviteit te verminderen en het bevorderen van efficiency. De hier beschreven techniek toont uitstekende betrouwbaarheid met goede resultaten voor zowel intra- en inter-observer reproduceerbaarheid met intraclass correlaties van 0,93-0,98. We hebben eerder gerapporteerd de correlatie van de resultaten verkregen via gecomputeriseerde beoordeling capillaire dichtheid, vergeleken met de gouden standaard van handmatige telling. ²¹ Pearson correlaties tussen basislijn, post-ischemische en veneuze congestie tellingen gedaan met de software en bijbehorende handmatige tellingen in 10 proefpersonen 0,78, 0,78 en 0,71 respectievelijk (alle p <0,05), met vermelding van een redelijke overeenstemming tussen de twee methoden.

Dit beeld labmanipulatie stappen maken gebruik van een aantal van de computer van hulpmiddelen voor de verwerking. Stap 1.3, het "af te vlakken", verwijdert de verschillende 'lagen' die aanwezig zijn in elk beeld zijn. Dit moet eerst worden gedaan, zodat alle toekomstige procedures beeldverwerking zal gelijkmatig worden toegepast op alle delen van het beeld. Contrastaanpassing zowel donkerder de haarvaten en verbleekt de achtergrond, dus waardoor de haarvaten meer zichtbaar. De "Ontvlekken" -proces vlakt de randen van de capillairen met behoud van hun grootte en vorm. Hoewel er blijken geen verschillen in despeckled beeld voor het blote oog, is een belangrijk proces om te zorgen meerdere capillairen niet vermengen tijdens het telproces. De afronding van het beeld met behulp van een "best fit histogram" sluit alle pixels op een van beide extreme van het histogram. Dit helpt definiëren de grenzen van de capillairen, terwijl verdere versterking van het contrast tussen de capillairen en de achtergrond. Overall zijn ercontrastverbetering drie stappen, en alle drie zijn nodig om de helderheid van eindbeeld capillaire tellen het maximaliseren.

Af en toe zal het programma te veel of te weinig haarvaten tellen. De eerste stap om dit probleem op te lossen is om de markering ongedaan te maken en eenvoudig opnieuw proberen de markering proces. Indien de capillairen onjuist gemarkeerd, het aanpassen van de minimale capillair diameter nodig zijn. De auteurs raden een diameter van 5 pixels standaard minimum. Als het programma rekent teveel capillairen en tellen van een capillair als meerdere capillairen de gebruiker het minimale diameter moet toenemen met één of twee pixels. Anderzijds, als het programma niet donker pixelgroepen die capillairen telt, de gebruiker kan de minimumdiameter verminderen met één pixel.

Er is ook behoefte aan de stand voor deze punten binnen het nagelbed standaardiseren. Zoals blijkt uit de tabel, telt bij hetzelfde individu sterkpositie afhankelijke, variërend op basis van sterk welk deel van het spijkerbed wordt geteld.

Kritische stappen van het protocol onder meer goede en optimale visualisatie van de haarvaten. De stappen waardoor optimale visualisatie van de haarvaten in dit protocol zijn volledig geautomatiseerd, waardoor een snelle en accurate beeldmanipulatie. Hoewel deze methoden vormen een belangrijke vooruitgang in de betrouwbaarheid en het gemak van de verwerking en het tellen imago capillaroscopic, de belangrijkste beperking van de techniek is de semi-automatische telproces. Idealiter zal een volledig geautomatiseerd proces worden gecreëerd in de nabije toekomst. Onderzoekers moeten voelen aangemoedigd om voort te bouwen op de in dit document beschreven, om een ​​volledig geautomatiseerde klinisch nuttige technologie die snelle kwantificering van nailfold capillaire dichtheid van een patiënt kunt ontwikkelen methodologie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-Pro Premier	Media Cybernetics, Inc	9.1	Image processing software