Introduction
Interazioni proteina-proteina (PPI) sono fondamentali per la biologia 1 e sono strettamente regolati attraverso meccanismi spazio-temporali attraverso molte tempo e lunghezza scale. Gli studi sulla segnalazione cellulare sulla membrana cellulare, ad esempio, hanno rivelato dinamici, scompartimenti spaziali nanoscala che facilitano PPI specifici e processi cellulari 2. Quindi, la capacità di sondare PPI nei sistemi biologici con risoluzioni sufficienti spaziali e temporali, alta specificità e sensibilità elevata è la chiave per raggiungere una comprensione meccanicistica della biologia.
Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) è uno dei pochi strumenti esistenti per la visualizzazione PPI in una cella con una risoluzione subcellulare e compatibilità live-cell 3-5. La tecnica è relativamente semplice e comporta frazionamento di una proteina fluorescente in due frammenti non fluorescenti; quando geneticamente etichettati per due proteine che interagiscono eportato in prossimità, i frammenti possono ricostituire per formare una proteina fluorescente completo, producendo segnale fluorescente. Se correttamente progettato, le sonde BiFC non dovrebbero ricostituire spontaneamente, in assenza di PPI. Come tale, il segnale di fluorescenza in un saggio BiFC sorgerà solo in presenza degli IPP, che consente la visualizzazione diretta degli IPP con elevata specificità. Ulteriori vantaggi di utilizzare la fluorescenza come la lettura sono alta sensibilità, risoluzione subcellulare, e compatibilità con l'alta produttività e alta test di screening di contenuti, tra gli altri. Per queste prestazioni, sono stati sviluppati una serie di sonde BiFC a base di proteine fluorescenti genitore differenti. Come in tutte le altre tecniche di rilevazione basate sulla microscopia luce convenzionale, tuttavia, la risoluzione spaziale di BiFC è limitata a ~ 250 nm dalla diffrazione della luce. Questo lo rende una sfida per studiare la regolazione di PPI su scala nanometrica, che, come accennato in precedenza e esemplificato da un raft lipidici 6nd nanocluster Ras 7, è una scala di lunghezza fondamentale per comprendere molti processi cellulari, come la segnalazione.
BiFC è stato combinato con la microscopia localizzazione fotoattivato (PALM) 8,9 per superare questo limite a risoluzione spaziale per l'imaging PPI 10. PALM è una recente tecnica di microscopia Super Risoluzione che aggira il limite di diffrazione di imaging di fluorescenza attraverso l'attivazione stocastico e localizzazione subdiffractive di molecole fluorescenti singoli. In ogni ciclo di attivazione, una molecola fluorescente emette poche centinaia a qualche migliaio di fotoni e dà luogo ad una singola immagine Molecola sul rivelatore. Mentre l'immagine è diffrazione limitata (~ 250 nm in larghezza), il suo baricentro può essere determinata con precisione molto maggiore, tipicamente dell'ordine di 10-50 nm in funzione del numero di fotoni rilevati. Attivando e localizzare ogni molecola fluorescente del campione, una immagine ad alta risoluzione può essere ricostruita. Performed su cellule viventi, singola molecola tracking (all'SMT) PALM ulteriori permessi acquisizione di migliaia di traiettorie di diffusione proteine da una singola cella 11. È importante sottolineare che, PALM utilizza sonde fluorescenti specializzati come proteine fluorescenti fotoattivabile (PA-PQ) per ottenere l'attivazione stocastico. Dal momento che sia BiFC e proteine fluorescenti uso PALM, sono stati combinati dividendo PAmCherry1, un comunemente usato PA-FP per PALM, in due frammenti tra aminoacidi 159 e 160.
Il sistema basato su PAmCherry1 BiFC scissione mostra basso segnale di fondo da ricostituzione spontanea dei due frammenti. Quando geneticamente etichettato ad una coppia di proteine interagenti, i due frammenti (RN = residui 1-159; RC = Met + residui 160-236) ricostituito in modo efficiente per formare le proteine complete PAmCherry1 anche a 37 ° C e senza incubazione a temperature più basse, che non è il caso per altre coppie BiFC 12, come il genitore mCherry 13. Furthermore, la proteina PAmCherry1 ricostituito mantenuto le proprietà fotofisiche del PAmCherry1 genitore, come l'elevato rapporto di contrasto, resa fotoni media, e fotoattivazione veloce, tra gli altri, che sono fondamentali per la localizzazione precisa di singola molecola e immagini ad alta risoluzione PALM.
In questo protocollo, l'uso di BiFC-PALM per l'imaging interazioni Ras-Raf in cellule U2OS utilizzando PAmCherry1 split (Figura 1A) è descritta. Il primo passo è quello di progettare i costrutti per l'espressione di proteine di fusione tra i frammenti PAmCherry1 (cioè, RN e RC) e le proteine di interesse. In teoria, per ogni coppia di proteine candidati (A e B), vi sono otto coppie di proteine di fusione da testare: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; e A-RC / B-RN. Spesso il processo può essere semplificato tenendo conto delle proprietà strutturali o biochimiche delle proteine candidate. Nel caso di Ras, la proteina èpost-traduzionale modificato nella casella CAAX C-terminale (C = Cys; A = alifatici; X = qualsiasi), dopo di che il motivo AAX viene aperto fuori. Quindi, RN o RC possono essere fuse solo al N-terminale di Ras; Questo riduce il numero di coppie di proteine di fusione di quattro (Figura 1B). Per Raf, dominio Ras vincolanti (RBD; residui 51-131) viene utilizzato e possono essere contrassegnati su entrambe le estremità. Sono stati generati Queste quattro configurazioni di fusione: RN-Kras / RC-Raf RBD; RN-Kras / Raf RBD-RC; RC-KRAS / RN-Raf RBD; e RC-KRAS / Raf RBD-RN.
Inoltre, il linker tra i frammenti e le proteine di interesse deve essere considerato. Un linker flessibile di circa dieci amminoacidi è spesso usato in quanto fornisce sufficiente libertà per complementazione a verificarsi. Uno di questi è linker (GGGGS) x2, anche se ci sono molti altri che sono state applicate con successo, tra cui sequenze casuali generati da un sito di clonazione multipla (MCS) 14. La lunghezza dei linker può avere bisogno di essere ottimizzato depending delle dimensioni delle proteine di interesse e il loro orientamento quando interagenti.
I frammenti PAmCherry1 sono contenuti in una piccola spina dorsale di clonazione con accompagnamento MCSs (vedi Lista dei materiali). I geni di interesse possono essere inseriti attraverso i siti di restrizione o con un metodo di legatura indipendente. Dopo la verifica clonazione e la sequenza, la cassetta di espressione viene trasferito in un vettore di espressione mediante una reazione ricombinasi, un processo di clonazione con alta fedeltà e ad alta efficienza.
Successivamente, i costrutti di espressione risultanti vengono trasfettati nella linea cellulare di destinazione o, se una linea cellulare stabile è desiderato, confezionato in lentivirus per infettare la linea cellulare di destinazione. Trasfezione transitoria consente di convalida rapida delle configurazioni BiFC, ma i potenziali problemi deve essere notato. Trasfezione utilizzo di sostanze chimiche spesso sottolinea le cellule, con conseguente forte autofluorescenza; mentre l'uso di riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopy può attenuare questo segnale di fondo limitando il volume illuminazione, TIRF ideale quando le IPP avvengono sulla membrana cellulare. Inoltre, trasfezioni transienti portano spesso ad alti livelli di espressione della proteina, di gran lunga superiori a quelli delle proteine endogene, che possono causare artefatti nel rilevare i PPI. Pertanto, si raccomanda che le linee cellulari stabili essere stabiliti dopo una configurazione BiFC appropriata è stata determinata attraverso prove iniziali. Linee cellulari stabili hanno anche la possibilità di espressione sintonizzabile tramite induzione doxiciclina 15.
Dopo l'infezione, le cellule sono selezionate con antibiotici, tipicamente puromicina e neomicina, uno per ciascun costrutto. Le fasi successive per la preparazione del campione, l'acquisizione delle immagini, e l'analisi dei dati verranno descritti in dettaglio nei protocolli.
Con questo approccio, la formazione di cluster in nanoscala nelle immagini BiFC-PALM di Ras-Raf RBD sono comunemente osservati (Figura 2A </ strong>). Coerentemente, traiettorie SMT-PALM di Ras-Raf RBD mostrano una distribuzione eterogenea negli stati di diffusione (figura 2B-D). Questi risultati suggeriscono che esistono complessi Ras-Raf in più stati sulla membrana cellulare, presumibilmente come monomeri e cluster, con potenziali implicazioni biologiche. Questo lavoro dimostra la potenza di BiFC-PALM nell'imaging selettiva di PPI in cellule con nanometrica risoluzione spaziale e sensibilità singola molecola, che sarebbe difficile da ottenere con BiFC convenzionale, a fluorescenza co-localizzazione o la risonanza di fluorescenza trasferimento di energia (FRET).
Nel progettare gli esperimenti BiFC e interpretare i risultati, è importante tenere a mente che il processo è irreversibile BiFC nella maggior parte dei casi, di cui PAmCherry1 spaccato. Una volta che i due frammenti uniscono e formano una proteina PAmCherry1 completa, il collegamento tra i due frammenti, e quindi la PPI diventa permanente. Questo limita l'uso di BiFC e BiFC-PALM per monitorare la dinamica dei PPI (cioè, la cinetica di legame e non la dinamica di diffusione del complesso proteico volta che è formata) e, a volte potrebbe anche portare alla mislocalization dei complessi PPI.
Un ulteriore fattore da considerare nella progettazione di esperimenti BiFC-Palm è il ritardo nella maturazione cromoforo che è insita in proteine fluorescenti. Dopo due proteine interagiscono ei frammenti FP si incontrano, in genere ripiegare dell'ordine di secondi (primo tempo di 60 sec per EYFP 3). Tuttavia, la successiva maturazione cromoforo e segnale fluorescente sviluppano dell'ordine di minuti. Mentre fluorescenza può essere rilevabile entro 10 minuti dopo la ricostituzione del split-Venere, un fast-pieghevole variante YFP, il primo tempo per la maturazione in generale è spesso circa 60 min 16. Split-PAmCherry1 è stato osservato ad avere tassi simili. Quindi, BiFC e BiFC-PALM sono scelte attualmente poveri per monitorare la cinetica PPI in tempo reale; altro mithods, come FRET e dimerizzazione recentemente sviluppato proteina fluorescente dipendente 17, può essere più adatto per questo scopo.
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Protocol
1. Clonazione
- Determinare le configurazioni per clonare e scegliere un linker. Proteine tag con i frammenti sul N- o C-terminale come descritto di seguito in modo da non interrompere la loro localizzazione corretta. Utilizzare un linker flessibile come (GGGGS) x2.
- Geneticamente contrassegnare le proteine di interesse ai frammenti PAmCherry1. Come un'opzione, utilizzare i plasmidi clonazione elencate nella Lista dei materiali contenente il frammenti RN (residui PAmCherry1 1-159) e RC (Met più residui PAmCherry1 160-236) con sequenze fiancheggianti MCS.
- Linearizzare i plasmidi contenenti i frammenti RN e RC con inversa PCR (o restrizione digest) nel punto di inserimento. Primer per PCR inversa sono elencate nella Tabella 1. Di seguito è riportato un protocollo PCR esempio utilizzato nel laboratorio dell'autore (vedi elenco dei materiali per i materiali esatti utilizzati in questo protocollo).
- Mescolare la reazione PCR insieme, portato ad un volume finale di 50 ml con acqua: a parete sottiletubo ed PCR, aggiungere l'acqua, 25 ml di 2x master mix, 0,5 microlitri ciascuno dei primer in avanti e all'indietro (20 mM azionari diluita, 0,2 micron concentrazione finale), e 1 ng di modello. Utilizzare le seguenti condizioni di ciclo: 98 ° C per 30 sec, 30 cicli di 98 ° C per 7 sec e 68 ° C per 2 min, ed una estensione finale a 72 ° C per 10 min.
- PCR dei geni di interesse per l'inserimento di plasmidi linearizzate contenenti frammenti RN e RC. Eseguire la PCR come al punto 1.2.1 con il tempo di estensione a 68 ° C. Utilizzare primer con strapiombi che contengono una sequenza linker flessibile, come GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT per (GGGGS) x2, e 15 paia di basi omologia con le estremità della RN linearizzato e plasmidi RC per ricombinazione.
Nota: I sbalzi di primer per le proteine di interesse sono presentati nella tabella 2 se si utilizza i primer in tabella 1 per linearizzare la spina dorsale plasmide. - Digerire la PCRreazione con Dpn1 per eliminare il template PCR. Aggiungere 0,5 ml di Dpn1 (20 U / mL) direttamente ai 50 ml di reazione PCR. Incubare a 37 ° C per 1 ora e calore inattivare a 80 ° C per 20 min. Se template di sfondo persiste nelle fasi successive, aumentare la quantità di enzimi o allungare il tempo di digestione.
- Purificare i prodotti di PCR con una colonna di spin come descritto dal produttore.
- Eseguire una reazione legatura indipendente per combinare un plasmide linearizzato contenente un infermiere o RC frammento con il gene di interesse. Misurare la concentrazione dei prodotti di PCR purificati: unire 50 ng di plasmide linearizzato e 50 ng del gene di interesse con 1 ml di enzima premix e portare il volume totale a 5 ml con acqua deionizzata. Incubare a 50 ° C per 15 min, posto su ghiaccio, e aggiungere 20 ml di tampone TE.
- Trasforma plasmidi ricombinanti in batteri competenti 18.
- Selezionare 2-4 + (a piacere) colonie per O / N cultura. Aggiungere 5 mldi brodo LB e 5 ml di kanamicina (50 mg / ml di brodo) in una provetta a fondo rotondo 14 ml in polipropilene, e aggiungere la colonia batteri selezionato con un ciclo inoculo sterilizzata. Incubare a 37 ° CO / N agitando a 225 giri al minuto.
- Congelare 1 ml di O / N cultura per stock di glicerolo 19 e Miniprep il resto come descritto dal produttore.
- Eseguire sequenziamento per determinare un buon clone. Se si utilizzano i plasmidi clonazione nella lista dei materiali, utilizzare M13 avanti e indietro primer (in reazioni separate) come necessario per ottenere la sequenza completa del costrutto di fusione. Confronto con la sequenza attesa utilizzando uno strumento di allineamento, come BLAST dal National Center for Biotechnology Information (NCBI) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- Trasferire i costrutti sequenza verificata ad un plasmide di espressione attraverso una reazione ricombinasi.
- Aggiungere 75 ng della destinazione plasmide & #8212; quali pcDNA per trasfezioni transienti o Plenti per imballaggio lentivirali 20 - e 50 ng della clonazione plasmide ricombinante a 1 ml di enzima premiscelato e portare il volume totale a 5 ml con acqua deionizzata. Incubare a 25 ° C per 1 ora, quindi aggiungere 5 ml di tampone TE.
Nota: Per il confezionamento lentivirale e generazione linea cellulare stabile, utilizzare un diverso plasmide destinazione per ogni costrutto, per esempio, una resistenza puromicina e l'altra neomicina. Ciò consente di doppia selezione delle cellule trasdotte. Considerare anche il promotore per ciascuno, come il promotore del citomegalovirus costitutiva (CMV) per elevati livelli di espressione, o CMV con l'operatore per Teto espressione doxiciclina regolata sintonizzabile. - Trasforma 5 ml in batteri competenti e Miniprep i plasmidi come nei passaggi 1.2.6 a 1.2.8, ma utilizzando l'antibiotico appropriato (tipicamente ampicillina).
- Aggiungere 75 ng della destinazione plasmide & #8212; quali pcDNA per trasfezioni transienti o Plenti per imballaggio lentivirali 20 - e 50 ng della clonazione plasmide ricombinante a 1 ml di enzima premiscelato e portare il volume totale a 5 ml con acqua deionizzata. Incubare a 25 ° C per 1 ora, quindi aggiungere 5 ml di tampone TE.
- Linearizzare i plasmidi contenenti i frammenti RN e RC con inversa PCR (o restrizione digest) nel punto di inserimento. Primer per PCR inversa sono elencate nella Tabella 1. Di seguito è riportato un protocollo PCR esempio utilizzato nel laboratorio dell'autore (vedi elenco dei materiali per i materiali esatti utilizzati in questo protocollo).
- Determinare la ottimaleConfigurazione BiFC.
- Co-trasfezione espressione plasmidi in cellule U2OS (o cella di scelta).
- Aggiungere 350 ml di fenolo DMEM-rosso liberi e senza antibiotico integrato con il 10% FBS in ogni pozzetto di un 8-bene # 1.5 vetrino camera inferiore. Piastra circa 7,5 x 10 4 cellule per bene in modo cellule sono circa il 70% -90% confluenti il giorno successivo.
- Il giorno dopo la placcatura plasmidi di espressione, co-trasfezione con diverse configurazioni in ogni pozzetto usando il reagente preferita e come descritto dal produttore.
- Per ciascun pozzetto, aggiungere 125 ng di ciascun plasmide di espressione in 50 ml di mezzi ridotte senza siero in una provetta 0,6 ml e pipettare su e giù per mescolare. Aggiungere 1 ml di reagente di trasfezione lungo il centro del tubo e direttamente nel supporto. Agitare delicatamente per mescolare e lasciare che la reazione riposare per 30 minuti.
- Ridurre i media in ogni pozzetto del vetrino da camera di circa la metà. Aggiungere goccia a goccia miscela di trasfezione ai pozzetti e agitare gtemente per mescolare. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 24-48. Modificare i media il giorno dopo la trasfezione.
- Celle di immagine su un microscopio a fluorescenza, come nel protocollo 2 che iniziano con il passaggio 2.1.4.
Nota: Il campione può essere stampato su un microscopio a fluorescenza standard se i livelli di espressione sono alti e la fotocamera è abbastanza sensibile per l'emissione di fotoni relativamente bassa di PAmCherry1. Molecole PAmCherry1 ricostituiti possono essere attivate con un set di filtri ultravioletti (405 nm) prima di imaging con una di eccitazione verde (561 nm) set di filtri.
- Co-trasfezione espressione plasmidi in cellule U2OS (o cella di scelta).
- Se del caso, creare un controllo negativo, ad esempio, l'introduzione di una mutazione puntiforme in una delle proteine di interesse che interrompono l'interazione. Eseguire una mutagenesi sito-diretta 21 sul plasmide clonazione della proteina da mutato e della configurazione scelta.
- Genera una linea cellulare stabile confezionamento costrutti in viraleparticelle e infettare le cellule U2OS (o linea cellulare di scelta). Si consideri un sistema inducibile (tetracicline) espressione 15 così espressione può essere indotta prima di imaging se irreversibilità prolungata di BiFC è un problema, o se l'espressione sintonizzabile è desiderato.
ATTENZIONE: Lavorare con i virus è classificato come livello di biosicurezza 2. Mentre le recenti generazioni di sistemi di confezionamento virali hanno notevolmente ridotto la probabilità di produrre virus capaci di replicazione, alcuni rischi sono ancora presenti. I riferimenti possono essere trovati a http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.- Ripetere il punto 1.2.10 utilizzando una destinazione vettore retrovirale lenti- o 20. Aumentare il / cultura O N per 100 ml per un midiprep e una maggiore purezza dei plasmidi.
- Il 1 ° giorno: Piatto circa 2 x 10 6 293T / 17 cellule in un piatto 10 cm per ogni costrutto da confezionare.
- Il giorno 2: Preparare una reazione trasfezione con un menù tradizionalereagente nsfection di scelta e come descritto dal produttore.
- Preparare una premiscela di imballaggio plasmidi con concentrazioni finali di 250 ng / ml per plasmidi Confezioni 1 e 2, e 100 ng / ml per il confezionamento plasmide 3 in acqua sterile. Aggiungere 10 ml di premiscelato imballaggio plasmide e 2,5 microgrammi di plasmide obiettivo di 1 ml di mezzi ridotti senza siero in 5 ml in polipropilene tubo a fondo rotondo e pipetta su e giù per mescolare. Aggiungere 20 ml di reagente di trasfezione lungo il centro del tubo e direttamente nel supporto.
- Agitare delicatamente per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 30 min. Rimuovere circa la metà dei mezzi dalle cellule e aggiungere la miscela di trasfezione in maniera goccia a goccia. Agitare delicatamente per mescolare e incubare a 37 ° C e 5% di CO 2. Incubare 10 ml di supporti per piastra in una provetta con tappo allentato temperatura e CO 2 equilibrazione.
- Il giorno 3: cambia delicatamente la media con i media pre-incubati e return per le cellule per l'incubatore. Incubare un altro tubo di media con il tappo allentato.
Nota: sincizi, o la formazione di grandi cellule di multi-nucleate, può essere un segno che l'imballaggio sta andando bene. Tuttavia, le cellule sono in uno stato fragile e può essere facilmente rimosso. Quando cambia il supporto, inclinare il pipettatore modo che sia orizzontale e aggiungere goccia a goccia in un supporto bordo della piastra. - Il giorno 4: raccogliere il virus rimuovendo il materiale con una siringa e filtrando attraverso un filtro con 0,45 micron pori in una provetta pulita da 50 ml. Sostituire delicatamente i mezzi di comunicazione con i media pre-incubate.
- Il giorno 5: Raccolta di nuovo come fatto in precedenza al punto 1.5.3.3 e combinare filtrato comune nello stesso tubo da 50 ml. Aggiungere 6 ml di concentratore virus per ciascuna provetta e mescolare. Conservare a 4 ° C per almeno 24 ore fino a quando i precipitati virus.
Nota: A seconda della salute delle cellule, virus può essere raccolto un terzo tempo. - Concentrare il virus per centrifugazione a 1.500 xgper 15 min a 4 ° C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 250 ml di media. Virus può essere utilizzato immediatamente per infezione o conservato in aliquote di 50 microlitri a -80 ° C fino a un anno.
- Piatto circa 3 x 10 5 U2OS (o target) cellule per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti (2 ml di DMEM con 10% FBS per pozzetto) per infezione, in modo cellule sono circa il 50% confluenti al momento dell'infezione.
- Il giorno seguente, rimuovere circa la metà della media in modo circa 1 ml resti. Coinfect con 50 ml di virus concentrati per ogni costrutto. Aggiungere 1 ml di polibrene (8 mg / ml) in ciascun pozzetto. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2. Cambiare media il giorno successivo e incubare per un altro giorno prima selezione antibiotica.
Nota: La quantità di virus da aggiungere può variare a seconda del tasso desiderato di infezione. I virus possono essere titolati utilizzando qRT-PCR. - Aggiungere antibiotici selezionare per cellule infette. Pozzetti separati con cellule non infettate che non hanno visto virus sono tenuti come canarini per testare l'efficacia della selezione. Incubare per 2-7 giorni, o fino a quando la selezione è completa.
Nota: Le concentrazioni efficaci dovrebbero essere titolati inizialmente, ma sono tipicamente 1,0 ug / ml di puromicina e 1,0 mg / ml di neomicina. - Espandere le cellule in una più grande 10 centimetri piatto e procedere al protocollo 2.
- Preparare una premiscela di imballaggio plasmidi con concentrazioni finali di 250 ng / ml per plasmidi Confezioni 1 e 2, e 100 ng / ml per il confezionamento plasmide 3 in acqua sterile. Aggiungere 10 ml di premiscelato imballaggio plasmide e 2,5 microgrammi di plasmide obiettivo di 1 ml di mezzi ridotti senza siero in 5 ml in polipropilene tubo a fondo rotondo e pipetta su e giù per mescolare. Aggiungere 20 ml di reagente di trasfezione lungo il centro del tubo e direttamente nel supporto.
2. Imaging fisso Celle
- Preparare un campione per l'imaging
- Pulire 8 e # 1.5 fondo di vetro scorrevole camera aggiungendo 250 ml di 1 M NaOH per almeno 1 ora e lavare con PBS.
Nota: camera di diapositive non trattati tipicamente provocano alto segnale di fondo. Inoltre, le cellule possono essere sensibili a residuo NaOH e la mancata pulire accuratamente la superficie di vetro (fino a 10x lavaggi) possono rendere difficile l'adesione cellulare. Se necessario, incubare il vetrino camera pulita con PBS O / N dopo il lavaggio. Per le linee cellulari sensibili, placcatura ad una densità più alta(Ad esempio, al 50% -60% di confluenza iniziale) può aiutare. - Piatto circa 5,5 x 10 4 delle cellule U2OS espressione stabile per pozzetto in 350 ml di fenolo DMEM senza rosso con il 10% FBS in modo che le cellule sono sane e non oltre confluente quando l'imaging.
- Effettuare trattamenti necessari per l'esperimento, come l'aggiunta di tetraciclina per indurre l'espressione della proteina.
- Fissare le cellule immediatamente prima di imaging.
- Prima della fissazione, preparare la soluzione paraformaldeide fresca (PFA) - 3,7% PFA in 1x PHEM con 0,1% glutaraldeide (GA). Per 10 ml di soluzione PFA, pesare 0,37 g di PFA e trasferire in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 1 ml di acqua distillata e 30 ml di 1 M NaOH e vortex. Il calore a 70 ° C e vortice ogni 1-2 minuti fino a quando PFA è completamente sciolto.
- Trasferimento sciolto PFA a un tubo da 15 ml e aggiungere 3,8 ml di acqua distillata, 5 ml di 2x tampone PHEM, 20 ml di 25% glutaraldeide, e agitare per miscelare. Archivio, tampone PHEM 2x è 120 TUBI mM, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA, e 16 mM MgSO 4, con pH regolato a 7,0 con 10 M KOH. Questa soluzione fissativo può essere conservato a 4 ° C per diversi giorni.
ATTENZIONE: PFA e GA sono entrambi pericolosi. Preparare la soluzione in una cappa aspirante e indossare attrezzatura di protezione durante la manipolazione di sostanze chimiche entrambi. Evitare l'inalazione o contatto cutaneo diretto. - Rimuovere il mezzo di crescita. Lavare rapidamente con 500 ml di PBS e aggiungere 250 ml di fissativo PFA per pozzetto. Incubare le cellule per 20 minuti a RT.
- Rimuovere il fissativo PFA dal campione e aggiungere 350 ml di PBS o di tampone di immagini (100 mM Tris con 30 mM NaCl e 20 mM MgCl 2, pH 8,5) per pozzetto.
- Vortex 100 particelle d'oro nm a rompere gli aggregati e aggiungere 35 microlitri per bene (10x finale diluizione) per il monitoraggio fase deriva durante l'imaging.
- Pulire 8 e # 1.5 fondo di vetro scorrevole camera aggiungendo 250 ml di 1 M NaOH per almeno 1 ora e lavare con PBS.
- Acquisire le immagini
- Accendere il microscopio. Accendere i 405 e 561 nm laser, ma tenere le persiane(interna o esterna) chiuso a questo punto. Accendere la fotocamera EMCCD e lasciarlo raffreddare. Assicurarsi che i 561 nm filtri sono a posto.
- Aprire il software di acquisizione e impostare il tempo di esposizione di 100 msec e il guadagno EMCCD di 300 (range 1 - 1000).
- Aggiungere olio di immersione con l'obiettivo e fissare il campione al palco microscopio.
- Con entrambi campo chiaro o il laser 561 nm su (~ 1 kW / cm 2), trasferire il campione a fuoco.
- Per l'imaging di Ras e di altre proteine di membrana, utilizzare un obiettivo 60X apochromat TIRF con 1.49 apertura numerica e portare il microscopio nella configurazione TIRF. Regolare il laser di eccitazione in modo che sia decentrato quando colpisce l'apertura posteriore dell'obiettivo TIRF; questo fa sì che il laser a deviare raggiungimento campione. Mantenere la regolazione del laser fino a raggiungere l'angolo critico e il laser viene riflessa. Ricerca di una cella di un'immagine con più particelle d'oro in vista. Impostare una regione di interesseche racchiude la cella (o una regione all'interno della cellula) e le particelle di oro.
Nota: TIRF diminuisce la profondità di penetrazione del laser di eccitazione e riduce il segnale di fuori fuoco sfondo. Inoltre, la correzione della deriva rischia di essere più precisi quando altre particelle d'oro sono in vista. - Se disponibile, impegnare il sistema di autofocus per correggere la deriva campione nella direzione z. In caso contrario, regolare la messa a fuoco manualmente durante l'acquisizione se l'immagine va fuori fuoco.
- Iniziare con l'acquisizione nm laser 405 off e il laser 561 nm su (~ 1 kW / cm 2) in caso di attivazione avviene già sufficiente (tipicamente se i livelli di espressione sono elevati). Altrimenti, accendere il nm laser 405 sulla potenza di fabbrica più basso (0,02 mW o 0,01 W / cm 2) e aumentare gradualmente (0,1 mW alla volta) come necessario fino esistono diverse decine di molecole per fotogramma o che singole molecole sono ben separati.
- Mentre l'acquisizione dei dati continua, graddualmente aumentare potenza del laser 405 nm per mantenere la densità del punto più o meno costante.
Nota: In basso a potenza di eccitazione 405 nm, alcuni PAmCherry1 può già essere attivato. Poiché queste molecole photobleach, la popolazione di rimanere molecole PAmCherry1 fotoattivabile diminuisce, richiedendo un flusso di fotoni elevato per mantenere la stessa densità di molecole che emettono fluorescenza in ciascun frame. - Continuare fino a quando l'acquisizione di immagini ad alta potenza 405 nm (2,5-10 W / cm 2) non attiva più eventi di attivazione.
Nota: Il tempo totale di acquisizione dipende dal livello di espressione e l'efficienza del complementazione.
- Elaborare le immagini
Nota: Ci sono molte opzioni di software open source per l'elaborazione delle immagini. Esempi sono Temporale (https://code.google.com/p/thunder-storm/) e QuickPALM (https://code.google.com/p / quickpalm /). Le procedure tipiche trattamento dei dati sono brevemente illustrati qui utilizzando un pacchetto Matlab personalizzata denominata wfiread per elaborare dati PALM come esempio. Tuttavia, le revisioni future non esattamente seguire ciò che è descritto qui. Per l'elaborazione delle immagini con altri software, consultare la documentazione utente.- Scaricare il software di elaborazione delle immagini (file di codice supplementare) o la versione più recente di http://www.ohsu.edu/nan. Aprire Matlab e caricare il software wfiread (che è già messo nel percorso predefinito).
- Visualizza la sequenza di immagini raw e determinare la regione di interesse. Selezionare l'area dello stack da lavorare cliccando con il tasto sinistro e trascinando un riquadro intorno all'area desiderata. Se la regione di interesse non è stata ridotta durante l'acquisizione (a circa 256x256 pixel), selezionare un'area più piccola per diminuire il tempo di calcolo. Per deselezionare un'area ed elabora l'intera struttura, fare clic destro ovunque in the immagine.
- Inserire l'intervallo di fotogrammi da elaborare.
- Selezionare una particella d'oro (uno che è isolato e uniforme in forma) cliccando con il tasto sinistro sull'immagine e trascinando un piccolo riquadro. Sotto particelle Monitoraggio, fare clic sul pulsante Track. Apparirà un grafico che mostra la posizione della particella dell'oro selezionato attraverso la pila di immagini, raffigurante la misura della deriva.
- Ripetere questo processo per rintracciare il maggior numero di particelle d'oro possibili e determinare quelli che tracciano insieme (le particelle saranno codice colore). Idealmente la deriva complessiva è dell'ordine di un pixel al massimo.
- Selezionare singolarmente le particelle d'oro che monitorati insieme una alla volta e fare clic sul pulsante Aggiungi marcatore sotto Particle inseguimento. Una croce verde apparirà a indicare che è stata aggiunta come un marcatore e sarà utilizzato per correggere la deriva.
- Regolare la gamma Sigma, Smoothing Threshold Range e, se necessario, modificando i valori leggermente. Fare clic sul Particle Trovapulsante per verificare le impostazioni. Le particelle che verranno elaborati saranno inscatolati e quelli che non sono saranno lasciati fuori. Le molecole PAmCherry1, particelle che sono relativamente rotondo e brillante, devono essere selezionati.
- Avviare l'elaborazione delle immagini, fare clic sul pulsante Coord Crea file e salvare il file.
Nota: il programma passerà attraverso ogni fotogramma all'interno della gamma telaio definito, trovare tutti i punti fluorescenti, ed eseguire il montaggio gaussiana per trovare le coordinate centroide. Un file .cor verrà generato memorizzare tutte le coordinate e gli altri parametri di montaggio delle immagini di singola molecola elaborate.
- Post-processo le immagini e rendono l'immagine PALM
Nota: Altri software possono rendere direttamente l'immagine dopo l'estrazione di coordinate.- In Matlab, avviare il pacchetto 'palme' e caricare il file .cor appena creato.
- Prima di pronunciare l'immagine PALM utilizzando le coordinate, ordinare le singole coordinate (ciascuna da un 'localizatisu evento '). I valori di ordinamento ottimali possono variare a seconda della configurazione e fluoroforo.
- Per PAmCherry1, utilizzare i seguenti valori: Combinando Frame - 8; Combinando Distanza (nm) - 100; RMS minimi - 4; Fit minima Bontà - 0.25; e Max. Eccentricità - 1.4. Vedi la sezione di discussione per ulteriori spiegazioni di questi parametri.
- Fare clic sul pulsante Ordina per generare un nuovo insieme di coordinate pronte per il rendering di immagini ad alta risoluzione.
- Immettere i valori per una corretta rappresentazione dell'immagine finale, come il formato grezzo pixel (nm), la dimensione del tratto desiderato (nm) nell'immagine di rendering, e la dimensione dei pixel per l'immagine di rendering.
Nota: la dimensione dei pixel crudo deve essere determinata per ogni installazione. La dimensione dell'elemento di rendering può essere impostata arbitrariamente, ma è tipicamente impostata ad un valore leggermente superiore alla precisione media localizzazione. Per PAmCherry1, la precisione media localizzazione è di circa 18 nm, quindi una dimensione del tratto 20-30 nm è appropriate. Da notare, la precisione di localizzazione è stato calcolato prendendo la deviazione standard delle localizzazioni della stessa molecola su più fotogrammi 22 e non dividendo il limite di diffrazione con la radice quadrata del numero di fotoni rilevati. Per quanto riguarda la dimensione in pixel dell'immagine di rendering, 10 nm è un buon punto di partenza; impostazione di un valore troppo basso si tradurrà in file di immagini inutilmente grandi per le viste non ingrandita. - Fare clic sul pulsante Rendering per generare l'immagine PALM. Utilizzare le icone +/- ingrandimento nella barra degli strumenti della finestra cifra per ingrandire e rimpicciolire.
- Opzionale: Eseguire l'analisi di cluster dell'immagine PALM ricostruita utilizzando test di K di Ripley o altri meccanismi, come la simulazione assistita DBSCAN (SAD) 23. Nota: Nel pacchetto di palma personalizzato, sia K di Ripley e analisi SAD sono già costruite in; per le coordinate generate da altri software, le stesse analisi possono essere eseguite con l'aggiunta di script personalizzati.
3. singola molecola di monitoraggio in cellule vive - Trattare la superficie di coltura tissutale e piastra le cellule come descritto nel protocollo 2. Poiché la temperatura e / o CO 2 stadi controllata può richiedere un certo piatto di coltura, assicurarsi assicurarsi che il coprioggetti ha lo spessore adeguato (0.17 mm) per l'impostazione microscopia.
- Trasfettare cellule se facendo un'espressione transiente ed eseguire eventuali trattamenti necessari per l'esperimento, come tetraciclina per indurre l'espressione, e incubare come necessario. Questo è anche lo stesso come descritto nel protocollo 2.
- Porre la capsula cultura su un incubatore sul palco. Lasciate che il piatto si depositano sul palco per qualche minuto fino a quando la temperatura e la concentrazione di CO 2 stabilizzare ogni volta dopo aver montato il piatto cultura o lo spostamento di una nuova regione di interesse. I laser di blocco di questo passo. Se CO 2 di controllo non è disponibile, passare a una di CO 2 media indipendenti a destra prima di imaging, come Leibovdi itz L-15.
Nota: medio fenolo-rosso-libero è raccomandato per sfondo deprimente fluorescenza.
- Acquisire le immagini come nel protocollo 2. Tuttavia, impostare un tempo di esposizione appropriato (tipicamente 25-50 msec per PAmCherry1).
Nota: La densità molecola deve essere inferiore di cellule fissate in modo che le traiettorie possono essere registrati senza sovrapporsi tra loro. Le poche decine di molecole specificati è tipico per un'acquisizione 256x256 pixel in una dimensione di pixel di circa 160 nm. La densità di potenza laser 561 nm è stato fissato a 0,8 kW / cm 2 per mantenere un buon rapporto segnale-rumore riducendo la fototossicità alle cellule e aumentando la lunghezza media traiettoria. - Elaborare le immagini.
- Estrarre coordinate di singole molecole con il pacchetto wfiread come descritto nel protocollo 2, o con un altro pacchetto.
- Ricostruire traiettorie delle particelle singole utilizzando varie singola particella tenere traccia dei pacchetti (SPT) in base a diversi algoritmi trovatialtrove 24. Nota: In alternativa, questa operazione può essere effettuata utilizzando il pacchetto Matlab casa costruita (forse disponibile a future revisioni a http://www.ohsu.edu/nan.
- Opzionale: Dopo la ricostruzione, utilizzare un pacchetto SPT 24 per il calcolo di spostamento e di diffusione costanti dalle traiettorie. Inoltre, utilizzare variazionale Bayes singola particella tracking (vbSPT) 25 per determinare gli stati di diffusione delle proteine bersaglio. Pacchetto e la documentazione vbSPT Matlab sono disponibili sul suo sito Sourceforge ufficiale: http://vbspt.sourceforge.net/.
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Representative Results
L'esempio BiFC-PALM mostrata è KRAS G12D mutante interagire con Ras legame dominio (RBD) del CRAF (Figura 1A). Come discusso, la RN o frammenti RC non contrassegnati al C-terminale di Ras perché interromperebbe la localizzazione di membrana e quindi l'attività biologica di Ras. Questo riduce le possibili combinazioni da otto a quattro (Figura 1B). Ciascuno di questi quattro combinazioni stato introdotto in cellule U2OS utilizzando infezione lentivirale. Le cellule sono state fissate come specificato nel protocollo, ed i segnali BiFC sono stati valutati usando un setup PALM. Cellule con segnali positivi BiFC stati identificati dal brusco aumento della fluorescenza quando il laser 405 nm è stata attivata; il laser 561 nm era in tutto l'esperimento di imaging. Questo brusco cambiamento di fluorescenza è dovuto alla fotoattivazione di PAmCherry1 BiFC ricostituito sotto illuminazione con il laser 405 nm. Regioni multiple nel campione sono stati valutati utilizzando questo approccio, E l'intensità del segnale BiFC stato calcolato facendo la media del aumento delle intensità dei pixel prima e dopo un impulso ad alta potenza del laser 405 nm.
Come si vede nella figura 1C, dei quattro possibili configurazioni, due configurazioni (cioè RN-Ras / RC-Raf RBD e RN-Ras / Raf-RBD RC) ha avuto segnali forti BiFC. Un'altra configurazione (RC-Ras / Raf RBD-RN) aveva segnale debole, e uno aveva alcun segnale. Per tutti gli esperimenti successivi, è stato utilizzato il RN-Ras / Raf-RBD configurazione RC (in alto a destra in Figura 1C). Come controllo negativo, una mutazione puntiforme (R89L) nel dominio di legame Ras della Raf è stato introdotto e l'efficienza BiFC utilizzando la stessa configurazione è stata testata. Questa mutazione era noto per interrompere Raf legame con Ras; costantemente, la mutazione notevolmente ridotto il segnale BiFC (Figura 1D).
Poiché le molecole PAmCherry1 generati attraverso BiFC hanno mostrato proprietà fotoattivazione simili agli originaliPAmCherry1 10, questo permette PALM l'imaging dei campioni BiFC utilizzando le stesse impostazioni sperimentali con il PAmCherry1 genitore. Un'immagine PALM esempio di cellule con segnale forte BiFC dopo l'infezione con RN-Ras e Raf-RBD RC è mostrato nella Figura 2A.
Quando zoom (in basso a sinistra Figura 2A e inserti, con aree ingrandite in scatola), le singole molecole e la loro distribuzione spaziale nanoscala può essere visto chiaramente. Da notare, ciascun punto in queste immagini PALM rappresenta un complesso di Ras-Raf RBD putativo contrassegnati con una molecola PAmCherry1. Per confronto, il lato destro della Figura 2B è stato simulato immagini a bassa risoluzione degli stessi campi di vista, in cui i cluster sono diventati completamente oscura. L'osservazione di cluster Ras-Raf RBD è in linea con precedenti osservazioni sul comportamento di clustering di Ras e Raf.
Con cellule vive che esprimono BiFC ricostituiti PAmCherry1, SMT-PALM era perfoconfermate di acquisire traiettorie di diffusione dei singoli complessi Ras-Raf RBD, analogamente a descritto in precedenza 10. Sotto illuminazione continua con 561 nm e 405 nm laser, molecole PAmCherry1 singoli stocasticamente accendono e durano alcuni fotogrammi prima di entrare in stati di scure (in parte a causa photobleaching). In questo periodo di tempo, le molecole esposte almeno due differenti comportamenti di diffusione: uno stato immobile (Figura 2B, molecola 1) e un elemento mobile (Figura 2B, molecola 2). Entrambi i tipi di traiettorie sono chiaramente presenti in (x, y) grafico mostrato nella Figura 2C, dove vengono registrate le traiettorie di più molecole. La stessa distribuzione eterogenea degli stati di diffusione può essere dedotta dalla istogramma di spostamento molecolare tra i fotogrammi successivi. In genere, 10.000 - 100.000 traiettorie di diffusione possono essere acquisite da ciascuna cella; questo gran numero consente per l'analisi statistica più rigorosa di tegli diffusione stati, per esempio, con l'algoritmo vbSPT 25.
Figura 1. BiFC-PALM disegno sperimentale di interazione Ras-Raf. (A) Ras è una proteina legata membrana che recluta Raf quando è attivo. Quando non fluorescenti frammenti PAmCherry1 scissione sono attaccati Ras e Raf, l'interazione porta i frammenti insieme e complementazione verifica, causando una proteina fluorescente funzionale. (B) Poiché la codifica Ras al suo C-terminale potrebbe interrompere la sua localizzazione a membrana, il numero di configurazioni testate per Ras-Raf BiFC-PALM è stato ridotto da otto a quattro. (C) Immagini di cellule che esprimono U2OS le configurazioni testate prese con un microscopio TIRF. Per misurare l'efficienza BiFC di ogni configurazione, le cellule hanno la stessa elevata dose di 405 nm mentre la luceessere eccitato con 561 nm luce. (D) Introdurre la mutazione R89L nella Raf RBD notevolmente ridotto il segnale BiFC della configurazione RN-KRAS G12D / CRAF RBD-RC (in alto a destra in C, n = 5-8). Le barre di errore sono in SEM (D). Barre di scala in (C), 10 micron. RN = PAmCherry1 N-terminale frammento, frammento RC = PAmCherry1 C-terminale, e RBD = Ras legame dominio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. BiFC-PALM di cellule che esprimono la configurazione U2OS RN-KRAS G12D / CRAF RBD-RC. (A) L'intera immagine PALM è mostrato sopra. Pannelli inferiori sono ingrandite vista delle regioni in scatola nell'immagine superiore come indicato. Inserti sono più altiingrandimenti delle regioni in scatola nei rispettivi viste ingrandite. Il lato destro dei pannelli inferiori (TIRF etichettato) sono rappresentazioni delle immagini sul loro sinistra come se preso con un microscopio diffrazione limitata. (B) fotogrammi successivi da un esperimento SMT-PALM cellule vive che raffigurano lenti (1) e veloci (2) movimento complessi Ras-Raf. (C) Uscita da un esperimento SMT-PALM mostrando traiettorie di diffusione di complessi Ras-Raf in una piccola area di una cella. (D) Istogramma degli spostamenti per fotogramma di complessi Ras-Raf da un esperimento SMT-PALM. Barre di scala in (A), 5 micron top, 500 nm di fondo, 50 tramezze nm, e (C), 1 micron. RN = PAmCherry1 N-terminale frammento, frammento RC = PAmCherry1 C-terminale, e RBD = Ras legame dominio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Sequenza Primer (5 'a 3') | |
| Clonazione plasmide per l'inserimento di N-terminale inversa | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| RN a N-terminale in avanti | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RC a N-terminale in avanti | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| Clonazione plasmide per l'inserimento in C-terminale in avanti | TAAAAGGGTGGGCGCGCC |
| RN da C-terminale inversa | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| RC da C-terminale inversa | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
Tabella 1. Primer per linearizzare plasmidi contenenti frammenti PAmCherry1 clonazione. I plasmidi contenenti clonazione RN e RC possono essere linearizzati con PCR inversa al punto di inserimento sia nella N- o C-terminale dei frammenti. Le sequenze sono elencati 5 'a 3R17 ;.
| Le sporgenze per gene di primer di interesse (5 'a 3') | |
| N-terminale RN inserimento o RC avanti | GAGCTCGGTACCATG |
| N-terminale inserimento RN inversa | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| N-terminale inserimento RC inversa | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| C-terminale RN inserimento in avanti | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| Inserimento C-terminale RC avanti | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminale inserimento RN o RC retromarcia | GCGCCCACCCTTTTA |
Tabella 2. Le sporgenze per gene di primer interesse che corrispondono Tabella 1 primer. Viene generato il 15 coppie di basi di omologia per la reazione legatura indipendenteda sbalzi di primer. Inoltre, le sporgenze comprendono la sequenza di un (GGGGS) x2 linker flessibile. La sequenza linker flessibile può essere aggiunta ai primer in Tabella 1, invece. Le sequenze sono elencati 5 'a 3'.
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Discussion
BiFC è una tecnica comunemente usata per il rilevamento e la visualizzazione PPI nelle cellule, mentre PALM è una recente tecnica di microscopia molecola SuperResolution unico che permette l'imaging su nanoscala di campioni biologici intatti. La combinazione di BiFC con PALM raggiunto l'imaging selettivo di PPI all'interno di una cella con nanometrica risoluzione spaziale e sensibilità singola molecola. BiFC-PALM estende l'utilità di entrambe le tecniche, e come dimostrato in questo lavoro, mostra una grande promessa nel rivelare i dettagli molecolari di IPP nel loro contesto cellulare nativo. In particolare, la risoluzione nanometrica permette un'indagine approfondita del regolamento spaziale e temporale di PPI specifici su scala molecolare, che è stata una sfida nella ricerca biomedica. Tuttavia, come accennato prima, BiFC-PALM è limitata dalla irreversibilità del complementazione e lenta maturazione cromoforo.
Split PAmCherry1 è stato utilizzato per dimostrare il principio e la uPu di BiFC-PALM. PAmCherry1 è stato ampiamente utilizzato negli esperimenti PALM per le sue eccellenti proprietà fotofisiche. Un ulteriore vantaggio di utilizzare PAmCherry1 come sonda BiFC è lo sfondo bassa e alta specificità ed efficienza di proteine ricostituzione a 37 ° C quando accoppiato PPI. Per queste ragioni, la sonda PAmCherry1 BiFC divisione è destinato a diventare una risorsa preziosa applicabile a molti differenti indagini biologiche che coinvolgono imaging ad alta risoluzione di PPI. Oltre a PAmCherry1, una proteina fluorescente fotoconvertibile, mEos3.2, è stato anche dividere per BiFC-PALM 26. Perché i loro spettri di emissione si sovrappongono, mEos3.2 e PAmCherry1 non possono essere utilizzati insieme, ma verde PA-PQ sono stati recentemente segnalati 27, aprendo la possibilità per due colori nanoscala SuperResolution imaging PPI.
Come in BiFC convenzionale, un passaggio fondamentale nella realizzazione BiFC-PALM è la progettazione e la clonazione dei costrutti di fusione. Il fatto che finoa otto diversi costrutti di espressione devono essere clonato e otto paia BiFC essere testato in ogni tentativo di attuare BiFC e BiFC-PALM può essere un noioso, se non proibitivo, processo. Tuttavia, come illustrato nell'esempio Ras-Raf, previa conoscenza delle proprietà biochimiche e strutturali delle proteine di interesse spesso può essere usato per guidare un progetto ottimizzato dei costrutti di fusione con un ridotto numero di coppie BiFC da testare. Detto questo, al momento non c'è una linea guida universale, al fine di garantire che un BiFC (quindi BiFC-PALM) esperimento avrebbe funzionato; gran parte di essa è ancora un'arte.
Mentre BiFC e BiFC-PALM sono tipicamente utilizzati per studiare la formazione dell'eterodimero tra due proteine, è anche fattibile per studiare la formazione omodimero con questi approcci, nel qual caso le due proteine candidati dovrebbero essere uguali. Tuttavia, come tale, due proteine con lo stesso frammento possono interagire ma non comportare segnale BiFC. Nonostante ogni costrutto in qualità diun inibitore competitivo alle altre, queste interazioni sono reversibili, mentre le interazioni con conseguente complementazione successo accumulerebbero causa l'irreversibilità. In generale, ci potrebbe essere una riduzione segnale se vi è una drastica differenza tra i livelli di espressione di ciascun costrutto. Pertanto, i livelli di espressione dei due costrutti possono avere bisogno di essere determinato quando si confrontano intensità di fluorescenza (ad esempio, tra il wild type e campioni omodimero mutanti) a livelli di espressione endogeni. Questo è forse il motivo per cui gli esperimenti BiFC sono comunemente eseguiti con trasfezioni transienti e sovraespressione di costrutti.
Ultimo ma non meno importante, tutti gli esperimenti BiFC devono essere confermati con controlli adeguati. Se il segnale BiFC è presente, c'è la possibilità che il segnale è non-specifica (ad esempio, i frammenti sono ricostituendo per conto proprio e non a causa del PPI). Un controllo negativo è mutazioni in una o entrambe le proteine che sono notidi interrompere l'interazione, che dovrebbe sfociare in una significativa perdita di segnale di BiFC. Se tale mutazione puntiforme è sconosciuta, altri metodi possono essere utilizzati, ad esempio introducendo un partner di legame competitivo per una delle proteine e vedere se vi è una concomitante diminuzione del segnale.
La situazione più difficile è la risoluzione dei problemi la mancanza di segnale di BiFC o falsi negativi. In tali casi, è importante comprendere controlli positivi durante il processo di clonazione, come un controllo GFP durante trasfezioni. Western blot possono essere eseguiti per verificare l'espressione dei costrutti. Se questi fattori sono normali, altri fattori possono devono essere modificate, come la lunghezza linker e / o la sequenza, oppure una configurazione diversa BiFC dovrebbe essere considerato.
Per quanto riguarda la porzione PALM, un certo numero di parametri deve essere considerato quando l'elaborazione delle immagini. Passo 2.4.2.1 descrive i parametri utilizzati per l'ordinamento le coordinate e generare l'immagine finale PALM. Il primodue parametri, combinando Telaio e Combinando distanza, definiscono se due eventi di localizzazione si trovano entrambi a 100 nm e appaiono meno di 8 fotogrammi (a 100 msec / frame) o ~ 0,8 sec a parte come abbiamo descritto in precedenza 23. Se è così, allora saranno considerate derivino dalla stessa molecola, e le loro coordinate saranno combinate media. Stati scuri con durate molto superiori a 0,8 sec per PAmCherry1 sembra essere rara; come il caso di un fluoroforo recupero da uno stato scuro longeva è indistinguibile da una molecola diversa a fluorescenza distanza prossimale emettitori, due eventi di localizzazione si considerano derivanti dalla stessa molecola solo se sono apparsi entro un certo numero di fotogrammi e distanza fisica. Empiricamente, una impostazione 'combinare telaio' a 8-12 fotogrammi (0,8-1,2 sec) sembra essere ottimale nelle nostre condizioni sperimentali. RMS minima definisce il rapporto minimo tra ampiezza raccordo e la deviazione standard del rumore residuo doporaccordo. Questi valori vengono registrati nel file .cor durante l'estrazione di coordinate.
In sintesi, BiFC-PALM unisce i vantaggi di BiFC e PALM e consente indagini di IPP a molto più dettagliato di quello che è stato raggiunto in precedenza. Con considerazioni per i fattori di cui sopra e con esperimenti di controllo adeguati, BiFC-PALM dovrebbe essere uno strumento utile per lo studio PPI in una vasta gamma di impostazioni biologiche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope frame | Nikon | Ti-U | |
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | CFI Apo TIRF 60x H | |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Opto Engine | MGL-FN-561 | |
| 405 nm laser | Coherent | CUBE-405 50mW | |
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25x36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | Tokai Hit | INUBG2ATW-PLAM | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 ml tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 ml tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
References
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