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Bioengineering

Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation साथ Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (BiFC-पाम)

Published: December 22, 2015 doi: 10.3791/53154
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health and Science University, 2Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 3OHSU Center for Spatial Systems Biomedicine, Oregon Health and Science University

Introduction

प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (पीपीआई) जीव विज्ञान 1 के लिए मौलिक हैं और कसकर कई समय और लंबाई पैमानों पर spatiotemporal तंत्र के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है। कोशिका झिल्ली पर संकेतन सेल पर अध्ययन, उदाहरण के लिए, विशिष्ट पीपीआई और सेलुलर प्रक्रियाओं 2 की सुविधा है कि गतिशील nanoscale, स्थानिक डिब्बों का पता चला है। इसलिए, पर्याप्त स्थानिक और लौकिक संकल्प, उच्च विशिष्टता है, और उच्च संवेदनशीलता के साथ जैविक प्रणालियों में पीपीआई की जांच करने की क्षमता जीव विज्ञान की एक यंत्रवत समझ प्राप्त करने की कुंजी है।

5 - Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरक (BiFC) subcellular संकल्प और लाइव सेल अनुकूलता 3 के साथ एक सेल में पीपीआई दृश्यमान करने के लिए कुछ मौजूदा उपकरणों में से एक है। तकनीक अपेक्षाकृत सरल है और दो गैर फ्लोरोसेंट टुकड़ों में एक प्रतिदीप्ति प्रोटीन के बंटवारे शामिल है; आनुवंशिक रूप से दो बातचीत प्रोटीन के लिए टैग और जबनिकटता में लाया, टुकड़े फ्लोरोसेंट संकेत उपज, एक पूरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए फार्म का पुनर्गठन कर सकते हैं। अच्छी तरह से डिजाइन करते समय, BiFC जांच अनायास पीपीआई के अभाव में पुनर्गठित नहीं किया जाना चाहिए। जैसे, एक BiFC परख में प्रतिदीप्ति संकेत केवल उच्च विशिष्टता के साथ पीपीआई के प्रत्यक्ष दृश्य सक्षम बनाता है जो पीपीआई की उपस्थिति में पैदा होगा। Readout के रूप में प्रतिदीप्ति का उपयोग कर का अतिरिक्त लाभ दूसरों के बीच उच्च throughput और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग assays के साथ उच्च संवेदनशीलता, subcellular संकल्प, और अनुकूलता हैं। इन लाभों के लिए, अलग माता पिता फ्लोरोसेंट प्रोटीन पर आधारित BiFC जांच की एक संख्या विकसित किया गया है। पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी पर आधारित अन्य सभी पता लगाने की तकनीक के रूप में, हालांकि, BiFC के स्थानिक संकल्प प्रकाश के विवर्तन द्वारा ~ 250 एनएम तक सीमित है। इस लिपिड राफ्ट 6 एक से पहले alluded और उदाहरण के रूप में है, जो nanoscale है, पर पीपीआई के नियमन का अध्ययन करने के लिए यह एक चुनौती बना देता हैएन डी रास nanoclusters 7, इस तरह के संकेत दे के रूप में कई सेलुलर प्रक्रियाओं को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण लंबाई पैमाने पर है।

BiFC पीपीआई 10 इमेजिंग के लिए स्थानिक संकल्प में इस सीमा पर काबू पाने के लिए Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) 8,9 के साथ संयुक्त कर दिया गया है। पाम स्टोकेस्टिक सक्रियण और एक फ्लोरोसेंट अणु की subdiffractive स्थानीयकरण के माध्यम से प्रतिदीप्ति इमेजिंग में विवर्तन सीमा में गतिरोध उत्पन्न कि हाल ही में एक superresolution माइक्रोस्कोपी तकनीक है। प्रत्येक सक्रियण चक्र में, एक फ्लोरोसेंट अणु कुछ हजार फोटॉनों करने के लिए कुछ सौ उत्सर्जन करता है और डिटेक्टर पर एक अणु की छवि को जन्म देता है। छवि के विवर्तन सीमित है जबकि (~ चौड़ाई में 250 एनएम), उसके केन्द्रक आम तौर पर पता चला फोटॉनों की संख्या के आधार पर 10-50 एनएम के आदेश पर, बहुत उच्च परिशुद्धता के साथ निर्धारित किया जा सकता है। सक्रिय करने और नमूने में प्रत्येक फ्लोरोसेंट अणु स्थानीयकृत द्वारा, एक उच्च संकल्प छवि को खंगाला जा सकता है। Performeजीवित कोशिकाओं पर डी, एक एकल कोशिका 11 से प्रोटीन प्रसार प्रक्षेप पथ के हजारों के एक अणु ट्रैकिंग (smt-) पाम आगे परमिट अधिग्रहण। महत्वपूर्ण बात है, पाम स्टोकेस्टिक सक्रियण को प्राप्त करने के लिए इस तरह के photoactivatable फ्लोरोसेंट प्रोटीन (पीए एफपीएस) के रूप में विशेष फ्लोरोसेंट जांच उपयोग करता है। BiFC और हाथ का प्रयोग फ्लोरोसेंट प्रोटीन दोनों के बाद से, वे अमीनो एसिड 159 और 160 के बीच दो टुकड़ों में, पाम के लिए PAmCherry1, आमतौर पर इस्तेमाल किया पीए एफपी बंटवारे से संयुक्त थे।

विभाजन PAmCherry1 पर आधारित BiFC प्रणाली के दो टुकड़े की सहज पुनर्गठन से कम पृष्ठभूमि संकेत से पता चलता है। आनुवंशिक रूप से बातचीत प्रोटीन की एक जोड़ी के लिए टैग, जब दो टुकड़े (आर एन = 1-159 अवशेषों, आर सी = मेट + अवशेषों 160-236) भी 37 डिग्री सेल्सियस पर और कम तापमान पर incubating के बिना पूरा PAmCherry1 प्रोटीन फार्म को कुशलता का पुनर्गठन, जो ऐसे माता-पिता mCherry के रूप में 13 अन्य BiFC जोड़े 12 के लिए मामला नहीं है। Furthermo, फिर से पुनर्गठित PAmCherry1 प्रोटीन ऐसी सटीक एक अणु स्थानीयकरण और उच्च संकल्प पाम इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं, जो दूसरों के बीच उच्च विपरीत अनुपात, मध्यम फोटोन उपज, और तेजी से photoactivation, के रूप में माता पिता PAmCherry1 की photophysical गुण, को बनाए रखा।

इस प्रोटोकॉल में, विभाजन PAmCherry1 (चित्रा 1 ए) का उपयोग करके U2OS कोशिकाओं में रास-आरएएफ बातचीत इमेजिंग के लिए BiFC-ताड़ के उपयोग में वर्णित है। पहला कदम PAmCherry1 टुकड़े (यानी, आर.एन. और आर सी) और ब्याज की प्रोटीन के बीच संलयन प्रोटीन व्यक्त करने के लिए निर्माणों डिजाइन करने के लिए है। सिद्धांत रूप में, उम्मीदवार प्रोटीन (ए और बी) के प्रत्येक जोड़ी के लिए, संलयन प्रोटीन के आठ जोड़े का परीक्षण किया जा करने के लिए कर रहे हैं: आर.एन.-ए / आर सी बी; आर.एन.-ए / बी आर सी; आर सी ए / आर एन बी; आर सी ए / बी आर एन; ए आर एन / आर सी बी; ए आर एन / बी आर सी; ए आर सी / आर एन बी; और ए आर सी / बी आर एन। इस प्रक्रिया को अक्सर खाते में उम्मीदवार प्रोटीन के संरचनात्मक या जैव रासायनिक गुण लेने के द्वारा सरल बनाया जा सकता है। रास के मामले में प्रोटीन होता हैपोस्ट-translationally सी टर्मिनल CAAX बॉक्स में संशोधित (सी = Cys; एक = स्निग्ध, एक्स = कोई भी), जिसके बाद AAX मूल भाव बंद cleaved है। इसलिए, आर.एन. या आर सी ही रास के एन टर्मिनस से इनकार किया जा सकता है; इस चार (चित्रा 1 बी) के संलयन प्रोटीन जोड़े की संख्या कम कर देता है। आरएएफ के लिए, डोमेन रास बाध्यकारी (आरबीडी; अवशेषों 51-131) का इस्तेमाल किया जाता है और दोनों छोर पर टैग किया जा सकता। इन चार संलयन विन्यास उत्पन्न किया गया: आर.एन.-क्रास / आर सी-आरएएफ आरबीडी; आर.एन.-क्रास / आरएएफ आरबीडी-आर सी; आर सी-क्रास / आर एन-आरएएफ आरबीडी; और आर सी-क्रास / आरएएफ आरबीडी आर एन।

इसके अतिरिक्त, टुकड़े और ब्याज की प्रोटीन के बीच लिंकर विचार करने की आवश्यकता होगी। के बारे में दस अमीनो एसिड की एक लचीला लिंकर अक्सर यह पूरक होते हैं करने के लिए पर्याप्त स्वतंत्रता प्रदान करता है के रूप में प्रयोग किया जाता है। एक कई क्लोनिंग साइट (एमसीएस) 14 से उत्पन्न यादृच्छिक दृश्यों सहित सफलतापूर्वक लागू किया गया है कि कई अन्य लोगों, वहाँ रहे हैं, हालांकि ऐसा ही एक लिंकर, (GGGGS) X2 है। linkers की लंबाई dependin अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती हैब्याज की प्रोटीन और उनके झुकाव जब बातचीत के आकार पर छ।

PAmCherry1 टुकड़े MCSS flanking के साथ एक छोटे से क्लोनिंग रीढ़ की हड्डी में समाहित कर रहे हैं (सामग्री सूची देखें)। ब्याज की जीन प्रतिबंध साइटों के माध्यम से या एक बंधाव स्वतंत्र विधि के साथ डाला जा सकता है। क्लोनिंग और अनुक्रम सत्यापन के बाद, अभिव्यक्ति कैसेट एक Recombinase प्रतिक्रिया, उच्च निष्ठा और उच्च दक्षता के साथ एक क्लोनिंग की प्रक्रिया का उपयोग कर एक अभिव्यक्ति वेक्टर को सौंप दिया है।

इसके बाद, जिसके परिणामस्वरूप अभिव्यक्ति निर्माणों लक्ष्य सेल लाइन को संक्रमित करने के लिए एक स्थिर सेल लाइन वांछित है, तो lentivirus में पैक, लक्ष्य सेल लाइन में ट्रांसफ़ेक्ट या कर रहे हैं। क्षणिक अभिकर्मक BiFC विन्यास के त्वरित सत्यापन के लिए अनुमति देता है, लेकिन संभावित समस्याओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए। अक्सर रसायनों का उपयोग अभिकर्मक उच्च autofluorescence, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं पर जोर दिया; जबकि कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) microsco का उपयोगPY पीपीआई कोशिका झिल्ली पर जगह ले जब रोशनी मात्रा TIRF आदर्श सीमित करके इस पृष्ठभूमि के संकेत को कम कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, क्षणिक transfections अक्सर दूर पीपीआई का पता लगाने में कलाकृतियों का कारण हो सकता है जो अंतर्जात प्रोटीन, उन लोगों से अधिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर तक ले। इसलिए, यह एक उचित BiFC विन्यास प्रारंभिक परीक्षण के माध्यम से निर्धारित किया गया है के बाद स्थिर सेल लाइनों की स्थापना की जा सिफारिश की है। स्थिर सेल लाइनों को भी डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरण 15 के माध्यम से ट्यून करने योग्य अभिव्यक्ति के लिए क्षमता है।

संक्रमण के बाद, कोशिकाओं को आमतौर पर puromycin और प्रत्येक निर्माण के लिए neomycin, एक, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ चुना जाता है। नमूना तैयार करने, छवि अधिग्रहण, और डेटा विश्लेषण के लिए बाद के चरणों प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित किया जाएगा।

इस दृष्टिकोण के साथ, रास-आरएएफ आरबीडी की BiFC-पाम छवियों में nanoscale समूहों के गठन नियमित तौर पर मनाया जाता है (2A चित्रा </ Strong>)। लगातार, रास-आरएएफ आरबीडी की श्रीमती पाम प्रक्षेप पथ प्रसार राज्यों (चित्रा 2 बी-डी) में एक विषम वितरण दिखा। इन परिणामों के रास-आरएएफ परिसरों संभावित जैविक प्रभाव के साथ, शायद monomers और समूहों के रूप में, कोशिका झिल्ली पर कई राज्यों में मौजूद है कि सुझाव देते हैं। इस काम के पारंपरिक BiFC, प्रतिदीप्ति सह स्थानीयकरण, या प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) के साथ प्राप्त करने के लिए मुश्किल होगा, जो नैनोमीटर स्थानिक संकल्प और एक अणु संवेदनशीलता के साथ कोशिकाओं में पीपीआई के चुनिंदा इमेजिंग में BiFC-हथेली की शक्ति को दर्शाता है।

BiFC प्रयोगों के डिजाइन और परिणामों की व्याख्या करते हैं, यह BiFC प्रक्रिया विभाजन PAmCherry1 सहित ज्यादातर मामलों में अपरिवर्तनीय है कि मन में रखने के लिए महत्वपूर्ण है। दो टुकड़े गठबंधन और एक पूरा PAmCherry1 प्रोटीन, दो टुकड़ों के बीच संबंध बनाने के लिए, और एक बार इस प्रकार पीपीआई स्थायी हो जाता है। इस BiFC और BiFC-पाल के उपयोग की सीमापीपीआई की गतिशीलता (यानी, बाध्यकारी कैनेटीक्स और न यह बनाई है एक बार प्रोटीन परिसर के प्रसार गतिशीलता) की निगरानी के लिए और समय पर एम भी पीपीआई परिसरों के mislocalization करने के लिए ले जा सकता है।

BiFC-पाम प्रयोगों को डिजाइन फ्लोरोसेंट प्रोटीन में निहित है कि क्रोमोफोर परिपक्वता में देरी है जब एक अतिरिक्त पहलू पर विचार करने के लिए। दो प्रोटीन बातचीत और एफपी के टुकड़े को एक साथ आने के बाद, वे आम तौर पर सेकंड (EYFP 3 के लिए 60 सेकंड के आधे समय) के आदेश पर refold। हालांकि, बाद में क्रोमोफोर परिपक्वता और फ्लोरोसेंट संकेत मिनट के आदेश पर विकसित करना। प्रतिदीप्ति विभाजन वीनस, एक तेजी से तह YFP संस्करण के पुनर्गठन के बाद 10 मिनट के भीतर पता लगाने योग्य हो सकता है, सामान्य रूप में परिपक्वता के लिए आधे समय अक्सर लगभग 60 मिनट 16 है। विभाजन PAmCherry1 समान दर है मनाया गया। इसलिए, BiFC और BiFC-पाम वास्तविक समय पीपीआई कैनेटीक्स की निगरानी के लिए वर्तमान में गरीब विकल्प हैं; अन्य मुझेऐसे झल्लाहट और एक हाल ही में विकसित dimerization निर्भर फ्लोरोसेंट प्रोटीन, 17 के रूप में thods, इस उद्देश्य के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है।

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Protocol

1. क्लोनिंग

  1. क्लोन और एक संयोजक का चयन करने के विन्यास का निर्धारण करते हैं। वे उनके उचित स्थानीयकरण को बाधित नहीं है तो एन या सी टर्मिनस पर टुकड़े के साथ टैग प्रोटीन नीचे वर्णित है। इस तरह के (GGGGS) X2 के रूप में एक लचीला लिंकर का प्रयोग करें।
  2. आनुवांशिक रूप से PAmCherry1 टुकड़े करने के लिए ब्याज की प्रोटीन टैग। एक विकल्प के रूप में, एमसीएस दृश्यों flanking के साथ टुकड़े आर.एन. (PAmCherry1 अवशेषों 1-159) और आर सी (मेट प्लस PAmCherry1 अवशेषों 160-236) युक्त सामग्री सूची में सूचीबद्ध क्लोनिंग प्लास्मिडों का उपयोग करें।
    1. प्रविष्टि के बिंदु पर टुकड़े आर.एन. और आर सी उलटा पीसीआर के साथ (या प्रतिबंध पचाने) युक्त प्लास्मिडों Linearize। उलटा पीसीआर के लिए प्राइमर 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं। नीचे लेखक की प्रयोगशाला में इस्तेमाल एक उदाहरण पीसीआर प्रोटोकॉल (इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सटीक सामग्री के लिए सामग्री सूची देखें)।
      1. पानी के साथ 50 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए लाया एक साथ पीसीआर प्रतिक्रिया, मिक्स: एक पतली दीवार के लिएएड पीसीआर ट्यूब, पानी, 2x मास्टर मिश्रण के 25 μl, आगे और रिवर्स प्राइमरों के 0.5 μl प्रत्येक (20 माइक्रोन से पतला शेयर, 0.2 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता), और टेम्पलेट का 1 एनजी जोड़ें। निम्नलिखित साइकिल चालन की स्थिति का उपयोग करें: 98 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड के लिए, 98 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्रों 7 सेकंड और 2 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस, और 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार के लिए।
    2. पीसीआर आर.एन. और आर सी टुकड़े युक्त linearized प्लास्मिडों सम्मिलन के लिए ब्याज की जीन। 68 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार समय के साथ कदम 1.2.1 के रूप में पीसीआर प्रदर्शन। इस तरह के पुनर्संयोजन के लिए linearized आर.एन. के सिरों और आर सी प्लास्मिडों को GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT के लिए (GGGGS) X2, और 15 आधार जोड़ी अनुरूपता के रूप में एक लचीला लिंकर अनुक्रम में होते हैं कि overhangs, साथ प्राइमरों का प्रयोग करें।
      नोट: प्लाज्मिड रीढ़ linearize करने के लिए 1 टेबल में प्राइमरों का उपयोग करता है, तो ब्याज की प्रोटीन के लिए प्राइमर overhangs तालिका 2 में प्रस्तुत कर रहे हैं।
    3. पीसीआर डाइजेस्टDpn1 साथ प्रतिक्रिया पीसीआर टेम्पलेट समाप्त करने के लिए। पीसीआर प्रतिक्रिया के 50 μl के लिए Dpn1 के 0.5 μl (20 यू / μl) सीधे जोड़ें। 20 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे और गर्मी निष्क्रिय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। पृष्ठभूमि टेम्पलेट बाद के चरणों में बनी रहती है, एंजाइम राशि बढ़ाने या पाचन समय लंबा।
    4. निर्माता द्वारा वर्णित के रूप में एक स्पिन स्तंभ के माध्यम से पीसीआर उत्पादों शुद्ध।
    5. ब्याज की जीन के साथ एक आर.एन. या आर सी टुकड़ा युक्त एक linearized प्लाज्मिड गठबंधन करने के लिए एक बंधाव स्वतंत्र प्रतिक्रिया प्रदर्शन। शुद्ध पीसीआर उत्पादों की एकाग्रता उपाय: linearized प्लाज्मिड के 50 एनजी और एंजाइम Premix के 1 μl के साथ ब्याज की जीन के 50 एनजी गठबंधन और विआयनीकृत पानी के साथ 5 μl के लिए कुल मात्रा लाने के लिए। बर्फ पर 15 मिनट, स्थान के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, और ते बफर के 20 μl जोड़ें।
    6. सक्षम बैक्टीरिया 18 में पुनः संयोजक प्लास्मिडों रूपांतरण।
    7. हे / एन संस्कृति के लिए कालोनियों (वांछित) के रूप में 2-4 + का चयन करें। 5 मिलीलीटर जोड़ेंलेग शोरबा और एक 14 मिलीलीटर polypropylene दौर नीचे ट्यूब में केनामाइसिन (50 मिलीग्राम / एमएल शेयर) के 5 μl, और एक निष्फल inoculating पाश के साथ चयनित बैक्टीरिया कॉलोनी को जोड़ने की। 225 rpm पर मिलाते हुए, जबकि 37 डिग्री सीओ / एन पर सेते हैं।
    8. ग्लिसरॉल शेयर 19 के लिए हे / एन संस्कृति के 1 मिलीलीटर रुक और निर्माता के रूप में वर्णित शेष Miniprep।
    9. एक अच्छा क्लोन निर्धारित करने के लिए अनुक्रमण प्रदर्शन करते हैं। माल की सूची में क्लोनिंग प्लास्मिडों का उपयोग करते हैं संलयन निर्माण की पूरी अनुक्रम प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में, आगे M13 उपयोग करें और (अलग प्रतिक्रियाओं में) प्राइमरों रिवर्स। - इस तरह के जैव प्रौद्योगिकी सूचना के लिए राष्ट्रीय केन्द्र (एन सी बी आई) से विस्फोट के रूप में एक संरेखण उपकरण का उपयोग करने की उम्मीद अनुक्रम के साथ तुलना करें http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi ।
    10. एक Recombinase प्रतिक्रिया के माध्यम से एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड अनुक्रम-सत्यापित निर्माणों स्थानांतरण।
      1. गंतव्य प्लाज्मिड & # 75 एनजी जोड़ें8212; और 50 एंजाइम Premix के 1 μl करने के लिए पुनः संयोजक क्लोनिंग प्लाज्मिड की एनजी और विआयनीकृत पानी के साथ 5 μl के लिए कुल मात्रा को लाने के - जैसे pcDNA रूप lentiviral पैकेजिंग 20 के लिए क्षणिक transfections या pLenti के लिए। तब ते बफर के 5 μl जोड़ने के लिए, 1 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
        नोट: lentiviral पैकेजिंग और स्थिर सेल लाइन पीढ़ी के लिए, puromycin प्रतिरोध और अन्य neomycin के साथ, उदाहरण के लिए, प्रत्येक निर्माण के लिए एक अलग गंतव्य प्लाज्मिड का उपयोग करें। यह transduced कोशिकाओं के दोहरे चयन के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा ऐसे ट्यून करने योग्य डॉक्सीसाइक्लिन विनियमित अभिव्यक्ति के लिए teto ऑपरेटर के साथ विधान cytomegalovirus (सीएमवी) उच्च अभिव्यक्ति के स्तर के लिए प्रमोटर, या सीएमवी के रूप में प्रत्येक के लिए प्रमोटर, पर विचार करें।
      2. सक्षम बैक्टीरिया में 5 μl रूपांतरण और कदम 1.2.6 के लिए 1.2.8 के रूप में प्लास्मिडों Miniprep, लेकिन उचित एंटीबायोटिक (आमतौर पर एम्पीसिलीन) का उपयोग।
  3. इष्टतम निर्धारण करते हैंBiFC विन्यास।
    1. सह transfect अभिव्यक्ति U2OS कोशिकाओं में प्लास्मिडों (या पसंद का सेल)।
      1. एक 8 # अच्छी तरह से 1.5 गिलास नीचे चैम्बर स्लाइड के प्रत्येक कुएं में 10% FBS के साथ पूरक फिनोल लाल मुक्त और एंटीबायोटिक मुक्त DMEM के 350 μl जोड़ें। कोशिकाओं इतनी अच्छी तरह से प्रति प्लेट के बारे में 7.5 x 10 4 कोशिकाओं के बारे में 70% -90% मिला हुआ अगले दिन हैं।
      2. अच्छी तरह से वरीय अभिकर्मक का उपयोग कर प्रत्येक में अलग अलग विन्यास के साथ चढ़ाना, सह transfect अभिव्यक्ति plasmids के बाद और निर्माता द्वारा वर्णित के रूप में दिन।
        1. प्रत्येक अच्छी तरह से, एक 0.6 मिलीलीटर ट्यूब और पिपेट में सीरम मुक्त कम कर मीडिया के 50 μl में प्रत्येक प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के 125 एनजी जोड़ने के लिए ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए। ट्यूब के केन्द्र नीचे और सीधे मीडिया में अभिकर्मक अभिकर्मक के 1 μl जोड़ें। मिश्रण और प्रतिक्रिया 30 मिनट के लिए बैठते हैं करने के लिए धीरे आंदोलन।
        2. के बारे में आधे से चैम्बर स्लाइड के प्रत्येक कुएं में मीडिया को कम करें। जी वेल्स को अभिकर्मक मिश्रण dropwise जोड़ें और हिलाently मिश्रण करने के लिए। 24-48 घंटे के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं और 5%। मीडिया अभिकर्मक के बाद दिन बदल जाते हैं।
    2. कदम 2.1.4 के साथ शुरुआत प्रोटोकॉल 2 के रूप में एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर छवि कोशिकाओं।
      नोट: अभिव्यक्ति का स्तर ऊँचा है और कैमरा PAmCherry1 की अपेक्षाकृत कम फोटान उत्पादन के लिए काफी संवेदनशील है यदि नमूना एक मानक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर imaged किया जा सकता है। पुनर्गठन PAmCherry1 अणुओं एक हरे रंग की उत्तेजना (561 एनएम) फिल्टर सेट के साथ इमेजिंग के लिए पहले एक अल्ट्रा वायलेट फिल्टर सेट (405 एनएम) के साथ सक्रिय हो सकते हैं।
  4. जहां लागू हो, बातचीत बाधित है कि ब्याज के प्रोटीन में से एक में एक बिंदु उत्परिवर्तन शुरू करने, उदाहरण के लिए, एक नकारात्मक नियंत्रण बनाने के लिए। प्रोटीन की क्लोनिंग प्लाज्मिड पर एक साइट निर्देशित उत्परिवर्तजनन 21 और चुने विन्यास की उत्परिवर्तित हो करने के लिए कार्य करें।
  5. वायरल में निर्माणों पैकेजिंग के द्वारा एक स्थिर सेल लाइन उत्पन्नकणों और संक्रमित U2OS कोशिकाओं (या पसंद का सेल लाइन)। एक inducible (टेट्रासाइक्लिन) अभिव्यक्ति प्रणाली 15 इसलिए अभिव्यक्ति BiFC के लंबे समय तक irreversibility एक मुद्दा है, या ट्यून करने योग्य अभिव्यक्ति वांछित है, तो इमेजिंग के लिए पहले प्रेरित किया जा सकता पर विचार करें।
    चेतावनी: वायरल पैकेजिंग सिस्टम की हाल ही में पीढ़ियों बहुत प्रतिकृति सक्षम वायरस के उत्पादन की संभावना को कम कर दिया है, जबकि वायरस के साथ कार्य करना जैव सुरक्षा स्तर 2 के रूप में वर्गीकृत किया गया है, कुछ जोखिम अभी भी मौजूद हैं। संदर्भ में पाया जा सकता http://www.cdc.gov/biosafety/publications/।
    1. एक lenti- या रेट्रोवायरल गंतव्य वेक्टर 20 का उपयोग दोहराएँ कदम 1.2.10। 100 एक midiprep के लिए मिलीग्राम और plasmids के लिए अधिक से अधिक शुद्धता के लिए हे / एन संस्कृति बढ़ाएँ।
    2. 1 दिन पर: प्लेट प्रत्येक निर्माण के लिए एक 10 सेमी डिश में लगभग 2 एक्स 10 6 293T / 17 कोशिकाओं से पैक किया जाना है।
    3. 2 दिन: एक टीआरए का उपयोग कर एक अभिकर्मक प्रतिक्रिया तैयारपसंद की और निर्माता के रूप में वर्णित nsfection अभिकर्मक।
      1. पैकेजिंग प्लास्मिड 1 और 2 के लिए 250 एनजी / μl के अंतिम सांद्रता के साथ प्लास्मिडों पैकेजिंग की एक Premix तैयार है, और 100 एनजी / बाँझ पानी में प्लाज्मिड 3 पैकेजिंग के लिए μl। मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे एक 5 मिलीलीटर polypropylene दौर नीचे ट्यूब और पिपेट में 10 पैकिंग प्लाज्मिड Premix की μl और सीरम मुक्त कम कर मीडिया के 1 मिलीलीटर लक्ष्य प्लाज्मिड के 2.5 माइक्रोग्राम जोड़ें। ट्यूब के केन्द्र नीचे और सीधे मीडिया में अभिकर्मक अभिकर्मक के 20 μl जोड़ें।
        1. मिक्स और 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते धीरे आंदोलन। कोशिकाओं से आधे के बारे में मीडिया को हटाने और एक dropwise ढंग से अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें। मिश्रण और सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% करने के लिए धीरे हिला। तापमान और सीओ 2 संतुलन के लिए ढीला टोपी के साथ एक ट्यूब में प्रति प्लेट मीडिया के 10 मिलीलीटर सेते हैं।
      2. 3 दिन: धीरे पूर्व incubated मीडिया के साथ मीडिया को बदलने और returइनक्यूबेटर में कोशिकाओं एन। ढीला टोपी के साथ मीडिया का एक और ट्यूब सेते हैं।
        Syncytia, या बड़ी बहु nucleated कोशिकाओं के निर्माण, पैकेजिंग अच्छी तरह से जा रहा है कि एक संकेत हो सकता है: ध्यान दें। हालांकि, कोशिकाओं को एक नाजुक स्थिति में हैं और आसानी से अलग किया जा सकता है। मीडिया बदल रहा है, यह क्षैतिज है कि इतनी pipettor का झुकाव और प्लेट के एक किनारे में मीडिया dropwise जोड़ें।
      3. 4 दिन: एक सिरिंज के साथ मीडिया को हटाने और एक स्वच्छ 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 0.45 माइक्रोन रोमकूप आकार फिल्टर के माध्यम से छान कर वायरस हार्वेस्ट। धीरे पूर्व incubated मीडिया के साथ मीडिया की जगह।
      4. दिन 5 पर: हार्वेस्ट फिर से कदम 1.5.3.3 में किया है और पहले ही 50 मिलीलीटर ट्यूब में आम छानना गठबंधन के रूप में। प्रत्येक ट्यूब वायरस concentrator के 6 मिलीग्राम और मिश्रण जोड़ें। वायरस अवक्षेप तक कम से कम 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
        नोट: कोशिकाओं के स्वास्थ्य पर निर्भर करता है, वायरस एक तीसरी बार काटा जा सकता है।
      5. 1,500 XG पर centrifuging द्वारा वायरस ध्यान लगाओ4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और मीडिया के 250 μl में गोली resuspend। वायरस के संक्रमण के लिए तुरंत इस्तेमाल किया या अप करने के लिए एक वर्ष के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 50 μl aliquots में संग्रहित किया जा सकता है।
      6. कोशिकाओं तो थाली के बारे में 3 एक्स 10 5 U2OS (या लक्ष्य) के संक्रमण के लिए अच्छी तरह से (प्रति 10% FBS के साथ DMEM के 2 मिलीलीटर) 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं, संक्रमण के समय के बारे में 50% मिला हुआ हैं।
      7. अगले दिन, के बारे में 1 मिलीलीटर रहता है तो आधे के बारे में मीडिया को हटा दें। प्रत्येक निर्माण के लिए केंद्रित वायरस के 50 μl के साथ Coinfect। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए polybrene की 1 μl (8 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ 2। मीडिया अगले दिन बदलें और एंटीबायोटिक चयन से पहले एक और दिन के लिए सेते हैं।
        नोट: संक्रमण के वांछित दर के आधार पर अलग-अलग हो सकते हैं जोड़ने के लिए वायरस की राशि। वायरस QRT- पीसीआर का उपयोग कर titrated जा सकता है।
      8. संक्रमित कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ें। छठी नहीं देखा है कि असंक्रमित कोशिकाओं के साथ अलग-अलग कुओंकैनरी चयन की प्रभावोत्पादकता की जांच करने के लिए के रूप में रस के लिए आवश्यक हैं। चयन पूरा हो गया है 2-7 दिनों के लिए, या जब तक सेते हैं।
        नोट: प्रभावी सांद्रता शुरू में titrated किया जाना चाहिए, लेकिन वे आम तौर पर neomycin के लिए puromycin और 1.0 मिलीग्राम / एमएल के लिए 1.0 माइक्रोग्राम / एमएल हैं।
      9. एक बड़े 10 सेमी डिश में कोशिकाओं का विस्तार और प्रोटोकॉल 2 के लिए आगे बढ़ें।

2. इमेजिंग तय कोशिकाओं

  1. इमेजिंग के लिए एक नमूना तैयार
    1. कम से कम 1 घंटे के लिए 1 एम NaOH के 250 μl जोड़कर एक 8 # अच्छी तरह से 1.5 गिलास नीचे चैम्बर स्लाइड साफ और पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धो लें।
      नोट: अनुपचारित कक्ष स्लाइड आम तौर पर उच्च पृष्ठभूमि संकेत में परिणाम। इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं अवशिष्ट NaOH और कोशिका आसंजन मुश्किल बना सकता है अच्छी तरह से कांच की सतह को साफ करने के लिए विफलता (के रूप में कई 10x के रूप में जलरंग) के प्रति संवेदनशील हो सकता है। यदि आवश्यक हो, धोने के बाद पीबीएस हे / एन के साथ साफ चैम्बर स्लाइड सेते हैं। एक उच्च घनत्व पर चढ़ाना संवेदनशील सेल लाइनों के लिए(उदाहरण के लिए, 50% -60% प्रारंभिक confluency) मदद मिल सकती है।
    2. प्लेट के बारे में 5.5 x 10 4 10% FBS के साथ फिनोल लाल मुक्त DMEM के कुएं में 350 μl प्रति U2OS स्थिर अभिव्यक्ति कोशिकाओं की कोशिकाओं को स्वस्थ नहीं है और जब इमेजिंग मिला हुआ खत्म हो गई हैं कि इतनी।
    3. इस तरह के प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने टेट्रासाइक्लिन जोड़ने के रूप में प्रयोग के लिए आवश्यक उपचार, प्रदर्शन करते हैं।
    4. तुरंत इमेजिंग से पहले कोशिकाओं को ठीक करें।
      1. पहले निर्धारण करने के लिए, ताजा paraformaldehyde (पीएफए) समाधान तैयार - 3.7% पीएफए ​​1x PHEM में 0.1% glutaraldehyde (जीए) के साथ। 10 मिलीलीटर पीएफए ​​समाधान के लिए, पीएफए ​​की 0.37 ग्राम वजन और एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण। आसुत जल के 1 मिलीलीटर और 1 एम NaOH और भंवर के 30 μl जोड़ें। 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी और भंवर पीएफए ​​तक हर 1-2 मिनट के लिए पूरी तरह से भंग कर रहा है।
      2. स्थानांतरण एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पीएफए ​​भंग और मिश्रण करने के लिए आसुत जल 3.8 मिलीलीटर, 5 मिलीलीटर 2x PHEM बफर, 25% glutaraldehyde के 20 μl, और भंवर जोड़ें। स्टॉक, 2x PHEM बफर 12 है0 मिमी पाइप, 10 एम KOH के साथ 7.0 करने के लिए समायोजित पीएच के साथ 50 मिमी HEPES, 20 मिमी EGTA, और 16 मिमी MgSO 4,। इस लगानेवाला समाधान कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
        चेतावनी: पीएफए ​​और जीए दोनों खतरनाक हैं। एक धूआं हुड में समाधान तैयार है और दोनों रसायनों से निपटने जब समुचित सुरक्षा उपकरण पहनने। साँस लेना या सीधे त्वचा के संपर्क से बचें।
      3. विकास के माध्यम से निकालें। पीबीएस के 500 μl के साथ जल्दी से धो लें और पीएफए ​​लगानेवाला के 250 μl जोड़ने के प्रति अच्छी तरह से। आरटी पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    5. नमूना से पीएफए ​​लगानेवाला निकालें और पीबीएस या इमेजिंग बफर प्रति अच्छी तरह से (30 मिमी NaCl और 20 मिमी 2 MgCl, पीएच 8.5 के साथ 100 मिमी Tris) के 350 μl जोड़ें।
    6. भंवर 100 एनएम सोने के कणों समुच्चय को तोड़ने और इमेजिंग के दौरान मंच बहाव पर नज़र रखने के लिए अच्छी तरह से प्रति 35 μl (10x अंतिम कमजोर पड़ने) जोड़ने के लिए।
  2. छवियों का मोल
    1. माइक्रोस्कोप चालू करें। 405 और 561 एनएम लेज़रों पर पावर, लेकिन शटर रखना(आंतरिक या बाह्य) इस बिंदु पर बंद हुआ। EMCCD कैमरा चालू करें और इसे शांत करने के लिए अनुमति देते हैं। 561 एनएम फिल्टर जगह में हैं सुनिश्चित करें।
    2. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें और 100 मिसे के लिए जोखिम समय और 300 (सीमा 1 - 1000) के लिए EMCCD लाभ निर्धारित किया है।
    3. उद्देश्य के लिए विसर्जन के तेल जोड़ें और माइक्रोस्कोप चरण के लिए नमूना सुरक्षित है।
    4. उज्ज्वल क्षेत्र या पर 561 एनएम लेजर के साथ या तो (~ 1 किलोवाट / 2 सेमी), ध्यान में नमूना लाने के लिए।
    5. रास और अन्य झिल्ली प्रोटीन इमेजिंग के लिए, 1.49 संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 60x apochromat TIRF उद्देश्य का उपयोग करें और TIRF विन्यास में माइक्रोस्कोप लाने के लिए। इसे बंद केन्द्रित TIRF उद्देश्य के पीछे एपर्चर मार जब इतना है कि उत्तेजना लेजर समायोजित; इस लेजर नमूना पहुंचने पर से ध्यान हटाने के लिए कारण बनता है। महत्वपूर्ण कोण तक पहुँच जाता है और लेजर वापस परिलक्षित किया जा रहा है जब तक लेजर का समायोजन रखें। दृश्य में कई सोने के कणों के साथ छवि के लिए एक सेल के लिए खोजें। ब्याज की एक क्षेत्र सेट करेंकि सेल (या कोशिका के भीतर एक क्षेत्र) और सोने के कणों encloses।
      नोट: TIRF उत्तेजना लेजर के प्रवेश गहराई कम हो जाती है और ध्यान केंद्रित पृष्ठभूमि संकेत से बाहर कम कर देता है। इसके अतिरिक्त, बहाव सुधार अधिक सोने के कणों को ध्यान में रखते हैं, जब और अधिक सटीक होने की संभावना है।
    6. यदि उपलब्ध हो तो, जेड दिशा में नमूना बहाव के लिए सही करने के लिए ऑटोफोकस प्रणाली संलग्न हैं। छवि को ध्यान से बाहर चला जाता है, तो अन्यथा, अधिग्रहण के दौरान मैन्युअल फोकस समायोजित करें।
    7. 405 एनएम लेजर बंद और (~ 1 किलोवाट / 2 सेमी) के मामले में पर्याप्त सक्रियण में पहले से ही हो रहा है पर 561 एनएम लेजर के साथ अधिग्रहण शुरू (अभिव्यक्ति का स्तर ऊँचा है, आम तौर पर करते हैं)। अन्यथा फ्रेम प्रति अणुओं या तो यह है कि एकल अणुओं के कई दसियों देखते हैं जब तक आवश्यक के रूप में, सबसे कम कारखाने सत्ता की स्थापना पर 405 एनएम लेजर मोड़ पर (0.02 मेगावाट या 0.01 डब्ल्यू / सेमी 2) और (एक समय में 0.1 मेगावाट) धीरे-धीरे वृद्धि अच्छी तरह से अलग हो रहे हैं।
    8. डाटा अधिग्रहण, ग्रैड जारी हैually मोटे तौर पर स्थिर मौके घनत्व रखने के लिए 405 एनएम लेजर शक्ति में वृद्धि।
      नोट: कम 405 एनएम उत्तेजना शक्ति, कुछ PAmCherry1 पहले से ही सक्रिय हो सकते हैं। इन अणुओं photobleach के रूप में, photoactivatable PAmCherry1 अणुओं शेष की आबादी हर फ्रेम में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन अणुओं का एक ही घनत्व को बनाए रखने के लिए एक उच्च फोटॉन प्रवाह की आवश्यकता कम हो जाती है।
    9. अधिक सक्रियण की घटनाओं को सक्रिय नहीं करता है - (10 डब्ल्यू / 2 सेमी 2.5) उच्च 405 एनएम सत्ता तक छवि अधिग्रहण जारी रखें।
      नोट: कुल अधिग्रहण समय पूरक की अभिव्यक्ति के स्तर और क्षमता पर निर्भर करता है।
  3. छवियों की प्रक्रिया
    नोट: छवि प्रसंस्करण के लिए कई खुला स्रोत सॉफ्टवेयर विकल्प हैं। उदाहरण गरज़ (हैं https://code.google.com/p/thunder-storm/ ) और QuickPALM ( https://code.google.com/पी / quickpalm /)। ठेठ डेटा प्रसंस्करण प्रक्रिया संक्षेप में एक उदाहरण के रूप में पाम डेटा के प्रसंस्करण के लिए wfiread नामक एक कस्टम मैटलैब पैकेज का उपयोग यहाँ सचित्र हैं। हालांकि, भविष्य के संशोधन वास्तव में यहाँ वर्णित है क्या पालन नहीं हो सकता। अन्य सॉफ्टवेयर के साथ छवि प्रसंस्करण के लिए, उपयोगकर्ता दस्तावेजों को देखें।
    1. इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर (पूरक कोड फ़ाइल) या कम से नवीनतम संस्करण को डाउनलोड http://www.ohsu.edu/nan । (पहले से ही डिफ़ॉल्ट पथ में डाल दिया जाता है) wfiread सॉफ्टवेयर मैटलैब खोलें और लोड।
    2. कच्चे छवि अनुक्रम देखें और हित के क्षेत्र का निर्धारण। ढेर के क्षेत्र का चयन करें क्लिक छोड़ दिया और वांछित क्षेत्र के चारों ओर एक बॉक्स को खींच कर कार्रवाई की जा करने के लिए। हित के क्षेत्र के बारे में (256x256 पिक्सल के लिए) के अधिग्रहण के दौरान कम नहीं था, तो गणना समय को कम करने के लिए एक छोटे क्षेत्र का चयन करें। एक क्षेत्र का चयन रद्द और पूरे फ्रेम प्रक्रियाओं के लिए, सही वीं में कहीं भी क्लिक करेंई छवि।
    3. तख्ते की सीमा में प्रवेश संसाधित करने के लिए।
    4. एक सोने के कण (अलग है कि एक और आकृति में एक समान) छवि पर क्लिक छोड़ दिया द्वारा और इसके चारों ओर एक छोटा सा बॉक्स को खींच का चयन करें। कण ट्रैकिंग के तहत, ट्रैक बटन पर क्लिक करें। एक ग्राफ बहाव की हद तक का चित्रण, कि छवियों के ढेर भर में चयनित सोने के कण की स्थिति से पता चलता दिखाई देंगे।
    5. संभव के रूप में कई सोने के कणों को ट्रैक और एक साथ ट्रैक है कि लोगों को निर्धारित करने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं (कणों रंग कोडित) हो जाएगा। आदर्श रूप में समग्र बहाव अधिक से अधिक एक पिक्सेल के आदेश पर है।
    6. व्यक्तिगत रूप से एक समय में एक साथ एक नज़र रखी है कि सोने के कणों का चयन और कण ट्रैकिंग के तहत ऐड मार्कर बटन पर क्लिक करें। एक ग्रीन क्रॉस यह एक मार्कर के रूप में जोड़ा गया है और बहाव के लिए सही करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि वाचक दिखाई देंगे।
    7. थोड़ा बदलते मूल्यों से आवश्यक रूप सिग्मा रेंज, चौरसाई रेंज और दहलीज को समायोजित करें। ढूँढें कण क्लिक करेंबटन सेटिंग्स का परीक्षण करने के लिए। कार्रवाई की जाएगी कि कणों बॉक्सिंग किया जाएगा और नहीं कर रहे हैं कि उन लोगों को बाहर छोड़ दिया जाएगा। PAmCherry1 अणुओं, अपेक्षाकृत दौर और चमकीले हैं कि कणों का चयन किया जाना चाहिए।
    8. मेक Coord फ़ाइल बटन पर क्लिक करके छवियों प्रसंस्करण शुरू और फ़ाइल सहेजें।
      नोट: इस कार्यक्रम में सभी फ्लोरोसेंट स्पॉट खोजने, परिभाषित फ्रेम सीमा के भीतर प्रत्येक फ्रेम के माध्यम से जाना है, और केन्द्रक निर्देशांक लगाने के लिए गाऊसी ढाले प्रदर्शन करेंगे। एक .cor फ़ाइल संसाधित एक अणु छवियों के सभी निर्देशांक और अन्य फिटिंग के मापदंडों के भंडारण उत्पन्न हो जाएगा।
  4. बाद प्रक्रिया छवियों और पाम छवि प्रस्तुत करना
    नोट: अन्य सॉफ्टवेयर सीधे छवि के बाद निकासी का समन्वय प्रदान कर सकते हैं।
    1. मैटलैब में, 'खजूर' पैकेज शुरू करने और अभी बनाया .cor फ़ाइल लोड।
    2. निर्देशांक का उपयोग पाम छवि प्रतिपादन करने से पहले, एक 'localizati से अलग-अलग निर्देशांक (प्रत्येक प्रकार) 'घटना पर। इष्टतम छँटाई मूल्यों की स्थापना और फ्लोरोफोरे के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
      1. PAmCherry1 लिए, निम्न मान का उपयोग करें: संयोजन फ़्रेम - 8; संयोजन दूरी (एनएम) - 100; न्यूनतम आरएमएस - 4; न्यूनतम फ़िट हे भगवान - 0.25; और मैक्स। सनक - 1.4। इन मापदंडों के अतिरिक्त स्पष्टीकरण के लिए चर्चा अनुभाग देखें।
    3. उच्च संकल्प छवियों प्रतिपादन के लिए तैयार निर्देशांक का एक नया सेट उत्पन्न करने के लिए क्रमबद्ध बटन पर क्लिक करें।
    4. इस तरह के कच्चे पिक्सेल आकार (एनएम), प्रदान की छवि में वांछित सुविधा आकार (एनएम), और प्रदान की छवि के लिए पिक्सेल आकार के रूप में अंतिम छवि के समुचित प्रतिपादन के लिए मान दर्ज करें।
      नोट: कच्चे पिक्सेल आकार प्रत्येक स्थापना के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। प्रदान की सुविधा आकार मनमाने ढंग से स्थापित किया जा सकता है, लेकिन आम तौर पर औसत स्थानीयकरण परिशुद्धता तुलना में थोड़ा अधिक एक मूल्य पर सेट किया जाता है। PAmCherry1 के लिए, औसत स्थानीयकरण परिशुद्धता लगभग 18 समुद्री मील दूर है, इसलिए 20 की एक विशेषता आकार - 30 एनएम appropria हैते। ध्यान से, स्थानीयकरण परिशुद्धता फोटॉनों का पता लगाया संख्या का वर्गमूल साथ विवर्तन सीमा को विभाजित करके कई फ्रेम में 22 और न ही अणु के स्थानीयकरण के मानक विचलन लेने से गणना की गई थी। प्रदान की छवि के पिक्सेल आकार के रूप में, 10 एनएम एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है; बहुत कम इस मूल्य की स्थापना unmagnified विचारों के लिए अनावश्यक रूप से बड़ी छवि फ़ाइलों में परिणाम होगा।
    5. पाम छवि को उत्पन्न करने के लिए प्रस्तुत बटन पर क्लिक करें। में और बाहर ज़ूम करने के लिए आंकड़ा विंडो के उपकरण पट्टी में +/- शीशा माउस का प्रयोग करें।
    6. वैकल्पिक: रिप्ले की कश्मीर परीक्षण या इस तरह के अनुकरण सहायता प्राप्त DBSCAN (एसएडी) के रूप में 23 अन्य तंत्र या तो उपयोग खंगाला पाम छवि का प्रदर्शन करना क्लस्टर विश्लेषण। नोट: कस्टम हथेली पैकेज में, Ripley है कश्मीर और शिरोमणि अकाली दल के विश्लेषण दोनों पहले से ही में बनाया जाता है; अन्य सॉफ्टवेयर से उत्पन्न निर्देशांक के लिए वही विश्लेषण अतिरिक्त कस्टम स्क्रिप्ट के साथ किया जा सकता है।
    5. जीवित कोशिकाओं में 3. एकल अणु ट्रैकिंग

    1. टिशू कल्चर सतह का इलाज और एक निश्चित संस्कृति डिश की आवश्यकता होती है coverglass माइक्रोस्कोपी स्थापना के लिए उपयुक्त मोटाई (0.17 मिमी) यकीन है कि यह सुनिश्चित हो सकता है तापमान और / या सीओ 2 नियंत्रित मंच के बाद से प्रोटोकॉल 2 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं थाली।
      1. एक क्षणिक अभिव्यक्ति कर रही है, तो कोशिकाओं Transfect और अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए इस तरह के टेट्रासाइक्लिन, के रूप में प्रयोग के लिए आवश्यक किसी भी उपचार करते हैं, और आवश्यक के रूप में सेते हैं। प्रोटोकॉल 2 में वर्णित के रूप में यह भी एक ही है।
      2. एक मंच पर इनक्यूबेटर पर संस्कृति डिश रखें। पकवान संस्कृति डिश बढ़ते या ब्याज का एक नया क्षेत्र में जाने के बाद हर बार स्थिर तापमान और सीओ 2 एकाग्रता जब तक कुछ मिनट के लिए मंच पर तय है। इस कदम पर ब्लॉक लेज़रों। सीओ 2 नियंत्रण उपलब्ध नहीं है, तो इस तरह के Leibov के रूप में सही इमेजिंग से पहले एक सीओ 2 स्वतंत्र मीडिया, के लिए बदलitz के एल -15।
        नोट: phenol लाल मुक्त मध्यम निराशाजनक पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए सिफारिश की है।
    2. प्रोटोकॉल 2 के रूप में छवियों का मोल हालांकि, एक उपयुक्त समय जोखिम (PAmCherry1 के लिए आम तौर पर 25-50 मिसे) की स्थापना की।
      नोट: प्रक्षेप पथ एक दूसरे के साथ अतिव्यापी बिना दर्ज किया जा सकता है, ताकि अणु घनत्व तय की कोशिकाओं के लिए की तुलना में कम होना चाहिए। अणुओं की निर्दिष्ट कुछ दसियों के बारे में 160 एनएम के एक पिक्सेल आकार में एक 256x256 पिक्सेल अधिग्रहण के लिए विशिष्ट है। 561 एनएम लेजर शक्ति घनत्व कोशिकाओं को phototoxicity कम और औसत प्रक्षेपवक्र लंबाई में वृद्धि करते हुए एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात को बनाए रखने के लिए 0.8 किलोवाट / 2 सेमी करने के लिए स्थापित किया गया था।
    3. छवियों की प्रक्रिया।
      1. प्रोटोकॉल 2, में या किसी अन्य पैकेज के साथ वर्णित के रूप में wfiread पैकेज के साथ एकल अणुओं के निर्देशांक निकालें।
      2. पाया अलग एल्गोरिदम के आधार पर (एसपीटी) संकुल ट्रैकिंग विभिन्न एकल कण का उपयोग कर एक कण प्रक्षेप पथ का पुनर्निर्माणकहीं और 24। नोट: वैकल्पिक रूप से, इस कदम पर भविष्य के संशोधन में संभवतः उपलब्ध घर बनाया मैटलैब पैकेज (का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है http://www.ohsu.edu/nan।
      3. वैकल्पिक: पुनर्निर्माण के बाद, प्रक्षेप पथ से विस्थापन और प्रसार स्थिरांक की गणना करने के लिए एक एसपीटी पैकेज 24 का उपयोग करें। इसके अतिरिक्त, लक्ष्य प्रोटीन का प्रसार राज्यों का निर्धारण करने के लिए ट्रैकिंग परिवर्तन संबंधी Bayes एकल कण (vbSPT) 25 का उपयोग करें। : vbSPT मैटलैब पैकेज और प्रलेखन इसकी आधिकारिक Sourceforge साइट पर पाया जा सकता है http://vbspt.sourceforge.net/।

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Representative Results

दिखाया BiFC-पाम उदाहरण craf के डोमेन (आरबीडी) (चित्रा 1 ए) बाध्यकारी रास के साथ बातचीत के क्रास G12D उत्परिवर्ती है। चर्चा के रूप में यह रास की झिल्ली स्थानीयकरण और इसलिए जैविक गतिविधि को बाधित होता है, क्योंकि आर.एन. या आरसी टुकड़े रास की सी टर्मिनस के लिए टैग नहीं कर रहे थे। यह चार (चित्रा 1 बी) के लिए आठ से संभव संयोजनों कम कर दिया। इन चार संयोजन से प्रत्येक lentiviral संक्रमण का उपयोग कर U2OS कोशिकाओं में पेश किया गया था। प्रोटोकॉल में विस्तृत रूप में कोशिकाओं को तय किया गया है, और BiFC संकेतों एक पाम सेटअप का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया। 405 एनएम लेजर पर दिया गया था जब सकारात्मक BiFC संकेतों के साथ कोशिकाओं प्रतिदीप्ति में अचानक वृद्धि से पहचान की गई है; 561 एनएम लेजर इमेजिंग प्रयोग के दौरान किया गया था। प्रतिदीप्ति में इस अचानक परिवर्तन 405 एनएम लेजर के साथ रोशनी पर BiFC-पुनर्गठन PAmCherry1 के photoactivation की वजह से है। नमूने में कई क्षेत्रों में इस दृष्टिकोण का उपयोग का मूल्यांकन किया गयाऔर BiFC संकेत तीव्रता से पहले पिक्सेल तीव्रता में वृद्धि के औसत से और 405 एनएम लेजर से एक उच्चस्तरीय नाड़ी के बाद गणना की गई।

चित्रा 1C में देखा, चार संभावित विन्यास से बाहर, दो विन्यास (अर्थात्-आर.एन. रास / आर सी-आरएएफ आरबीडी और आर एन-रास / आरएएफ आरबीडी-आर सी) मजबूत BiFC संकेतों था। एक अन्य विन्यास (आर सी-रास / आरएएफ आरबीडी-आर एन) के कमजोर संकेत था, और एक कोई संकेत नहीं था। बाद के सभी प्रयोगों के लिए, आर एन-रास / आरएएफ आरबीडी-आर सी विन्यास (चित्रा 1C में ऊपरी दाहिने) का इस्तेमाल किया गया था। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, आरएएफ की रास बाध्यकारी डोमेन में एक बिंदु उत्परिवर्तन (R89L) पेश किया गया था और एक ही विन्यास का उपयोग BiFC दक्षता परीक्षण किया गया था। इस उत्परिवर्तन आरएएफ रास के लिए बाध्य को बाधित करने के लिए जाना जाता था; लगातार उत्परिवर्तन बहुत BiFC संकेत (चित्रा -1) कम कर दिया।

BiFC के माध्यम से उत्पन्न PAmCherry1 अणुओं मूल के समान photoactivation के गुण से पता चला है के बाद सेPAmCherry1 10, यह माता पिता PAmCherry1 साथ के रूप में एक ही प्रयोगात्मक सेटिंग्स का उपयोग BiFC नमूनों की हथेली इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। आर एन-रास और आरएएफ आरबीडी-आर सी के साथ संक्रमण के बाद मजबूत BiFC संकेत के साथ कोशिकाओं का एक उदाहरण पाम की छवि चित्र 2A में दिखाया गया है।

में तेजी से बढ़ी जब (2A चित्रा नीचे छोड़ दिया और बॉक्सिंग बढ़ाया क्षेत्रों के साथ insets), व्यक्तिगत अणुओं और उनके nanoscale स्थानिक वितरण स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। ध्यान से, इन पाम छवियों में प्रत्येक डॉट एक PAmCherry1 अणु के साथ टैग एक ख्यात रास-आरएएफ आरबीडी जटिल प्रतिनिधित्व करता है। तुलना के लिए, चित्रा 2 बी के दाईं ओर समूहों पूरी तरह से अस्पष्ट बन गया है जहां देखने का एक ही क्षेत्र की कम संकल्प छवियों नकली था। रास-आरएएफ आरबीडी समूहों के अवलोकन के रास और आरएएफ की क्लस्टरिंग व्यवहार पर पिछले टिप्पणियों के अनुरूप है।

BiFC व्यक्त जीवित कोशिकाओं PAmCherry1 पुनर्गठन के साथ, श्रीमती-पाम perfo था, व्यक्तिगत रास-आरएएफ आरबीडी परिसरों के प्रसार प्रक्षेप पथ प्राप्त करने के लिए rmed इसी तरह पहले 10 में वर्णित करने के लिए। 561 एनएम और 405 एनएम लेज़रों के साथ सतत रोशनी के तहत अलग-अलग PAmCherry1 अणुओं प्रसंभात्य पर स्विच और (कारण भाग में photobleaching के लिए) अंधेरे राज्यों में प्रवेश करने से पहले कुछ फ्रेम पिछले। एक स्थिर राज्य (चित्रा 2 बी, अणु 1) और एक मोबाइल राज्य (चित्रा 2 बी, अणु 2): समय की इस अवधि में, अणु कम से कम दो अलग प्रसार व्यवहार का प्रदर्शन किया। प्रक्षेप पथ के दोनों प्रकार के कई अणुओं के प्रक्षेप पथ दर्ज की गई हैं जहां चित्रा -2 में दिखाया गया है (एक्स, वाई) साजिश में स्पष्ट रूप से मौजूद हैं। प्रसार राज्यों का एक ही विषम वितरण लगातार फ्रेम के बीच आणविक विस्थापन के हिस्टोग्राम से अनुमान लगाया जा सकता है। आमतौर पर, 10,000 - 100,000 प्रसार प्रक्षेप पथ प्रत्येक कोशिका से प्राप्त किया जा सकता है; यह बड़ी संख्या में टी के और अधिक कठोर सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए अनुमति देता हैवह vbSPT एल्गोरिथ्म 25 के साथ उदाहरण के लिए, राज्यों प्रसार।

आकृति 1
रास-आरएएफ बातचीत का चित्रा 1. BiFC-पाम प्रयोगात्मक डिजाइन। (ए) रास जब सक्रिय आरएएफ रंगरूटों कि एक झिल्ली बाध्य प्रोटीन होता है। गैर फ्लोरोसेंट विभाजन PAmCherry1 टुकड़े रास और आरएएफ से जुड़े होते हैं, बातचीत के साथ टुकड़े लाता है और पूरक एक कार्यात्मक फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जिसके परिणामस्वरूप होता है। अपनी झिल्ली स्थानीयकरण को बाधित करेगा अपनी सी टर्मिनस पर रास टैगिंग के बाद से (बी), रास-आरएएफ BiFC-पाम के लिए परीक्षण किया विन्यास की संख्या 8-4 कम हो गया था। एक TIRF माइक्रोस्कोप के साथ लिया परीक्षण किया विन्यास व्यक्त U2OS कोशिकाओं (सी) छवियां। प्रत्येक विन्यास की BiFC दक्षता गेज करने के लिए, कोशिकाओं 405 एनएम प्रकाश, जबकि का एक ही उच्च खुराक दी जाती है561 एनएम प्रकाश के साथ उत्साहित किया जा रहा। आरएएफ आरबीडी में R89L उत्परिवर्तन का परिचय (डी) बहुत आर.एन.-क्रास G12D / craf आरबीडी-आर सी विन्यास की BiFC संकेत कम (सी में ऊपरी सही, एन = 5-8)। त्रुटि सलाखों (डी) में SEM हैं। (सी) में स्केल सलाखों, 10 माइक्रोन। आर एन = PAmCherry1 एन टर्मिनल टुकड़ा, आर सी = PAmCherry1 सी टर्मिनल टुकड़ा है, और आरबीडी = रास बाध्यकारी डोमेन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
आर.एन.-क्रास G12D / craf आरबीडी-आर सी विन्यास व्यक्त U2OS कोशिकाओं की चित्रा 2. BiFC-पाम। (ए) एक पूरे पाम छवि के ऊपर दिखाया गया है। संकेत के रूप में कम पैनल ऊपरी छवि में बॉक्सिंग क्षेत्रों के विचारों बढ़ाया जाता है। Insets अधिक कर रहे हैंसंबंधित बढ़ाया विचारों में बॉक्सिंग क्षेत्रों के आवर्धन। एक विवर्तन सीमित माइक्रोस्कोप के साथ लिया के रूप में हालांकि कम पैनल (लेबल TIRF) के दाईं ओर उनके बाएँ पर छवियों का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। (बी) के धीमी गति से (1) और तेजी से (2) चलती रास-आरएएफ परिसरों को दर्शाती है कि एक जीवित कोशिका श्रीमती पाम प्रयोग से लगातार फ्रेम। एक सेल के एक छोटे से क्षेत्र के भीतर रास-आरएएफ परिसरों के प्रसार प्रक्षेप पथ दिखा एक श्रीमती पाम प्रयोग से (सी) आउटपुट। (डी) एक श्रीमती पाम प्रयोग से रास-आरएएफ परिसरों के फ्रेम प्रति विस्थापन की हिस्टोग्राम। (ए) में स्केल सलाखों, 5 माइक्रोन शीर्ष, 500 एनएम तल, 50 एनएम insets, और (सी), 1 माइक्रोन। आर एन = PAmCherry1 एन टर्मिनल टुकड़ा, आर सी = PAmCherry1 सी टर्मिनल टुकड़ा है, और आरबीडी = रास बाध्यकारी डोमेन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्राइमर अनुक्रम (5 'से 3')
एन टर्मिनस रिवर्स में प्रविष्टि के लिए प्लाज्मिड क्लोनिंग CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC
आगे एन टर्मिनस पर आर.एन. GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA
आगे एन टर्मिनस पर आर.सी. GGCGCCCTGAAGGGCGA
आगे सी टर्मिनस पर प्रविष्टि के लिए प्लाज्मिड क्लोनिंग TAAAAGGGTGGGCGCGCC
सी टर्मिनस रिवर्स से आर.एन. GTCCTCGGGGTACATCCGCTC
सी टर्मिनस रिवर्स से आर.सी. CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG

तालिका 1 PAmCherry1 टुकड़े युक्त क्लोनिंग प्लास्मिडों linearizing के लिए प्राइमर। आर.एन. और आर सी युक्त क्लोनिंग प्लास्मिडों एन या टुकड़े के सी टर्मिनस पर या तो प्रविष्टि के बिंदु पर उलटा पीसीआर के साथ linearized जा सकता है। दृश्यों सूचीबद्ध हैं 5 '3R के लिए17 ;.

('3' को 5) ब्याज प्राइमरों के जीन के लिए overhangs
एन टर्मिनल प्रविष्टि आर.एन. या आर सी आगे GAGCTCGGTACCATG
एन टर्मिनल प्रविष्टि आर.एन. रिवर्स ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC
एन टर्मिनल प्रविष्टि आर सी रिवर्स ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC
आगे सी टर्मिनल प्रविष्टि आर.एन. ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT
आगे सी टर्मिनल प्रविष्टि आर.सी. GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT
सी टर्मिनल प्रविष्टि आर.एन. या आरसी रिवर्स GCGCCCACCCTTTTA

तालिका तालिका 1 प्राइमरों है कि मैच के हित प्राइमरों के जीन के लिए 2. overhangs। बंधाव स्वतंत्र प्रतिक्रिया के लिए अनुरूपता के 15 आधार जोड़े उत्पन्न होता हैप्राइमर overhangs से। इसके अतिरिक्त, overhangs एक (GGGGS) X2 लचीला लिंकर के लिए अनुक्रम में शामिल हैं। लचीला लिंकर अनुक्रम बजाय तालिका 1 में प्राइमरों के लिए जोड़ा जा सकता है। दृश्यों '3' को 5 में सूचीबद्ध हैं।

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Discussion

पाम बरकरार जैविक नमूने के nanoscale इमेजिंग सक्षम बनाता है कि हाल ही में एक ही अणु superresolution माइक्रोस्कोपी तकनीक है, जबकि BiFC, का पता लगाने और कोशिकाओं में पीपीआई visualizing के लिए एक सामान्य तकनीक का इस्तेमाल किया गया है। हथेली के साथ BiFC के संयोजन नैनोमीटर स्थानिक संकल्प और एक अणु संवेदनशीलता के साथ एक सेल के अंदर पीपीआई के चुनिंदा इमेजिंग हासिल की। BiFC-पाम दोनों तकनीकों की उपयोगिता फैली हुई है, और इस काम में प्रदर्शन के रूप में, उनके पैतृक सेलुलर संदर्भ में पीपीआई की आणविक विवरण का खुलासा करने में बहुत वादा दिखाता है। विशेष रूप से, नैनोमीटर संकल्प जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में एक चुनौती रहा है जो आणविक पैमाने पर विशिष्ट पीपीआई के स्थानिक और लौकिक विनियमन, की विस्तृत जांच के लिए अनुमति देता है। पहले उल्लेख किया है लेकिन, जैसा कि BiFC-पाम पूरक और धीमी गति से क्रोमोफोर परिपक्वता के irreversibility द्वारा सीमित है।

विभाजन PAmCherry1 सिद्धांत का प्रदर्शन किया और यू थाBiFC-ताड़ के tility। PAmCherry1 व्यापक रूप से अपनी उत्कृष्ट photophysical गुण के लिए पाम प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है। पीपीआई करने के लिए मिलकर जब BiFC जांच के रूप में PAmCherry1 का उपयोग करने का एक अतिरिक्त लाभ 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन पुनर्गठन में कम पृष्ठभूमि और उच्च विशिष्टता और दक्षता है। इन कारणों के लिए, विभाजन PAmCherry1 BiFC जांच पीपीआई के उच्च संकल्प इमेजिंग से जुड़े कई अलग अलग जैविक जांच के लिए लागू एक मूल्यवान संसाधन हो जाने की उम्मीद है। PAmCherry1, एक photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन, mEos3.2 के अलावा, यह भी BiFC-पाम 26 के लिए विभाजित किया गया था। उनके उत्सर्जन स्पेक्ट्रम ओवरलैप है, क्योंकि mEos3.2 और PAmCherry1 एक साथ इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, लेकिन हरे पीए एफपीएस हाल ही में पीपीआई के दो रंग के nanoscale superresolution इमेजिंग के लिए संभावना खोलने, 27 सूचित किया गया है।

पारंपरिक BiFC के रूप में, BiFC-पाम को लागू करने में एक महत्वपूर्ण कदम संलयन निर्माणों के डिजाइन और क्लोनिंग है। तथ्य यह है कि ऊपरआठ अलग अभिव्यक्ति निर्माणों को क्लोन किया जा सकता है और आठ BiFC जोड़े BiFC और BiFC-पाम एक थकाऊ, निषेधात्मक यदि नहीं, तो प्रक्रिया हो सकती है को लागू करने के लिए प्रत्येक प्रयास में परीक्षण किया जाना है। रास-आरएएफ उदाहरण में सचित्र के रूप में फिर भी, अक्सर हित के प्रोटीन के जैव रासायनिक और संरचनात्मक गुणों पर पूर्व ज्ञान के BiFC जोड़े की संख्या कम परीक्षण किया जा करने के साथ फ्यूजन निर्माणों की एक अनुकूलित डिजाइन मार्गदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यही कारण है कि वर्तमान में एक BiFC (इसलिए BiFC) पाम प्रयोग काम होता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक सार्वभौमिक दिशानिर्देश नहीं है, ने कहा; इसके बारे में ज्यादा अभी भी एक कला है।

BiFC और BiFC-पाम आम तौर पर दो प्रोटीन के बीच heterodimer के गठन की जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, यह दो उम्मीदवार प्रोटीन वही होगा, जो मामले में इन तरीकों का उपयोग करते हुए homodimer गठन का अध्ययन करने के लिए भी संभव है। हालांकि, इस तरह के रूप में, एक ही टुकड़ा के साथ दो प्रोटीन बातचीत कर सकते हैं, लेकिन BiFC संकेत में परिणाम नहीं। प्रत्येक निर्माण के रूप में अभिनय के बावजूदसफल पूरक में जिसके परिणामस्वरूप बातचीत irreversibility के कारण जमा होता है, जबकि अन्य, इस तरह की बातचीत के लिए एक प्रतिस्पर्धी अवरोध करनेवाला, प्रतिवर्ती हैं। प्रत्येक निर्माण की अभिव्यक्ति के स्तर के बीच एक कठोर अंतर नहीं है, तो सामान्य तौर पर, संकेत में कमी हो सकती है। इसलिए, दो निर्माणों की अभिव्यक्ति के स्तर अंतर्जात अभिव्यक्ति के स्तर पर (जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती homodimer नमूनों के बीच जैसे,) प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना करते समय निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है। BiFC प्रयोगों सामान्यतः क्षणिक transfections और निर्माणों की overexpression के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं यह शायद इसलिए।

पिछले नहीं बल्कि कम से कम, सभी BiFC प्रयोगों उचित नियंत्रण के साथ पुष्टि की जानी चाहिए। BiFC संकेत मौजूद है, तो संकेत (यानी, टुकड़े और नहीं है क्योंकि पल्स पोलियो टीकाकरण के लिए अपने दम पर पुनर्गठन कर रहे हैं) गैर विशिष्ट है कि वहाँ एक मौका है। एक नकारात्मक नियंत्रण में या तो म्यूटेशन या जाना जाता है कि दोनों प्रोटीन हैBiFC संकेत का एक महत्वपूर्ण नुकसान में परिणाम चाहिए जो बातचीत को बाधित करने के लिए। इस तरह के एक बिंदु उत्परिवर्तन अज्ञात है, तो अन्य तरीकों जैसे प्रोटीन में से एक के लिए एक प्रतियोगी बाध्यकारी साथी को शुरू करने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और संकेत में एक सहवर्ती कमी नहीं है, तो देखते हैं।

अधिक मुश्किल स्थिति BiFC संकेत, या झूठी नकारात्मक की कमी की समस्या का निवारण किया जाता है। ऐसे मामलों में, यह एक ऐसी transfections के दौरान एक GFP नियंत्रण के रूप में क्लोनिंग की प्रक्रिया के दौरान सकारात्मक नियंत्रण, शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है। पश्चिमी blots निर्माणों की अभिव्यक्ति के लिए जाँच करने के लिए चलाया जा सकता है। इन कारकों में सामान्य हो रहे हैं, तो अन्य कारकों जैसे लिंकर लंबाई और / या अनुक्रम, या एक अलग BiFC विन्यास विचार किया जाना चाहिए, के रूप में परिवर्तित करने की आवश्यकता हो सकती है।

छवियों प्रसंस्करण जब पाम हिस्से के रूप में, मानकों के एक नंबर पर विचार किया जाना चाहिए। चरण 2.4.2.1 निर्देशांक छंटाई और अंतिम पाम छवि पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया मानकों का वर्णन है। सबसे पहलाजैसा कि हम पहले 23 में वर्णित के रूप में दो मापदंडों, फ्रेम का मेल और दूरी का मेल है, ~ अलावा 0.8 सेकंड दो स्थानीयकरण घटनाओं 100 एनएम के भीतर दोनों कर रहे हैं और (100 मिसे / फ्रेम में) कम से कम 8 फ्रेम दिखाई देते हैं तो परिभाषित या। यदि हां, तो वे एक ही अणु से उत्पन्न होती हैं पर विचार किया जाएगा, और उनके निर्देशांक के औसत से संयुक्त हो जाएगा। PAmCherry1 दुर्लभ प्रतीत होता है के लिए 0.8 सेकंड की तुलना में बहुत अधिक से अधिक जन्मों के साथ डार्क राज्यों; एक लंबे समय रहते अंधेरे राज्य से ठीक एक fluorophore की घटना एक समीपस्थ दूरी उत्सर्जन प्रतिदीप्ति पर एक अलग अणु से पृथक है, के रूप में दो स्थानीयकरण घटनाओं वे तख्ते की एक निश्चित संख्या के भीतर दिखाई दिया और तभी एक ही अणु से उत्पन्न होने वाली माना जाता है भौतिक दूरी। अनुभव से, 8-12 फ्रेम (0.8-1.2 सेकंड) पर एक 'फ्रेम गठबंधन' सेटिंग हमारे प्रयोगात्मक परिस्थितियों में इष्टतम प्रतीत होता है। न्यूनतम आरएमएस फिटिंग आयाम और अवशेषों शोर का मानक विचलन के बाद बीच कम से कम अनुपात को परिभाषित करता हैफिटिंग। इन मूल्यों को निकासी के समन्वय के दौरान .cor फाइल में दर्ज हैं।

सारांश में, BiFC-पाम BiFC और हथेली के लाभों को जोड़ती है और पहले से हासिल किया गया है उससे कहीं ज्यादा अधिक से अधिक विस्तार में पीपीआई की जांच के लिए सक्षम बनाता है। ऊपर और उचित नियंत्रण प्रयोगों के साथ कारकों के लिए विचारों के साथ, BiFC-पाम जैविक सेटिंग्स की एक विस्तृत रेंज में पीपीआई के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण हो जाना चाहिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope frame Nikon Ti-U
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA Nikon CFI Apo TIRF 60x H
EMCCD camera Andor iXon Ultra 897
561 nm laser Opto Engine MGL-FN-561
405 nm laser Coherent CUBE-405 50mW
561 nm dichroic mirror Semrock  Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nm filter Semrock FF01-525/45-25
405/561 nm notch filter Semrock NF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stage Tokai Hit INUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS Addgene 60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS Addgene 60546
pcDNA3.2-DEST Life Technologies 12489-019
pLenti-DEST Addgene http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Scientific F-531
In-Fusion HD Cloning Clontech 639649
LR Clonase Life Technologies 11791
Vira Power Lentivirus Packaging Life Technologies K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent Roche 13873800
Lab-Tek II Chambered Coverglass Thermo Scientific 155409 #1.5 glass bottom dishes
U2OS cells ATCC HTB-96
293T/17 cells ATCC CRL-11268
DMEM with phenol red Life Technologies 11995
DMEM no phenol red Life Technologies 21063
Fetal bovine serum Life Technologies 10082
Leibovit's L-15, no phenol red Life Technologies 21083-027
Reduced serum medium Life Technologies 31985
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14040
Syringe BD Biosciences 309604
Syringe filter Millipore SLHV033RB
Lentiviral concentrator Clontech 631231
Retroviral concentrator Clontech 631455
10 cm culture dish BD Biosciences 353003
6-well culture plate BD Biosciences 353046
Polybrene Sigma 107689
Puromycin Life Technologies A11138
G-418 Calbiochem 345812 Neomycin
Doxycyline Fisher BP2653
Tris base Fisher BP152
EDTA Sigma EDS
Sodium Hydroxide Sigma S5881
Paraformaldehyde Sigma 158127
Glutaraldehyde Sigma G6257
PIPES Sigma P6757
HEPES Sigma H4034
EGTA Sigma 3777
Magnesium Sulfate Sigma M2643
Potassium Hydroxide Sigma 221473
Sodium chloride Fisher BP358
Magnesium chloride Fisher M33
100 nm gold particles BBI Solutions EM.GC100
Molecular grade water Life Technologies 10977
Dpn1 New England Biolabs R0176
PCR purification kit Qiagen 28104
Miniprep kit Qiagen 27104
Midiprep kit Macherey-Nagel 740410
0.6 ml microcentrifuge tubes Fisher 05-408-120
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher 05-408-137
15 ml tubes Fisher 05-539-12
5 ml polypropylene round-bottom tubes BD Biosciences 352063
14 ml polypropylene round-bottom tubes BD Biosciences 352059
50 ml tube BD Biosciences 352070
PCR tube GeneMate C-3328-1
SOC medium Life Technologies 15544
LB broth BD Biosciences 244610
Kanamycin sulfate Fisher BP906
Competent cells Life Technologies C4040
Matlab Mathworks

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 106 प्रोटीन प्रोटीन बातचीत superresolution माइक्रोस्कोपी Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी bimolecular प्रतिदीप्ति पूरक एक अणु ट्रैकिंग PAmCherry प्रोटीन क्लस्टरिंग vbSPT
Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation साथ Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (BiFC-पाम)
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Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM). J. Vis. Exp. (106), e53154, doi:10.3791/53154 (2015).

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