Introduction
Protein-proteininteraktioner (PPI) är grundläggande för biologi 1 och är hårt reglerad via Spatiotemporal mekanismer inom många tids- och längdskalor. Studier av cellsignal på cellmembranet, exempelvis, har avslöjat dynamiska, nanoskala rumsliga fack som underlättar specifika protonpumpshämmare och cellulära processer 2. Därför är förmågan att sondera PPI i biologiska system med tillräckliga rumsliga och tidsmässiga resolutioner, hög specificitet och hög känslighet nyckeln till att uppnå en mekanistisk förståelse av biologi.
Bimolekylär fluorescens komplettering (BiFC) är en av de få befintliga verktyg för att visualisera PPI i en cell med subcellulära upplösning och live-cell kompatibilitet 3-5. Tekniken är relativt enkelt och innebär delning av en fluorescensprotein i två icke-fluorescerande fragment; när genetiskt taggade till två samverkande proteiner ochbringas i närhet, kan fragmenten rekonstituera att bilda en komplett fluorescerande protein, vilket ger fluorescerande signal. När rätt utformad, bör BiFC sonder inte spontant återskapa i avsaknad av protonpumpshämmare. Som sådan kommer fluorescenssignalen i en BiFC analys endast uppstår i närvaro av protonpumpshämmare, vilket möjliggör direkt visualisering av protonpumpshämmare med hög specificitet. Ytterligare fördelar med användning av fluorescens som utläsningen är hög känslighet, en subcellulär upplösning, och kompatibilitet med hög genomströmning och hög halt screeningsanalyser, bland andra. För dessa fördelar, har ett antal BiFC prober baserade på olika föräldra fluorescerande proteiner utvecklats. Som i alla andra detekteringstekniker baserade på konventionell Ijusmikroskopi emellertid den rumsliga upplösningen i BiFC begränsad till ~ 250 nm genom diffraktionen av ljus. Detta gör det till en utmaning att studera regleringen av protonpumpshämmare på nanonivå, vilket som nämndes tidigare och exemplifieras av lipidaggregat 6 and Ras nanokluster 7, är en kritisk skallängd för att förstå många cellulära processer såsom signalering.
BiFC har kombinerats med fotoaktiverade lokalisering mikroskopi (PALM) 8,9 för att övervinna denna begränsning i rumslig upplösning för avbildning PPI 10. PALM är en ny Superresolution mikroskopi teknik som kringgår diffraktionsgränsen i fluorescens avbildning genom stokastisk aktivering och subdiffractive lokalisering av enstaka fluorescerande molekyler. I varje aktivering cykel, utsänder en fluorescerande molekyl några hundra till några tusen fotoner och ger upphov till en enda molekyl bild på detektorn. Medan bilden är diffraktionsbegränsad (~ 250 nm i bredd), dess centroid kan bestämmas med mycket högre precision, typiskt i storleksordningen av 10 till 50 nm, beroende på antalet fotoner som detekteras. Genom att aktivera och lokalisera varje fluorescerande molekyl i provet, kan en högupplöst bild rekonstrueras. Performed på levande celler, enda molekyl spårning (smt-) PALM medger vidare förvärv av tusentals protein diffusion banor från en enda cell 11. Viktigt använder PALM specialiserade fluorescerande prober såsom fotoaktiverbara fluorescerande proteiner (PA-FPS) för att uppnå stokastisk aktivering. Eftersom både BiFC och PALM användning fluorescerande proteiner, de kombinerade genom att dela PAmCherry1, en vanligt förekommande PA-FP för PALM, i två fragment mellan aminosyrorna 159 och 160.
Den BiFC system baserat på delad PAmCherry1 visar låg bakgrundssignal från spontan rekonstituering av de två fragmenten. När genetiskt taggade till ett par interagerande proteiner, de två fragmenten (RN = resterna 1-159; RC = Met + rester 160-236) rekonstituerad effektivt för att bilda fullständiga PAmCherry1 proteiner även vid 37 ° C och utan inkubering vid lägre temperaturer, vilket är inte fallet för andra BiFC par 12 som förälder mCherry 13. Furthermore, den färdigberedda PAmCherry1 proteinet behållit fotofysikaliska egenskaperna hos moder PAmCherry1, såsom högt kontrastförhållande, medium avkastning foton, och snabb fotoaktivering, bland andra, som är avgörande för exakt enda molekyl lokalisering och hög upplösning PALM avbildning.
I detta protokoll, användning av BiFC-PALM för avbildning Ras-Raf interaktioner i U2OS celler genom att använda split PAmCherry1 (Figur 1A) beskrivs. Det första steget är att utforma konstruktionerna för uttryck av fusionsproteiner mellan PAmCherry1 fragment (dvs, RN och RC) och de proteiner som är av intresse. I teorin, för varje par av kandidatproteiner (A och B), finns det åtta par fusionsproteiner som skall testas: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; och A-RC / B-RN. Denna process kan ofta förenklas genom att ta hänsyn till de strukturella eller biokemiska egenskaper hos kandidatproteiner. I fallet av Ras är proteinetpost-translationellt modifierad vid den C-terminala CAAX-boxen (C = Cys; A = alifatisk, X = vilken), varefter AAX-motivet klyvs av. Därför kan RN eller RC endast fuseras till N-terminalen av Ras; detta minskar antalet fusionsproteinparen till fyra (Figur 1B). För Raf, Ras-bindande domän (RBD, resterna 51-131) används och kan märkas på vardera änden. Dessa fyra fusionskonfigurationer genererades: RN-Kras / RC-Raf RBD; RN-Kras / Raf RBD-RC; RC-Kras / RN-Raf RBD; och RC-KRAS / Raf RBD-RN.
Dessutom kommer linkern mellan fragmenten och proteiner av intresse måste beaktas. En flexibel linker av omkring tio aminosyror används ofta som det ger tillräcklig frihet för komplemente att inträffa. En sådan länk är (GGGGS) x2, även om det finns många andra som har tillämpats med framgång, inklusive slumpmässiga sekvenser genereras från ett multipelt kloningsställe (MCS) 14. Längden av linkers kan behöva optimeras depending om storleken på proteiner av intresse och deras inriktningar när de interagerar.
De PAmCherry1 fragmenten finns i en liten klonings ryggrad med flankerande förvaltnings- och kontrollsystem (se Materials List). Gener av intresse kan införas via restriktionsställen eller med en ligation oberoende metod. Efter kloning och sekvensverifiering, är expressionskassetten överfördes till en expressionsvektor med användning av ett rekombinas reaktion, en kloningsprocess med hög trohet och hög effektivitet.
Nästa, de resulterande expressionskonstruktioner transfekterades i målcellinjen eller, om en stabil cellinje önskas, packas i lentivirus för att infektera mål-cellinjen. Transient transfektion möjliggör en snabb validering av BiFC konfigurationer men potentiella problem måste noteras. Transfektion använda kemikalier ofta betonar cellerna, vilket resulterar i hög autofluorescens; medan användningen av total intern reflektion fluorescens (TIRF) microscopy kan mildra detta bakgrundssignal genom att begränsa belysningsvolymen, TIRF ideal när PPI sker på cellmembranet. Dessutom övergående transfektioner leder ofta till höga nivåer av proteinuttryck, långt över de av endogena proteiner, som kan orsaka artefakter i detektering av protonpumpshämmare. Därför rekommenderas det att stabila cellinjer fastställas efter en lämplig BiFC konfiguration har bestämts genom inledande tester. Stabila cellinjer har också potential för avstämbara uttryck via doxycyklin induktion 15.
Efter infektion, celler valda med antibiotika, typiskt puromycin och neomycin, ett för varje konstrukt. De efterföljande stegen för provpreparering, bildinhämtning och analys av data kommer att beskrivas i detalj i protokollen.
Med detta tillvägagångssätt är bildandet av nanokluster i BiFC-PALM bilder av Ras-Raf RBD rutinmässigt observeras (Figur 2A </ strong>). Genomgående, smt-PALM banor av Ras-Raf RBD visar en ojämn fördelning i spridningstillstånd (Figur 2B-D). Dessa resultat tyder på att Ras-Raf-komplex förekommer i flera stater på cellmembranet, förmodligen som monomerer och kluster, med potentiella biologiska konsekvenser. Detta arbete visar kraften av BiFC-PALM i selektiv avbildning av protonpumpshämmare i celler med nanometer rumslig upplösning och enda molekyl känslighet, vilket skulle vara svårt att erhålla med konventionella BiFC, fluorescens samlokalisering eller fluorescensresonansenergiöverföring (FRET).
Vid utformningen BiFC experiment och tolkning av resultaten, är det viktigt att komma ihåg att BiFC processen är oåterkallelig i de flesta fall, inklusive split PAmCherry1. När väl de två fragmenten kombineras och bilda en fullständig PAmCherry1 protein, länksystemet mellan de två fragmenten, och sålunda PPI blir permanent. Detta begränsar användningen av BiFC och BiFC-PALM för att övervaka dynamiken i PPI (dvs. bindnings kinetik och inte diffusionsegenskaperna dynamiken i proteinkomplexet när den bildas) och ibland kan även leda till mislocalization av PPI-komplexen.
En ytterligare faktor att beakta när man utformar BiFC-PALM experiment är fördröjningen i kromofor mognad som är inneboende i fluorescerande proteiner. När två proteiner interagerar och FP fragmenten möts, de vanligtvis återveckas i storleksordningen sekunder (halvtid av 60 sekunder för EYFP 3). Men efterföljande kromofor mognad och fluorescerande signal utvecklas i storleksordningen minuter. Medan fluorescens kan vara detekterbara inom 10 minuter efter beredning av split-Venus, en snabbt fällbara YFP variant är halvtid för mognaden i allmänhet ofta runt 60 min 16. Split-PAmCherry1 observerades ha liknande satser. Därför BiFC och BiFC-PALM finns för närvarande dåliga val för övervakning i realtid PPI kinetik; andra migthods, såsom FRET och ett nyligen utvecklat dimerisering beroende fluorescerande protein 17, kan vara mer lämpade för detta ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning
- Bestäm konfigurationer för att klona och välja en länk. Tag proteiner med fragmenten på N- eller C-terminalen, såsom beskrivs nedan så att de inte stör deras rätta lokalisering. Använd en flexibel linker såsom (GGGGS) x2.
- Genetiskt märka proteinerna av intresse för PAmCherry1 fragmenten. Som ett alternativ, använda klonings plasmiderna som anges i materiallistan innehåller fragment RN (PAmCherry1 resterna 1-159) och RC (Met plus PAmCherry1 resterna 160-236) med flankerande MCS sekvenser.
- Linjärisera plasmiderna innehållande fragmenten RN och RC med omvänd PCR (eller begränsning Digest) vid insättningspunkten. Primrar för omvänd PCR är listade i tabell 1. Nedan är ett exempel PCR-protokoll som används i författarens labbet (se Material Förteckning för de exakta materialen som används i detta protokoll).
- Blanda PCR-reaktionen tillsammans, bringades till en slutlig volym av 50 pl med vatten: till en tunnväggiged PCR-rör, tillsätt vatten, 25 il 2x Master Mix, 0,5 pl vardera av framåt- och bakåt primers (20 pm utspädda lager, 0,2 iM slutkoncentration) och 1 ng mall. Använd följande cykelbetingelser: 98 ° C under 30 sek, 30 cykler av 98 ° C under 7 sek och 68 ° C under 2 min och en slutlig förlängning vid 72 ° C under 10 minuter.
- PCR generna av intresse för införande till de linjäriserade plasmider innehållande RN och RC-fragment. Utför PCR som i steg 1.2.1 med förlängningstiden vid 68 ° C. Använd primrar med överhäng som innehåller en flexibel linkersekvens, såsom GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT för (GGGGS) x 2, och 15 baspar homologi till ändarna på den linjäriserade RN och RC plasmider för rekombination.
Anmärkning: primer överhäng för proteiner av intresse presenteras i tabell 2, om med användning av primrarna i tabell 1 för att linearisera plasmiden ryggrad. - Smälta PCRreaktion med Dpn1 att eliminera PCR-mall. Tillsätt 0,5 | il Dpn1 (20 U / | il) direkt till det 50 pl PCR-reaktion. Inkubera vid 37 ° C under 1 h och värme inaktivt vid 80 ° C under 20 minuter. Om bakgrunden mall framhärdar i senare steg, öka enzymet beloppet eller förlänga koktiden.
- Rena PCR-produkter via ett spinnkolonn såsom beskrivits av tillverkaren.
- Utför en ligering oberoende reaktion för att kombinera en linjäriserad plasmid innehållande ett RN eller RC-fragmentet med genen av intresse. Mäta koncentrationen av de renade PCR-produkter: kombinera 50 ng av lineariserad plasmid och 50 ng av genen av intresse med 1 ni av enzymförblandning och bringa den totala volymen till 5 ^ med avjoniserat vatten. Inkubera vid 50 ° C under 15 minuter, lägg på is och tillsätt 20 pl TE-buffert.
- Omvandla rekombinanta plasmider in i kompetenta bakterier 18.
- Välj 2-4 + (som önskas) kolonier för O / N-kulturen. Tillsätt 5 mlLB-buljong och 5 pl kanamycin (50 mg / ml lager) till en 14 ml polypropylen rundbottnad röret, och lägga till den valda bakterier kolonin med en steriliserad inokulering loop. Inkubera vid 37 ° CO / N under skakning vid 225 varv per minut.
- Freeze 1 ml O / N-kulturen för glycerolförråd 19 och miniprep återstoden såsom beskrivits av tillverkaren.
- Utför sekvensering för att bestämma en bra klon. Om du använder kloning plasmiderna i Materials List, använd M13 framåt och bakåt primers (i separata reaktioner) som behövs för att få den fullständiga sekvensen för fusionskonstruktionen. Jämför med den förväntade sekvensen med hjälp av en justeringsverktyg såsom BLAST från National Center for Biotechnology Information (NCBI) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- Överför de sekvens verifierade konstruktionerna till en expressionsplasmid via en rekombinas-reaktion.
- Lägg 75 ng av destinations plasmiden & #8212; såsom pcDNA för transienta transfektioner eller pLenti för Lentiviral förpackningar 20 - och 50 ng av den rekombinanta klonings plasmiden till 1 pl enzymförblandning och uppfostra den totala volymen till 5 ^ med avjoniserat vatten. Inkubera vid 25 ° C under 1 timme, tillsätt sedan 5 pl TE-buffert.
Obs: För lentivirala förpackningar och stabil cellinje generation, använda en annan destination plasmid för varje konstruktion, till exempel, en med puromycinresistens och andra neomycin. Detta möjliggör för dubbel urval av omvandlade celler. Också överväga promotorn för vardera, såsom den konstitutiva cytomegalovirus (CMV) -promotorn för höga expressionsnivåer, eller CMV med TetO operatör för avstämbara doxicyklin reglerade uttrycket. - Omvandla 5 pl in i kompetenta bakterier och miniprep plasmiderna såsom i stegen 1.2.6 till 1.2.8, men med användning av det lämpliga antibiotikumet (typiskt ampicillin).
- Lägg 75 ng av destinations plasmiden & #8212; såsom pcDNA för transienta transfektioner eller pLenti för Lentiviral förpackningar 20 - och 50 ng av den rekombinanta klonings plasmiden till 1 pl enzymförblandning och uppfostra den totala volymen till 5 ^ med avjoniserat vatten. Inkubera vid 25 ° C under 1 timme, tillsätt sedan 5 pl TE-buffert.
- Linjärisera plasmiderna innehållande fragmenten RN och RC med omvänd PCR (eller begränsning Digest) vid insättningspunkten. Primrar för omvänd PCR är listade i tabell 1. Nedan är ett exempel PCR-protokoll som används i författarens labbet (se Material Förteckning för de exakta materialen som används i detta protokoll).
- Bestämma den optimalaBiFC konfiguration.
- Co-transfektera expressionsplasmider in U2OS celler (eller cellen).
- Lägg 350 pl av fenolrött-fritt och antibiotikafritt DMEM kompletterat med 10% FBS i varje brunn i en 8-brunnars # 1,5 glas bottenkammare objektglas. Plate ca 7,5 x 10 4 celler per brunn så celler är ungefär 70% -90% konfluenta nästa dag.
- Dagen efter utstrykning, sam-transfektera expressionsplasmider med olika konfigurationer i varje brunn med användning av det föredragna reagenset och såsom beskrivits av tillverkaren.
- För varje brunn, tillsätt 125 ng av varje expressionsplasmid till 50 pl av serumfria reducerade media i en 0,6 ml-rör och pipettera upp och ned för att blanda. Tillsätt 1 pl av transfektionsreagens längs mitten av röret och direkt in i mediet. Skaka försiktigt för att blanda och låt reaktionen sitta i 30 minuter.
- Minska media i varje brunn i kammarobjektglas med ungefär halv. Lägg transfektion blandningen droppvis till brunnarna och skaka glunda att blanda. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 under 24-48 timmar. Ändra media dagen efter transfektion.
- Bildceller på ett fluorescensmikroskop som i protokoll 2 börjar med steg 2.1.4.
Obs: Provet kan avbildas på en standardfluorescensmikroskop om uttrycksnivåerna är höga och kameran är tillräckligt känslig för den relativt låga foton produktionen av PAmCherry1. Rekonstituerade PAmCherry1 molekyler kan aktiveras med en ultraviolett filteruppsättningen (405 nm) före avbildning med en grön excitation (561 nm) filteruppsättning.
- Co-transfektera expressionsplasmider in U2OS celler (eller cellen).
- I förekommande fall, skapa en negativ kontroll genom att exempelvis, införande av en punktmutation i ett av de proteiner av intresse som stör interaktionen. Utför en ställesriktad mutagenes 21 om kloning plasmiden av proteinet som skall muteras och av den valda konfigurationen.
- Skapa en stabil cellinje genom att paketera konstruktionerna i viralpartiklar och infektera U2OS celler (eller cellinje val). Överväga en inducerbar (tetracyklin) expressionssystem 15 så uttryck kan induceras före avbildning om förlängd oåterkallelig BiFC är en fråga, eller om avstämbara uttryck önskas.
VARNING: Arbeta med virus klassificeras som biosäkerhetsnivå 2. Medan senaste generationerna av virala förpackningssystem har kraftigt minskat sannolikheten för att producera replikationskompetenta virus, vissa risker som fortfarande finns kvar. Referenser kan hittas på http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.- Upprepa steg 1.2.10 använder en lenti- eller retroviral destination vektor 20. Öka O / N-kulturen till 100 ml för en Midiprep och större renhet av plasmiderna.
- På dag 1: Plate ca 2 x 10 6 293T / 17-celler i en 10 cm skål för varje konstruktion som skall förpackas.
- Dag 2: Förbered en transfektion reaktion med hjälp av en transfection reagens med val och såsom beskrivits av tillverkaren.
- Förbered en förblandning av förpacknings plasmider med slutliga koncentrationer av 250 ng / l för förpackning plasmider 1 och 2, och 100 ng / l för förpackning plasmid 3 i sterilt vatten. Tillsätt 10 pl av packnings plasmiden förblandningen och 2,5 ^ g av målplasmiden till 1 ml serumfritt reducerade medier i en 5 ml polypropylen rundbottnad rör och pipettera upp och ned för att blanda. Tillsätt 20 ul av transfektionsreagens längs mitten av röret och direkt in i mediet.
- Skaka försiktigt för att blanda och inkubera vid RT i 30 min. Ta bort ungefär hälften av media från cellerna och tillsätt transfektion blandningen droppvis. Skaka försiktigt för att blanda och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2. Inkubera 10 ml medium per platta i ett rör med locket lossas för temperatur och CO 2 ekvilibrering.
- Dag 3: Ändra försiktigt media med förinkuberades medier och return cellerna till inkubatorn. Inkubera annat rör medier med locket lossat.
Obs: Syncytia, eller bildandet av stora multikärnförsedda celler, kan vara ett tecken på att förpackningen går bra. Men cellerna är i en bräcklig stat och lätt kan tas loss. Vid byte medier, luta pipetten, så att den är horisontell och tillmedia droppvis i en kant av plattan. - Dag 4: Harvest viruset genom att ta bort media med en spruta och filtrering genom ett 0,45 um porstorlek filter till en ren 50 ml rör. Försiktigt ersätta media med förinkuberades medier.
- Dag 5: Harvest igen som gjort tidigare i steg 1.5.3.3 och kombinera gemensam filtratet i samma 50 ml rör. Tillsätt 6 ml virus koncentrator till varje rör och blanda. Förvaras vid 4 ° C under minst 24 timmar tills viruset fällningarna.
Obs! Beroende på hälsan hos cellerna kan viruset skördas en tredje gång. - Koncentrera viruset genom centrifugering vid 1500 x gunder 15 minuter vid 4 ° C. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 250 | il medium. Virus kan användas omedelbart för infektion eller lagras i 50 | il alikvoter vid -80 ° C i upp till ett år.
- Plate ca 3 x 10 5 U2OS (eller mål) celler per brunn i en 6-brunnsplatta (2 ml DMEM med 10% FBS per brunn) för infektion, så celler är ungefär 50% sammanflytande vid tiden för infektion.
- Följande dag, ta bort ungefär hälften av media så ca 1 ml återstår. Coinfect med 50 il koncentrerad virus för varje konstruktion. Tillsätt 1 pl av polybren (8 mg / ml) till varje brunn. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2. Ändra media nästa dag och inkubera under en dag innan antibiotikaselektion.
Obs: Mängden virus att lägga kan variera beroende på den önskade hastigheten av infektion. Virus kan titreras med hjälp av QRT-PCR. - Lägg antibiotika för att selektera för infekterade celler. Separata brunnar med oinfekterade celler som inte har sett virus krävs som kanariefåglar att testa effekten av valet. Inkubera under 2-7 dagar, eller tills valet är klart.
Obs: Effektiva koncentrationer bör titreras till en början, men de är oftast 1,0 mikrogram / ml för puromycin och 1,0 mg / ml för neomycin. - Expandera celler i en större 10 cm skålen och gå vidare till protokoll 2.
- Förbered en förblandning av förpacknings plasmider med slutliga koncentrationer av 250 ng / l för förpackning plasmider 1 och 2, och 100 ng / l för förpackning plasmid 3 i sterilt vatten. Tillsätt 10 pl av packnings plasmiden förblandningen och 2,5 ^ g av målplasmiden till 1 ml serumfritt reducerade medier i en 5 ml polypropylen rundbottnad rör och pipettera upp och ned för att blanda. Tillsätt 20 ul av transfektionsreagens längs mitten av röret och direkt in i mediet.
2. Imaging fixerade celler
- Framställa ett prov för avbildning
- Rengör en 8-brunn # 1.5 glasbottenkammare glida genom att tillsätta 250 pl av 1 M NaOH i minst en timme och tvätta noga med PBS.
Obs: Obehandlade kammare diabilder normalt leda till hög bakgrundssignal. Dessutom kan celler vara känslig för resterande NaOH och underlåtenhet att rengöra glasytan (så många som 10x tvättar) kan göra celladhesion svårt. Om det behövs, inkubera den rengjorda kammaren glida med PBS O / N efter tvätt. För känsliga cellinjer, plätering vid en högre densitet(T.ex. vid 50% -60% första konfluens) kan hjälpa. - Plattan kring 5,5 x 10 4 av de U2OS stabil expressions celler per brunn i 350 | il fenolrött-fritt DMEM med 10% FBS, så att cellerna är friska och inte över konfluenta vid avbildande.
- Utför nödvändiga behandlingar för försöket, till exempel lägga tetracyklin att inducera proteinuttryck.
- Fixera cellerna omedelbart före avbildning.
- Före fixering, förbereda färsk paraformaldehyd (PFA) lösning - 3,7% PFA i 1x PHEM med 0,1% glutaraldehyd (GA). För 10 ml PFA lösning, väger 0,37 g PFA och överför till en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 1 ml destillerat vatten och 30 pl 1 M NaOH och vortexa. Värm vid 70 ° C och virvel varje 1-2 min tills PFA är fullständigt upplöst.
- Transfer löst PFA till en 15 ml koniska rör och tillsätt 3,8 ml destillerat vatten, 5 ml 2x PHEM buffert, 20 pl av 25% glutaraldehyd, och virvel att blanda. Lager, är 12 2x PHEM buffert0 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA, och 16 mM MgSO 4, med pH justerat till 7,0 med 10 M KOH. Denna fixeringslösning kan lagras vid 4 ° C under flera dagar.
VARNING: PFA och Georgien är både farligt. Bered lösningen i ett dragskåp och bära lämplig skyddsutrustning vid hantering av både kemikalier. Undvik inandning eller direkt hudkontakt. - Avlägsna odlingsmediet. Tvätta snabbt med 500 ul PBS och tillsätt 250 mikroliter av PFA fixativ per brunn. Inkubera cellerna i 20 min vid rumstemperatur.
- Ta bort PFA fixativ från provet och tillsätt 350 pl PBS eller bildbuffert (100 mM Tris med 30 mM NaCl och 20 mM MgCl2, pH 8,5) per brunn.
- Vortex 100 nm guldpartiklar för att bryta upp aggregat och tillsätt 35 pl per brunn (10x slutlig utspädning) för att spåra stadium Avvikelsen under avbildning.
- Rengör en 8-brunn # 1.5 glasbottenkammare glida genom att tillsätta 250 pl av 1 M NaOH i minst en timme och tvätta noga med PBS.
- Få bilder
- Slå på mikroskopet. Ström på 405 och 561 nm lasrar, men hålla jalusier(intern eller extern) stängt vid denna punkt. Slå på EMCCD kameran och låt den svalna. Se till att 561 nm filter är på plats.
- Öppna förvärv programvara och ställ in exponeringstiden till 100 ms och EMCCD vinsten till 300 (intervall 1 - 1000).
- Lägg immersionsolja till målet och säkra provet till mikroskop scenen.
- Med antingen ljusa fält eller 561 nm laser på (~ 1 kW / cm 2), frammatning av provet i fokus.
- För avbildning Ras och andra membranproteiner, använd en 60X Apochromat TIRF målet med 1,49 numerisk bländare och sätta mikroskopet i TIRF konfiguration. Justera excitation lasern så att det är off-centrerad när slå tillbaka öppning TIRF mål; detta bringar lasern att avböja när den når provet. Håll att justera lasern tills den kritiska vinkeln är uppnådd och lasern reflekteras tillbaka. Sök efter en cell till bilden med flera guldpartiklar i sikte. Ställ in en region av intressesom omsluter cellen (eller en region inom cellen) och guldpartiklarna.
Obs: TIRF minskar inträngningsdjupet av exciteringslaser och minskar ofokuserad bakgrundssignal. Dessutom är det sannolikt att vara mer exakt när fler guldpartiklar är i visa driftkorrigering. - Om tillgängligt, engagera autofokussystemet för att korrigera för provdriften i z-riktningen. Annars justera fokus manuellt genom förvärvet om bilden går ur fokus.
- Börja förvärv med 405 nm lasern och 561 nm laser på (~ 1 kW / cm 2) om tillräcklig aktivering sker redan (vanligen om expressionsnivåerna är höga). Annars, slå på 405 nm laser på lägsta fabrikseffektinställning (0,02 mW eller 0,01 W / cm 2) och öka gradvis (0,1 mW vid en tidpunkt) som behövs tills det finns flera tiotals molekyler per ram eller så att enstaka molekyler är väl separerade.
- Som datainsamling fortsätter gradcessivt öka 405 nm laser makt för att hålla platsen tätheten i stort sett konstant.
Obs: Vid lägre 405 nm excitation makt, kan vissa PAmCherry1 redan aktiveras. Eftersom dessa molekyler photobleach befolkningen återstående fotoaktiverbara PAmCherry1 molekyler minskar, vilket kräver en högre fotonflöde för att bibehålla samma densitet av molekyler som avger fluorescens i varje ram. - Fortsätt bildtagning tills hög 405 nm effekt (2,5-10 W / cm 2) aktiverar inte fler aktiveringshändelser.
Obs: Den totala förvärvsTiden beror på uttrycksnivån och effektivitet komplettering.
- Bearbeta bilderna
Obs: Det finns många öppen källkod alternativ för bildbehandling. Exempel är åska (https://code.google.com/p/thunder-storm/) och QuickPALM (https://code.google.com/p / quickpalm /). De typiska förfaranden databehandlingskortfattat illustreras här med en anpassad Matlab paket som kallas wfiread för bearbetning PALM uppgifter som ett exempel. Emellertid kan framtida revisioner inte exakt följa vad som beskrivs här. För bildbehandling med annan programvara, hänvisas till användardokumentation.- Ladda ner bildbehandlingsprogram (Supplemental Code File) eller den senaste versionen på http://www.ohsu.edu/nan. Öppna Matlab och ladda wfiread programvara (som redan är satt i standardsökvägen).
- Visa råbildsekvensen och bestämmer regionen av intresse. Välj området av stapeln som skall behandlas genom att vänsterklicka och dra en ruta runt önskat område. Om regionen av intresse inte minskade under förvärv (cirka 256x256 pixlar), väljer ett mindre område att minska beräkningstiden. Om du vill avmarkera ett område och behandlar hela ramen, högerklicka någonstans i the bild.
- Ange området av ramar som skall bearbetas.
- Välj en guldpartikel (en som isoleras och enhetlig form) genom att vänsterklicka på bilden och dra en liten ruta runt det. Under Particle Tracking, klickar du på Track knappen. En graf visas som visar positionen för den valda guldpartikel tvärs stapeln av bilder, som visar omfattningen av avdriften.
- Upprepa denna process för att spåra så många guldpartiklar som möjligt och avgöra de som spårar tillsammans (partiklarna kommer att vara färgkodade). Idealt den övergripande glidningen är av storleksordningen en pixel som mest.
- Individuellt välja guldpartiklarna som spårade tillsammans en i taget och klicka på Lägg till markör knappen under Particle Tracking. En grön kors visas anger att det har lagts till som en markör och kommer att användas för att korrigera för drift.
- Justera Sigma Range, Utjämning Range och Threshold vid behov genom att ändra värdena något. Klicka på Sök Particleför att testa inställningarna. Partiklarna som kommer att behandlas kommer att förpackade och de som inte kommer att lämnas ut. De PAmCherry1 molekyler, partiklar som är relativt rund och ljus, bör väljas.
- Börja bearbeta bilderna genom att klicka på Make Coord File knappen och spara filen.
Obs: Programmet kommer att gå igenom varje ram inom det definierade bildruteintervall, alla fluorescerande fläckar, och utföra Gauss passande att hitta de centroida koordinater. En .cor fil kommer att genereras att lagra alla koordinater och andra passande parametrar av de bearbetade enda molekyl bilder.
- Post-process bilderna och göra PALM bilden
Obs: Andra program kanske direkt göra bilden efter koordinat extraktion.- I Matlab, startar "palm" paket och ladda .cor filen nyss skapade.
- Innan göra PALM bilden med koordinaterna, sortera enskilda koordinaterna (vardera från en "localizatiom händelse). De optimala sorterings värden kan variera beroende på installation och fluoroforen.
- För PAmCherry1, använd följande värden: Kombinera Frame - 8; Kombinera distans (nm) - 100; Minsta RMS - 4; Minsta Fit Goodness - 0,25; och Max. Excentricitet - 1.4. Se diskussionen avsnitt för ytterligare förklaring av dessa parametrar.
- Klicka på knappen Sortera för att generera en ny uppsättning koordinater redo för rendering högupplösta bilder.
- Ange värden för korrekt återgivning av den slutliga bilden som råpixelstorlek (nm), den önskade funktionen storlek (nm) i den renderade bilden och pixelstorleken för den renderade bilden.
Obs: Den råa pixelstorlek måste bestämmas för varje inställning. Den renderade karaktäristisk storlek kan ställas in godtyckligt, men är typiskt inställd på ett värde något högre än det genomsnittliga lokaliseringsprecision. För PAmCherry1 är den genomsnittliga lokaliseringsprecision omkring 18 nm, så en karaktäristisk storlek 20 - 30 nm är appropriate. Att notera var lokaliseringen precisionen beräknas genom att ta standardavvikelsen för lokaliseringar av samma molekyl över flera ramar 22 och inte genom att dividera diffraktionsgränsen med kvadratroten av detekterade antalet fotoner. När det gäller pixelstorlek på den renderade bilden, är 10 nm en bra utgångspunkt; sätta detta värde för lågt kommer att resultera i onödigt stora bildfiler för oförstorade vyer. - Klicka på knappen Överför till generera PALM bilden. Använd +/- förstoringsglas ikoner i verktygsfältet i figuren fönstret för att zooma in och ut.
- Tillval: Utför klusteranalys av den rekonstruerade PALM bilden med antingen Ripley K test eller andra mekanismer som simuleringsstödd DBSCAN (SAD) 23. Obs: I den anpassade palm paketet är både Ripleys K och SAD analys redan byggts in; för koordinater som genereras från andra program, kan samma analyser utföras med extra anpassade skript.
3. enda molekyl Tracking i levande celler - Behandla vävnadsodlingsytan och plattan cellerna som beskrivs i protokoll 2. Eftersom temperaturen och / eller CO2 kontrollerad stadium kan kräva en viss odlingsskål, se till att coverglass har lämplig tjocklek (0,17 mm) för mikroskopi inställning.
- Transfektera celler om gör en transient expression och utföra alla behandlingar som behövs för experimentet, såsom tetracyklin för att inducera uttryck, och inkubera vid behov. Detta är också densamma som beskrivs i protokoll 2.
- Placera kulturen skålen på en på scenen inkubator. Låt skålen bosätta sig på scenen för några minuter tills temperaturen och CO 2 koncentration stabilisera varje gång efter montering odlingsskål eller flytta till ett nytt område av intresse. Block lasrar på detta steg. Om CO 2 kontroll är inte tillgänglig, byta till en CO 2 oberoende medier rätt innan avbildning, såsom Leibovitz s L-15.
Obs: Fenol-rött-fritt medium rekommenderas för deprimerande bakgrundsfluorescens.
- Hämta bilder som i protokoll 2. Ställ en lämplig exponeringstid (vanligen 25-50 ms för PAmCherry1).
Obs: Molekylen tätheten måste vara lägre än för fasta celler så att banor kan spelas in utan att överlappa varandra. De angivna tiotal molekyler är typiskt för en 256x256 pixel förvärv vid en pixelstorlek på ca 160 nm. Den 561 nm laser effekttäthet var inställd på 0,8 kW / cm 2 för att bibehålla en bra signal-till-brus-förhållandet samtidigt som man minskar fototoxiciteten till celler och öka den genomsnittliga bana längden. - Bearbeta bilderna.
- Utdrag koordinaterna för enskilda molekyler med wfiread paket som beskrivs i protokoll 2, eller med ett annat paket.
- Rekonstruera enda partikel banor som använder olika enda partikel spårning (SPT) paket baserade på olika algoritmer hittadesannorstädes 24. Obs: Alternativt kan detta steg åstadkommas med hem byggt Matlab-paketet (möjligen finns i framtida revideringar på http://www.ohsu.edu/nan.
- Tillval: Efter ombyggnad, använda en SPT paket 24 för att beräkna förskjutning och diffusionskonstanter från banorna. Dessutom använder variations Bayes enda partikel tracking (vbSPT) 25 för att bestämma diffusion tillstånden hos målproteiner. vbSPT Matlab paket och dokumentation kan hittas på sin officiella Sourceforge webbplats: http://vbspt.sourceforge.net/.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den BiFC-PALM visade exemplet är KRAS G12D-mutant interagerar med Ras-bindande domän (RBD) hos Craf (Figur 1A). Såsom diskuterats, var RN eller RC-fragmenten inte taggade till C-terminalen av Ras, eftersom det skulle störa membranlokalisering och följaktligen den biologiska aktiviteten av Ras. Detta minskade möjliga kombinationer 8-4 (Figur 1B). Var och en av dessa fyra kombinationer infördes i U2OS celler med användning lentivirala infektion. Cellerna fixerades som beskrivs i protokollet, och BiFC signalerna utvärderades med hjälp av en PALM setup. Celler med positiva BiFC signaler identifierades genom den abrupta ökningen i fluorescens när 405 nm laser var aktiverat, den 561 nm laser var på under hela avbildningsexperiment. Denna abrupta ändring i fluorescens beror på fotoaktivering av BiFC-rekonstituerade PAmCherry1 vid belysning med 405 nm laser. Flera regioner i provet utvärderades med hjälp av denna metodOch BiFC signalintensiteten beräknades som genomsnittet av den ökade pixelintensiteter före och efter en kraftfull puls från 405 nm laser.
Som framgår av Figur 1C, av de fyra möjliga konfigurationer, två konfigurationer (nämligen RN-Ras / RC-Raf RBD och RN-Ras / Raf RBD-RC) hade starka BiFC signaler. En annan konfiguration (RC-Ras / Raf RBD-RN) hade svag signal, och en hade ingen signal. För alla efterföljande experiment RN-Ras / Raf RBD-RC konfiguration (uppe till höger i figur 1C) som används. Som en negativ kontroll användes en punktmutation (R89L) i Ras-bindande domänen hos Raf infördes och BiFC effektivitet med användning av samma konfiguration testades. Denna mutation var känd för att störa Raf bindning till Ras; konsekvent, mutationen kraftigt minskade BiFC signalen (figur 1D).
Eftersom PAmCherry1 molekyler genereras genom BiFC visade liknande fotoaktivering egenskaper till originalPAmCherry1 10, gör detta för PALM avbildning av BiFC prover med hjälp av samma experimentella inställningar med moder PAmCherry1. Ett exempel PALM bild av celler med stark BiFC signalen efter infektion med RN-Ras och Raf RBD-RC visas i figur 2A.
När du har zoomat in (Figur 2A nere till vänster och inlägg, med förstorade områden boxed), enskilda molekyler och deras nano rumsliga fördelning syns tydligt. Notera varje punkt i dessa PALM bilder representerar en förmodad Ras-Raf RBD komplex märkta med en PAmCherry1 molekyl. Som jämförelse var den högra sidan av figur 2B simulerade lågupplösta bilder av samma synfält, där klustren blev helt oklar. Observation av Ras-Raf RBD kluster är förenligt med tidigare synpunkter på klusterbeteende Ras och Raf.
Med levande celler som uttrycker BiFC beredda PAmCherry1, smt-PALM var performed att förvärva diffusion banor enskilda Ras-Raf RBD-komplex, på samma sätt som tidigare beskrivits 10. Under kontinuerlig belysning med 561 nm och 405 nm lasrar, enskilda PAmCherry1 molekyler stokastiskt slå på och håller några bilder innan mörka stater (delvis på grund av fotoblekning). Under denna tidsperiod, molekylerna uppvisade åtminstone två olika diffusion beteenden: en orörlig tillstånd (figur 2B, molekyl 1) och en mobil tillstånd (figur 2B, molekyl 2). Båda typerna av banor är tydligt närvarande i (x, y) -kurva visas i figur 2C, där banorna för multipla molekyler registreras. Samma ojämn fördelning av diffusion tillstånd kan härledas från histogrammet av molekylär förskjutning mellan successiva ramar. Typiskt, 10.000 - kan 100000 diffusion banor förvärvas från varje cell; Detta stort antal möjliggör mer noggrann statistisk analys av than diffusion stater, till exempel med vbSPT algoritmen 25.
Figur 1. BiFC-PALM experimentell design av Ras-Raf interaktion. (A) Ras är ett membranbundet protein som rekryterar Raf när den är aktiv. När icke-fluorescerande delad PAmCherry1 fragment är bundna till Ras och Raf, bringar interaktionen fragmenten tillsammans och komplemente inträffar, vilket resulterar i en funktionell fluorescerande protein. (B) Eftersom märkning Ras vid sin C-terminal skulle störa sin membranlokalisering, var antalet konfigurationer testats för Ras-Raf BiFC-PALM minskas 8-4. (C) Bilder från U2OS celler som uttrycker de testade konfigurationer tagna med en TIRF mikroskop. För att bedöma BiFC effektiviteten för varje konfiguration är celler ges samma höga dos av 405 nm ljus, medansom exciteras med 561 nm ljus. (D) Presentation av R89L mutationen i Raf RBD kraftigt minskade BiFC signalen från RN-Kras G12D / Craf RBD-RC konfiguration (uppe till höger i C, n = 5-8). Felstaplar är SEM i (D). Skalstrecken i (C), 10 ^ M. RN = PAmCherry1 N-terminal fragment, RC = PAmCherry1 C-terminalt fragment, och RBD = Ras bindande domän. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. BiFC-PALM av U2OS celler som uttrycker RN-Kras G12D / Craf RBD-RC-konfiguration. (A) En hel PALM bild visas ovan. Lägre paneler förstorade vyer av inramade regionerna i övre bilden som visas. Inläggningar är högreförstoringar av de inramade regionerna i respektive förstorade vyer. Den högra sidan av de lägre panelerna (märkt TIRF) är representationer av bilder på deras vänster som om tas med en diffraktionsbegränsat mikroskop. (B) Successiva ramar från en levande cell smt-PALM experiment som skildrar långsam (1) och snabba (2) flyttar Ras-Raf-komplex. (C) Effekt från en SMT-PALM Försök som visar diffusion banor Ras-Raf-komplex inom ett litet område av en cell. (D) Histogram av förskjutningar per ram av Ras-Raf-komplex från en SMT-PALM experiment. Skalstrecken i (A), 5 | j, m topp, 500 nm botten, 50 nm inlägg, och (C), en ^ M. RN = PAmCherry1 N-terminal fragment, RC = PAmCherry1 C-terminalt fragment, och RBD = Ras bindande domän. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Primersekvens (5 'till 3') | |
| Kloning plasmid för infogning vid N-terminal omvänd | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| RN på N-terminalen framåt | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RC på N-terminalen framåt | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| Klonings plasmid för infogning vid C-terminalen framåt | TAAAAGGGTGGGCGCGCC |
| RN från C-terminalen omvänd | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| RC från C-terminalen omvänd | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
Tabell 1. Primrar för linjärisering klonings plasmider innehållande PAmCherry1 fragment. Klonings plasmider innehållande RN, och RC kan linjäriseras med omvänd PCR vid insättningspunkten vid antingen N- eller C-terminalen av fragmenten. Sekvenser listas 5 "till 3R17 ;.
| Överhäng för genen av intresse primrar (5 'till 3') | |
| N-terminal insättning RN eller RC framåt | GAGCTCGGTACCATG |
| N-terminal insättning RN omvänd | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| N-terminala inser RC omvänd | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| C-terminala inser RN framåt | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminala inser RC framåt | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminal insättning RN eller RC omvänt | GCGCCCACCCTTTTA |
Tabell 2. Överhäng för genen av ränte primers som matchar Tabell 1 primers. De 15 baspar av homologi för ligeringen oberoende reaktion genererasfrån primer överhäng. Dessutom är överhäng innefattar sekvensen för en (GGGGS) x2 flexibel länk. Den flexibla linkersekvens kan sättas till primrama i tabell 1 i stället. Sekvenser är listade 5 'till 3'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiFC har varit en ofta använd teknik för att upptäcka och visualisera PPI i celler, medan PALM är en ny enda molekyl Superresolution mikroskopi teknik som möjliggör nanoskala avbildning av intakta biologiska prover. Kombinationen av BiFC med PALM uppnådde selektiv avbildning av protonpumpshämmare i en cell med nanometer rumslig upplösning och enda molekyl känslighet. BiFC-PALM utökar nyttan av både tekniker och som visat i detta arbete, visar mycket lovande i att avslöja de molekylära detaljerna av protonpumpshämmare på sitt eget cellulära sammanhang. I synnerhet möjliggör nanometerupplösning för detaljerad undersökning av den rumsliga och tidsmässiga reglering av särskilda protonpumpshämmare på molekylär skala, vilket har varit en utmaning i biomedicinsk forskning. Men som tidigare nämnts är BiFC-PALM begränsas av oåterkallelig komplettering och långsam kromofor mognad.
Split PAmCherry1 användes för att demonstrera principen och utility av BiFC-PALM. PAmCherry1 har använts i stor utsträckning PALM experiment för sina utmärkta fotofysikaliska egenskaper. En ytterligare fördel med att använda PAmCherry1 som BiFC sonden är den låga bakgrund och hög specificitet och effektivitet i protein rekonstitution vid 37 ° C när den är kopplad till protonpumpshämmare. Av dessa skäl är det split PAmCherry1 BiFC sond förväntas bli en värdefull resurs som är tillämplig på många olika biologiska undersökningar som involverar hög upplösning avbildning av protonpumpshämmare. Förutom PAmCherry1, en photoconvertible fluorescerande protein, mEos3.2, även delas upp för BiFC-PALM 26. Eftersom deras utsläppsspektra överlappar varandra, kan mEos3.2 och PAmCherry1 inte användas tillsammans, men grön PA-ramprogrammen har nyligen rapporterats 27, öppnar möjligheten för två färger nanoskala Superresolution avbildning av protonpumpshämmare.
Såsom vid konventionell BiFC, är ett kritiskt steg i genomförandet av BiFC-PALM utformning och kloning av fusionskonstruktionerna. Det faktum att upptill åtta olika expressionskonstruktioner måste klonas och åtta BiFC par måste prövas i varje försök att genomföra BiFC och BiFC-PALM kan vara en mödosam, om inte oöverkomliga, process. Ändå, som visas i Ras-Raf exempel förkunskaper om de biokemiska och strukturella egenskaper hos proteiner av intresse ofta kan användas för att styra en optimerad konstruktion av fusionskonstruktionerna med ett reducerat antal BiFC par som ska testas. Som sagt, för närvarande finns det inte en universell riktlinje för att säkerställa att en BiFC (därav BiFC-PALM) experiment skulle fungera; mycket av det är fortfarande en konst.
Medan BiFC och BiFC-PALM används typiskt för att undersöka heterodimerbildning mellan två proteiner, är det även tänkbart att studera homodimer bildning med användning av dessa metoder, i vilket fall de två kandidatproteiner skulle vara densamma. Emellertid som sådan, kan två proteiner med samma fragment samverkar men inte resultera i BiFC signalen. Trots varje konstruktion egenskapen konkurrerande inhibitor till de andra, sådana interaktioner är reversibla, medan interaktioner som resulterar i en framgångsrik komplettering skulle samlas på grund av oåterkallelig. I allmänhet kan det finnas en minskning av signal om det finns en drastisk skillnad mellan uttrycksnivåer av varje konstruktion. Därför kan expressionsnivåer för de två konstruktionerna måste bestämmas vid jämförelse av fluorescensintensiteterna (t.ex. mellan vildtyp och mutant homodimer prover) vid endogena expressionsnivåer. Det är kanske därför BiFC experiment vanligen utförs med transienta transfektioner och överuttryck av konstruktionerna.
Sist men inte minst måste alla BiFC experiment bekräftas med riktiga kontroller. Om BiFC signal är närvarande, det finns en chans att signalen är icke-specifik (dvs, är fragmenten beredning på egen hand och inte på grund av PPI). En negativ kontroll är mutationer i endera eller båda proteinerna som är kändaatt störa interaktion, vilket bör leda till en betydande förlust av BiFC signalen. Om en sådan punktmutation är okänd, kan andra metoder användas, såsom att införa en kompetitiv bindningspartner till en av proteinerna och se om det finns en åtföljande minskning i signalen.
Ju svårare situationen felsökning brist på BiFC signal eller falskt negativa resultat. I sådana fall är det viktigt att inkludera positiva kontroller under kloningsprocessen, till exempel en GFP kontroll under transfektioner. Western blöts kan köras för att kontrollera för uttryck av konstruktionerna. Om dessa faktorer är normala, kan andra faktorer behöver ändras, såsom linker längd och / eller sekvens, eller en annan BiFC konfiguration bör övervägas.
Som för PALM parti, måste ett antal parametrar beaktas vid bearbetning av bilderna. Steg 2.4.2.1 beskriver parametrar som används för att sortera koordinaterna och generera den slutliga PALM bilden. Den förstatvå parametrar, Kombinera Ram och kombinera Avstånd, definiera om två lokaliserings händelser är båda inom 100 nm och verkar mindre än 8 ramar (vid 100 ms / ram) eller ~ 0,8 sekunder ifrån varandra som vi beskrivit tidigare 23. Om så är fallet, kommer de att anses uppstå från samma molekyl, och deras koordinater kommer att kombineras genom medelvärdes. Mörka stater med livslängder mycket större än 0,8 sekunder för PAmCherry1 verkar vara sällsynt; som vid en fluorofor återhämta sig från en långlivad mörkt tillstånd är omöjlig att skilja från en annan molekyl vid en proximal avstånd avger fluorescens, två lokaliserings händelser anses som härrör från samma molekyl endast om de uppträdde inom ett visst antal ramar och fysiskt avstånd. Empiriskt visas en "kombinera ram" inställningen på 8-12 ramar (0,8 till 1,2 sek) vara optimal enligt våra experimentella betingelser. Minsta RMS definierar den minimala förhållandet mellan montering amplitud och standardavvikelsen för rester buller efterbeslaget. Dessa värden registreras i .cor filen under koordinat extraktion.
Sammanfattningsvis kombinerar BiFC-PALM fördelarna med BiFC och PALM och möjliggör undersökning av protonpumpshämmare på mycket större detalj än vad som har uppnåtts tidigare. Med hänsyn till ovanstående faktorer och med riktiga kontrollförsök, bör BiFC-PALM vara ett användbart verktyg för att studera protonpumpshämmare i ett brett spektrum av biologiska inställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope frame | Nikon | Ti-U | |
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | CFI Apo TIRF 60x H | |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Opto Engine | MGL-FN-561 | |
| 405 nm laser | Coherent | CUBE-405 50mW | |
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25x36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | Tokai Hit | INUBG2ATW-PLAM | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 ml tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 ml tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
References
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
- Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
- Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589 (2014).
- Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171 (2013).
- Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
- Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
- Seidman, C. E., Struhl, K., et al. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Coligan, J. E., et al. Appendix 4, 4D (2001).
- Morrison, S. L.
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
- Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
- Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).
