Introduction
Protein-protein etkileşimleri (PPİ) biyoloji 1 için temel olan ve sıkı birçok zaman ve uzunluk ölçeklerinde genelinde zamanmekansal mekanizmalar üzerinden düzenlenir. Hücre zarı üzerinde hücre sinyal ile ilgili çalışmalar, örneğin, belirli bir PPIs ve hücresel süreçlerin 2 kolaylaştıran dinamik nano ölçekli mekansal bölmeleri göstermektedir. Bu nedenle, yeterli mekansal ve zamansal çözünürlükte, yüksek özgüllük ve yüksek hassasiyet ile biyolojik sistemlerde PPIs prob yeteneği biyoloji mekanistik anlayış ulaşmanın anahtarıdır.
5 - Bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) hücre içi çözünürlük ve canlı hücre uyumluluğu 3 bir hücreye PPIs görselleştirmek için birkaç mevcut araçlardan biridir. Tekniği oldukça basit ve iki floresan olmayan parçalara bir floresan proteininin yarma içerir; genetik iki etkileşen proteinlere etiketlendi zaman veyakınına getirildiğinde, fragmanları, flüoresan sinyali verecek şekilde tam bir floresan protein oluşturmak üzere sulandırmak olabilir. Doğru tasarlandığında, BiFC probları kendiliğinden PPİ yokluğunda sulandırmak gerekir. Bunun gibi, bir BiFC tahlilinde floresan sinyali sadece yüksek özgüllük ile PPİ doğrudan görüntülenmesine olanak tanıyan PPİ varlığında ortaya çıkacaktır. Okuma olarak floresan kullanmanın ek yararlar diğerleri arasında yüksek verimlilik ve yüksek içerik tarama deneyleri, yüksek hassasiyet, subsellüler çözünürlük ve uyumluluk. Bu faydalar, farklı üst floresan proteinleri göre BiFC probları bir dizi geliştirilmiştir. Geleneksel ışık mikroskopisi göre tüm diğer algılama teknikleri gibi, ancak, BiFC uzaysal çözünürlüğü ışık difraksiyonu ile ~ 250 nm ile sınırlıdır. Bu lipit sallar 6 a göre daha önce değindiğim ve örneklendiği gibi, nano, at PPİ düzenlenmesini incelemek için bunu bir meydan okuma yaparnd Ras nanokümeler 7, örneğin sinyalizasyon gibi birçok hücresel süreçleri anlamak için kritik bir uzunluk ölçektir.
BiFC PPIs 10 görüntülenmesi için mekansal çözünürlükte bu sınırı aşmak için fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) 8,9 ile kombine edilmiştir. PALM stokastik aktivasyonu ve tek flüoresan moleküllerinin subdiffractive lokalizasyonu ile floresan görüntüleme kırınım sınırı atlatır son superresolution mikroskopi tekniğidir. Her bir aktivasyon çevriminde, bir flüoresan molekül birkaç bin fotonlara birkaç yüz verir ve dedektör üzerinde tek bir molekülün bir görüntüye yol açmaktadır. Görüntü kırınım sınırlı olsa da (~ genişliği 250 nm) olarak, ağırlık merkezi, tipik olarak tespit edilen fotonların sayısına bağlı olarak 10-50 nm mertebesinde, daha yüksek hassasiyet ile tespit edilebilir. Aktive ve numunedeki her floresan molekülü lokalize ederek, yüksek çözünürlüklü bir görüntü yeniden inşa edilebilir. Performecanlı hücreler üzerinde d tek bir hücreden 11 protein difüzyon yörüngeleri binlerce tek bir molekül izleme (smt-) PALM ileri izin edinimi. Önemlisi, PALM stokastik aktivasyonunu elde etmek için bu tür ışıkla aktive floresan proteinleri (PA-FP) gibi özel flüoresan millerini kullanır. BiFC ve PALM kullanım floresan proteinleri hem beri onlar amino asitler 159 ve 160 arasında iki parça halinde, PALM için PAmCherry1, yaygın olarak kullanılan bir PA-FP bölerek kombine edilmiştir.
Bölünmüş PAmCherry1 dayalı BiFC sistemi iki parçalarının kendiliğinden sulandırıldıktan düşük arka plan sinyalini gösterir. Genetik olarak etkileşen proteinlerin bir çift etiketli, iki fragman (RN = 1-159 kalıntıları RC = Met + kalıntıları 160-236) da 37 ° C 'de ve daha düşük sıcaklıklarda kuluçkaya olmadan PAmCherry1 proteinleri oluşturmak için etkin bir şekilde yeniden, burada Böyle ebeveyn mCherry 13 gibi diğer BiFC çiftleri 12 için durum böyle değil. Furthermoyeniden yeniden PAmCherry1 proteini gibi doğru tek bir molekül lokalizasyonu ve yüksek çözünürlüklü PALM görüntüleme için kritik olan diğerleri arasında yüksek kontrast oranı, orta foton verimi ve hızlı fotoaktivasyon gibi ana PAmCherry1 ait Fotofiziksel özelliklerini korudu.
Bu protokolde, split PAmCherry1 (Şekil 1A) kullanarak U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini görüntüleme için BiFC PALM kullanılması tarif edilmektedir. İlk adım PAmCherry1 fragmanları (örneğin, RN ve Re) ve ilgili proteinler arasındaki füzyon proteinleri ifade etmek için yapıları tasarlamaktır. Teorik olarak, aday protein (A ve B) her çifti için, füzyon proteinlerinin sekiz çifti, test edilecek vardır: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; ve A-RC / B-RN. Bu süreç genellikle dikkate aday proteinlerin yapısal veya biyokimyasal özellikleri alarak basitleştirilmiş olabilir. Ras'ın bir durumda, proteintranslasyon sonrası C-terminal CAAX kutusunun modifiye (C = Cys; A = alifatik, X = herhangi bir), ve bundan sonra AAX motifi kesilir. Bu nedenle, RN RC yalnızca Ras'ın N-terminine kaynaşmış olabilir; Bu dört (Şekil 1B), füzyon proteini çiftlerinin sayısını azaltır. Raf için domain Ras bağlayıcı (RBD; artıkları 51-131) kullanılır ve her iki uçta etiketlenmiş olabilir. Bu dört füzyon konfigürasyonları elde edilmiştir: RN-Kras / RC-Raf RBD; RN-Kras / Raf RBD-RC; RC-Kras / RN-Raf RBD; ve RC-KRAS / Raf RBD-RN.
Buna ek olarak, fragmanlar ve ilgi proteinleri arasındaki bağlayıcı olarak kabul edilmesi gerekir. Yaklaşık on amino asit esnek bir bağlayıcı genellikle tamamlama oluşması için yeterli özgürlüğü sağlar olarak kullanılır. Çoklu bir klonlama bölgesinin (MCS) 14 elde edilen rasgele diziler dahil olmak üzere, başarılı bir şekilde uygulanmıştır diğerleri, olmasına rağmen böyle bir bağlayıcı (GGGGS) x2. Bağlayıcıların uzunluğu dependin optimize edilmesi gerekebilirilgi proteinlerin ve yönelimleri etkileşim boyutuna g.
PAmCherry1 fragmanları MCSS yan küçük bir klonlama omurgası içerdiği (Malzeme listesi). Söz konusu genler sınırlama siteleri yoluyla, ya da bir ligasyon bağımsız yöntemi ile yerleştirilebilir. Klonlama ve Sekans doğrulama sonrasında, ekspresyon kaseti, bir yeniden bağlayıcı reaksiyonlar, yüksek aslına uygunluk ve yüksek verimlilik ile bir klonlama işlemi kullanılarak bir ekspresyon vektörüne transfer edilir.
Daha sonra, elde edilen sentezleme konstruktları hedef hücre hattı enfekte etmek için sabit bir hücre serisi isteniyorsa, lentivirüs içine paketlenmiş, hedef hücre hattına transfekte veya edilir. Geçici transfeksiyon BiFC yapılandırmasının hızlı doğrulama için sağlar, ancak potansiyel problemler dikkat edilmelidir. Genellikle kimyasallar kullanarak Transfeksiyon yüksek otofloresans sonuçlanan hücreleri vurgular; ise toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobik kullanımıpy PPİ hücre zarındaki yer alırken aydınlatma hacmi, TIRF idealini sınırlayarak bu arka plan sinyalini azaltmak olabilir. Buna ek olarak, geçici nakiller genellikle çok PPIs saptanmasında eserler neden endojen proteinlerin aşan, protein ekspresyonunun yüksek seviyeleri yol açar. Bu nedenle, uygun bir BiFC yapılandırması ilk test ile belirlenmiştir sonra kararlı hücre soyları kurulmuştur önerilir. Stabil hücre hatları da doksisiklin indüksiyonu 15 vasıtasıyla ayarlanabilir ekspresyon için potansiyele sahiptir.
Enfeksiyondan sonra, hücreler tipik haliyle puromisin ve her bir yapı için neomisin, bir antibiyotik kullanılarak seçilir. Numune hazırlama, görüntü elde etme ve veri analizi için bir sonraki adım protokoller detaylı olarak tarif edilecektir.
Bu yaklaşımla, Ras-Raf RBD BiFC PALM görüntülerde nano kümelerin oluşumu rutin görülmektedir (Şekil 2A </ strong>). Sürekli, Ras-Raf RBD smt-PALM yörüngeleri difüzyon devletler (Şekil 2B-D) heterojen bir dağılım gösterir. Bu sonuçlar, Ras-Raf kompleksleri potansiyel biyolojik etkileri olan, muhtemelen monomerlerin ve kümeleri gibi, hücre zarı üzerinde birden fazla eyalette mevcut olduğunu göstermektedir. Bu çalışma, geleneksel BiFC, floresan co-lokalizasyon veya floresan rezonans enerji transferi (FRET) ile elde etmek zor olurdu nanometre uzamsal çözünürlük ve tek bir molekülün duyarlılık, hücrelerin içinde PPİ seçici görüntülenmesinde BiFC PALM gücünü gösteriyor.
BiFC deneyler tasarlama ve sonuçları yorumlama, bu BiFC süreci bölünmüş PAmCherry1 dahil çoğu durumda, geri dönüşümsüz akılda tutmak önemlidir. Iki parça bir araya ve tam bir PAmCherry1 protein, iki parça arasındaki bağlantı oluşturabilir ve sonra bu şekilde PPI kalıcı olur. Bu BiFC ve BiFC-PAL kullanımını sınırlamaktadırPPI dinamiklerini (örneğin, bağlayıcı bir kinetik olup oluşturulduğu bir kez protein kompleksinin difüzyon dinamikleri) izlenmesi için ve zaman zaman M da PPI komplekslerinin mislocalization yol açabilir.
BiFC PALM deney tasarlama floresan proteinleri doğasında vardır kromofor olgunlaşmasında gecikme olduğunda ek bir faktör dikkate. İki protein etkileşim ve FP fragmanları bir araya gelip, onlar genellikle saniye (EYFP 3 60 saniyelik yarı zamanlı) mertebesinde yeniden katlayın. Ancak, sonraki kromofor olgunlaşma ve flüoresan sinyal dakika mertebesinde gelişir. Floresan bölünmüş Venüs, hızlı bir katlama YFP varyant sulandırılmasından sonra 10 dakika içinde tespit edilebilir iken, genel olarak olgunlaşması için yarı-zamanı genellikle yaklaşık 60 dakika 16. Split-PAmCherry1 benzer fiyat bilgisi gözlendi. Dolayısıyla, BiFC ve BiFC PALM gerçek zamanlı ÜFE kinetiği izlemek için şu anda kötü seçimlerdir; Diğer meörneğin FRET ve yeni geliştirilmiş bir dimerizasyon bağlı floresan proteini 17 gibi thods, bu amaç için daha uygun olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klonlama
- Klonlamak ve bir bağlayıcı seçmek için yapılandırmaları belirleyin. Onların uygun lokalizasyonu bozmayacak böylece N- veya C-terminali üzerindeki parçaları ile Etiket proteinleri, aşağıda anlatıldığı gibi. Böyle (GGGGS) x2 olarak esnek bir bağlayıcı kullanın.
- Genetiği PAmCherry1 fragmanları ilgi proteinleri etiketleyin. Tek seçenek olarak, MCS dizileri komşu olan parçaları RN (PAmCherry1 kalıntıları 1-159) ve RC (Met artı PAmCherry1 kalıntıları 160-236) içeren malzemeler Listesi'nde yer klonlama plasmidlerini kullanın.
- Insersiyon noktasındaki fragmanları RN ve Re, ters PCR (ya da restriksiyon sindirimi) ihtiva eden plasmidler linearize. Ters PCR primerleri Tablo 1'de verilmiştir. Aşağıda yazarın laboratuarda kullanılan bir örnek PCR protokolü (Bu protokolde kullanılan kesin malzemeler için Malzeme Listesi bakınız).
- Su ile 50 ul'lik nihai bir hacme kadar getirildi birlikte PCR reaksiyonu, karıştırın ince duvaraed PCR tüpü, su, 2x ana karışımı 25 ul, düz ve ters primerlerin her biri 0.5 ul (20 uM seyreltilmiş stok, 0.2 uM nihai konsantrasyon) ve şablon olarak 1 ng ila ekleyin. Aşağıdaki döngü koşullarında, kullanın: 98 ° C, 30 sn için, 98 ° C'lik 30 döngü 7 saniye ve 2 dakika süreyle 68 ° C'de ve 10 dakika süreyle 72 ° C'de son uzatma.
- PCR RN ve Re fragmanlarını ihtiva eden doğrusallaştırılmış plazmid sokulması için ilgili genler. 68 ° C de uzatma süresi aşama 1.2.1 gibi PCR gerçekleştirin. Böyle rekombinasyon için doğrusallaştırılmış RN uçları ve RC plazmidler için GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT için (GGGGS) x2 ve 15 baz çifti homoloji gibi esnek bir bağlayıcı dizisi içeren çıkıntılar ile primerler kullanın.
Not: Plazmid omurgası linearize Tablo 1 'de primerler kullanılarak halinde ilgi konusu olan proteinlerin astar çıkıntılar Tablo 2'de sunulmaktadır. - PCR DigestDpn1 tepkime PCR şablonu ortadan kaldırmak için. PCR reaksiyonunun 50 ul Dpn1 0.5 ul (20 U / ul), doğrudan ekleme. 20 dakika boyunca 80 ° C de 1 saat karıştırıldı ve bir ısı durgunluk, 37 ° C'de inkübe edilir. Arka plan şablonu sonraki adımlarda devam ederse, enzim miktarını artırmak veya sindirim süresini uzatır.
- Üretici tarafından tarif edilen bir spin sütunu vasıtası ile PCR ürünleri saflaştırılır.
- Ilgi konusu genin bir RN veya RC fragmanını ihtiva eden bir linearize plazmid birleştirmek için bir bağlama bağımsız bir tepki gerçekleştirmek. Saflaştırılmış PCR ürünlerinin konsantrasyonu ölçülür: doğrusallaştırılmış plazmidin 50 ng ve enzim ön karışımın 1 ul ilgi konusu genin 50 ng birleştirmek ve iyonu giderilmiş su ile 5 ul toplam hacim getirmek. Buz üzerinde 15 dakika, bir yer için 50 ° C'de inkübe edilir ve TE tamponu 20 ul ekle.
- Güçlü bakterilerin 18 rekombinant plazmidler dönüştürün.
- O / N kültür için kolonilerin (istenildiği gibi) 2-4 + seçin. 5 mlLB suyu ve 14 ml polipropilen yuvarlak tabanlı tüp içine kanamisin (50 mg / ml stok), 5 ul ve steril bir aşılama döngü ile seçilen bakteri kolonisi add. 225 rpm ile çalkalanarak bir 37 ° de CO / N inkübe edin.
- Gliserol stoku 19 O / N kültürünün 1 ml Freeze ve üretici tarafından tarif edildiği gibi geri kalan Miniprep.
- İyi bir klonu belirlemek için sıralamayı uygulayın. Malzeme Listesi klonlama plazmid kullanılırsa, füzyon yapının tam sekansı elde etmek için gerekli ileri M13 kullanmak ve (ayrı reaksiyonlarda) ters primerleri. - Böyle Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) dan BLAST olarak bir hizalama aracı kullanarak beklenen dizisi ile karşılaştır http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- Bir Rekombinaz reaksiyonu vasıtasıyla bir ifade plazmid dizisi doğrulanmış yapıları aktarın.
- Hedef plazmid & # 75 ng ekle8212; ve 50 enzim ön karışımın 1 ul rekombinant klonlama plazmid ng ve deiyonize su ile 5 ul toplam hacim getirmek - örneğin pcDNA olarak lentiviral ambalaj 20 için geçici transfeksiyonları ve randımanlı için. Daha sonra TE tamponu 5 ul, 1 saat süre ile 25 ° C'de inkübe edin.
Not: lentiviral ambalaj ve dengeli hücre çizgisi üretimi için, puromisin direnç ve diğer neomisin, örneğin, her bir yapı için bir farklı bir hedef plazmiti kullanın. Bu kalıt aktarımlı hücrelerin iki seçilmesine olanak tanır. Ayrıca bu gibi ayarlanabilir doksisiklin ayarlı ifadesi için teto operatör ile yapısal sitomegalovirüs (CMV), yüksek ekspresyon düzeyleri için promoter veya CMV her biri için promoter, düşünün. - Yetkili bakterilerin içine 5 ul Dönüşümü ve adımlar 1.2.6 için 1.2.8 gibi plazmidleri Miniprep, ancak uygun bir antibiyotik (genellikle ampisilin) kullanarak.
- Hedef plazmid & # 75 ng ekle8212; ve 50 enzim ön karışımın 1 ul rekombinant klonlama plazmid ng ve deiyonize su ile 5 ul toplam hacim getirmek - örneğin pcDNA olarak lentiviral ambalaj 20 için geçici transfeksiyonları ve randımanlı için. Daha sonra TE tamponu 5 ul, 1 saat süre ile 25 ° C'de inkübe edin.
- Insersiyon noktasındaki fragmanları RN ve Re, ters PCR (ya da restriksiyon sindirimi) ihtiva eden plasmidler linearize. Ters PCR primerleri Tablo 1'de verilmiştir. Aşağıda yazarın laboratuarda kullanılan bir örnek PCR protokolü (Bu protokolde kullanılan kesin malzemeler için Malzeme Listesi bakınız).
- Optimal belirleyinBiFC yapılandırması.
- Co-transfeksiyonu sentezleme U2OS hücrelere plazmidler (ya da seçenek hücre).
- 8 oyuklu # 1,5 cam alt oda slayt her oyuğuna% 10 FBS ile takviye edilmiş fenol kırmızısız ve antibiyotik içermeyen DMEM 350 ul ekle. Hücrelerin bu nedenle oyuk başına Plaka yaklaşık 7.5 x 10 hücre 4 yaklaşık% 70 -90% konfluent ertesi gün vardır.
- De tercih edilen bir reaktif kullanılarak her birinde farklı konfigürasyonlara sahip kaplama, ko-transfeksiyonu ekspresyon plazmidleri sonra üretici tarafından tarif edildiği gibi bir gün.
- Her bir oyuğa, 0.6 ml tüp ve pipet serumsuz indirgenmiş ortamlarda 50 ul her bir ekspresyon plazmidinin 125 ng ekleme için yukarı ve aşağı karıştırın. Tüpün merkezine doğru doğrudan ortam içine transfeksiyon reaktifi 1 ul ekleyin. Mix ve reaksiyon 30 dakika bekletin hafifçe çalkalayın.
- Yaklaşık yarı yarıya bölme slayt her bir kuyunun medyayı azaltın. G kuyulara transfeksiyon karışımı damla damla ekleyin ve sallamakently karıştırın. 24-48 st için CO 2 37 ° C'de inkübe hücreleri ve% 5. Ortam transfeksiyondan gün sonra değiştirin.
- Aşama 2.1.4 başlayan Protokol 2'deki gibi bir floresan mikroskop görüntü hücreleri.
Not: sentezleme seviyeleri yüksek olan ve kamera PAmCherry1 nispeten düşük foton çıkışı için yeterince hassas ise, numune, standart bir floresan mikroskop görüntüsü alınabilir. Sulandırılmış PAmCherry1 molekülleri yeşil uyarım (561 nm) filtre seti ile görüntüleme öncesinde ultra viyole filtre seti (405 nm) ile aktif hale getirilebilir.
- Co-transfeksiyonu sentezleme U2OS hücrelere plazmidler (ya da seçenek hücre).
- Uygun olduğunda, etkileşim bozan ilgi konusu olan proteinlerin birinin içine bir nokta mutasyonu, örneğin, bir negatif kontrol oluşturun. Protein klonlama plasmid üzerinde bir bölge-yönlendirmeli mütajenez 21 ve seçilen konfigürasyonun mutasyona uğratılacak gerçekleştirin.
- Viral olarak yapıları paketlenmesiyle stabil bir hücre dizisi oluşturmaktanecikleri ve enfekte U2OS hücreleri (ya da tercih edilen hücre çizgisi). Bir uyarılabilir (tetrasiklin) ifade sistemi 15 için ifade BiFC uzun süre tersinmezliği bir sorun, ya da ayarlanabilir sentezleme isteniyorsa halinde görüntüleme öncesi indüklenebilir düşünün.
DİKKAT: Viral paketleme sistemlerinin son nesil büyük ölçüde çoğaltma yetkili virüs üretme olasılığını azalttı ederken virüslere çalışma Biyogüvenlik Seviye 2 olarak sınıflandırılan bazı riskler hala mevcut bulunmaktadır. Kaynaklar bulunabilir http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.- Bir lenti- veya retroviral hedef vektör 20 kullanılarak adımı yineleyin 1.2.10. 100 Midiprep için ml plazmitlerin daha saflığı O / N kültürünü artırın.
- 1. Gün Açık: Plate her yapı için bir 10 cm çanak içine yaklaşık 2 x 10 6 293T / 17 hücreleri paketlenecek.
- 2. Gün: Bir tra kullanarak bir transfeksiyon reaksiyonu hazırlayıntercih edilen ve üretici tarafından tarif edildiği gibi nsfection reajanı.
- Ambalaj plasmidler 1 ve 2 için 250 ng / ul nihai konsantrasyonları ile plazmidleri ambalaj bir ön-karışımı hazırlanmakta ve 100 ng / steril suda plazmid 3 paketlenmesi için mcL. Karıştırmak için yukarı ve aşağı 5 ml'lik bir polipropilen yuvarlak dipli tüp ve pipet 10 ambalaj plazmid ön karışım ul ve serumsuz indirgenmiş eden 1 ml'lik ortam hedef plazmitin 2,5 ug ekleyin. Tüpün merkezine doğru doğrudan ortam içine transfeksiyon reaktifi 20 ul ekle.
- Karıştırın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe yavaşça çalkalayın. Hücrelerinden yaklaşık yarım Ortamı çıkarın ve damla damla bir tarzda transfeksiyon karışımı ekleyin. Karıştırmak ve CO2 37 ° C'de inkübe etmek ve 5% yavaşça çalkalayın. Sıcaklık ve CO2 dengeleme için gevşetilmiş kapaklı bir tüp içinde levha başına ortam 10 ml inkübe edin.
- Gün 3: yavaşça öncesi inkübe medya ile ortamı değiştirmek ve returinkübatör hücrelerin n tane. Gevşetilmiş kapaklı başka bir medya tüp inkübe edin.
Syncytia veya büyük çoklu-çekirdekli hücrelerin oluşumu, paketleme iyi gidiyor bir işareti olabilir: Not. Bununla birlikte, hücreler kırılgan bir halde ve kolayca ayrılabilir. Ortam değiştirirken, yatay olacak şekilde pipet tilt ve plakanın bir kenarına ortam damla damla ilave edin. - Gün 4: bir şırınga ile medya kaldırılması ve temiz bir 50 ml tüp içine 0.45 mikron gözenek boyutu filtre ile filtreleme yoluyla virüs Hasat. Yavaşça öncesi inkübe medya ile medya değiştirin.
- Gün 5 Açık: Hasat yeniden adımda 1.5.3.3 önceden yapılması ve aynı 50 ml tüp içine ortak süzülen birleştirmek olarak. Her bir tüp virüs yoğunlaştırıcısının 6 ml ilave et ve karıştır. Virüs çökelene kadar en az 24 saat süre ile 4 ° C'de saklayın.
Not: hücrelerin sağlığı bağlı olarak, virüs 3 zaman hasat edilebilir. - 1500 xg'de santrifüj virüsü Konsantre4 ° C'de 15 dakika daha karıştırıldı. Süpernatantı aspire ve medya 250 ul pelletini. Virüs enfeksiyonu için hemen kullanılabilir veya bir yıla kadar -80 ° C 'de 50 ul alikolar içinde saklanabilir.
- Hücreler, böylece levhalar 3 x 10 5 U2OS (veya hedef), enfeksiyon için (oyuk başına% 10 FBS ile DMEM 2 mi) bir 6-yuvalı plaka içine oyuk başına hücreleri enfeksiyonu zamanında yaklaşık% 50 konfluent.
- Ertesi gün, yaklaşık 1 ml kalıntıları yani yaklaşık yarım ortamı çıkarın. Her bir yapı için konsantre virüs 50 ul Coinfect. Her bir oyuğa polibren 1 ul (8 mg / ml) eklenir. 37 ° C'de inkübe edin ve% 5 CO2. Ortam ertesi gün değiştirin ve antibiyotik seçimi öncesi bir gün daha kuluçkaya yatmaktadır.
Not: Enfeksiyon istenilen oranda bağlı olarak değişebilir eklemek virüs miktarını. Virüsler QRT-PCR kullanılarak titre edilebilir. - Enfekte hücreleri seçmek için antibiyotik ekleyin. Vi görmedim bulaşmamış hücreleri ile ayrı kuyukanarya seçiminin etkinliğini test etmek rus gerekmektedir. Seçimi tamamlandığında 2-7 gün kadar veya inkübe edin.
Not: etkili konsantrasyonları başlangıçta titre edilebilir, ama bunlar genellikle, neomisin puromycin ve 1.0 mg / ml 1,0 ug / ml'dir. - Daha büyük bir 10 cm çanak içine hücreleri genişletin ve Protokol 2'ye geçin.
- Ambalaj plasmidler 1 ve 2 için 250 ng / ul nihai konsantrasyonları ile plazmidleri ambalaj bir ön-karışımı hazırlanmakta ve 100 ng / steril suda plazmid 3 paketlenmesi için mcL. Karıştırmak için yukarı ve aşağı 5 ml'lik bir polipropilen yuvarlak dipli tüp ve pipet 10 ambalaj plazmid ön karışım ul ve serumsuz indirgenmiş eden 1 ml'lik ortam hedef plazmitin 2,5 ug ekleyin. Tüpün merkezine doğru doğrudan ortam içine transfeksiyon reaktifi 20 ul ekle.
2. Görüntüleme Sabit Hücreler
- Görüntüleme için bir örnek hazırlayın
- En az 1 saat boyunca 1 M NaOH 250 ul ilave edilerek 8 oyuklu # 1,5 cam alt odasına slayt temizleyip PBS ile iyice yıkayın.
Not: tedavi edilmemiş bölmeli lamlar tipik haliyle, yüksek bir zemin sinyali ile sonuçlanır. Ayrıca, hücreler artık NaOH ve hücre yapışması zor hale getirebilir iyice cam yüzeyi temizlemek için başarısızlık (kadar 10x olarak yıkar) duyarlı olabilir. Gerekirse, yıkadıktan sonra PBS O / N ile temizlenmelidir kamara slayt kuluçkaya yatmaktadır. Daha yüksek bir yoğunlukta kaplama duyarlı hücre hatları için,(Örneğin,% 50 -60% başlangıç konflüansa) yardımcı olabilir. - Plaka yaklaşık 5.5 x 10 4,% 10 FBS ile fenol kırmızısı içermeyen DMEM de 350 ul başına U2OS stabil ekspresyon hücreleri hücreleri sağlıklı olup görüntülerken, belirli konfluent fazla olacak şekilde.
- Böyle bir protein ifadesini uyarmak için tetrasiklin eklenmesi gibi deney için gerekli tedavileri, gerçekleştirin.
- Hemen görüntüleme önce hücreleri saptamak.
- Önce tespite, taze paraformaldehid (PFA) solüsyonu hazırlamak -% 3.7 PFA 1x PHEM% 0.1 glutaraldehit (GA) ile. 10 ml PFA çözüm için, PFA 0.37 g ağırlığında ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüp transfer. Damıtık su 1 ml, 1 M NaOH ve girdap 30 ul ekle. 70 ° C de ısı ve vorteks PFA kadar her 1-2 dakika tamamen çözülür.
- Transfer 15 ml konik tüp PFA çözündürüldü ve karışımı su damıtılmış 3,8 mi, 5 ml 2x PHEM tamponu,% 25 Tik glutaraldehid 20 ul ve vorteks ekleyin. Hazır, 2x PHEM tamponu 12'dir0 mM PIPES, 10 M KOH ile 7.0'a ayarlanmıştır pH, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA, 16 mM MgSO 4. Bu çözelti, sabitleştirici birkaç gün 4 ° C'de saklanabilir.
DİKKAT: PFA ve GA hem zararlıdır. Davlumbaz çözeltisi hazırlayın ve her iki Kimyasallarla çalışırken uygun koruyucu ekipman giyin. Solumaktan veya doğrudan cilt temasından kaçının. - Büyüme ortamı çıkarın. PBS 500 ul hızla yıkayın ve PFA fiksatif 250 ul ekleyin başına iyi. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe hücreleri.
- Örnek PFA Fiksatif çıkarın ve PBS veya görüntüleme tamponu oyuk başına (30 mM NaCI ve 20 mM MgCI2, pH 8.5 ile 100 mM Tris) 350 ul ilave edin.
- Vortex 100 nm altın parçacıkları agrega kırmak ve görüntüleme sırasında sahne sürüklenme izlemek için kuyu başına 35 ul (10x son seyreltme) ekleyin.
- En az 1 saat boyunca 1 M NaOH 250 ul ilave edilerek 8 oyuklu # 1,5 cam alt odasına slayt temizleyip PBS ile iyice yıkayın.
- Görüntü elde
- Mikroskop açın. 405 ve 561 nm lazerler Güç, ama kepenkleri tutmak(dahili veya harici) bu noktada kapattı. EMCCD Kamerayı açın ve soğumasını bekleyin. 561 nm filtreler yerinde olduğundan emin olun.
- Toplama yazılımı açın ve 100 milisaniye maruz kalma süresi ve 300 (aralık: 1 - 1000) için EMCCD kazancını ayarlayın.
- Hedefe daldırma yağı ekleyin ve mikroskop aşamasına örneği sabitleyin.
- Parlak bir alan veya 561 nm lazer biriyle (~ 1 kW / cm 2), odak noktası haline getirmek numune.
- Ras ve diğer membran proteinleri görüntüleme için 1.49 sayısal diyafram ile 60X apochromat TIRF objektif kullanmak ve TIRF yapılandırma içine mikroskop getirmek. Kapalı merkezli TIRF objektif arka diyafram isabet zaman böylece uyarma lazer ayarlayın; Bu lazer örneği ulaşan üzerine saptırmak neden olur. Kritik açı ulaşıldığında ve lazer geri yansıtılıyor kadar lazer ayar tutun. Görünümde birçok altın parçacıkları ile görüntüye bir hücre için ara. Ilgi bir bölge ayarlayınBu hücreyi (ya da hücre içinde bir bölge) ve altın parçacıkları kapsamaktadır.
Not: TIRF uyarma lazer penetrasyon derinliğini azaltır ve odak background sinyalinin out azaltır. Buna ek olarak, kayma düzeltme daha çok altın parçacıkları görünümünde daha doğru olması muhtemeldir. - Varsa, z-doğrultusunda örnek sürüklenme düzeltmek için otomatik odaklama sistemi meşgul. Görüntü odak dışında giderse Aksi takdirde, satın alma boyunca Odağı manuel olarak ayarlayabilirsiniz.
- 405 nm lazer kapalı ve (~ 1 kW / cm 2) dava yeterli aktivasyon zaten oluşup üzerinde 561 nm lazer ile edinilmesini başlayın (ifade düzeyleri yüksek olan tipik ise). Aksi halde kare başına molekül veya böylece tek moleküllerin onlarca vardır kadar gerekli, en düşük fabrika güç ayarında 405 nm lazer açın (0.02 mW veya 0.01 W / cm 2) ve (bir seferde 0,1 mW) giderek artması iyi ayrılır.
- Veri toplama, grad devam ettikçeually kabaca sabit nokta yoğunluğunu tutmak için 405 nm lazer gücünü artırmak.
Not: Alt 405 nm eksitasyon gücü, bazı PAmCherry1 önce aktif hale getirilebilir. Bu moleküllerin photobleach gibi, foto-aktifleştirilebilen PAmCherry1 molekülleri kalan nüfusu her çerçeve içinde floresan yayan molekülleri aynı yoğunluğunu korumak için yüksek bir foton akısı gerektiren azalır. - Daha fazla aktivasyon olayları aktive etmez - (10 W / cm 2 2.5) yüksek 405 nm gücü kadar görüntü elde etme devam edin.
Not: Toplam iktisap süresi tamamlama ifadesi seviyesi ve verimliliğine bağlıdır.
- Görüntüleri işlemek
Not: Görüntü işleme için birçok açık kaynak kodlu yazılım seçeneği vardır. Örnekler Gök Gürültülü (vardır https://code.google.com/p/thunder-storm/) ve QuickPALM (https://code.google.com/p / quickpalm /). Tipik veri işleme prosedürleri kısaca bir örnek olarak PALM verilerin işlenmesi için wfiread denilen özel bir Matlab paket programı kullanılarak burada gösterilmiştir. Ancak, gelecekteki revizyonlar tam burada açıklanan şeyleri takip edebilir. Diğer yazılımlar ile görüntü işleme için kullanıcı kılavuzlarına başvurun.- Görüntü işleme yazılımları (Ek Kod Dosyası) ya da en son sürümünü indirin http://www.ohsu.edu/nan. (Zaten varsayılan yoluna koymak) wfiread yazılım Matlab açın ve yükleyin.
- Ham görüntü sırasını görüntüleyin ve ilgi bölgeyi belirler. Yığının alanı seçin sol tıklayarak ve istenen alanın etrafına bir kutu sürükleyerek işlenecek. Çevrede bölgesi (yaklaşık 256x256 piksel) satın alma sırasında düşürülen değil ise, işlem süresini azaltmak için daha küçük bir alanı seçin. Bir alan seçimini kaldırmak ve tüm çerçeveyi işler için, sağ inci herhangi tıklayıne görüntüsü.
- Dilimlerinde aralığını giriniz işlenecek.
- Bir altın parçacığı (izole edilir bir şekil ve üniforma) resmin üzerine sol tıklayarak ve çevresindeki küçük bir kutu sürükleyerek seçin. Parçacık Takip altında Parça butonuna tıklayın. Bir grafik sürüklenme kapsamını gösteren, bu görüntülerin yığınının karşısında seçilen altın parçacığın konumunu göstermektedir görünecektir.
- Mümkün olduğunca çok sayıda altın parçacıkları izlemek ve birlikte izlemek olanları belirlemek için bu işlemi tekrarlayın (partiküller renk kodlu olacaktır). İdeal genel sürüklenme en az bir pikselin sırasına olduğunu.
- Bireysel bir anda birlikte bir paletli altın parçacıkları seçin ve Parçacık Takip altında Add Marker düğmesini tıklatın. Yeşil çapraz bir işaretleyici olarak eklenmiştir ve sürüklenme düzeltmek için kullanılacak olacağını belirten görünecektir.
- Biraz değerleri değiştirerek gerektiğinde Sigma Range, Pürüzsüzleştirici Range ve Eşik ayarlayın. Bul Parçacık tıklayındüğme ayarlarını test etmek için. Işlenecektir parçacıklar kutulu olacak ve olmayanlar dışı bırakılacaktır. PAmCherry1 molekülleri, yuvarlak ve parlak partiküllerin seçilmelidir.
- Yap Coord Dosya düğmesine tıklayarak görüntü işleme başlayın ve dosyayı kaydedin.
Not: Program tüm floresan noktalar bulmak, belirlenen çerçeve aralığında her karede geçmesi ve ağırlık merkezi koordinatları bulmak için Gauss uydurma gerçekleştirecektir. Bir .cor dosyası işlenmiş tek bir molekül görüntüleri tüm koordinatları ve diğer montaj parametreleri saklamak oluşturulur.
- Post-işlem görüntüleri ve PALM resmi işlemek
Not: Diğer yazılım doğrudan görüntü sonra çıkarma koordine hale getirebilir.- Matlab, 'hurma' paketi başlatmak ve yeni oluşturulan .cor dosyası yüklenemedi.
- Koordinatları kullanarak PALM görüntüyü render önce, 'localizati bireysel koordinatları (her sıralamak) 'olay. Uygun ayırma değerleri, kurulum ve fluorofor bağlı olarak değişebilir.
- PAmCherry1 için aşağıdaki değerleri kullanın: birleştiren Frame - 8; Birleştiren Uzaklık (nm) - 100; Asgari RMS - 4; Asgari Fit İyilik - 0,25; ve Max. Eksantriklik - 1.4. Bu parametrelerin ek açıklama için tartışma bölümüne bakın.
- Yüksek çözünürlüklü görüntüler render hazır koordinatlar yeni bir dizi oluşturmak için Sıralama düğmesini tıklatın.
- Böyle ham piksel boyutunda (nm), işlenmiş görüntüde istenen özellik boyutu (nm) ve işlenmiş görüntü için piksel boyutuna kadar nihai görüntünün düzgün render değerleri girin.
Not: Çiğ piksel boyutu her kurulum için tespit edilmelidir. Işlenen özellik boyutunun, isteğe göre ayarlanabilir, fakat genellikle ortalama lokalizasyon hassas göre biraz daha yüksek bir değere ayarlanır. PAmCherry1 için ortalama yerelleştirme hassas yaklaşık 18 nm, yani 20 bir özelliği boyutu - 30 nm ÖDENEK olduğunute. Not, yerelleştirme hassas fotonların tespit sayısının kare kökü ile kırınım limiti bölerek birden fazla kare üzerinden 22 ve aynı molekülün lokalizasyonu standart sapması alınarak hesaplanmıştır. Işlenmiş görüntünün piksel boyutunda ise 10 nm iyi bir başlangıç noktasıdır; Bu değer çok düşük ayarı büyütülmemiş görünümler için gereksiz yere büyük görüntü dosyalarını neden olur. - PALM görüntü oluşturmak için Render düğmesine tıklayın. Yakınlaştırma ve uzaklaştırma için şekil penceresinin araç çubuğunda +/- büyüteç simgeleri kullanın.
- İsteğe bağlı: Ripley'in K testi veya simülasyon destekli DBSCAN (SAD) 23 gibi diğer mekanizmalar kullanılarak yeniden PALM görüntüsünün gerçekleştirin küme analizi. Not: Özel hurma paketinde, Ripley'in K ve SAD analiz hem zaten inşa edilir; diğer yazılım elde edilen koordinatları için, aynı analizler ek özel komut ile gerçekleştirilebilir.
Canlı hücreler 3. Tek Molekül Takibi - Doku kültürü yüzeyi tedavi ve belirli bir kültür çanağı ihtiyaç coverglass mikroskopi yerleşim için uygun kalınlık (0.17 mm) sahip olduğundan emin olun olabilir, sıcaklık ve / veya CO2 kontrol aşaması yana Protokol 2'de anlatıldığı gibi hücreler plaka.
- Geçici bir ifadeyi yapıyor eğer hücreleri transfect ve ifade ikna etmek için böyle bir tetrasiklin gibi deney için gerekli herhangi bir tedavi gerçekleştirmek ve gerektiğinde kuluçkaya yatmaktadır. Protokol 2 de tarif edildiği gibi da aynıdır.
- Bir sahnede inkübatör kültür çanak yerleştirin. Çanak kültür çanak montaj veya ilgi yeni bir bölgeye taşıdıktan sonra her zaman stabilize sıcaklık ve CO2 konsantrasyonu kadar birkaç dakika sahnede dinlendiriniz. Bu aşamada Blok lazerler. CO 2 kontrol mevcut değilse, örneğin Leibov olarak sağ görüntüleme önce bir CO 2 bağımsız medya, değiştirmekitz L-15.
Not: Fenol kırmızısı içermeyen aracı madde, sıkıcı eşiğe için tavsiye edilir.
- Protokolde 2'deki gibi görüntü elde Ancak, uygun bir pozlama süresini (PAmCherry1 için tipik 25-50 msn) ayarlayın.
Not: yörüngeleri birbirleri ile üst üste ihlal eder, böylece molekülün yoğunluğu sabit hücreler için daha düşük olmalıdır. Moleküllerin belirtilen birkaç on yaklaşık 160 nm'lik bir piksel boyutunda, 256x256 piksel elde edilmesi için tipik bir örneğidir. 561 nm lazer güç yoğunluğu hücrelere fototoksisite azaltılması ve ortalama uzunluğu yörünge artırırken iyi bir sinyal-gürültü oranını korumak için 0.8 kW / cm2 olarak ayarlanmış. - Görüntüleri işlemek.
- Protokol 2, ya da başka bir paket ile tarif edildiği gibi wfiread paketi ile tek moleküllerin koordinatları ekstrakte edin.
- Bulunan farklı algoritmalar dayalı (SPT) paketleri izleme çeşitli tek parçacık kullanarak tek parçacık yörüngeleri yenidenBaşka bir yerde 24. Not: Alternatif olarak, bu adımı gelecekteki revizyonlar muhtemelen mevcut ev inşa Matlab paket (kullanılarak gerçekleştirilebilir http://www.ohsu.edu/nan.
- İsteğe bağlı: Rekonstrüksiyon sonrası yörüngeleri yer değiştirme ve difüzyon katsayılarını hesaplamak için bir SPT paketini 24 kullanın. Ayrıca, hedef proteinlerin difüzyon durumlarını belirlemek için izleme variational Bayes tek parçacık (vbSPT) 25 kullanın. : vbSPT Matlab paketi ve dokümantasyon kendi resmi Sourceforge sitesi adresinde bulunabilir http://vbspt.sourceforge.net/.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gösterilen BiFC PALM örnek Craf etki (RBD) (Şekil 1A) bağlayıcı Ras ile etkileşim Kras G12D mutant olduğunu. Tartışıldığı gibi Ras zar lokalizasyonu ve dolayısıyla biyolojik aktivitesini bozacak, çünkü, RN veya RC fragmanları Ras'ın C-terminaline etiketlenmemiş. Bu dört (Şekil 1B) sekizden olası kombinasyonları azalır. Bu dört kombinasyon her lentiviral enfeksiyonu ile U2OS hücrelerine dahil edilmiştir. Protokolde ayrıntılı olarak hücreler sabitlendi ve BiFC sinyalleri PALM kurulumu kullanılarak değerlendirildi. 405 nm lazer açıldığında pozitif BiFC sinyalleriyle Hücreler floresan ani artış tespit edilmiştir; 561 nm lazer görüntüleme deney boyunca oldu. Floresanstaki bu ani bir değişiklik 405 nm lazer ile aydınlatma üzerine BiFC yeniden PAmCherry1 ışık etkisi ile aktive kaynaklanmaktadır. Numunedeki birden fazla bölge bu yaklaşımı kullanarak değerlendirildiVe BiFC sinyal yoğunluğu önce piksel yoğunlukları artış ortalamasını alarak ve 405 nm lazer gelen yüksek enerjili darbe sonrası hesaplandı.
Şekil 1C görüldüğü gibi, dört olası yapılandırmaları dışında, iki konfigürasyonları (yani-RN Ras / RC-Raf RBD ve RN-Ras / Raf RBD-RC) kuvvetli BiFC sinyalleri vardı. Başka bir yapılandırma (RC-Ras / Raf RBD-RN) zayıf sinyal vardı, ve bir hiç sinyal vardı. Tüm takip eden deneyler için, RN-Ras / Raf RBD RC konfigürasyonu (Şekil 1C'de sağ üst) kullanıldı. Bir negatif kontrol olarak, Raf Ras bağlanma alanının bir nokta mutasyonu (R89L) ilave edildi ve aynı konfigürasyonu kullanılarak BiFC etkinliği test edilmiştir. Bu mutasyon, Raf Ras bağlanmasını bozmak için bilinen; sürekli olarak, mutasyon büyük BiFC sinyal (Şekil 1D) azalttı.
BiFC yoluyla üretilen PAmCherry1 molekülleri orijinaline benzer fotoaktivasyon özelliklerini gösterdi beriPAmCherry1 10, bu üst PAmCherry1 ile aynı deney ayarları kullanarak BiFC numunelerin PALM görüntüleme için izin verir. RN-Ras ve Raf RBD-RC ile enfeksiyondan sonra güçlü bir BiFC sinyali hücreleri örneğin, Palm resim Şekil 2A'da gösterilmiştir.
Büyütülmüşken (Şekil 2A alt sol ve kutulu büyütülmüş alanları ile oyuklar), tek tek moleküller ve nano ölçekli mekansal dağılımı net bir şekilde görülebilir. Unutmayın ki, bu PALM görüntüleri her nokta bir PAmCherry1 molekülü ile etiketlenen tek varsayılan Ras-Raf RBD kompleksini temsil eder. Karşılaştırma için, Şekil 2B'de sağ tarafı kümeleri tamamen belirsiz hale görüş aynı alanda, düşük çözünürlüklü görüntüleri simüle edilmiştir. Ras-Raf RBD kümelerin gözlem, Ras ve Rafnin kümelenme davranışı üzerinde önceki gözlemlerle uyumludur.
BiFC ifade canlı hücreler PAmCherry1 yeniden sayesinde, smt-PALM perfo oldubireysel Ras-Raf RBD komplekslerinin difüzyon yörüngeleri elde etmek için benzer şekilde daha önce rmed 10 tarif etmek. 561 nm ve 405 nm lazerler ile sürekli aydınlatma altında, bireysel PAmCherry1 molekülleri stokastik açın ve (kısmen photobleaching için) karanlık devletleri girmeden önce bir kaç kare sürer. Hareketsiz bir duruma (Şekil 2B, bir molekül 1) ve bir mobil durumunu (Şekil 2B, bir molekül 2): Bu süre içinde, moleküller en az iki farklı difüzyon davranışı sergilemiştir. Yörüngelerin Her iki tip çok sayıda molekülün yörüngeleri kaydedilir Şekil 2C'de gösterilen (x, y) plot net biçimde mevcut bulunmaktadır. Difüzyon devletlerin aynı heterojen dağılımı ardışık çerçeveler arasında moleküler deplasman histogram anlaşılabilir. Tipik haliyle, 10,000 - 100,000 difüzyon yörüngeleri, her bir hücre elde edilebilir; Bu sayıda t daha titiz istatistiksel analiz için izin verirO vbSPT algoritması 25 ile, örneğin, devletleri difüzyon.
Ras-Raf etkileşimi Şekil 1. BiFC PALM deney tasarımı. (A) Ras aktif Raf iş veren bir zar bağlı proteindir. Floresan olmayan bölünmüş PAmCherry1 fragmanları Ras ve Raf bağlı olduğunda, etkileşim içinde fragmanları getirir ve tamamlama fonksiyonel floresan protein ile sonuçlanan, meydana gelir. Zar lokalizasyonu bozacak, C-terminalinde Ras etiketleme yana (B), Ras-Raf BiFC PALM için test yapılandırmaları sayısı dörde sekiz düşürülmüştür. Bir TIRF mikroskop ile çekilen test konfigürasyonu ifade U2OS hücrelerinin (C) görüntüler. Her yapılandırma BiFC verimliliğini ölçmek için hücreler 405 nm ışık bir süre aynı yüksek dozda verilir561 nm ışık ile heyecanlı olmak. Raf RBD içine R89L mutasyonunu Tanıtımı (D) büyük ölçüde RN-Kras G12D / Craf RBD-RC yapılandırma BiFC sinyal azalır (C sağ üst, n = 5-8). Hata çubukları, (D) SEM bulunmaktadır. (C) 'Ölçek çubukları, 10 um. RN = PAmCherry1 N-terminal fragmanı, RC = PAmCherry1 C-terminal fragmanı ve RBD = Ras bağlama alanı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
RN-Kras G12D / Craf RBD-RC yapılandırmasını ifade U2OS hücrelerinin Şekil 2. BiFC PALM. (A) Bir bütün PALM görüntüsü yukarıda gösterilmiştir. Belirtildiği gibi alt paneller, üst görüntüde kutulu bölgelerin görüşlerini büyümektedir. Insets yüksektirİlgili büyütülmüş görünümleri kutulu bölgelerin büyütme. Bir kırınım sınırlı mikroskop ile çekilen sanki alt paneller (etiketli TIRF) sağ tarafında kendi sol görüntülerin temsilleri vardır. (B) yavaş (1) ve hızlı (2) hareketli Ras-Raf kompleksleri tasvir bir canlı hücre smt-PALM deneyden Ardışık kare. Bir hücrenin küçük bir alan içinde Ras-Raf komplekslerinin difüzyon yörüngelerini gösteren bir smt-PALM deneyden (C) Çıkış. (D) smt-PALM deneyden Ras-Raf komplekslerinin kare başına değiştirmelerin Histogram. (A) 'daki Ölçek çubukları, 5 um üst 500 nm taban, 50 nm insets ve (C), 1 um. RN = PAmCherry1 N-terminal fragmanı, RC = PAmCherry1 C-terminal fragmanı ve RBD = Ras bağlama alanı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Primer dizisi (5 'ila 3'), | |
| N-terminali tersine de sokulması için plazmid klonlanması | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| İleri N-ucunda RN | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| İleri N-ucunda RC | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| İleri C-terminalinde sokulması için plazmid klonlanması | TAAAAGGGTGGGCGCGCC |
| C-terminali tersinden RN | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| C-terminali ters RC | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
Tablo 1. PAmCherry1 fragmanlarını ihtiva eden klonlama plazmid doğrusallaştırmak için astarlar. RN ve Re içeren klonlama plazmidler N- veya fragmanlarının Cı-terminalinde insersiyon noktasında ters PCR ile linearize edilebilir. Diziler listelenen 5 '3R17 ;.
| (3 '5) İlgi primerlerin gen için Çıkmalar | |
| N-terminal ekleme RN veya RC ileri | GAGCTCGGTACCATG |
| N-terminal ekleme RN ters | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| N-terminal ekleme RC ters | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| İleri C-terminal ekleme RN | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| İleri C-terminal ekleme RC | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminali yerleştirme RN veya RC ters | GCGCCCACCCTTTTA |
Tablo Tablo 1 primerleri maç faiz primerlerin geni için 2. Çıkmalar. Ligasyon bağımsız reaksiyon için homoloji 15 baz çifti oluşturulurastar çıkıntıları. Buna ek olarak, çıkıntılar, bir (GGGGS) x2 esnek linker dizisi içerir. Esnek bağlayıcı dizisi yerine Tablo 1 'de primerlere eklenebilir. Diziler 'den 3' 5 listelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PALM sağlam biyolojik örneklerin nano ölçekli sokulmuşlardır son tek bir molekül superresolution mikroskopi tekniği ise BiFC, tespit ve hücrelerde PPIs görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir teknik, olmuştur. PALM ile BiFC kombinasyonu nanometre mekansal çözünürlükte ve tek bir molekülün duyarlılığı ile bir hücrenin içinde PPİ seçici görüntüleme elde etti. BiFC PALM her iki tekniğin yararını uzanır ve bu çalışmada gösterildiği gibi, kendi ana hücresel bağlamda PPİ moleküler ayrıntıları ortaya büyük olacağını göstermektedir. Özellikle, nanometre çözünürlük biyomedikal araştırma bir meydan okuma olmuştur moleküler ölçekte belirli PPİ mekansal ve zamansal yönetmelik, detaylı inceleme için izin verir. Daha önce de belirtildiği gibi Ancak, BiFC PALM tamamlama ve yavaş kromofor olgunlaşma tersinmezlik ile sınırlıdır.
Bölünmüş PAmCherry1 prensibi göstermek için kullanılır ve u edildiBiFC PALM bir varabilecek. PAmCherry1 yaygın mükemmel Fotofiziksel özellikleri PALM deneylerinde kullanılmıştır. PPI bağlanmış BiFC prob olarak PAmCherry1 kullanmanın bir diğer avantajı, 37 ° C'de protein sulandırma düşük arka plan ve yüksek spesifite ve verimliliktir. Bu nedenlerden dolayı, bölünmüş PAmCherry1 BiFC prob PPİ yüksek çözünürlüklü görüntüleme içeren birçok farklı biyolojik araştırmalara uygulanabilir değerli bir kaynak olması bekleniyor. PAmCherry1 bir photoconvertible floresan protein, mEos3.2 ek olarak, aynı zamanda BiFC PALM 26 için ayrıldı. Emisyon spektrumları üst üste için, mEos3.2 ve PAmCherry1 birlikte kullanılabilir, ancak, yeşil PA-FP son PPİ iki renkli nano ölçekli superresolution görüntüleme imkanı açılması, 27 bildirilmiştir.
Geleneksel BiFC gibi, BiFC PALM uygulanmasında önemli bir adımdır füzyon yapıları tasarım ve klonlama olduğunu. Aslında o kadarSekiz farklı sentezleme konstruktları klonlanabilir gerekir sekiz BiFC çiftleri BiFC ve BiFC PALM sıkıcı engelleyici değilse, işlem olabilir uygulamak için, her denemede test edilmesi gerekir. Ras-Raf örneğinde gösterildiği gibi Bununla birlikte, çoğu zaman ilgi konusu olan proteinlerin biyokimyasal ve yapısal özellikleri üzerine ön bilgi BiFC çiftlerinin azaltılmış sayıda test edilecek olan kaynaşma optimize edilmiş bir tasarımı yönlendirmek için kullanılabilir. Bu şu anda BiFC (dolayısıyla BiFC-PALM) deney çalışacak sağlamak için evrensel bir kural yoktur, dedi; çok onun hala bir sanattır.
BiFC ve BiFC PALM tipik olarak, iki protein arasındaki heterodimer oluşumunu belirlemek için kullanılır ise de, iki aday protein aynı olacaktır, bu durumda, bu yaklaşımlar kullanılarak homodimer oluşumunu çalışmak da mümkündür. Bununla birlikte, örneğin, aynı fragmanı ile, iki proteinin etkileşim ancak BiFC sinyali ile sonuçlanmaz. Her konstrukt olarak hareket rağmenBaşarılı tamamlama sonuçlanan etkileşimler tersinmezlik nedeniyle birikir olacağını ise diğer tür etkileşimleri yarışmalı inhibitörü, geri dönüşümlüdür. Her bir yapı ekspresyon düzeyleri arasında ciddi bir fark yoktur, genel olarak, sinyal bir azalma olabilir. Bu nedenle, iki yapı ifade seviyeleri endojen ekspresyonunun seviyelerde (vahşi tip ve mutant homodimer numuneleri arasındaki, örneğin) floresans yoğunlukları karşılaştırırken tespit edilmesi gerekebilir. BiFC deneyler genellikle geçici transfeksiyonları ve yapıları aşırı ekspresyonu ile yapılmaktadır Bu yüzden belki de.
Son ama en az, tüm BiFC deneyler uygun kontroller ile teyit edilmesi gerekir. BiFC sinyali varsa, sinyal (yani fragmanları ve çünkü PPI kendi sulandırma vardır) non-spesifik olduğu bir şans var. Bir negatif kontrol ya mutasyon ya da bilinen iki proteinleriBiFC sinyalin önemli bir kayıp ile sonuçlanmalıdır etkileşimi bozabilir. Böyle bir nokta mutasyon bilinmiyorsa, diğer yöntemler bu tür proteinlerin birine rekabetçi bir bağlanma partneri sokulması gibi kullanılabilir ve sinyal eşlik eden bir azalma olup olmadığını görmek.
Daha zor bir durum BiFC sinyal veya yanlış negatif bir eksikliği giderme olduğunu. Bu gibi durumlarda, bu tür Transfeksiyonlar sırasında GFP kontrol olarak klonlama işlemi sırasında pozitif kontroller dahil etmek çok önemlidir. Western blot yapıların ekspresyonu kontrol etmek için çalıştırılabilir. Bu faktörler, normal olarak ise, diğer faktörler gibi bir bağlayıcı uzunluğu ve / veya sekans, ya da farklı bir BiFC yapılandırma düşünülmelidir olarak değiştirilmesi gerekebilir.
Görüntülerin işlenmesi sırasında PALM bölümü için olduğu gibi, bir dizi parametre göz önüne alınmalıdır. Adım 2.4.2.1 koordinatları sıralama ve nihai PALM görüntüyü oluşturmak için kullanılan parametreleri açıklar. Birincidaha önce 23 açıklandığı gibi iki parametre, Kare birleştiren ve Distance birleştiren ~ arayla 0.8 sn iki yerelleştirme olaylar 100 nm mesafededir ve (100 milisaniye / karede) az 8 kare görünür eğer tanımlamak veya. Eğer öyleyse, o zaman aynı molekülden kaynaklanan kabul edilecektir ve koordinatları ortalamasını alarak birleştirilecektir. PAmCherry1 nadir görünen 0.8 sn çok daha yaşamlar Dark devletler; Uzun ömürlü karanlık halinden kurtarmak bir floroforun olay yakın mesafe yayan floresan farklı bir molekülün ayırt edilemez olduğu gibi, iki yerelleştirme olaylar kare belli bir sayısı içinde çıktı ve yalnızca aynı molekülün doğan olarak kabul edilir fiziksel mesafe. Ampirik, 8-12 kare (0,8-1,2 sn) bir 'çerçeve birleştirmek' ayarı bizim deneysel koşullar altında optimum olduğu görülmektedir. Asgari RMS uydurma genlik ve kalıntı gürültü standart sapma sonrası arasında asgari oran tanımlaruydurma. Bu değerler çıkarma koordinat sırasında .cor dosyasına kaydedilir.
Özetle, BiFC PALM BiFC ve PALM avantajlarını birleştirir ve daha önce elde edilmiş olandan çok daha ayrıntılı olarak PPİ soruşturma sağlar. Yukarıda ve uygun kontrol deneyleri ile faktörler hususlar ile, BiFC PALM biyolojik ayarları geniş bir yelpazede PPIs incelemek için yararlı bir araç olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope frame | Nikon | Ti-U | |
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | CFI Apo TIRF 60x H | |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Opto Engine | MGL-FN-561 | |
| 405 nm laser | Coherent | CUBE-405 50mW | |
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25x36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | Tokai Hit | INUBG2ATW-PLAM | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 ml tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 ml tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
References
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
- Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
- Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589 (2014).
- Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171 (2013).
- Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
- Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
- Seidman, C. E., Struhl, K., et al. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Coligan, J. E., et al. Appendix 4, 4D (2001).
- Morrison, S. L.
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
- Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
- Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).
