Introduction
Protein-protein interaksjoner (PPI) er grunnleggende for biologi 1 og er tett regulert via tid og rom mekanismer over mange tids og lengdeskalaer. Studier på cellesignalering på cellemembranen, for eksempel, har avdekket dynamiske, nanoskala romlige avdelinger som letter spesifikke PPIs og cellulære prosesser 2. Derfor er evnen til å sondere PPIer i biologiske systemer med tilstrekkelig romlige og tidsmessige oppløsning, høy spesifisitet og høy følsomhet nøkkelen til å oppnå en mekanistisk forståelse av biologien.
Bimolecular fluorescens complementation (BiFC) er en av de få eksisterende verktøy for å visualisere PPIs i en celle med subcellulære oppløsning og lever-celle kompatibilitet 3-5. Teknikken er relativt enkel og innebærer splitting av en fluorescens protein i to ikke-fluorescerende fragmenter; når genetisk kodet til to samspill proteiner ogbringes i nærhet, kan fragmentene rekonstituere for å danne en komplett fluorescent protein, noe som ga fluorescerende signal. Når riktig utformet, bør BiFC prober ikke spontant rekonstituere i fravær av protonpumpehemmere. Som sådan, vil fluorescens-signalet i et BiFC analysen ble kun oppstår i nærvær av PPIer, noe som muliggjør direkte visualisering av PPIer med høy spesifisitet. Andre fordeler med å bruke fluorescens som avlesning er høy følsomhet, subcellulære oppløsning, og kompatibilitet med høy gjennomstrømning og høyt innhold utvelgelsesassays, blant andre. For disse fordelene, er det utviklet en rekke BiFC prober basert på ulike forelder fluorescerende proteiner. Som i alle andre teknikker for deteksjon basert på konvensjonelle lys-mikroskopi, men er den romlige oppløsningen av BiFC begrenset til ~ 250 nm ved diffraksjon av lys. Dette gjør det til en utfordring å studere reguleringen av PPIer på nanoskala, som, som antydet tidligere, og eksemplifiseres ved lipid flåter 6 and Ras nanoclusters 7, er en kritisk lengde skala for å forstå mange cellulære prosesser som signalering.
BiFC har vært kombinert med photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) 8,9 for å overvinne denne grensen i romlig oppløsning for å avbilde PPIer 10. PALM er en fersk superresolution mikroskopi teknikk som omgår diffraksjonsgrensen i fluorescens bildebehandling gjennom stokastisk aktivering og subdiffractive lokalisering av enkelt fluorescerende molekyler. I hver aktiveringssyklus, avgir et fluorescerende molekyl noen få hundre til noen få tusen fotoner og gir opphav til et enkelt molekyl bilde på detektoren. Mens bildet er diffraksjon-begrenset (~ 250 nm i bredde), dens sentroide kan bestemmes med meget høyere nøyaktighet, typisk av størrelsesorden 10 til 50 nm, avhengig av antall fotoner som detekteres. Ved å aktivere og lokalisere hver fluorescerende molekyl i utvalget, kan en høyoppløselig bilde rekonstrueres. Performed på levende celler, enkelt molekyl sporing (smt-) PALM tillater videre oppkjøp av tusenvis av protein diffusjon baner fra en enkelt celle 11. Viktigere, bruker PALM spesialiserte fluorescerende prober som photoactivatable fluorescerende proteiner (PA-FPS) for å oppnå stokastisk aktivering. Siden både BiFC og PALM bruk fluorescerende proteiner, de ble kombinert ved å splitte PAmCherry1, en vanlig brukt PA-FP for PALM, i to fragmenter mellom aminosyrene 159 og 160.
Den BiFC system basert på split PAmCherry1 viser lavt bakgrunnssignal fra spontan tilberedning av de to fragmenter. Når genetisk kodet til et par samvirkende proteiner, de to fragmenter (RN = stene 1-159; RC = Met + rester 160-236) rekonstituert effektivt for å danne komplette PAmCherry1 proteiner, selv ved 37 ° C og uten inkubering ved lavere temperaturer, noe er ikke tilfelle for andre BiFC par 12 som forelder mCherry 13. Furthermore, rekonstituert PAmCherry1 protein beholdt photophysical egenskapene til den overordnede PAmCherry1, som for eksempel høyt kontrastforhold, medium foton yield, og rask fotoaktivering, blant andre, som er avgjørende for nøyaktig ett molekyl lokalisering og høy oppløsning PALM bildebehandling.
I denne protokollen, bruk av BiFC-PALM for avbilding av Ras-Raf interaksjoner i U2OS celler ved hjelp av delt PAmCherry1 (figur 1A) er beskrevet. Det første trinnet er å utforme konstruksjonene for å uttrykke fusjonsproteiner mellom PAmCherry1 fragmenter (dvs. RN og RC) og proteiner av interesse. I teorien, for hvert par av kandidat proteiner (A og B) er det åtte par av fusjonsproteiner som skal testes: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; og A-RC / B-RN. Denne prosessen kan ofte forenkles ved å ta hensyn til de strukturelle og biokjemiske egenskaper av kandidatproteinene. I tilfelle av Ras, er proteinetpost-translasjonelt modifisert ved den C-terminale CAAX-boksen (C = Cys; A = alifatisk, X = en hvilken som helst), hvoretter AAX motivet avspaltes. Derfor kan RN eller RC bare bli fusjonert til N-terminalen av Ras; Dette reduserer antallet av fusjonsprotein parene til fire (figur 1B). For Raf, Ras-bindende domene (RBD; rester 51-131) er brukt og kan være merket på hver ende. Disse fire fusjons konfigurasjoner ble generert: RN-Kras / RC-Raf RBD; RN-Kras / Raf RBD-RC; RC-KRAS / RN-Raf RBD; og RC-Kras / Raf RBD-RN.
I tillegg vil linkeren mellom fragmentene og proteiner av interesse må tas i betraktning. En fleksibel linker på omtrent ti aminosyrer er ofte brukt som det gir tilstrekkelig frihet for komplementering skal skje. En slik linker er (GGGGS) x2, selv om det er mange andre som har blitt brukt, inkludert tilfeldige sekvenser generert fra en multippel kloningssete (MCS) 14. Lengden av linkerne kan ha behov for å være optimalisert depending av størrelsen av proteinene av interesse, og deres orienteringer ved interaksjon.
De PAmCherry1 fragmenter finnes i en liten kloning ryggrad med flanke mcss (se Materials List). Gener av interesse kan innføres via restriksjonsseter eller med en ligeringsuavhengig metode. Etter kloning og sekvensbekreftelse er ekspresjonskassetten overført til en ekspresjonsvektor ved anvendelse av en rekombinase reaksjon, en kloningsprosessen med høy nøyaktighet og høy effektivitet.
Deretter blir de resulterende ekspresjonskonstruksjoner transfektert inn i målet cellelinje, eller dersom en stabil cellelinje er ønsket, pakket inn i lentivirus for å infisere mål-cellelinje. Transient transfeksjon sørger for rask validering av BiFC konfigurasjoner, men potensielle problemer må bemerkes. Transfeksjon bruk av kjemikalier ofte streker cellene, noe som resulterer i høy autofluorescence; mens bruken av total indre refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskop,py kan redusere denne bakgrunnssignal ved å begrense belysningsvolumet, TIRF ideell når PPIer foregå på cellemembranen. I tillegg transiente transfeksjoner ofte føre til høye nivåer av proteinekspresjon, som langt overskrider de av de endogene proteiner, noe som kan føre til artefakter i å detektere PPIer. Derfor anbefales det at stabile cellelinjer bli etablert etter at en passende konfigurasjon BiFC er blitt bestemt ved innledende testing. Stabile cellelinjer har også potensial for tunbare uttrykk via doksycyklin induksjon 15.
Etter infeksjon blir cellene velges med antibiotika, typisk puromycin og neomycin, en for hver konstruksjon. De etterfølgende trinn for prøvepreparering, bildeoverføring, og analyse av data vil bli beskrevet i detalj i protokollene.
Med denne tilnærmingen, er dannelsen av nanoskala klynger i BiFC-PALM bilder av Ras-Raf RBD rutinemessig observert (Figur 2A </ strong>). Konsekvent, smt-PALM baner av Ras-Raf RBD viser en heterogen fordeling i spredningstilstander (figur 2B-D). Disse resultatene tyder på at Ras-Raf komplekser eksisterer i flere stater på cellemembranen, antagelig som monomerer og klynger, med potensielle biologiske konsekvenser. Dette arbeidet viser kraften i BiFC-PALM i selektiv avbildning av PPIer i celler med nanometer romlig oppløsning og enkelt molekyl følsomhet, noe som ville være vanskelig å oppnå med konvensjonelle BiFC, fluorescens co-lokalisering, eller fluorescens resonans energioverføring (FRET).
Ved utforming BiFC eksperimenter og tolke resultatene, er det viktig å huske på at BiFC prosessen er irreversibel i de fleste tilfeller, inkludert split PAmCherry1. Når de to fragmentene kombinere og danne en komplett PAmCherry1 protein, koblingen mellom de to fragmentene, og dermed PPI blir permanent. Dette begrenser bruken av BiFC og BiFC-PALM for overvåking av dynamikken i PPIer (dvs. bindingskinetikken og ikke diffusjon dynamikken av proteinkomplekset når den er dannet) og til tider til og med kan føre til mislocalization av PPI komplekser.
En ekstra faktor å vurdere når du utformer BiFC-PALM eksperimenter er forsinkelsen i kromofor modning som er iboende i fluoriserende proteiner. Når to proteinene samhandle og FP fragmenter kommer sammen, de vanligvis refolder i størrelsesorden sekunder (halveringstid på 60 sek for EYFP 3). Imidlertid følgende kromofor modning og fluorescerende signal utvikles i størrelsesorden minutter. Mens fluorescens kan påvises innen 10 min etter oppløsning av split-Venus, en rask folding YFP variant, er halveringstiden for modning generelt ofte rundt 60 min 16. Split-PAmCherry1 ble observert å ha lignende priser. Derfor BiFC og BiFC-PALM er for tiden dårlig valg for overvåking sanntids PPI kinetikk; annet megthods, slik som FRET og en nylig utviklet dimerisering avhengig fluorescerende protein 17, kan være mer egnet for dette formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning
- Bestem konfigurasjoner for å klone og velge en linker. Tag proteiner med fragmentene på N- eller C-terminale ende slik som beskrevet nedenfor slik at de ikke forstyrre deres riktige lokalisering. Bruk en fleksibel linker slik som (GGGGS) x2.
- Genetisk kode proteiner av interesse for PAmCherry1 fragmenter. Som ett alternativ, bruker kloning plasmider oppført i Materials List inneholder fragmenter RN (PAmCherry1 rester 1-159) og RC (Met pluss PAmCherry1 rester 160-236) med flanke MCS sekvenser.
- Linearisere plasmider inneholdende fragmentene RN og RC med invers PCR (eller restriksjonskutting) ved punktet for innsettingen. Primere for invers PCR er oppført i tabell 1. Nedenfor er et eksempel PCR protokoll som brukes i forfatterens lab (se Materialer List for de eksakte materialene som brukes i denne protokollen).
- Bland PCR-reaksjonen sammen, brakt opp til et sluttvolum på 50 pl med vann: til en tynn vegged PCR-rør, tilsett vann, 25 ul av 2x konsentrat-blanding, 0,5 ul av hver av forover- og reversprimerne (20 uM fortynnet lager, 0,2 pM sluttkonsentrasjon), og 1 ng templat. Bruk følgende sykkel betingelser: 98 ° C i 30 sek, 30 sykluser av 98 ° C i 7 sekunder og 68 ° C i 2 min, og en sluttforlengelse ved 72 ° C i 10 min.
- PCR gener av interesse for innsetting til den lineariserte plasmider inneholdende RN og RC fragmenter. Utføre PCR som i trinn 1.2.1 med utvidelsen tiden ved 68 ° C. Bruke primere med overheng som inneholder en fleksibel linker-sekvens, så som for GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT (GGGGS) x2, og 15 basepar homologi til endene av det lineariserte RN og RC plasmider for rekombinasjon.
Merk: primer overheng for proteiner av interesse er vist i tabell 2 ved bruk av primerne i tabell 1 for å linearisere plasmidet ryggrad. - Fordøye PCRomsetning med Dpn1 å eliminere PCR-templat. Legg 0,5 mL av Dpn1 (20 U / mL) direkte til 50-ul PCR reaksjon. Inkuber ved 37 ° C i 1 time og varme inaktiverer ved 80 ° C i 20 min. Hvis bakgrunnen mal vedvarer i senere trinn, øke enzymet beløp eller forlenge koketiden.
- Rens PCR-produktene via en spinnkolonne som beskrevet av produsenten.
- Utføre en ligeringsuavhengig reaksjon for å kombinere et linearisert plasmid inneholdende en RN eller RC fragment med genet av interesse. Måle konsentrasjonen av de rensede PCR produktene: Kombiner 50 ng linearisert plasmid og 50 ng av genet av interesse med 1 ul enzym forblanding og bringe det totale volum til 5 ml med avionisert vann. Inkuber ved 50 ° C i 15 min, sted på is, og tilsett 20 ul TE-buffer.
- Transform rekombinante plasmider inn kompetente bakterier 18.
- Velg 2-4 + (etter ønske) kolonier for O / N kultur. Tilsett 5 mlav LB-næringsløsning og 5 ul av kanamycin (50 mg / ml stock) til et 14 ml polypropylen rundbunnet rør, og legge til det valgte bakterier koloni med en sterilisert inokulering sløyfe. Inkuber ved 37 ° CO / N under rysting ved 225 rpm.
- Fryse 1 ml av O / N kultur for glyserol lager 19 og miniprep-resten som beskrevet av produsenten.
- Utfør sekvensering for å finne en god klone. Hvis du bruker kloning plasmider i Materials List, bruke M13 forover og bakover primere (i egne reaksjoner) som er nødvendig for å oppnå fullstendig sekvens av fusjonskonstruksjon. Sammenlign med den forventede sekvensen ved hjelp av en justeringsverktøy som BLAST fra National Center for Biotechnology Information (NCBI) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- Overfør sekvens verifisert konstruksjoner til et ekspresjonsplasmid via en rekombinase reaksjon.
- Legg 75 ng av reisemålet plasmid & #8212; slik som pcDNA for transiente transfeksjoner eller pLenti for lentiviral emballasje 20 - og 50 ng av det rekombinante plasmid for kloning 1 pl av enzym premix og bringe det totale volum opp til 5 ml med avionisert vann. Inkuber ved 25 ° C i 1 time, og deretter legge 5 pl TE buffer.
Merk: For lentiviral emballasje og stabil cellelinje generasjon, bruke en annen destinasjon plasmid for hver konstruksjon, for eksempel, en med puromycin motstand og den andre neomycin. Dette gjør det mulig for dobbel utvalg av transduserte celler. Også vurdere promoter for hver, slik som den konstitutive cytomegalovirus (CMV) promoter for høye ekspresjonsnivåer, eller CMV med teto operatør for avstembare doksycyklin-regulert ekspresjon. - Transform 5 pl inn kompetente bakterier og miniprep plasmidene som i trinn 1.2.6 til 1.2.8, men ved hjelp av riktig antibiotika (vanligvis ampicillin).
- Legg 75 ng av reisemålet plasmid & #8212; slik som pcDNA for transiente transfeksjoner eller pLenti for lentiviral emballasje 20 - og 50 ng av det rekombinante plasmid for kloning 1 pl av enzym premix og bringe det totale volum opp til 5 ml med avionisert vann. Inkuber ved 25 ° C i 1 time, og deretter legge 5 pl TE buffer.
- Linearisere plasmider inneholdende fragmentene RN og RC med invers PCR (eller restriksjonskutting) ved punktet for innsettingen. Primere for invers PCR er oppført i tabell 1. Nedenfor er et eksempel PCR protokoll som brukes i forfatterens lab (se Materialer List for de eksakte materialene som brukes i denne protokollen).
- Bestem optimalBiFC konfigurasjon.
- Co-transfisere ekspresjonsplasmider inn U2OS celler (eller celle av valget).
- Legg 350 mL av fenol rød-fri og antibiotika-fritt DMEM supplert med 10% FBS i hver brønn av en 8-brønn # 1.5 glassbunn kammer lysbilde. Plate ca 7,5 x 10 4 celler per brønn så cellene er ca 70% -90% konfluent neste dag.
- Dagen etter plating, co-transfeksjon av ekspresjonsplasmider med forskjellige konfigurasjoner i hver brønn ved å bruke det foretrukne reagens og som beskrevet av produsenten.
- For hver brønn, tilsett 125 ng av hver ekspresjonsplasmidet i 50 ul av serumfritt redusert medier i en 0,6 ml tube og pipette opp og ned for å blande. Tilsett 1 pl av transfeksjon reagens ned i midten av røret, og direkte inn i mediet. Agitere forsiktig for å blande og la reaksjonen sitte i 30 min.
- Reduser mediet i hver brønn av kammeret glide med omtrent halvparten. Tilsett transfeksjon blandingen dråpevis til brønnene og riste gently å blande. Inkuber cellene ved 37 ° C og 5% CO2 i 24-48 timer. Endre media dagen etter transfeksjon.
- Bilde celler på en fluorescens mikroskop som i protokoll 2 begynner med trinn 2.1.4.
Merk: Prøven kan avbildes på et standard fluorescensmikroskop Hvis uttrykket nivåene er høye og kameraet er følsomt nok for relativt lave foton utgang PAmCherry1. Rekonstituerte PAmCherry1 molekyler kan aktiveres med en ultrafiolett filtersett (405 nm) før avbildning med en grønn eksitering (561 nm) filter-apparatet.
- Co-transfisere ekspresjonsplasmider inn U2OS celler (eller celle av valget).
- Der det er anvendelig som en negativ kontroll ved for eksempel å innføre en punktmutasjon i en av de proteiner av interesse som forstyrrer interaksjonen. Utfør en seterettet mutagenese 21 på kloning plasmidet av proteinet som skal muteres og av den valgte konfigurasjonen.
- Generere en stabil cellelinje ved pakking konstruksjonene i viralpartikler og infiserer U2OS celler (eller cellelinje av valget). Vurdere en induserbar (tetracyclin) uttrykk system 15 så uttrykket kan induseres før bildebehandling dersom forlenget irreversibilitet av BiFC er et problem, eller hvis tunbare uttrykk er ønsket.
FORSIKTIG: Arbeide med virus er klassifisert som biosikkerhetsnivå 2. Mens de senere generasjoner av virusemballasjesystemer har sterkt redusert sannsynligheten for å produsere replikering-kompetent virus, noen risiko er fortsatt til stede. Referanser kan bli funnet på http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.- Gjenta trinn 1.2.10 bruker en lenti- eller retroviral reisemålet vektor 20. Øk O / N kultur til 100 ml for en midiprep og større renhet av plasmidene.
- På dag 1: Plate omtrent 2 x 10 6 293T / 17 celler i en 10 cm skål for hver enkelt konstruksjon som skal pakkes.
- På dag 2: Utarbeide en transfeksjon reaksjon ved hjelp av en transfection reagens av valg og som beskrevet av produsenten.
- Fremstille en premiks av emballasje plasmider med sluttkonsentrasjoner på 250 ng / mL for emballasje plasmider 1 og 2, og 100 ng / mL for emballasje plasmid 3 i sterilt vann. Tilsett 10 pl av pakningens plasmidet forblandingen og 2,5 ug av mål-plasmid til 1 ml serum-fritt media redusert i en 5 ml rundbunnet polypropylen rør og pipette opp og ned for å blande. Tilsett 20 pl av transfeksjon reagens ned i midten av røret, og direkte inn i mediet.
- Agitere forsiktig for å blande og inkubere ved romtemperatur i 30 minutter. Fjern omtrent halvparten av media fra cellene og legge til transfeksjon blandingen dråpevis. Rist forsiktig for å blande og inkubere ved 37 ° C og 5% CO2. Inkuber 10 ml av mediet på hver plate i et rør med lokket løsnet for temperatur og CO 2 likevekt.
- På dag 3: endre forsiktig media med preinkubert media og return cellene til inkubatoren. Inkuber annen tube av media med hetten løsnet.
Merk: syncytia, eller dannelse av store multi-kjernedannet celler, kan være et tegn på at emballasjen går bra. Men cellene er i en skjør tilstand og kan lett tas av. Når du skifter media, vippe pipetten slik at den er vannrett og legge til media dråpevis inn i den ene kanten av tallerkenen. - På dag 4 Harvest viruset ved å fjerne mediet med en sprøyte, og filtrering gjennom en 0,45 um porestørrelse filter til en ren 50 ml tube. Erstatte forsiktig media med preinkubert media.
- På dag 5: Harvests igjen som gjort tidligere i trinn 1.5.3.3 og kombinere vanlig filtratet inn i den samme 50 ml tube. Tilsett 6 ml virus konsentratoren til hvert rør og bland. Oppbevar ved 4 ° C i minst 24 timer før viruset utfellinger.
Merk: Avhengig av helsen til cellene, kan viruset høstes en tredje gang. - Konsentrer viruset ved sentrifugering ved 1500 xgi 15 min ved 4 ° C. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 250 mL av mediet. Virus kan brukes umiddelbart for infeksjon eller lagres i 50 ul porsjoner ved -80 ° C i inntil ett år.
- Plate ca 3 x 10 5 U2OS (eller target) celler per brønn i en 6-brønns plate (2 ml DMEM med 10% FBS per brønn) for infeksjon, slik at cellene er omtrent 50% konfluent på tidspunktet for infeksjon.
- Dagen etter, fjerner omtrent halvparten av media så ca 1 ml restene. Coinfect med 50 ul konsentrert virus for hver konstruksjon. Tilsett 1 pl av polybren (8 mg / ml) til hver brønn. Inkuber ved 37 ° C og 5% CO2. Endre media neste dag og inkuberes i en dag før antibiotika utvalg.
Bemerk: Mengden av virus til å legge til, kan variere, avhengig av den ønskede hastighet på infeksjon. Virus kan titreres hjelp QRT-PCR. - Legg antibiotika for å selektere for infiserte celler. Separate brønner med infiserte celler som ikke har sett VIrus er nødvendig som kanarifugler for å teste effekten av utvalget. Inkuber i 2-7 dager, eller inntil valget er ferdig.
Merk: Effektive konsentrasjoner titreres i utgangspunktet, men de er vanligvis 1,0 ug / ml for puromycin og 1,0 mg / ml for neomycin. - Utvid cellene inn i en større 10 cm tallerken og fortsett til protokoll 2.
- Fremstille en premiks av emballasje plasmider med sluttkonsentrasjoner på 250 ng / mL for emballasje plasmider 1 og 2, og 100 ng / mL for emballasje plasmid 3 i sterilt vann. Tilsett 10 pl av pakningens plasmidet forblandingen og 2,5 ug av mål-plasmid til 1 ml serum-fritt media redusert i en 5 ml rundbunnet polypropylen rør og pipette opp og ned for å blande. Tilsett 20 pl av transfeksjon reagens ned i midten av røret, og direkte inn i mediet.
2. Imaging Fast Cells
- Forberede en prøve for bildebehandling
- Rengjør en 8-brønn # 1,5 glass-bunn kammer lysbilde ved å legge 250 mL av 1 M NaOH i minst en time og vask grundig med PBS.
Merk: Ubehandlet kammer lysbilder typisk resultere i høy bakgrunn signal. I tillegg kan cellene være følsomme for rest NaOH og unnlatelse av å rengjøre glassflaten (så mange som 10x vasker) kan gjøre celleadhesjonen vanskelig. Hvis det er nødvendig, inkuber renset kammer lysbildet med PBS O / N etter vask. For sensitive cellelinjer, plettering ved en høyere tetthet(F.eks 50% -60% første confluency) kan hjelpe. - Plate ca. 5,5 x 10 4 av U2OS stabil ekspresjon celler per brønn i 350 ul av fenolrødt-fritt DMEM med 10% FBS, slik at cellene er friske og ikke over konfluent når avbildning.
- Utføre nødvendige behandlinger for forsøket, for eksempel legge tetracyklin å indusere protein uttrykk.
- Fikse cellene umiddelbart før bildebehandling.
- Før fiksering, forberede fersk Paraformaldehyde (PFA) løsning - 3,7% PFA i 1x cefem med 0,1% glutaraldehyd (GA). Til 10 ml oppløsning PFA, veie 0,37 g av PFA og overføres til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 1 ml destillert vann og 30 pl av 1 M NaOH og virvle. Oppvarm til 70 ° C og virvle hver 1-2 min til PFA er helt oppløst.
- Overføring oppløst PFA til et 15 ml konisk rør og tilsett 3,8 ml destillert vann, 5 ml 2 x cefem-buffer, 20 ul 25% glutaraldehyd, og vortex å blande. Lager, er 2x cefem buffer 120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA og 16 mM MgSO4, med pH justert til 7,0 med 10 M KOH. Dette fikseringsmiddel-løsning kan lagres ved 4 ° C i flere dager.
FORSIKTIG: PFA og GA er både farlig. Forbered løsningen i et avtrekksskap og slitasje riktig verneutstyr ved håndtering av både kjemikalier. Unngå innånding eller direkte hudkontakt. - Fjern vekstmediet. Vask raskt med 500 mL PBS og tilsett 250 mL av PFA fiksativ per brønn. Cellene inkuberes i 20 min ved RT.
- Fjern det PFA fiksativ fra prøven og tilsett 350 ul PBS eller bildebuffer (100 mM Tris med 30 mM NaCl og 20 mM MgCl2, pH 8,5) per brønn.
- Vortex 100 nm gullpartikler for å bryte opp aggregater og tilsett 35 mL per brønn (10x sluttfortynning) for sporing scenen drift under bildebehandling.
- Rengjør en 8-brønn # 1,5 glass-bunn kammer lysbilde ved å legge 250 mL av 1 M NaOH i minst en time og vask grundig med PBS.
- Hente bilder
- Slå på mikroskopet. Strøm på 405 og 561 nm lasere, men holde skodder(intern eller ekstern) stengt på dette punktet. Slå på EMCCD kameraet og la det kjøle seg ned. Sikre de 561 nm filtre er på plass.
- Åpne oppkjøpet programvare og sette eksponeringstiden til 100 msek og EMCCD gevinsten til 300 (område 1 - 1000).
- Legg nedsenking olje til målet og sikre prøven til mikroskop scenen.
- Med enten lyse felt eller 561 nm laser på (~ 1 kW / cm 2), ta prøven i fokus.
- For bildebehandling Ras og andre membran proteiner, bruk en 60X apochromat TIRF objektiv med 1,49 numerisk apertur og bringe mikroskop inn TIRF konfigurasjon. Juster eksitasjon laser slik at det er off-sentrert når treffer baksiden blenderåpning på TIRF mål; Dette fører til at laseren for å avbøye ved å nå prøven. Holde justere laseren til den kritiske vinkel er nådd, og laseren blir reflektert tilbake. Søk etter en celle til bilde med flere gullpartikler i sikte. Sett en region av interessesom omslutter cellen (eller i en region inne i cellen) og gullpartiklene.
Merk: TIRF reduserer inntrengningsdybde magnetisering laser og reduserer ut av fokus bakgrunnssignal. I tillegg er korreksjon av drifting sannsynlig å være mer nøyaktig når flere gullpartikler er i sikte. - Hvis tilgjengelig, engasjere autofokussystemet til rette for prøve drift i z-retning. Ellers justere fokus manuelt gjennom oppkjøpet hvis bildet går ut av fokus.
- Begynn oppkjøpet med 405 nm laser av og 561 nm laser på (~ 1 kW / cm 2) i tilfelle tilstrekkelig aktivisering skjer allerede (typisk hvis uttrykk nivåer er høy). Ellers slår på 405 nm laser til lavest fabrikken effektinnstillingen (0,02 mW eller 0,01 W / cm 2) og øke gradvis (0,1 mW om gangen) som nødvendig til det er flere titalls molekyler per bilde eller slik at enkle molekyler er godt atskilt.
- Som datainnsamling fortsetter, gradi manuell øke 405 nm laser makt for å holde stedet tetthet omtrent konstant.
Merk: Ved lavere 405 nm eksitasjon makt, kan noen PAmCherry1 allerede være aktivert. Som disse molekylene photobleach, befolkningen i værende photoactivatable PAmCherry1 molekyler avtar, noe som krever en høyere foton fluks for å opprettholde den samme tettheten av molekyler som avgir fluorescens i hver ramme. - Fortsett bilde oppkjøpet til høy 405 nm kraft (2,5 - 10 W / cm 2) aktiverer ikke flere aktiverings hendelser.
Merk: Den totale Innsamlingstiden avhenger av ekspresjonsnivået og effektiviteten av komplementering.
- Behandle bildene
Merk: Det er mange åpen kildekode-programvare alternativer for bildebehandling. Eksempler er tordenvær (https://code.google.com/p/thunder-storm/) og QuickPALM (https://code.google.com/p / quickpalm /). De typiske data behandlingsprosedyrene er kort illustrert her ved å bruke en tilpasset Matlab pakke kalt wfiread for behandling PALM data som et eksempel. Imidlertid kan fremtidige revisjoner ikke akkurat følger det som er beskrevet her. For bildebehandling med annen programvare, se brukerdokumentasjoner.- Last ned bildebehandling (Kode Opplysning File) eller den nyeste versjonen på http://www.ohsu.edu/nan. Åpne Matlab og laste wfiread programvare (som allerede er satt i standardbanen).
- Se den rå bildesekvensen og bestemme regionen av interesse. Velg det området av stabelen som skal behandles i venstreklikke og dra en boks rundt det ønskede området. Hvis regionen av interesse ikke ble redusert i løpet av oppkjøpet (til ca 256x256 piksler), velg et mindre område å minske beregne tid. Å fjerne merkingen av et område og behandler hele rammen, høyreklikk hvor som helst i the image.
- Skriv inn utvalget av rammer for å bli behandlet.
- Velg en gull partikkel (en som er isolert og ensartet i form) ved å venstreklikke på bildet og dra en liten boks rundt det. Under Particle Tracking, klikker du på Track-knappen. Et diagram vises som viser posisjonen av den valgte gull partikkel tvers over stabelen av bilder, som viser graden av drift.
- Gjenta denne prosessen for å spore så mange gullpartikler som mulig og bestemme de som sporer sammen (partiklene vil være fargekodet). Ideelt den samlede drift er i størrelsesorden én piksel på de fleste.
- Individuelt velge gullpartikler som spores sammen en om gangen, og klikk på Legg til markør-knappen under Particle Tracking. En grønn kors vil vises som angir at det er blitt tilsatt som en markør, og vil bli brukt til å korrigere for drift.
- Juster Sigma Range, Smoothing Range og Threshold som er nødvendig ved å endre verdiene litt. Klikk på Finn Partikkelknappen for å teste innstillingene. Partiklene som skal behandles skal pakkes, og de som ikke vil bli utelatt. De PAmCherry1 molekyler, partikler som er forholdsvis rund og lyse, bør velges.
- Begynn å behandle bildene ved å klikke på Make Koord File knappen og lagre filen.
Merk: Programmet vil gå gjennom hver ramme innenfor det definerte bildeutvalg, finne alle fluorescerende flekker, og utføre Gaussian passende å finne tyngdepunkt koordinater. En .cor filen vil bli generert lagring av alle koordinater og andre passende parametere av den bearbeidede enkelt molekyl bilder.
- Post-prosessen bildene og gjengi PALM bilde
Merk: Annen programvare kan direkte gjengi bildet etter koordinere utvinning.- I Matlab, lansere 'palm' pakke og laste .cor fil nettopp opprettet.
- Før rende PALM bildet ved hjelp av koordinatene, sortere de enkelte koordinater (hver fra en 'localizatipå arrangementet '). De optimale sorterings verdiene kan variere avhengig av oppsett og fluorophore.
- For PAmCherry1 bruke følgende verdier: Kombinere Frame - 8; Kombinere Avstand (nm) - 100; Minimum RMS - 4; Minimum Fit Godhet - 0,25; og Max. Eksentrisitet - 1.4. Se diskusjon seksjon for ytterligere forklaring av disse parametrene.
- Klikk på Sorter-knappen for å generere et nytt sett med koordinater klar for å gjengi bilder med høy oppløsning.
- Angi verdier for riktig gjengivelse av det endelige bildet som rå pikselstørrelse (nm), funksjonen størrelse (nm) i det gjengitte bildet ønsket, og pikselstørrelse for den gjengitte bildet.
Merk: rå pixel størrelse må bestemmes for hvert oppsett. Den gjengitte trekk størrelse kan innstilles vilkårlig, men blir typisk satt til en verdi litt høyere enn den gjennomsnittlige lokalisering presisjon. For PAmCherry1 er den gjennomsnittlige lokalisering presisjon rundt 18 nm, så en funksjon størrelse mellom 20 - 30 nm er appropriate. Av notatet, ble lokaliseringen nøyaktighet beregnes ved å ta standardavviket av lokaliseringene av samme molekyl over flere rammer 22, og ikke ved å dele diffraksjonsgrensen med kvadratroten av antall fotoner detektert. Som for piksler for det gjengitte bildet, er 10 nm et godt utgangspunkt; sette denne verdien for lavt vil føre til unødvendig store bildefiler for uforstørrede utsikt. - Klikk på Render knappen for å generere PALM bildet. Bruk +/- forstørrelses ikonene på verktøylinjen i figuren vinduet for å zoome inn og ut.
- Valgfritt: Utfør cluster analyse av den rekonstruerte PALM bildet ved hjelp av enten Ripleys K test eller andre mekanismer som simulering assistert DBSCAN (SAD) 23. Merk: I den tilpassede palm pakken, er begge Ripleys K og SAD analyse allerede bygget inn; for koordinater generert fra annen programvare, kan de samme analysene utføres med flere tilpassede skript.
3. Enkelt Molecule Tracking i levende celler - Behandl vevskultur overflate og plate cellene, som beskrevet i protokoll 2. Siden temperaturen og / eller CO 2 kontrollert trinn kan kreve en viss kulturskål, sørge for at dekkglass har den riktige tykkelse (0,17 mm) for mikroskopi oppsett.
- Transfektere celler hvis gjør en transient ekspresjon og utføre behandlinger som trengs for forsøket, slik som tetracyklin for å indusere ekspresjon, og inkuberes etter behov. Dette er også den samme som beskrevet i protokoll 2.
- Plasser dyrkningsskålen på en på scenen kuvøse. La retten avgjøre på scenen i noen minutter før temperaturen og CO 2 -konsentrasjon stabilisere hver gang etter montering dyrkningsskålen eller flytte til en ny region av interesse. Block lasere på dette trinnet. Dersom CO 2 kontroll ikke er tilgjengelig, endre til en CO 2 uavhengige media rett før bildebehandling, for eksempel Leibovitz L-15.
Merk: Fenol-rød-free medium anbefales for deprimerende bakgrunn fluorescens.
- Hente bilder som i protokoll 2. imidlertid sette en passende eksponeringstid (typisk 25-50 msek for PAmCherry1).
Merk: molekyl tetthet må være lavere enn for faste cellene slik at banene kan tas opp uten overlappende med hverandre. De angitte noen titalls molekyler er typisk for en 256x256 bildeelement anskaffelse på pikselstørrelse på ca 160 nm. Den 561 nm laser strømtetthet ble satt til 0,8 kW / cm 2 for å opprettholde en god signal-til-støy-forholdet, mens reduksjon av fototoksisitet til celler og øke den gjennomsnittlige banelengden. - Behandle bildene.
- Pakk koordinatene til enkle molekyler med wfiread pakken som beskrevet i protokoll 2, eller med en annen pakke.
- Rekonstruere enkelt partikkel baner ved hjelp av ulike enkelt partikkel sporing (SPT) pakker basert på ulike algoritmer funnetandre steder 24. Merk: Alternativt kan dette trinnet gjøres ved hjelp av hjemme bygget Matlab pakken (muligens tilgjengelig i fremtidige revisjoner på http://www.ohsu.edu/nan.
- Valgfritt: Etter rekonstruksjon, må du bruke en SPT pakke 24 for å beregne fortrengning og diffusjon konstanter fra banene. I tillegg bruker variasjons Bayes single-partikkel sporing (vbSPT) 25 for å bestemme diffusjon statene målproteinene. vbSPT Matlab pakken og dokumentasjon kan bli funnet på sin offisielle Sourceforge site: http://vbspt.sourceforge.net/.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den BiFC-PALM eksempel vises er Kras G12D mutant samspill med Ras bindende domene (RBD) av Craf (figur 1A). Som nevnt tidligere, ble det RN eller RC-fragmenter ikke knyttes til den C-terminale ende av Ras fordi det ville forstyrre membranen lokalisering og dermed den biologiske aktiviteten av Ras. Dette reduserte de mulige kombinasjonene 8-4 (figur 1B). Hver av disse fire kombinasjoner ble innført i U2OS celler ved hjelp av lentiviral infeksjon. Cellene ble løst som beskrevet i protokollen, og de BiFC signalene ble evaluert ved hjelp av en PALM oppsett. Celler med positive BiFC signaler ble identifisert ved den brå økning i fluorescens ved 405 nm laser ble slått på; den 561 nm laser var på hele bildebehandling eksperimentet. Denne brå endring i fluorescens er på grunn av den fotoaktivering av BiFC-rekonstituert PAmCherry1 ved belysning med en 405 nm laser. Flere områder i prøven ble evaluert ved anvendelse av denne tilnærmingenOg BiFC signalintensiteten ble beregnet som gjennomsnittet av økningen i bildeelementintensitetene før og etter en kraftig puls fra 405 nm laser.
Som vist i figur 1C, ut av de fire mulige konfigurasjoner, to konfigurasjoner (nemlig Rn Ras / RC-Raf RBD og RN-Ras / Raf RBD-RC) hadde sterke BiFC signaler. En annen konfigurasjon (RC-Ras / Raf RBD-RN) hadde svakt signal, og man hadde ikke noe signal. For alle etterfølgende eksperimenter, ble den RN-Ras / Raf RBD-RC-konfigurasjonen (øverst til høyre i figur 1C) brukt. Som en negativ kontroll ble en punktmutasjon (R89L) i Ras bindingsdomene av Raf introdusert og BiFC effektivitet ved å bruke den samme konfigurasjonen ble testet. Denne mutasjonen var kjent for å forstyrre Raf binding til Ras; gående, mutasjonen sterkt redusert BiFC signal (figur 1D).
Siden PAmCherry1 molekyler som genereres gjennom BiFC viste lignende fotoaktivering egenskapene til den opprinneligePAmCherry1 10, gjør dette for PALM avbildning av BiFC prøver å bruke de samme eksperimentelle innstillinger som med den overordnede PAmCherry1. Et eksempel PALM bilde av celler med sterk BiFC signal etter infeksjon med RN-Ras og Raf RBD-RC er vist i figur 2A.
Når zoomet inn (figur 2A nederst til venstre og innfellinger, med forstørret områder eske), individuelle molekyler og deres nanoskala romlige fordelingen kan sees tydelig. Av notatet, hver prikk i disse Palm bildene representerer en antatt Ras-Raf RBD kompleks merket med en PAmCherry1 molekyl. For sammenligning ble den høyre siden av figur 2B simulert lavoppløselige bilder av de samme synsfelt, hvor klyngene ble helt uklar. Observasjon av Ras-Raf RBD klynger er i samsvar med tidligere observasjoner om clustering oppførselen til Ras og Raf.
Med levende celler uttrykker BiFC rekonstituert PAmCherry1, smt-PALM var gjengivelseRMED å tilegne diffusjon baner av individuelle Ras-Raf RBD komplekser, på samme måte som tidligere beskrevet 10. Under kontinuerlig belysning med 561 nm og 405 nm lasere, individuelle PAmCherry1 molekyler stokastisk slå på og vare noen rammer før vi går mørke tilstander (delvis på grunn av fotobleking). I denne periode, molekylene oppviste minst to forskjellige virkemåter diffusjon: en immobile tilstand (figur 2B, molekyl 1) og en mobil tilstand (figur 2B, molekyl 2). Begge typer baner er tydelig tilstede i (x, y) plottet vist i figur 2C, der baner av flere molekyler er registrert. Det samme heterogen fordeling av diffusjon tilstander kan utledes fra histogrammet av molekylær forskyvning mellom påfølgende rammer. Vanligvis 10000 - kan 100 000 diffusjon baner bli kjøpt fra hver celle; Dette store antall sørger for mer nøyaktig statistisk analyse av than diffusjon stater, for eksempel med vbSPT algoritmen 25.
Figur 1. BiFC-PALM eksperimentell design av Ras-Raf samhandling. (A) Ras er et membranbundet protein som rekrutterer Raf når aktiv. Når ikke-fluorescerende split PAmCherry1 fragmenter er festet til Ras og Raf, bringer interaksjonen fragmentene sammen og komplementering forekommer, noe som resulterer i en funksjonell fluorescerende protein. (B) Etter merking av Ras ved sin C-terminale ende ville forstyrre dens membran lokalisering, ble antall konfigurasjoner testet for Ras-Raf-BiFC PALM redusert fra 8 til fire. (C) bilder fra U2OS celler som uttrykker de testede konfigurasjoner som er tatt med et mikroskop TIRF. For å måle effektiviteten av BiFC hver konfigurasjon, blir cellene gitt samme høye dosering av 405 nm lys mensblir spent med 561 nm lys. (D) presenterer R89L mutasjonen inn i Raf RBD sterkt redusert BiFC signal av RN-Kras G12D / Craf RBD-RC konfigurasjon (øverst til høyre i C, n = 5-8). Feilfelt er SEM i (D). Skala barer i (C), 10 mikrometer. RN = PAmCherry1 N-terminale fragment, RC = PAmCherry1 C-terminale fragment, og RBD = Ras bindende domene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. BiFC-PALM av U2OS celler som uttrykker RN-Kras G12D / Craf RBD-RC konfigurasjon. (A) En hel PALM bildet er vist ovenfor. Lavere paneler er forstørret utsikt over eske regionene i øvre bilde som angitt. Innfellinger er høyereforstørrelser av eske regionene i de respektive forstørrede utsikt. På høyre side av nedre paneler (merket TIRF) er representasjoner av bildene på deres venstre side som om tatt med en diffraksjon-begrenset mikroskop. (B) Skiftende rammer fra en levende celle smt-PALM eksperiment som skildrer trege (1) og raske (2) bevegelige Ras-Raf komplekser. (C) Utgang fra en smt-PALM eksperiment viser diffusjon baner av Ras-Raf komplekser innenfor et lite område i en celle. (D) Histogram av forskyvninger per bilde av Ras-Raf komplekser fra en smt-PALM eksperiment. Skala barer i (A), 5 mikrometer topp, 500 nm bunn, 50 nm innfellinger, og (C), 1 mikrometer. RN = PAmCherry1 N-terminale fragment, RC = PAmCherry1 C-terminale fragment, og RBD = Ras bindende domene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Primer-sekvens (5 'til 3') | |
| Kloning plasmid for innføring i N-terminus revers | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| RN på N-terminale frem | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RC på N-terminale frem | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| Kloning plasmid for innføring i C-terminus fremover | TAAAAGGGTGGGCGCGCC |
| RN fra C-terminalen revers | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| RC fra C-terminalen revers | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
Tabell 1. Primere for linearisering av klonings plasmider inneholdende PAmCherry1 fragmenter. Kloningen plasmider innehold RN og RC kan lineariseres med invers PCR ved punktet for innsettingen på enten N- eller C-terminus av fragmentene. Sekvenser er oppført 5 'til 3R17 ;.
| Overheng for genet av interesse primere (5 'til 3') | |
| N-terminal innsetting RN eller RC fremover | GAGCTCGGTACCATG |
| N-terminal innsetting RN revers | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| N-terminal innsetting RC revers | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| C-terminale innsetting RN fremover | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminale innsetting RC fremover | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminal innsetting RN eller RC revers | GCGCCCACCCTTTTA |
Tabell 2. Overheng for genet av interesse primere som svarer til tabell 1 primere. De 15 basepar av homologi for ligeringsuavhengig reaksjon blir generertfra primer overheng. I tillegg er overheng omfatter sekvensen for et (GGGGS) x2 fleksibel linker. Den fleksible linkersekvens kan tilsettes til primerne i tabell 1 i stedet. Sekvenser er listet 5 'til 3'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiFC har vært en vanlig brukt teknikk for å detektere og å visualisere PPIer i celler, mens PALM er et nylig enkelt molekyl superresolution mikros teknikk som gjør det mulig nanoskala avbildning av intakte biologiske prøver. Kombinasjonen av BiFC med PALM oppnås selektiv avbildning av PPIs inne i en celle med nanometer romlig oppløsning og enkelt molekyl følsomhet. BiFC-PALM strekker nytten av begge teknikkene, og som demonstrert i dette arbeidet, viser store løftet i å avsløre de molekylære detaljene PPIs på sitt eget mobil sammenheng. Spesielt lar nanometer oppløsning for detaljert undersøkelse av romlig og tidsmessig regulering av spesifikke PPIs på molekylært skala, som har vært en utfordring i biomedisinsk forskning. Imidlertid, som nevnt før, er BiFC-PALM begrenset av irreversibilitet av komplemente og langsom kromofor modning.
Split PAmCherry1 ble anvendt for å demonstrere prinsippet og ulitet av BiFC-PALM. PAmCherry1 har vært mye brukt i Palm eksperimenter for sine gode photophysical egenskaper. En ytterligere fordel med å bruke PAmCherry1 som BiFC sonden er lav bakgrunn og høy spesifisitet og effektivitet i protein rekonstitusjon ved 37 ° C når det er koplet til PPIer. Av disse grunner, er det delte PAmCherry1 BiFC probe forventes å bli en verdifull ressurs som gjelder for mange ulike biologiske undersøkelser som involverer høyoppløselig avbildning av protonpumpehemmere. I tillegg til PAmCherry1, en photoconvertible fluorescerende protein, mEos3.2, ble også delt for BiFC-PALM 26. Fordi deres utslipps spektrum overlapper, kan mEos3.2 og PAmCherry1 ikke brukes sammen, men grønn PA-FPS har nylig blitt rapportert 27, åpner muligheten for to-farge nanoskala superresolution avbildning av protonpumpehemmere.
Som i konvensjonell BiFC, et avgjørende skritt i å implementere BiFC-PALM er design og kloning av fusjonskonstruksjonene. Det faktum at opptilåtte forskjellige ekspresjonskonstruksjoner må klonet og åtte BiFC parene må testes i hvert forsøk på å implementere BiFC og BiFC-PALM kan være en langtekkelig, hvis ikke uoverkommelige, prosess. Ikke desto mindre, som vist på Ras-Raf eksempel tidligere kunnskap om de biokjemiske og strukturelle egenskaper av proteiner av interesse ofte kan benyttes for å lede en optimalisert konstruksjon av fusjonskonstruksjonene med et redusert antall BiFC par som skal testes. Når det er sagt, i dag er det ikke en universell rettesnor for å sikre at en BiFC (derav BiFC-PALM) eksperiment ville fungere; mye av det er fortsatt en kunst.
Mens BiFC og BiFC-PALM brukes typisk for å undersøke heterodimerdannelse mellom to proteinene, er det også mulig å studere homodimerdannelse ved hjelp av disse fremgangsmåter, i hvilket tilfelle de to kandidatproteinene ville være den samme. Imidlertid, som sådan, kan to proteiner med den samme fragmentet samvirke, men resulterer ikke i BiFC signal. Til tross for hver konstruksjon fungerer somen konkurrerende inhibitor til de andre, slike interaksjoner er reversible, mens interaksjoner resulterer i vellykket komplementering ville hope seg opp på grunn av den irreversibilitet. Generelt sett kan det være en reduksjon i signal hvis det er en drastisk forskjell mellom ekspresjonsnivåer for hver konstruksjon. Derfor kan ekspresjonsnivåene for de to konstruksjoner må bestemmes ved sammenligning av fluorescens-intensitet (f.eks, mellom villtype og mutante homodimer prøver) på endogene ekspresjonsnivåer. Dette er kanskje grunnen BiFC eksperimenter blir ofte utført med forbigående transfections og overekspresjon av konstruksjonene.
Sist men ikke minst, må alle BiFC eksperimenter bekreftes med forsvarlig kontroll. Hvis BiFC signal er til stede, er det en sjanse for at signalet er ikke-spesifikke (dvs. at fragmenter rekonstituering på egenhånd, og ikke på grunn av PPI). En negativ kontroll er mutasjoner i enten eller begge proteiner som er kjentå forstyrre samspillet, som skal resultere i et betydelig tap av BiFC signal. Hvis en slik punktmutasjon er ukjent, kan andre metoder anvendes, slik som innføring av en kompetitiv bindingspartner til ett av proteinene, og se om det er en samtidig reduksjon i signal.
Jo mer vanskelig situasjon er feilsøking mangel på BiFC signal, eller falske negative. I slike tilfeller er det viktig å ta med positive kontroller under kloningsprosessen, for eksempel et GFP kontroll under transfeksjoner. Western blot kan kjøres for å kontrollere ekspresjon av konstruksjonene. Dersom disse faktorene er normal, kan andre faktorer må bli endret, slik som linker lengde og / eller sekvens, eller en annen BiFC konfigurasjon bør vurderes.
Som for håndflatepartiet, må betraktes som en rekke parametre under behandling av bildene. Trinn 2.4.2.1 beskriver parametrene som brukes for sortering koordinatene og generere den endelige PALM bildet. Den førsteto parametre, som kombinerer Frame og kombinere Avstand, definere om to lokaliserings hendelser er begge innen 100 nm og synes mindre enn 8 rammer (100 msek / ramme) eller ~ 0,8 sek fra hverandre som vi tidligere beskrevet 23. Hvis ja, så vil de bli vurdert å oppstå fra det samme molekylet, og deres koordinater vil bli kombinert ved gjennomsnitt. Mørke stater med levetid mye større enn 0,8 sek for PAmCherry1 synes å være sjeldne; som det oppstår en fluorofor utvinne fra en langlivet mørk tilstand ikke kan skilles fra et annet molekyl i en proksimal avstand mitterende fluorescens, er to lokaliserings arrangement anses for å være forbundet med samme molekyl bare hvis de først i løpet av et visst antall bilder og fysisk avstand. Empirisk, vises en "kombinere ramme" innstilling på 8-12 rammer (0,8-1,2 sek) for å være optimal i henhold til våre eksperimentelle forhold. Minimum RMS definerer det minimale forhold mellom passende amplitude og standardavviket for rester støy etterbeslaget. Disse verdiene blir registrert i .cor filen under koordinere utvinning.
I sammendraget, kombinerer BiFC-PALM fordelene ved BiFC og PALM og muliggjør undersøkelse av PPIs i mye større detalj enn hva som er oppnådd tidligere. Med hensyn til de faktorene ovenfor, og med riktig kontrollforsøk, bør BiFC-PALM være et nyttig verktøy for å studere PPIs i et bredt spekter av biologiske innstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope frame | Nikon | Ti-U | |
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | CFI Apo TIRF 60x H | |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Opto Engine | MGL-FN-561 | |
| 405 nm laser | Coherent | CUBE-405 50mW | |
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25x36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | Tokai Hit | INUBG2ATW-PLAM | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 ml tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 ml tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
References
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
- Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
- Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589 (2014).
- Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171 (2013).
- Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
- Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
- Seidman, C. E., Struhl, K., et al. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Coligan, J. E., et al. Appendix 4, 4D (2001).
- Morrison, S. L.
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
- Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
- Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).
