En reproduserbar Datastyrt metode for kvantifisering av kapillær tetthet ved hjelp Nailfold Capillaroscopy

Abstract

Capillaroscopy er en ikke-invasiv, effektiv, forholdsvis billig og lett å lære metode for direkte visualisering av mikrosirkulasjonen. Den capillaroscopy teknikken kan gi innsikt i pasientens mikrovaskulær helse, som fører til en rekke potensielt verdifull dermatologiske, øyelege, revmatologiske og kardiovaskulære kliniske applikasjoner. I tillegg kan tumorvekst være avhengig av angiogenese, som kan bli kvantifisert ved å måle microvessel tettheten i tumoren. Men det er foreløpig liten eller ingen standardisering av teknikker, og bare én utgivelse til dags dato rapporterer påliteligheten av noen tilgjengelige, komplekse databaserte algoritmer for kvantifisering capillaroscopy data. ¹ Dette notatet beskriver en ny, enklere, pålitelig, standardisert kapillær telling algoritme for kvantifisering nailfold capillaroscopy data. En enkel, reproduserbar data capillaroscopy algoritme som dette vil lette merutbredt bruk av teknikken blant forskere og klinikere. Mange forskere i dag analysere capillaroscopy bilder hånd, fremme bruker tretthet og subjektivitet av resultatene. Dette notatet beskriver en roman, lett-å-bruke automatisert bildebehandling algoritmen i tillegg til en reproduserbar, semi-automatisert telling algoritme. Denne algoritmen muliggjør analyse av bilder i løpet av minutter og samtidig redusere subjektivitet; bare en minimal mengde trening tid (i vår erfaring, mindre enn 1 time) er nødvendig for å lære teknikken.

Introduction

Microvascular bildebehandling er en raskt voksende felt med mange potensielle kliniske applikasjoner. ^{2 For} eksempel, onkologer bruker microvessel bildebehandling for å fastslå omfanget av tumor angiogenese, noe som gir verdifull informasjon om tilstanden av svulsten og innsikt i mulige behandlingsalternativer. ^{3 4} Men nailfold capillaroscopy er kanskje den mest kostnadseffektive og allment gjeldende form av mikrovaskulær bildebehandling. Forskere bruker video nailfold capillaroscopy å studere blodstrømningsrater og undersøke kapillær morfologi. ^{5 6} Både video og stillbilder nailfold capillaroscopy er supplementer til omsorg for diagnostisering og behandling av Raynauds fenomen og ulike bindevevssykdommer som systemisk sklerose. ²

Nailfold capillaroscopy har forskjellige potensielle hjerte-programmer også. Aktuell forskning ved hjelp nailfold capillaroscopy antyderat diabetes mellitus type 1 og type 2 pasienter viser en høy forekomst av unormal kapillær morfologi, men har uendret kapillær tetthet sammenlignet med ikke-diabetikere. ^7-8 Capillaroscopy har også blitt studert eksperimentelt i hypertensjon. Strukturelle kapillær vakuum, som fører til en redusert kapillær tetthet er påvist hos hypertensive individer sammenlignet med ikke-hypertensive individer. ^9-10 I motsetning til disse eldre hypertensive pasienter (gjennomsnittsalder 40 og over) som viser strukturelle vakuum, har nyere forskning vist at yngre hypertensive pasienter (gjennomsnittsalder under 40 år) har funksjonell vakuum, uten strukturell vakuum,. ¹¹ Dette tyder på at funksjonell vakuum, oppstår før og kan utvikle seg over tid til strukturelle vakuum,.

Interessant, hypertensive pasienter behandles med spesifikke blodtrykkssenkende medisiner som Perindopril / Indapamide vises normal kapillær tetthet og endotelfunksjon etter behandling, mens de som ble behandlet med ACE (angiotensin-converting-enzym) inhibitors eller diuretika holdt en lav kapillær tetthet tross sammenlignblodtrykkskontroll. ¹² Dette tyder på at enkelte blodtrykkssenkende medisiner kan normalisere kapillær tetthet ved å reversere kapillær vakuum, forårsaket av hypertensjon. I tillegg har andre forskere vist at en reduksjon i saltinntak fører til reversering av både funksjonell og strukturell kapillær vakuum, hos hypertensive personer. ¹³

Til tross for de ulike potensielle kliniske anvendelser av denne teknologien, er det lite standardisering i teknikk for kvantifisering av kapillær tetthet bilder. ² Hittil har forskere funnet ut at kapillær tetthet resultatene er reproduserbare fra både en intra-observatør og inter-observatør perspektiv bare hvis den eksakte samme område, telles hver gang. ^{1,14 15} 9 16 17 18 som er en langsom og subjektiv prosess.

Standardiserte, databaserte algoritmer for kvantifisering av kapillær bilder teoretisk gi mer effektiv og reproduserbar dataanalyse med mindre subjektivitet, tilrettelegging kliniske anvendelser av capillaroscopy. Enkelte forskere har faktisk brukt PC-baserte programmer for å kvantifisere data fra nailfold capillaroscopic bildene. ^{1,6 19 20} Men bare én publikasjon oppdatert beskriver påliteligheten av et komplekst program tilgjengelig for kvantifisering capillaroscopy ^data, 1 og dette programmet er komplisert som tidligere bemerket ovenfor ved kravet om å telle nøyaktig samme synsfeltet. Her presenterer vi en enklere, pålitelig protokoll for kvantifisering av kapillærer ved hjelp av en standardisert algoritme som gjør det mulig forbruken av flere visuelle felt. Bruken av flere synsfelt ikke bare forenkler fremgangsmåten, men også gjør det mulig å vurdere normale biologiske variasjonen i kapillar-teller.

Målet med denne studien er å beskrive en reproduserbar og effektiv databasert algoritme som standardiserer kapillær kvantifisering prosessen. Selv om disse metodene ikke er fullt automatisert de krever svært lite inndata fra brukeren, og gir en rask og pålitelig kvantifisering av bildene.

Protocol

Merk: anskaffelsesprosess for å oppnå kapillær bildene har tidligere vært publisert, og oppnås ved hjelp av en fortsatt digitalkamera med et tilsvarende bilde oppkjøpet og analyse dataprogram ^{11 21} Denne lab benytter stillbilder for analyse, ikke videoer, forenkle image oppkjøpet for analyse.. Følgende beskriver den nye teknikken for kvantifisering av kapillærene fra bildene.

1. Bildeforbedring Process

1. Skaff digitale bilder med en monokrom digitalkamera. Kalibrere bilder til et objekt med kjent størrelse ved å ta et bilde av et objekt med kjent lengde som en linjal med kameraet. Denne prosessen gjør at dataprogram for å måle og telle kapillærer nøyaktig etter behandling. Ideelt for høyeste presisjon, bør en reticule (vitenskapelig produsert stykke glass med en linjal etset inn i det) brukes. Måle antall piksler i en 1 mm kvadratboksen ved hjelp av et dataprogram.
   Merk: Nøkkelen til reproduserbarhet og standardisering av denne protokollen avhenger i stor grad av riktig plassering av en ^mm 2 boks som telles.
2. Bruk kontrastforbedringsverktøy for å mørkne kapillærene og lysere bakgrunn, som vil maksimere visualisering av kapillærene. Initial differensiering av kapillærer fra bakgrunnen er viktig for riktig beskjæring av bildet i senere trinn. Gjør dette ved å justere bildet ved hjelp av en For å gjøre dette, klikk på "best fit histogram.": Fangst, intensitet, image histogram, best passform.
3. Beskjære en region av interesse (ROI) for kapillær telling som et nytt bilde (velg, regioner av interesse). Bruk en 1 ^mm 2 boksen, som ble bestemt ved å kalibrere bildene på 530 piksler tilsvarer 1 mm. sjekk at det beskjærte bildet plasserer toppen av kapillær sløyfer på toppen av bildet.
4. Flat ut bildet slik at alle fremtidige bildejusteringer vil bli jevnt påførtbildet. For å gjøre dette, klikk på: prosessen kategorien 2D filtre, flate, BG intensiteten i "lyse" object width til "75", gjelder.
5. Hev kontrasten i bildet så kapillærer er maksimalt visualisert. For å gjøre dette klikker du på: justere fanen, display, øke kontrast til 75.
6. Støvfjernar bildet for å glatte ut kantene på kapillærene ved å klikke på prosessen fanen, 2D filtre, fjerne merker, kernel størrelse 7 x 7, gjelder.
7. Ferdig kontrasten i bildet så kapillærene er svart og bakgrunnen er hvit. Utfør dette trinnet ved å justere histogrammet til "best fit" modell.
   Merk: Se figur 2 i Representant Resultater for et eksempel på hva det bearbeidede bildet skal se ut som følgende måte.

2. Utføre Capillary Teller / kvantifisering av kapillær tetthet

1. På hvert bilde, manuelt velge én del av et veldefinert kapillær bruke "target objekt" feature å bli anerkjent som objekter som skal telles av programmet. Deretter velger du en liten del av bakgrunnen, ved hjelp av "bakgrunn" -funksjonen, som en referanse til områder som trenger å bli sett bort fra telling algoritme.
   Merk: Kombinasjonen av disse høydepunktene fører alle kapillærene å bli fremhevet samtidig ser bort bakgrunnsstøyen. Kvantifisering (telling) protokoll benytter datafunksjoner for å skille deler av bildet basert på farge og morfologi.
2. Bruk tellingen funksjon for å kjapt telle alle blodkar i bildet med radiologisk utstyr. Angi diameteren av telles objekter til 5 piksler minimum for å unngå å telle bakgrunnsstøy som kapillarer.
3. For hvert individ, regne gjennomsnittet av 3 - 4 bilder for å oppnå en mer pålitelig vurdering.
   Merk: Vennligst referer til figur 3 i Representant Resultater for et eksempel på hva bildet skal se ut under tellingen prosedyren.
3. Opprette og bruke makroer for å automatisere bildebehandling

Merk: For å spare tid, kan makroer opprettet for å automatisk utføre en bestemt sekvens av prosesser på ett eller flere bilder. Disse sekvensene kan tilpasses for å gjøre bildet modifikasjoner raskere. I hovedsak disse makroene husker hvordan bildene er behandlet, og utføre alle trinnene raskt og uten noen innspill. Utføre teller på 12 kapillære bildene tar denne lab mellom 20 til 30 minutter med makroer (2 til 3 min per bilde), i motsetning til ca 8 min per bilde uten makroene. Derfor bruker makroene er 3 til 5 ganger mer effektiv enn manuelt behandle hvert enkelt bilde.

1. Velg "Registrer makro" for å opprette en makro og på ett bilde utføre trinnene og prosesser ønsket, som beskrevet i trinn 1 og 2 ovenfor. Navn makro basert på hvilke bildebehandling trinn ble utført for fremtidig referanse. Når USIng makro på fremtidige bilder, klikker du bare "kjøre makro" og programmet vil automatisk bruke de registrerte forbedringer til bilde (r) ønsket.
   Merk: Denne lab bruker en makro til å utføre alle unntatt ett av trinnene i kapittel 1 av metodene i noen få sekunder. Den eneste punkt som krever at brukerundersøkelser er å velge hvor du skal beskjære bildet, trinn 1.2.

Representative Results

Målet med dette bildebehandling prosedyren er å skille kapillærene fra bakgrunnsbildet, slik at de kan være nøyaktig kvantifisert. Både ufullstendig bildebehandling og overdreven bildebehandling er skadelig for programmets evne til å kvantifisere kapillærene. Som vist i figur 3, gjør kapillærene vanskelig å skille fra bakgrunns ufullstendig bildebehandling. Det er viktig at brukeren kunne lett skille grensen av en kapillær siden tellemetoden beskrevet ovenfor, avhenger av brukerens mulighet til å nøyaktig markere noen kapillærer. På den annen side, som vist i figur 3, kan bruk av unødvendig bildebehandling trinn fører til uskarphet av kapillærene, og derfor kan også være skadelig for kvantifisering prosessen.

Et optimalt behandlet bilde kan telles i løpet av 30 sekunder og klart skiller kapillærer fra bakgrunn somsamt individuelle kapillærer fra hverandre. Et eksempel på en behandlet bilde er vist på figur 2 del D, med det opptalte bildet vist i figur 3.

Kapillær tetthet varierer avhengig av plasseringen av nailbed være telles. Tabell 1 viser at kapillær tetthet øker med avstanden fra den øverste raden av kapillærer ved nailbed. Standardisering av ROI plassering er avgjørende for å telle reproduserbarhet. Figur 1 viser hvordan bilder kan endres med ulike avkastnings plasseringer.

ID	T1	T2	T3	T4	Mener Top	M1	M2	M3	M4	Mener Middle	L1	L2	L3	L4	Laveste
Pasient A
Baseline	46	45	44	46	45.25	64	62	62	62	62.5	66	67	66	66	66.25
Venøs okklusjon	51	53	49	59	53	59	61	64	69	63.25	70	70	75	72	71.75
Pasient B
Baseline	47	51	48	51	49.25	73	74	75	81	75,75	76	85	81	80	80.5
Venøs okklusjon	68	57	65	64	63.5	75	78	76	72	75.25	91	89	93	83	89
Pasient C
Baseline	51	54	51	56	53	66	59	58	60	60.75	60	61	62	69	63
Venøs okklusjon	62	66	57	59	61	63	63	73	65	66	83	74	81	77	78.75

. Tabell 1: Variasjon i Capillary teller med Differential Positioning i Negl Bed Denne tabellen viser tellinger som oppnås for tre ulike pasienter (A, B, C) ​​når ROI-boksen er variabelt plassert på toppen (teller T1 - T4), midtre (M1 - M4), og nedre regioner (L1 - L4) av neglen sengen. De gjennomsnittlige teller øke fra toppen til lavere regioner, viser behovet for standardisering av ROI-boksen emisjon for å sammenligne teller hentet fra ulike laboratorier.

Utføre tellinger i området som er beskrevet i trinn 1.2, bør basislinjetall i området fra 30 til 60 kapillarer ^/ mm2, mens vene okklusjon tellinger kan variere hvor som helst fra 50 til 100. Som det fremgår av tabell 1, er disse densities avvike fra annen litteratur. Capillary tetthet tellinger oppnådd i forfatternes laboratoriet er mest sannsynlig lavere fordi denne prøve begynner tellinger ved den første raden i kapillærene, der tettheten er lavest. Som det fremgår av tabell 1, som utfører tellinger i nedre regioner av nailbed øke teller mot verdiene oppnådd tidligere ved Antonios et al ⁹ og Debbabi et al. ¹⁶ Dette avviket illustrerer behovet for standardisering på kvantifisering av nailbed capillaroscopy ved å telle den første (mest proksimale) rad med kapillærer. Telling ved den første raden i kapillarer er også optimal fordi kapillarene er mest klart og fullstendig visualisert i den første raden og progressivt blir mindre synlige med påfølgende rader.

Det ble gjennomført blindet reproduserbarhet studier med N = 10 emner og to uavhengige observatører. Pålitelighets resultater refererer til gjennomsnittlig A, B og C teller, oppnådd ved av eraging resultater på tvers av 4 bilder for hver. A, B og C teller representerer ulike fysiologiske tilstander innenfor samme individ som er brukt for å vurdere mikrovaskulær helse, kort oppsummert her. Detaljer har tidligere blitt publisert ^21. Kapillær tetthet er definert som antall kapillarer pr kvadrat millimeter (mm ²⁾ av fingeren nailfold hud. Stage A er en hvile baseline scene der kapillærene er kontinuerlig perfused ^16. Stage B oppstår under postocclusive reaktiv hyperemia. Disse teller representerer summen av kontinuerlig perfusert og periodevis perfuserte (funksjonell reserve) kapillærer. Denne fasen blir brukt som et mål for kapillær funksjon ^16.

Stage C oppstår under venøs okklusjon, derfor viser maksimal kapillær tetthet inkludert både perfusert (med aktiv røde blodceller (RBC) bevegelse) og nonperfused (fylt med stillestående, ikke-bevegelige RBC) kapillærer. ²²

ontent "> For intra-rater reliabilitet, den intra korrelasjoner (ICC) var 0,93 for bety en teller, 0,93 for gjennomsnitts B teller, og 0,94 for gjennomsnittlig C teller. For inter-rater reliabilitet, ICC-verdiene var 0,94 for bety en teller, 0,98 for middel B teller, og 0,94 for gjennomsnittlig C teller. Følgelig teknikken beskrevet her viser svært god driftssikkerhet med gode resultater både intra og inter-observatør reproduserbarhet.

Figur 1. Standardisering Beskjær Beliggenhet. Denne figuren illustrerer hvordan variabel plassering av ROI-boksen synlig endrer det beskårede bildet. På venstre er boksen plassert for lavt, kutte av den første raden av kapillærer. Den midterste boksen er plassert for høyt, forårsaker en tom plass over den første raden av kapillærer. Boksen til høyre er optimalt plassert. Dens beskåret bilde viser den første raden av capillaries helt på toppen av bildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. stadier av Bildebehandling (A) Stage A viser den første bildet tatt fra motivets nailbed med en monokrom kamera,. (B) Stage B viser det opprinnelige bildet etter første kontrastforbedring. Den grønne boksen viser en 530 x 530 pixel boksen, noe som tilsvarer 1 x 1 mm boks for kameraet, (C) Stage C representerer en mm boksen beskjæres fra bilde B; (D) Stage D viser forbedret bilde etter påføring forbedringene som er omtalt ovenfor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Endelig Telles bilde. Den forbedrede, telte bilde. Det totale antallet fastsatt for dette bildet var 54 kapillærer / mm ^2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Feil Image Processing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Bildet til venstre viser et bilde som ikke er behandlet nok. Kapillærene er vanskelig å skille fra bakgrunnen og kvantifisering prosessen vil være negativt affected. Bildet til høyre viser det samme bildet etter feil bildebehandling. Individuelle kapillærer er vanskelig å skille fra sine naboer og dermed kvantifisering prosessen vil bli negativt påvirket.

Discussion

Nailfold capillaroscopy viser lovende som en klinisk nyttig verktøy i fremtiden for ulike onkologi, hjerte, og revmatologiske sykdommer applikasjoner. Bildet anskaffelsesprosessen er ganske konsekvent blant forskere, men likevel er det i dag flere metoder for bildebehandling og analyse. Metodene som i dag består av datastyrte og manuelle kapillær teller. Manuelle tellinger er problematiske som de er tidkrevende, og underlagt bruker subjektivitet og tretthet. Nåværende databaserte metoder krever en høy grad av brukerundersøkelser, både i bildeforbedringsprosessen og kvantifisering prosessen. Den nye metoden beskrevet her krever relativt lite brukeropplæring eller engasjement, som bildeforbedring trinnene er helt automatisert. Brukerundersøkelser er bare nødvendig for opptellingen i første omgang å skille kapillær fra bakgrunn i de behandlede bilder. Ved hjelp av automatiserte makroer som beskrevet her er tre til fem ganger mer effektiv enn manualliert behandle hvert enkelt bilde.

Pålitelige standardiserte databaserte algoritmer for å kvantifisere capillaroscopy data mangler.

Pålitelig standardiserte datamaskinbaserte metoder er nødvendig for kapillær kvantifisering for å redusere subjektivitet og fremme effektivitet. Teknikken er beskrevet her viser svært god driftssikkerhet med gode resultater både intra og inter-observatør reproduserbarhet med intra korrelasjoner på 0,93 til 0,98. Vi har tidligere rapportert korrelasjonen av resultatene som oppnås via datastyrt kapillær tetthet vurdering, i forhold til gullstandarden for manuell telling. ²¹ Pearson korrelasjoner mellom baseline, postiskemisk, og venøse lunger tellinger gjort med programvaren og tilhørende manuelle tellinger i 10 fag var 0,78, 0,78 og 0,71 henholdsvis (alle p <0,05), noe som indikerer et rimelig samsvar mellom de to metodene.

Dette lab bildemanipulasjon skritt bruke en rekke datamaskin behandlingen verktøy. Trinn 1.3, image "flate", fjerner de forskjellige "lag" som er tilstede i hvert bilde. Dette må gjøres først, slik at alle fremtidige bildebehandlings prosedyrer vil bli brukt jevnt til alle deler av bildet. Kontrastjustering både mørkere kapillærene og blekner ut bakgrunnen, derfor gjør kapillærene mer synlig. Den "fjerne flekker" -prosessen jevner ut kantene av kapillærene og samtidig opprettholde sin form og størrelse. Selv om det synes å være noen forskjeller i en despeckled bilde for det blotte øye, er dette en viktig prosess for å sikre flere kapillærer ikke blandes sammen under telleprosessen. Fullfører bildet ved hjelp av en "best fit histogram" ekskluderer alle pikslene på enten ekstrem i histogrammet. Dette bidrar til å definere grensene til kapillærene mens ytterligere styrking kontrasten mellom kapillærene og bakgrunnen. Totalt er dettre kontrastforbedring trinn, og alle tre er nødvendig for å maksimalisere klarheten av det endelige bildet for kapillær telling.

Av og til vil programmet telle for mange eller for få kapillærer. Det første skrittet for å løse dette problemet er å angre uthevingen og bare prøve uthevingen prosessen på nytt. Dersom kapillarene blir fremhevet på feil måte, kan justering av minimums kapillær diameter være nødvendig. Forfatterne anbefaler en standard minimum diameter på 5 piksler. Hvis programmet teller for mange kapillarer eller telle en kapillær som flere blodkar må brukeren øke den minste diameter av en eller to piksler. På den annen side, dersom programmet ikke er medregnet mørke pikselgrupper som er kapillærene, kan brukeren redusere den minste diameter ved en piksel.

Det er også et behov for å standardisere posisjonen for disse tellinger innenfor nailbed. Som det fremgår av tabellen, teller i samme individ er megetstilling avhengig, sterkt varierende på grunnlag av hvilken del av nailbed blir tellet.

Kritiske trinn i protokollen inkluderer riktig og optimal visualisering av kapillærene. Trinnene tillater optimal visualisering av kapillærene i denne protokollen er helautomatisk, slik at for rask og nøyaktig bildemanipulering. Selv om disse metodene representerer et stort fremskritt i pålitelighet og enkel behandling og telle capillaroscopic bilde, er det stor begrensning av teknikken semi-automatisert opptellingen. Ideelt sett vil en helautomatisk prosess opprettes i nær fremtid. Forskere skal føle seg oppmuntret til å bygge videre på metodikken som er beskrevet i denne artikkelen for å utvikle et helautomatisk klinisk nyttig teknologi som tillater rask kvantifisering av pasientens nailfold kapillær tetthet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-Pro Premier	Media Cybernetics, Inc	9.1	Image processing software