Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית עם bimolecular פלואורסצנטי השלמה (BiFC-PALM)

Published: December 22, 2015 doi: 10.3791/53154
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health and Science University, 2Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 3OHSU Center for Spatial Systems Biomedicine, Oregon Health and Science University

Introduction

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) הן יסוד לביולוגיה 1 ומוסדרות בחוזקה באמצעות מנגנוני חלל ובזמן על פני קשקשים רבים זמן ואורך. מחקרים על תא איתות על קרום התא, למשל, חשפו תאים דינמיים, ננו מרחבי המאפשרים PPIs ספציפי ותהליכים תאיים 2. לפיכך, היכולת לחקור PPIs במערכות ביולוגיות עם רזולוציות מספיק מרחב ובזמן, סגוליות גבוה, ורגישות גבוהה היא מפתח להשגת הבנת מכניסטית של ביולוגיה.

שלמת הקרינה bimolecular (BiFC) היא אחד הכלים הקיימים כמה חזותיים PPIs בתא עם רזולוציה subcellular ולחיות תאי תאימות 3 - 5. הטכניקה היא פשוטה יחסית וכרוך פיצול של חלבון הקרינה לשני שברים שאינם ניאון; כאשר גנטי מתויג לשני חלבוני אינטראקציה והביא לקרבה, שברים יכולים לשקם כדי ליצור חלבון פלואורסצנטי מלא, מניב אות ניאון. כאשר מתוכננים כראוי, בדיקות BiFC לא צריכים באופן ספונטני מחדש בהעדר של PPI. ככזה, אות הקרינה בassay BiFC תקום רק בנוכחות של PPI, המאפשרת הדמיה ישירה של PPI עם סגוליות גבוהות. יתרונות נוספים של שימוש בקרינה כקריאת הנתונים הם רגישות גבוהה, רזולוציה subcellular, ותאימות עם תפוקה גבוהה ומבחני מיון תוכן גבוהים, בין יתר. ליתרונות אלה, מספר בדיקות BiFC מבוססות על חלבוני ניאון ההורה שונים פותחו. כמו בכל שיטות לזיהוי אחרות המבוססות על מיקרוסקופ אור הרגילה, לעומת זאת, ברזולוציה מרחבית של BiFC מוגבלת ל~ 250 ננומטר על ידי העקיפה של אור. זה עושה את זה אתגר ללמוד הרגולציה של PPI בקנה המידה ננומטרי, אשר, כפי שרמז קודם לכן ושהודגם על ידי רפסודות שומנים 6ND nanoclusters ראס 7, הוא בקנה מידה אורך קריטי להבנה רבות תהליכים תאיים כגון איתות.

BiFC כבר בשילוב עם מיקרוסקופ photoactivated הלוקליזציה (PALM) 8,9 להתגבר מגבלה זו ברזולוציה מרחבית הדמיה PPIs 10. PALM הוא טכניקת מיקרוסקופיה superresolution האחרונה שעוקפת את מגבלת העקיפה בהדמיה הקרינה באמצעות הפעלה אקראית ולוקליזציה subdiffractive של מולקולות ניאון בודדות. בכל מחזור הפעלה, מולקולת ניאון פולטת כמה מאה לכמה אלף פוטונים ויוצרת תמונת מולקולה בודדת בגלאי. בעוד התמונה היא עקיפה מוגבל (~ 250 ננומטר ברוחב), centroid ניתן לקבוע בדייקנות גבוהה הרבה יותר, בדרך כלל בסדר הגודל של 10-50 ננומטר בהתאם למספר הפוטונים זוהו. על ידי הפעלה ואיתור כל מולקולת ניאון במדגם, ניתן לשחזר תמונה ברזולוציה גבוהה. Performeד על תאי חיים, רכישת רישיונות נוספים PALM יחיד מולקולת מעקב (smt-) אלפי מסלולי דיפוזיה החלבון מתא בודד 11. חשוב לציין, PALM משתמש בדיקות ניאון מיוחדות כגון חלבוני ניאון photoactivatable (PA-FPS) כדי להשיג הפעלה סטוכסטיים. מאחר ששני חלבוני ניאון השימוש PALM BiFC ו, הם אוחדו על ידי פיצול PAmCherry1, PA-FP נפוץ עבור PALM, לשני שברים בין חומצות אמינו 159 ו -160.

מערכת BiFC מבוססת על PAmCherry1 המפוצל מציגה אות רקע נמוכה מכינון מחדש ספונטני של שני ברים. כאשר גנטי מתויג לזוג חלבוני אינטראקציה, שני שברים (RN = שאריות 1-159; RC = Met + שאריות 160-236) מחדש ביעילות כדי ליצור חלבוני PAmCherry1 מלאים אפילו על 37 מעלות צלזיוס וללא דוגרים בטמפרטורות נמוכות יותר, ש זה לא המקרה לזוגות BiFC אחרים 12 כמו ההורה 13 mCherry. Furthermoמחדש, חלבון PAmCherry1 מחדש נשמרים מאפייני photophysical של PAmCherry1 ההורה, כגון יחס ניגודיות גבוה, תשואת פוטון בינונית, וphotoactivation המהיר, ביניהם קריטיים ללוקליזציה מדויקת מולקולה בודדת והדמיה PALM ברזולוציה גבוהה, אחרים.

בפרוטוקול זה, השימוש בBiFC-PALM הדמיה אינטראקציות ראס-רף בתאי U2OS באמצעות PAmCherry1 (איור 1 א) פיצול מתואר. הצעד הראשון הוא לעצב מבנים לביטוי חלבוני היתוך בין שברי PAmCherry1 (כלומר, RN וRC) והחלבונים של עניין. בתאוריה, לכל זוג של חלבוני מועמד (A ו- B), יש שמונה זוגות של חלבוני היתוך להיבדק: RN-/ RC-B; RN-A / B-RC; RC-/ RN-B; RC-A / B-RN; -RN / RC-B; -RN / B-RC; RC-/ RN-B; ו- RC / B-RN. תהליך זה לעתים קרובות יכול להיות פשוט יותר על ידי לקיחה בחשבון את המאפיינים המבניים או ביוכימיים של חלבוני המועמד. במקרה של ראס, החלבון הואלאחר translationally שונה בתיבת CAAX C-מסוף (C = Cys; = אליפטי; X = כל), לאחר שמוטיב AAX הוא ביקע את. לפיכך, RN או RC ניתן התמזגו רק לN-הסופית של ראס; זה מפחית את מספר זוגות חלבון היתוך לארבעה (איור 1). לרף, ראס מחייב תחום (RBD; שאריות 51-131) משמשת ויכולות להיות מתויגת בשני קצותיו. ארבע תצורות היתוך אלה שנוצרו: RN-KRAS / RC-רף RBD; RN-KRAS / רף RBD-RC; RC-KRAS / RN-רף RBD; וRC-KRAS / רף RBD-RN.

בנוסף, מקשר בין שברים והחלבונים של ריבית צריך להילקח בחשבון. מקשר גמיש של כעשר חומצות אמינו משמש לעתים קרובות כפי שהוא מספק חופש מספיק להשלמה להתרחש. מקשר אחד כזה הוא X2 (GGGGS), אם כי יש רבים אחרים שיושמו בהצלחה, כוללים רצפים אקראיים שנוצרו מאתר מרובה שיבוט (MCS) 14. אורכו של linkers ייתכן שיצטרך להיות מותאם תלויG בגודל של החלבונים של עניין והאוריינטציות שלהם באינטראקציה.

שברי PAmCherry1 כלולים בעמוד שדרת שיבוט קטן עם איגוף MCSs (ראה חומרי רשימה). הגנים של עניין יכולים להיות מוכנסים דרך אתרי הגבלה או עם שיטת קשירה-עצמאית. לאחר אימות שיבוט ורצף, קלטת הביטוי מועברת לוקטור ביטוי באמצעות תגובת recombinase, תהליך שיבוט עם איכות גבוהה ויעילות גבוהה.

בשלב הבא, בונה הביטוי וכתוצאה מכך הם transfected לתוך קו תא המטרה או, אם קו תא יציב הוא רצוי, ארוזה לlentivirus להדבקת קו תא המטרה. transfection החולף מאפשר אימות מהירה של תצורות BiFC, אבל בעיות פוטנציאליות חייבים לציין. Transfection שימוש בכימיקלים לעתים קרובות מדגיש את התאים, וכתוצאה מכך גבוה autofluorescence; בעוד שהשימוש בסך הקרינה השתקפות פנימית microsco (TIRF)py יכול למתן אות רקע זה על ידי הגבלת נפח התאורה, אידיאלי TIRF כאשר PPIs יתקיים בקרום התא. בנוסף, transfections החולף לעתים קרובות להוביל לרמות גבוהות של ביטוי חלבון, עלה בהרבה על אלה של חלבונים אנדוגניים, אשר עלול לגרום לחפצים באיתור PPIs. לפיכך, מומלץ כי תוקמנה שורות תאי יציבות לאחר תצורת BiFC מתאימה נקבעה באמצעות בדיקה ראשונית. יש גם שורות תאי יציבות הפוטנציאל לביטוי מתכונן באמצעות האינדוקציה דוקסיציקלין 15.

לאחר הדבקה, תאים נבחרים עם אנטיביוטיקה, בדרך כלל puromycin ונאומיצין, אחד לכל מבנה. השלבים הבאים להכנת מדגם, רכישת תמונה, וניתוח הנתונים שיפורט בהרחבה בפרוטוקולים.

עם גישה זו, ההיווצרות של אשכולות ננו בתמונות BiFC-כף ראס-רף RBD הם נצפו באופן שיגרתי (איור 2 א </ Strong>). באופן עקבי, מסלולי SMT-כף ראס-רף RBD להראות הפצה הטרוגנית במדינות דיפוזיה (איור 2-D). תוצאות אלו מצביעות על כך שמתחמי ראס-רף קיימים במדינות רבות בקרום התא, ככל הנראה כמונומרים ואשכולות, עם השלכות ביולוגיות פוטנציאליות. עבודה זו ממחישה את העצמה של BiFC-PALM בהדמיה סלקטיבית של PPI בתאים עם רזולוציה מרחבית ננומטר ורגישות מולקולה בודדת, שתהיה קשה להשיג עם BiFC הקונבנציונלי, שיתוף לוקליזציה הקרינה, או העברת תהודת הקרינה אנרגיה (סריג).

בעת תכנון ניסויי BiFC ולפרש את התוצאות, חשוב לזכור כי התהליך הוא בלתי הפיך BiFC ברוב המקרים, כולל PAmCherry1 פיצול. ברגע ששני שברים לשלב וליצור חלבון PAmCherry1 מלא, ההצמדה בין שני הברים, ובכך הופך PPI קבוע. זה מגביל את השימוש בBiFC וBiFC-PALM לניטור הדינמיקה של PPIs (כלומר, קינטיקה מחייבת ולא את דינמיקת דיפוזיה של החלבון המורכב ברגע שנוצר) ולעתים אף עלול להוביל לmislocalization של מתחמי PPI.

גורם נוסף שיש לשקול בעת תכנון ניסויי BiFC-PALM הוא העיכוב בהבשלת כרומופור שטבוע בחלבוני ניאון. ברגע ששני חלבוני אינטראקציה ושברי FP באים ביחד, הם בדרך כלל לקפל על סדר שניות (בחץ המשרה של 60 שניות לEYFP 3). עם זאת, התבגרות כרומופור הבאה ואות ניאון לפתח על סדר דקות. בעוד הקרינה עלולה להתגלות בתוך 10 דקות לאחר הכינון מחדש של מפוצל ונוס, גרסת YFP מהירה מתקפלת, בחץ המשרה להבשלה באופן כללי הוא לעתים קרובות סביב 60 דקות 16. מפוצל PAmCherry1 נצפה יש שיעור דומה. לפיכך, BiFC וBiFC-PALM הם בחירות עניות כיום לניטור קינטיקה PPI בזמן אמת; שלי אחרthods, כגון סריג וחלבון פלואורסצנטי התלוי dimerization שפותח לאחרונה 17, עשוי להיות מתאים יותר למטרה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שיבוט

  1. לקבוע את התצורות לשבט ולבחור מקשר. חלבוני תג עם שברים על N- או C-הסופית כפי שיתוארו להלן, כדי שלא לשבש את הלוקליזציה הנכונה שלהם. השתמש במקשר גמיש כגון x2 (GGGGS).
  2. גנטי לתייג את החלבונים של עניין לברי PAmCherry1. כאפשרות אחת, להשתמש בפלסמידים השיבוט מופיעים ברשימת חומרים המכילה שברי RN (שאריות PAmCherry1 1-159) וRC (Met תוספת שאריות PAmCherry1 160-236) עם איגוף רצפי MCS.
    1. Linearize פלסמידים המכילים שברי RN וRC עם PCR ההפוך (או הגבלה לעכל) בנקודת הכניסה. צבעי יסוד להפוך PCR מפורטים בטבלה 1. להלן פרוטוקול PCR דוגמא בשימוש במעבדה של המחבר (ראה חומרי רשימה לחומרים מדויקים שימוש בפרוטוקול זה).
      1. מערבבים את תגובת PCR יחד, הביאה עד נפח סופי של 50 μl עם מים: לקיר דקצינור אד PCR, להוסיף את המים, 25 μl של תערובת אמן 2x, 0.5 μl כל אחד מצבעי היסוד קדימה לאחור (20 מיקרומטר המניה מדוללת, 0.2 מיקרומטר ריכוז סופי), וng 1 של תבנית. השתמשו בתנאי הרכיבה על אופניים הבאים: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 30 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 7 שניות ו -68 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, והארכה סופית על 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. PCR גנים של עניין לכניסה לפלסמידים ינארית מכילים שברי RN וRC. לבצע PCR כמו בשלב 1.2.1 עם זמן הארכה 68 ° C. השתמש בצבעי יסוד עם הסככות המכילות רצף מקשר גמיש, כגון x2 GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT ל( GGGGS), והומולוגית זוג 15 בסיס לקצוות של RN לינארית ופלסמידים RC לרקומבינציה.
      הערה: הסככות פריימר לחלבונים של עניין מוצגות בטבלה 2 אם באמצעות פריימרים בטבלה 1 לlinearize עמוד השדרה פלסמיד.
    3. לעכל PCRתגובה עם Dpn1 לחסל את תבנית ה- PCR. הוסף 0.5 μl של Dpn1 (20 U / μl) ישירות לμl 50 של תגובת PCR. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה ולהשבית חום 1 על 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. אם תבנית רקע נמשכת בשלבים מאוחר יותר, להגדיל את כמות האנזים או להאריך את זמן העיכול.
    4. לטהר את מוצרי ה- PCR באמצעות טור ספין כפי שתואר על ידי היצרן.
    5. בצע תגובת קשירה העצמאית לשלב פלסמיד לינארית מכיל RN או בר RC עם הגן של עניין. למדוד את הריכוז של מוצרי ה- PCR המטוהרים: לשלב 50 ng של פלסמיד לינארית ו -50 ng של הגן של עניין עם 1 μl של premix האנזים ולהביא את הנפח הכולל עד 5 μl עם מים ללא יונים. לדגור על 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, מניח על קרח, ולהוסיף 20 μl של TE חיץ.
    6. להפוך פלסמידים רקומביננטי לחיידקים המוסמכים 18.
    7. בחר 2-4 + (כרצויות) מושבות לO / תרבות N. הוסף 5 מיליליטרשל מרק LB ו -5 μl של kanamycin (50 מ"ג / מיליליטר מניות) לתוך צינור מסביב לתחתית 14 מיליליטר פוליפרופילן, ולהוסיף את המושבה חיידקים נבחרה עם לולאת inoculating מעוקרת. לדגור על 37 מעלות CO / N תוך רעד ב225 סל"ד.
    8. להקפיא 1 מיליליטר של O / תרבות N למניית גליצרול 19 וminiprep היתרה כפי שתואר על ידי היצרן.
    9. בצע רצף כדי לקבוע שיבוט טוב. אם שימוש בפלסמידים השיבוט ברשימת חומרים, להשתמש M13 קדימה הפוך פריימרים (בתגובות נפרדות) כנדרש כדי להשיג הרצף של מבנה ההיתוך המלא. השווה עם הרצף הצפוי באמצעות כלי יישור כגון פיצוץ מהמרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה (צמח השדה) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
    10. העבר את בונה-מאומת רצף לפלסמיד ביטוי באמצעות תגובת recombinase.
      1. להוסיף 75 ng של פלסמיד & # היעד8212; כגון pcDNA לtransfections החולף או pLenti לאריזת lentiviral 20 - 50 ng ושל פלסמיד רקומביננטי השיבוט לμl 1 של premix האנזים ולהעלות את הנפח הכולל עד 5 μl עם מים ללא יונים. לדגור על 25 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ולאחר מכן להוסיף 5 μl של TE חיץ.
        הערה: אריזת lentiviral ודור שורת תאים יציב, להשתמש פלסמיד יעד שונה לכל מבנה, לדוגמא, אחד עם התנגדות puromycin ונאומיצין האחר. זה מאפשר לבחירה כפולה של תאי transduced. כמו כן לשקול את האמרגן לכל, כמו אמרגן ציטומגלווירוס המכונן (CMV) לרמות ביטוי גבוהות, או CMV עם מפעיל TETO לביטוי מוסדר דוקסיציקלין מתכונן.
      2. להפוך 5 μl לחיידקים המוסמכים וminiprep פלסמידים כבצעדים 1.2.6 ל1.2.8, אך שימוש באנטיביוטיקה המתאימה (בדרך כלל אמפיצילין).
  3. לקבוע האופטימליתצורת BiFC.
    1. פלסמידים שיתוף transfect ביטוי לתאי U2OS (או תא של בחירה).
      1. להוסיף 350 μl של DMEM האדום-החופשי וללא אנטיביוטיקה פנול בתוספת 10% FBS לבאר כל תא תחתון שקופיות זכוכית 8 היטב # 1.5. צלחת על 7.5 x 10 4 תאים לכל כך טוב תאים כ 70% -90% ומחוברות למחרת.
      2. היום לאחר פלסמידים ביטוי הציפוי, שיתוף transfect עם תצורות שונות בכל גם באמצעות מגיב המועדף וכפי שתואר על ידי היצרן.
        1. לכל היטב, להוסיף 125 ננוגרם של כל פלסמיד ביטוי לμl 50 של תקשורת מופחתת סרום ללא בצינור 0.6 מיליליטר ופיפטה מעלה ומטה כדי לערבב. הוסף 1 μl של מגיב transfection את המרכז של הצינור וישירות לתקשורת. להתסיס בעדינות לתערובת ולתת התגובה לשבת במשך 30 דקות.
        2. להפחית את התקשורת בכל טוב של חדר שקופיות בכמחצית. מוסיף את תערובת dropwise transfection לבארות ולנער זently לערבב. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל24-48 שעות. לשנות את תקשורת היום לאחר transfection.
    2. תאי תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי כמו בפרוטוקול 2 מתחילים עם צעד 2.1.4.
      הערה: המדגם עשוי להיות צילם על מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי אם רמות הביטוי גבוהות והמצלמה היא רגישה מספיק לפלט הפוטון הנמוך יחסית של PAmCherry1. יכולות להיות מופעלות על מולקולות PAmCherry1 מחדש עם סט אולטרה סגול מסנן (405 ננומטר) לפני הדמיה עם סט מסנן עירור ירוק (561 ננומטר).
  4. במקרים רלוונטיים, ליצור שליטה שלילית על ידי, למשל, מציג מוטציה נקודה לאחד החלבונים של עניין שמשבש את האינטראקציה. בצע מכוון mutagenesis אתר 21 על פלסמיד השיבוט של החלבון שעבר מוטציה ושל התצורה שנבחרה.
  5. צור שורת תאים יציבה על ידי אריזת המבנים לויראליחלקיקים ותאים להדביק U2OS (או שורת תאים של בחירה). שקול מערכת מושרה ביטוי (טטרציקלין) 15 כך ביטוי יכול להיגרם לפני ההדמיה אם הפיכות ממושכות של BiFC היא נושא, או אם ביטוי מתכונן הוא רצוי.
    זהירות: עבודה עם וירוסים מסווגות כרמת בטיחות ביולוגית 2. בעוד הדורות האחרונים של מערכות אריזת ויראלי שצמצמו מאוד את הסבירות לייצור וירוסים שכפול-מוסמך, כמה סיכונים עדיין קיימים. ניתן למצוא אזכור בhttp://www.cdc.gov/biosafety/publications/.
    1. חזור על שלב 1.2.10 באמצעות וקטור יעד lenti- או retroviral 20. להגדיל את O / תרבות N לmidiprep 100 מ"ל ובטהרה גדולה יותר של פלסמידים.
    2. ביום 1: פלייט על 2 x 10 6 293T / 17 תאים לתוך צלחת 10 סנטימטרים לכל מבנה להיות ארוזים.
    3. ביום 2: הכן את תגובת transfection באמצעות traמגיב nsfection של בחירה וכפי שתואר על ידי היצרן.
      1. הכן premix אריזה פלסמידים עם ריכוזים סופיים של 250 ng / μl לפלסמידים אריזת 1 ו -2, ו- 100 ng / μl אריזת פלסמיד 3 במים סטריליים. הוסף 10 μl של premix פלסמיד האריזה ו -2.5 מיקרוגרם של פלסמיד היעד ל1 מיליליטר של תקשורת מופחתת סרום ללא בצינור מסביב לתחתית 5 מיליליטר פוליפרופילן ופיפטה מעלה ומטה כדי לערבב. הוסף 20 μl של מגיב transfection את המרכז של הצינור וישירות לתקשורת.
        1. להתסיס בעדינות לתערובת ולדגור על RT למשך 30 דקות. הסר כמחצית התקשורת מהתאים ולהוסיף את תערובת transfection באופן dropwise. לנער בעדינות לתערובת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. דגירה 10 מיליליטר של תקשורת לכל צלחת בצינור עם הכובע התיר לטמפרטורה ו- CO 2 איזון.
      2. ביום 3: בעדינות לשנות את התקשורת עם התקשורת לפני מודגרות וreturn התאים לחממה. דגירה צינור אחר של תקשורת עם הכובע משוחרר.
        הערה: Syncytia, או היווצרות של תאים-גרעיני רב גדולים, יכולה להיות סימן לכך שהאריזה הולכת טובה. עם זאת, תאים נמצאים במצב שביר ויכולים בקלות להיות מנותק. בעת שינוי תקשורת, להטות את pipettor כך שהוא אופקי ולהוסיף dropwise התקשורת לקצה אחד של הצלחת.
      3. ביום 4: קציר הווירוס על ידי הסרת התקשורת עם מזרק וסינון דרך מסנן גודל 0.45 מיקרומטר נקבובית לתוך צינור 50 מיליליטר נקי. בעדינות להחליף את התקשורת עם התקשורת לפני מודגרות.
      4. ביום 5: קציר שוב כפי שנעשה בעבר בשלב 1.5.3.3 ולשלב תסנין נפוץ לתוך צינור 50 מיליליטר. הוסף 6 מיליליטר של רכז וירוס לכל צינור ומערבבים. חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות עד למשקעי הווירוס.
        הערה: בהתאם לבריאותם של התאים, ניתן לקצור וירוס בפעם שלישית.
      5. לרכז את הנגיף על ידי צנטריפוגה ב 1500 XGבמשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב250 μl של תקשורת. וירוס יכול לשמש מייד לזיהום או מאוחסן ב -50 aliquots μl ב -80 ° C עד שנה אחת.
      6. צלחת על 3 x 10 5 U2OS (או יעד) תאים לכל גם לתוך צלחת 6-היטב (2 מיליליטר של DMEM עם 10% FBS בכל טוב) לזיהום, ולכן תאים כ 50% ומחוברות בזמן של זיהום.
      7. למחרת, להסיר כמחצית תקשורת כל כך על 1 מיליליטר שרידים. Coinfect עם 50 μl של נגיף מרוכז עבור כל מבנה. הוסף 1 μl של polybrene (8 מ"ג / מיליליטר) לכל אחד. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. שינוי תקשורת למחרת ודגירה לעוד יום אחד לפני בחירת אנטיביוטיקה.
        הערה: כמות הנגיף להוסיף יכול להשתנות בהתאם לשיעור הרצוי של זיהום. ניתן טיטרציה וירוסים באמצעות qRT-PCR.
      8. להוסיף אנטיביוטיקה כדי לבחור עבור תאים נגועים. בארות נפרדות עם תאים נגוע שלא ראו viRus נדרש ככנרות כדי לבדוק את היעילות של הבחירה. דגירה של 2-7 ימים, או עד שהבחירה היא מוחלטת.
        הערה: ריכוזים אפקטיביים צריכים להיות טיטרציה בתחילה, אבל הם בדרך כלל 1.0 מיקרוגרם / מיליליטר לpuromycin ו1.0 מ"ג / מיליליטר לנאומיצין.
      9. הרחב את התאים לתוך צלחת 10 סנטימטר גדול יותר ולהמשיך לפרוטוקול 2.

2. תאי הדמיה קבועה

  1. הכן מדגם הדמיה
    1. נקה # 1.5 קאמרי שקופיות זכוכית תחתונה 8-גם על ידי הוספת 250 μl של 1 M NaOH לשעה לפחות 1 ולשטוף ביסודיות עם PBS.
      הערה: שקופיות קאמריות אינה מטופלת בדרך כלל לגרום לאות רקע גבוהה. בנוסף, תאים עשויים להיות רגישים לNaOH וכישלון לנקות את משטח הזכוכית ביסודיות (רבים ככל 10x שוטף) עלול להפוך הידבקות תא קשה שייר. במידת צורך, דגירה השקופיות קאמריות ניקו עם PBS O / N לאחר כביסה. לשורות תאים רגישות, ציפוי בצפיפות גבוהה(לדוגמא, ב 50% -60% confluency הראשוני) עשויים לעזור.
    2. צלחת על 5.5 x 10 4 תאי הביטוי יציב U2OS לכל גם ב350 μl של DMEM האדום ללא פנול עם 10% FBS כך שתאים בריאים ולא על מחוברות כאשר הדמיה.
    3. לבצע טיפולים דרושים לניסוי, כגון הוספת טטרציקלין לגרום ביטוי חלבון.
    4. תקן את התאים באופן מיידי לפני ההדמיה.
      1. לפני הקיבעון, להכין paraformaldehyde הטרי פתרון (PFA) - 3.7% PFA ב1x PHEM עם glutaraldehyde 0.1% (GA). במשך 10 מיליליטר פתרון PFA, שוקל 0.37 גרם של PFA ולהעביר לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 1 מיליליטר של מים מזוקקים ו -30 μl של 1 M NaOH ומערבולת. חום על 70 מעלות צלזיוס ומערבולת כל 1-2 דקות עד PFA נמס לגמרי.
      2. העברה מומסת PFA לצינור חרוטי 15 מיליליטר ולהוסיף 3.8 מיליליטר מים מזוקקים, 5 מיליליטר 2x חיץ PHEM, 20 μl של glutaraldehyde 25%, ומערבולת לערבב. המניה, חיץ PHEM 2x הוא 120 צינורות מ"מ, 50 מ"מ HEPES, 20 מ"מ EGTA, ו -16 מ"מ MgSO 4, עם חומציות מותאמת ל7.0 עם 10 M KOH. פתרון מקבע זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים.
        זהירות: PFA וGA שניהם מסוכנים. הכן את הפתרון במנדף וללבוש ציוד מגן מתאים כאשר טיפול הן הכימיקלים. הימנע משאיפת או מגע עם עור ישיר.
      3. הסר את מדיום הגידול. לשטוף במהירות עם 500 μl של PBS ולהוסיף 250 μl של מקבע PFA בכל טוב. דגירה התאים במשך 20 דקות ב RT.
    5. הסר את מקבע PFA מהמדגם ולהוסיף 350 μl של PBS או חיץ הדמיה (100 מ"מ טריס עם 30 מ"מ NaCl ו -20 מ"מ MgCl 2, pH 8.5) בכל טוב.
    6. 100 חלקיקי זהב ננומטר מערבולת כדי לשבור את אגרגטים ולהוסיף 35 μl לכל גם (10x דילול סופי) למעקב אחר נדידת שלב במהלך הדמיה.
  2. לרכוש תמונות
    1. הפעל את המיקרוסקופ. כוח על 405 והלייזרים 561 ננומטר, אבל לשמור את התריסים(פנימי או חיצוני) נסגר בשלב זה. הפעל את המצלמה EMCCD ולאפשר לו להתקרר. ודא 561 המסננים ננומטר נמצאים במקום.
    2. פתח את תוכנת הרכישה ולקבוע את זמן חשיפה ל -100 אלפיות שניים ורווח EMCCD 300 (טווח 1 - 1,000).
    3. להוסיף שמן טבילה למטרה ולאבטח את המדגם לבמה מיקרוסקופ.
    4. עם או שדה בהיר או לייזר 561 ננומטר ב( ~ 1 קילוואט / 2 סנטימטר), להביא את המדגם אל מוקד.
    5. הדמיה ראס וחלבוני קרום אחרים, להשתמש במטרת TIRF Apochromat 60X עם 1.49 צמצם מספרי ולהביא מיקרוסקופ לתצורת TIRF. התאם את לייזר העירור כך שזה כאשר להכות את הצמצם האחורי של מטרת TIRF מרוכז מ; זה גורם לליזר כדי להסיט בהגיעם למדגם. שמור התאמת הלייזר עד לזווית הקריטית והליזר הוא להיות מוחזר. חפש תא לתמונה עם כמה חלקיקי זהב בתצוגה. הגדר אזור של ענייןשסוגר את התא (או אזור בתוך התא) וחלקיקי זהב.
      הערה: TIRF מקטין את עומק החדירה של לייזר העירור ומפחית את האות מתוך רקע מוקד. בנוסף, תיקון להיסחף עשוי להיות מדויקים יותר כאשר יותר חלקיקי זהב נמצאים בתצוגה.
    6. אם זמין, לעסוק מערכת פוקוס אוטומטי כדי לתקן את סחיפת מדגם בZ-הכיוון. אחרת, לשנות את הפוקוס באופן ידני בכל הרכישה אם התמונה יוצאת של התמקדות.
    7. בגין רכישה עם לייזר 405 ננומטר את וליזר 561 ננומטר ב( ~ 1 קילוואט / 2 סנטימטר) בהפעלה מספקת מקרה מתרחש כבר (בדרך כלל אם רמות הביטוי גבוהות). אחרת, להפעיל את לייזר ננומטר 405 בהגדרת כוח המפעל הנמוך ביותר (0.02 mW או 0.01 W / 2 סנטימטר) ולהגדיל בהדרגה (0.1 mW בכל פעם) צריך, עד שיש כמה עשרות מולקולות לכל מסגרת או כך שמולקולות בודדות מופרדים היטב.
    8. כרכישת נתונים ממשיכה, גראדually להגדיל 405 כוח לייזר ננומטר כדי לשמור על צפיפות הנקודה בערך קבוע.
      הערה: בכוח עירור 405 ננומטר נמוך יותר, יכול להיות כבר מופעל כמה PAmCherry1. כמולקולות אלה photobleach, האוכלוסייה שנותר מולקולות PAmCherry1 photoactivatable יורדת, דורש שטף פוטון גבוה יותר כדי לשמור על אותה הצפיפות של מולקולות פולטות הקרינה בכל מסגרת.
    9. המשך רכישת תמונה עד ההספק גבוה 405 ננומטר (2.5-10 W / 2 סנטימטר) אינו מפעיל יותר אירועי הפעלה.
      הערה: סך הכל זמן הרכישה תלוי ברמת הביטוי והיעילות של ההשלמה.
  3. לעבד את התמונות
    הערה: יש הרבה אפשרויות תוכנת קוד פתוח לעיבוד תמונה. דוגמאות לכך הן סופת רעמים (https://code.google.com/p/thunder-storm/) וQuickPALM (https://code.google.com/p / quickpalm /). תהליכי עיבוד נתונים האופייניים מומחשים כאן בקצרה באמצעות חבילת Matlab מותאמת אישית בשם wfiread לעיבוד נתונים PALM כדוגמא. עם זאת, שינויים בעתיד ייתכן שלא בדיוק אחרי מה שמתואר כאן. לעיבוד תמונה עם תוכנות אחרות, עיין בתיעוד למשתמש.
    1. הורד את תוכנת עיבוד תמונה (קובץ קוד נוסף) או את הגרסה האחרונה בhttp://www.ohsu.edu/nan. פתח Matlab ולטעון את תוכנת wfiread (שכבר לשים בנתיב ברירת המחדל).
    2. צפה רצף תמונת הגלם ולקבוע את האזור של עניין. בחר את האזור של הערימה להיות מעובד על ידי לחיצה על ימין ועל גרירת תיבה מסביב לאזור הרצוי. אם האזור של עניין לא הופחת במהלך רכישה (כ 256x256 פיקסלים), בחר אזור קטן יותר כדי להפחית את זמן המחשוב. כדי לבטל את בחירת אזור ומעבד את כל המסגרת, לחץ לחיצה ימנית בכל מקום בהתמונת דואר.
    3. הזן את מגוון מסגרות לעיבוד.
    4. בחר חלקיקי זהב (אחד כי הוא מבודד ואחיד בצורה) על ידי לחיצה השמאלית על התמונה וגרירת תיבה קטנה סביבו. תחת חלקיקים מעקב, לחץ על לחצן המסלול. גרף יופיע המציג את עמדתו של חלקיק הזהב נבחר על פני הערימה של תמונות, המתאר את היקף להיסחף.
    5. חזור על תהליך זה כדי לעקוב אחר חלקיקי זהב רבים ככל האפשר ולקבוע את אלה העוקבים אחר יחד (החלקיקים יהיו בצבע מקודד). באופן אידיאלי להיסחף הכולל הוא בסדר הגודל של פיקסל אחד לכל היותר.
    6. בנפרד לבחור את חלקיקי הזהב שאתרו ביחד אחד בכל פעם, ולחץ על כפתור הוספת מרקר תחת חלקיקים מעקב. צלב ירוק יופיע מסמן שנוסף כסמן וישמש לתיקון לסחיפה.
    7. התאם את טווח Sigma, טווח החלקה וסף כנדרש על ידי שינוי הערכים מעט. לחץ על החלקיקים מצאכפתור כדי לבדוק את ההגדרות. החלקיקים שיעובדו יהיו התאגרפו ואלה שאינם יישארו בחוץ. מולקולות PAmCherry1, החלקיקים שהם יחסית עגולים בהירים ו, ​​יש לבחור.
    8. התחל עיבוד התמונות על ידי לחיצה על כפתור קובץ coord לבצע ולשמור את הקובץ.
      הערה: התכנית תעבור כל מסגרת בטווח המסגרת המוגדרת, למצוא את כל כתמי הניאון, ולבצע התאמת גאוס כדי למצוא את קואורדינטות centroid. קובץ .cor יופק אחסון כל הקואורדינטות והפרמטרים מתאימים אחרים של תמונות מולקולה בודדות מעובד.
  4. לאחר תהליך התמונות ולהבהיר את תמונת PALM
    הערה: תוכנה אחר עשויה להבהיר את התמונה ישירות לאחר תיאום חילוץ.
    1. ב- Matlab, להשיק את החבילה "דקל" ולטעון את קובץ .cor עתה יצר.
    2. לפני טיוח תמונת PALM באמצעות הקואורדינטות, למיין את הקואורדינטות בודדות (כל אחד מ'localizatiבאירוע "). ערכי המיון אופטימליים עשויים להשתנות בהתאם להגדרת וfluorophore.
      1. לPAmCherry1, להשתמש בערכים הבאים: מסגרת שילוב - 8; מרחק (ננומטר) שילוב - 100; RMS מינימום - 4; אלוהים מינימום Fit - 0.25; ומקס. אקסצנטרי - 1.4. עיין בסעיף הדיון להסבר נוסף של פרמטרים אלה.
    3. לחץ על לחצן מיון כדי ליצור קבוצה חדשה של קואורדינטות מוכנות לעיבוד תמונות ברזולוציה גבוהה.
    4. הזן את הערכים לעיבוד נכון של התמונה הסופית כגון גודל גלם פיקסל (ננומטר), גודל הרצוי התכונה (ננומטר) בתמונה שניתנו, וגודל פיקסל לתמונה שניתנו.
      הערה: גודל פיקסל הגלם צריך להיקבע עבור כל התקנה. גודל התכונה שניתנו ניתן להגדיר באופן שרירותי, אלא מוגדר בדרך כלל בערך גבוה במעט מדיוק הלוקליזציה הממוצע. לPAmCherry1, דיוק הלוקליזציה הממוצע הוא סביב 18 ננומטר, כך גודל תכונה של 20 - 30 ננומטר הוא appropriaטה. ראוי לציין, דיוק הלוקליזציה חושבה על ידי לקיחת סטיית התקן של המגוירות של אותה המולקולה על פני מסגרות מרובות 22 ולא על ידי חלוקת גבול ההשתברות עם השורש הריבועי של מספר המזוהה של פוטונים. באשר לגודל פיקסל של התמונה שניתנו, 10 ננומטר היא נקודת התחלה טובה; הגדרת ערך זה נמוך מדי תגרום לקבצי תמונה גדולים שלא לצורך לנוף לא מוגדל.
    5. לחץ על הכפתור לדקלם כדי ליצור את תמונת PALM. השתמש בסמלי מגדלת +/- בסרגל הכלים של חלון הדמות ללהתקרב ולהתרחק.
    6. ניתוח אשכולות בצעו של התמונה המשוחזרת PALM או באמצעות בדיקת K של ריפלי או מנגנונים אחרים כגון DBSCAN בעזרת הסימולציה 23 (SAD): אופציונאלי. שים לב: בחבילת הכף המותאמת אישית, שניהם K של ריפלי וניתוח SAD כבר נבנו ב; לקואורדינטות שנוצרו מתוכנה אחרת, באותו הניתוח ניתן לבצע עם סקריפטים מותאמים אישית נוספים.
    5. 3. מולקולה בודדת מעקב בתאים חיים

    1. פנק את משטח תרבית הרקמה וצלחת התאים כפי שתואר בפרוטוקול 2. מאז הטמפרטורה והשלב או / CO 2 מבוקר עשויים לדרוש צלחת תרבות מסוימת, להבטיח בטוח שיש לו את coverglass העובי המתאים (0.17 מ"מ) להתקנת מיקרוסקופ.
      1. Transfect תאים אם עושה ביטוי חולף ולבצע כל טיפולים דרושים לניסוי, כגון טטרציקלין לגרום לביטוי, ודגירה במידת צורך. זהו גם אותו, כמתואר בפרוטוקול 2.
      2. מניחים את צלחת התרבות על חממה על הבמה. בואו הצלחת להתיישב על הבמה לכמה עד שהטמפרטורה וריכוז CO 2 דקות לייצב בכל פעם לאחר ההרכבה המנה התרבות או לעבור לאזור חדש של עניין. לייזרי בלוק בשלב זה. אם CO 2 שליטה אינה זמינה, לשנות לCO 2 תקשורת עצמאית ממש לפני ההדמיה, כגון LeibovL-15 של הריץ.
        הערה: הבינוני פנול-אדום-חופשי מומלץ לקרינת רקע מדכאת.
    2. לרכוש תמונות כמו בפרוטוקול 2. עם זאת, נקבע זמן חשיפה מתאים (בדרך כלל 25-50 msec עבור PAmCherry1).
      הערה: צפיפות המולקולה חייבת להיות נמוכה יותר מאשר לתאים קבועים כך שניתן להקליט מסלולים ללא חפיפה אחד עם השני. כמה עשרות המוגדר של מולקולות אופייניים לרכישת 256x256 פיקסל בגודל פיקסל של כ -160 ננומטר. צפיפות כוח הלייזר 561 ננומטר הייתה מוגדרת 0.8 קילוואט / 2 סנטימטר כדי לשמור על יחס אות לרעש טוב תוך הפחתת phototoxicity לתאים ולהגדיל את אורך המסלול הממוצע.
    3. לעבד את התמונות.
      1. לחלץ קואורדינטות של מולקולות בודדות עם חבילת wfiread כפי שתואר בפרוטוקול 2, או עם חבילה אחרת.
      2. לשחזר מסלולי חלקיקים בודדים באמצעות חלקיק יחיד שונים מעקב חבילות (SPT) המבוסס על אלגוריתמים שונים מצאובמקום אחר 24. הערה: לחלופין, צעד זה עשוי להיות מושלם באמצעות חבילת Matlab בנה את הבית (ואולי זמינה בגרסות עתידיות בhttp://www.ohsu.edu/nan.
      3. אופציונאלי: לאחר שחזור, השתמש חבילת SPT 24 לחשב קבועי עקירה ודיפוזיה מהמסלולים. בנוסף, לשימוש חד-חלקיקי הוריאציה ייס מעקב (vbSPT) 25 כדי לקבוע מדינות דיפוזיה של חלבוני היעד. ניתן למצוא חבילת vbSPT Matlab ותיעוד באתר הרשמי שלה Sourceforge: http://vbspt.sourceforge.net/.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דוגמא BiFC-PALM המוצג היא המוטציה KRAS G12D אינטראקציה עם ראס מחייב תחום (RBD) של craf (איור 1 א). כפי שנאמר, RN או שברי RC לא מתויגים לC-הסופית של ראס כי זה היה לשבש את לוקליזציה הקרום ולכן הפעילות הביולוגית של ראס. זה הפחית את הצירופים האפשריים משמונה עד ארבעה (איור 1). כל אחד מארבעת שילובים אלה הוכנס לתאי U2OS באמצעות זיהום lentiviral. התאים היו קבועים כמפורט בפרוטוקול, ואותות BiFC הוערכו באמצעות התקנת PALM. תאים עם אותות BiFC חיוביים זוהו על ידי העלייה החדה בקרינה כאשר לייזר 405 ננומטר היה מופעל; לייזר 561 ננומטר היה בלאורך ניסוי ההדמיה. השינוי הפתאומי הזה בקרינה נובע photoactivation של PAmCherry1 מחדש-BiFC על תאורה עם לייזר 405 ננומטר. אזורים מרובים במדגם הוערכו באמצעות גישה זו, ואת עוצמת אות BiFC הייתה מחושבת על ידי ממוצע העלייה בעוצמות פיקסל לפני ואחרי דופק עוצמה מליזר 405 ננומטר.

כפי שניתן לראות בתרשים 1C, מתוך ארבע התצורות אפשריות, שתי תצורות (RN-ראס כלומר / RC-רף RBD וRN-ראס / רף RBD-RC) היו אותות BiFC חזקים. תצורה אחרת (RC-ראס / רף RBD-RN) הייתה אות חלשה, והייתה אחד אין אות. לכל הניסויים הבאים, שימש RN-ראס / תצורת RBD-RC רף (ימני עליונה באיור 1 ג). כביקורת שלילית, מוטציה נקודה (R89L) בתחום מחייב ראס של רף הוצגה ויעילות BiFC תוך שימוש באותה התצורה נבדקה. מוטציה זו הייתה ידועה לשבש רף מחייב לראס; באופן עקבי, המוטציה מופחתת במידה ניכרת אות BiFC (1D איור).

מאז מולקולות PAmCherry1 נוצרו באמצעות BiFC הראו תכונות photoactivation דומות למקורPAmCherry1 10, זה מאפשר הדמיה כף דגימות BiFC באמצעות אותן ההגדרות ניסיוניות כעם PAmCherry1 ההורה. תמונת PALM דוגמא של תאים עם אות BiFC חזקה לאחר הדבקה עם RN-ראס והרף RBD-RC מוצגת באיור 2 א.

כאשר זינק ב( תחתון איור 2 א עזב וריבועים, עם אזורים מוגדלים התאגרפו), מולקולות בודדות והפריסה המרחבית ננו ניתן לראות בבירור. ראוי לציין, כל נקודה בתמונות PALM אלה מייצגת מורכב אחד משוער ראס-רף RBD מתויג עם מולקולת PAmCherry1. לשם השוואה, בצד ימין של איור 2 היה מדומה תמונות ברזולוציה נמוכות של אותו השדות של נוף, שבו האשכולות הפכו מעורפלים לחלוטין. התצפית של אשכולות ראס-רף RBD עולה בקנה אחד עם תצפיות קודמות על אשכולות ההתנהגות של ראס ורף.

עם תאי חיים להביע BiFC מחדש PAmCherry1, SMT-PALM היה performed לרכוש מסלולי דיפוזיה של מתחמי ראס-רף RBD בודדים, בדומה למתואר בעבר 10. תחת תאורה רציפה עם לייזרי 561 ננומטר 405 ננומטר ו, מולקולות בודדות PAmCherry1 stochastically לעבור על ותימשכנה כמה מסגרות לפני כניסת מדינות חשוכות (בין שאר בשל photobleaching). בפרק זמן זה, המולקולות הציגו לפחות שתי התנהגויות דיפוזיה שונות: מדינה נייחת (איור 2, מולקולת 1) ומצב נייד (איור 2, מולקולה 2). שני הסוגים של מסלולים ברורים הווה ב( x, y) העלילה שמוצגת באיור 2 ג, שבו המסלולים של מולקולות רבות נרשמים. אותו ההפצה הטרוגנית של מדינות דיפוזיה ניתן להסיק מהיסטוגרמה של עקירה מולקולרית בין מסגרות רצופות. בדרך כלל, 10,000 - ניתן לרכוש 100,000 מסלולי דיפוזיה מכל תא; מספר גדול זה מאפשר ניתוח סטטיסטי קפדני יותר של tהוא דיפוזיה מדינות, למשל עם אלגוריתם vbSPT 25.

איור 1
איור 1. BiFC-PALM עיצוב ניסיוני של אינטראקציה ראס-רף. () ראס הוא חלבון קרום נכנס שמגייס רף כאשר פעיל. כאשר שברי PAmCherry1 פיצול לא פלורסנט מחוברים לראס ורף, האינטראקציה מביאה שברים ביחד והשלמה מתרחשת, וכתוצאה מכך חלבון פלואורסצנטי פונקציונלי. (ב) מאז תיוג ראס בC-הסופית שלה היה לשבש לוקליזציה הקרום שלה, מספר התצורות נבדקו לראס-רף BiFC-PALM הופחת משמונה עד ארבעה. תמונות (C) של תאי U2OS להביע התצורות נבדקו נלקחו עם מיקרוסקופ TIRF. כדי לאמוד את יעילות BiFC של כל תצורה, מקבלים תאים באותו מינון גבוה של 405 ואילו אור ננומטרשהלהיב עם 561 ננומטר אור. (ד) מציגים את המוטציה R89L לRBD רף מופחת במידה ניכרת אות BiFC של תצורת RN-KRAS G12D / craf RBD-RC (הימנית העליון ב- C, n = 5-8). ברים שגיאה הם SEM ב( ד '). ברים סולם ב( ג), 10 מיקרומטר. RN = PAmCherry1 N-מסוף בר, בר RC = PAmCherry1 C-מסוף, וRBD = ראס תחום מחייב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. BiFC-כף תאי U2OS להביע את תצורת RN-KRAS G12D / craf RBD-RC. (א) תמונת PALM כל מוצגת לעיל. פנלים התחתונים מוגדלים נוף של האזורים בארגזים בתמונה העליונה כפי שצוין. ריבועי הם גבוהים יותרהגדלה של האזורים התאגרפו בתצוגות מוגדלות בהתאמה. הצד הימני של הלוחות הנמוכים (TIRF שכותרת) הם ייצוגים של התמונות על שמאלם כאילו נלקח עם מיקרוסקופ עקיפה מוגבל. (ב) מסגרות רצופות מניסוי SMT-PALM תא חי המתארים (1) ומהירים מתחמי ראס-רף (2) נעו איטיים. פלט (C) מניסוי SMT-PALM מראה מסלולי דיפוזיה של מתחמי ראס-רף בשטח קטן של תא. היסטוגרמה של התקות לכל מסגרת של מתחמי ראס-רף מניסוי SMT-PALM (ד '). ברים סולם ב (א), 5 מיקרומטר עליון, תחתון 500 ננומטר, 50 ננומטר ריבועי, ו- (ג), 1 מיקרומטר. RN = PAmCherry1 N-מסוף בר, בר RC = PAmCherry1 C-מסוף, וRBD = ראס תחום מחייב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

רצף פריימר (5 'ל 3')
שיבוט פלסמיד להכנסה בN-סופית הפוך CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC
RN בN-סופית קדימה GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA
RC בN-סופית קדימה GGCGCCCTGAAGGGCGA
שיבוט פלסמיד להכנסה בC-סופית קדימה TAAAAGGGTGGGCGCGCC
RN מהפוך C-סופית GTCCTCGGGGTACATCCGCTC
RC מהפוך C-סופית CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG

טבלת 1. צבעי יסוד לlinearizing פלסמידים שיבוט המכילים שברי PAmCherry1. פלסמידים השיבוט מכילים RN וRC יכולים להיות לינארית עם PCR ההפוך בנקודת הכניסה בשני N- או C-הסופית של הברים. רצפים רשומים 5 'ל3R17 ;.

הסככות לגן של פריימרים ריבית (5 'ל 3')
RN הכנסת N- מסוף או קדימה RC GAGCTCGGTACCATG
הפוך RN הכנסת N-מסוף ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC
N-מסוף הכנסה הפוך RC ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC
RN ההכנסה בטרמינל C-קדימה ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT
החדרת C-מסוף RC קדימה GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT
RN הכנסת C-מסוף או הפוך RC GCGCCCACCCTTTTA

טבלה 2. הסככות לגן של פריימרים עניין התואמות פריימרים 1 טבלה. 15 הזוגות הבסיסים של הומולוגיה לתגובת קשירה-עצמאית שנוצרמסככות פריימר. בנוסף, הסככות כוללות רצף למקשר גמיש x2 (GGGGS). רצף מקשר גמיש ניתן להוסיף פריימרים בטבלה 1 במקום. רצפים רשומים 5 'ל 3'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BiFC היה טכניקה נפוצות לאיתור וחזותי PPIs בתאים, ואילו PALM הוא הטכניקה האחרונה יחידה superresolution המולקולה מיקרוסקופית המאפשרת הדמיה בקנה מידה ננומטרי של דגימות ביולוגיות בשלמותה. השילוב של BiFC עם PALM השיג הדמיה סלקטיבית של PPI בתוך תא עם רזולוציה מרחבית ננומטר ורגישות מולקולה בודדת. BiFC-PALM מרחיב את השירות של שני הטכניקות, וכפי שהודגם בעבודה זו, מראה הבטחה גדולה בחושפים את הפרטים המולקולריים של PPI בהקשר הסלולרי האם שלהם. בפרט, הרזולוציה ננומטר מאפשרת חקירה מפורטת של הרגולציה מרחב ובזמן של PPI ספציפי ברמה המולקולרית, אשר כבר אתגר במחקר הביו-רפואי. עם זאת, כפי שציין קודם, BiFC-PALM מוגבל על ידי ההפיכות של ההשלמה והתבגרות כרומופור איטית.

פיצול PAmCherry1 שימש כדי להדגים את העיקרון וutility של BiFC-PALM. PAmCherry1 כבר בשימוש נרחב בניסויי PALM למאפייני photophysical המצוין שלה. יתרון נוסף של שימוש בPAmCherry1 כבדיקת BiFC הוא הרקע הנמוך וסגוליים גבוהים ויעילות בכינון מחדש חלבון ב 37 מעלות צלזיוס, כאשר מצמידים את PPIs. מסיבות אלה, הבדיקה PAmCherry1 BiFC הפיצול צפויה להיות משאב יקר ערך החלים על חקירות ביולוגיות שונות רבות מעורבות הדמיה ברזולוציה גבוהה של PPI. בנוסף לPAmCherry1, חלבון פלואורסצנטי photoconvertible, mEos3.2, גם לפצל לBiFC-PALM 26. בגלל ספקטרום הפליטה שלהם חופף, לא ניתן להשתמש בmEos3.2 וPAmCherry1 יחד, אבל PA-FPS הירוק כבר דיווח לאחרונה 27, פתיחת האפשרות להדמיה superresolution ננו שני צבעים של PPI.

כמו בBiFC הקונבנציונלי, שלב קריטי ביישום BiFC-PALM הוא העיצוב והשיבוט של מבני ההיתוך. העובדה שעדשמונה מבני ביטוי שונים צריכים להיות משובט ושמונה זוגות BiFC צריכים להיבדק בכל ניסיון ליישם BiFC וBiFC-PALM יכולים להיות מייגע, אם לא מונע, תהליך. עם זאת, כפי שמודגמים בדוגמא ראס-רף, ידע מוקדם על המאפיינים ביוכימיים ומבניים של חלבוני עניין לעתים קרובות ניתן להשתמש כדי להנחות את העיצוב מותאם של מבני ההתמזגות עם מספר מופחת של זוגות BiFC להיבדק. שאמרו, כרגע אין קו מנחה אוניוורסלי על מנת להבטיח שBiFC (ומכאן BiFC-PALM) ניסוי יעבוד; הרבה יותר מזה הוא עדיין אמנות.

בעוד BiFC וBiFC-PALM משמשים בדרך כלל כדי לחקור היווצרות heterodimer בין שני חלבונים, זה גם אפשרי ללמוד היווצרות homodimer תוך שימוש בגישות אלה, ובמקרה זה שני חלבוני המועמד יהיו זהים. עם זאת, כאמור, שני חלבונים עם אותו שבר יכולים לקיים אינטראקציה אך לא לגרום לאות BiFC. למרות כל מבנה פועל כמעכב תחרותי לאינטראקציות האחרות, כאלה הם הפיכים, ואילו אינטראקציות וכתוצאה מההשלמה מוצלחת היו לצבור בשל ההפיכות. באופן כללי, יכולה להיות שיש ירידה באות אם יש הבדל דרסטי בין רמות הביטוי של כל מבנה. לכן, רמות הביטוי של שני מבנים ייתכן שתהיינה הצורך נקבעו בעת השוואת עוצמות הקרינה (למשל, בין סוג הפראי ודגימות homodimer מוטציה) ברמות ביטוי אנדוגני. זו אולי הסיבה ניסויי BiFC מבוצעים בדרך כלל עם transfections וביטוי יתר של המבנים ארעיים.

אחרון חביב, כל ניסויי BiFC חייבים להיות מאושרים עם בקרות נאותות. אם אות BiFC היא הווה, יש סיכוי שהאות היא שאינם ספציפית (כלומר, שהברים מחדש של בעצמם ולא בגלל PPI). שליטה שלילית היא מוטציות באו שניהם החלבונים שידועיםלשבש את יחסי הגומלין, שאמור לגרום לאובדן משמעותי של אות BiFC. אם מוטציה כזאת נקודה אינה ידועה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון הכנסת שותף מחייב תחרותי לאחד מהחלבונים ולראות אם יש ירידה במקביל באות.

המצב קשה יותר לפתרון בעיות חוסר אות BiFC, או שליליים שווא. במקרים כאלה, חשוב לכלול בקרות חיוביות בתהליך השיבוט, כגון שליטת GFP במהלך transfections. ניתן להפעיל כתמים מערביים כדי לבדוק ביטוי של המבנים. אם גורמים אלה הם נורמלים, גורמים אחרים ייתכן שיהיו הצורך לשנות, כגון אורך מקשר ו / או רצף, או תצורת BiFC שונה יש לשקול.

באשר לחלק PALM, מספר הפרמטרים יש לקחת בחשבון בעת ​​עיבוד התמונות. שלב 2.4.2.1 מתאר פרמטרים המשמשים למיון הקואורדינטות ויצירת תמונת PALM הסופי. הראשוןשני פרמטרים, שילוב מסגרת ושילוב מרחק, להגדיר אם שני אירועי לוקליזציה שניהם בטווח של 100 ננומטר ומופיעים פחות מ 8 מסגרות (ב 100 אלפיות שניים / מסגרת) או ~ 0.8 שניות מלבד כפי שתוארנו קודם לכן 23. אם כן, אז הם ייחשבו לנבוע מאותה המולקולה, והקואורדינטות שלהם תהיה בשילוב ידי ממוצעים. מדינות חשוכות עם חיים הרבה יותר מאשר 0.8 שניות לPAmCherry1 נראה נדיר; כמקרה של fluorophore מתאושש ממדינה חשוכה חיים ארוכים הוא שאין להבחין בין מולקולה שונה בקרינת מרחק הפרוקסימלי פולט, שני אירועי לוקליזציה נחשבים הלנובעים מאותה המולקולה רק אם הם הופיעו במספר מסוים של מסגרות ו מרחק פיזי. באופן אמפירי, הגדרה 'לשלב מסגרת' ב8-12 מסגרות (.8-1.2 שניות) נראית אופטימלי בתנאי הניסוי שלנו. מינימום RMS מגדיר את היחס המינימלי בין משרעת הראויה וסטיית התקן של רעש שאריות לאחרהמתאים. ערכים אלה נרשמים בקובץ .cor במהלך לתאם חילוץ.

לסיכום, BiFC-PALM משלב את היתרונות של BiFC וPALM ומאפשר חקירה של PPI בפירוט רב יותר ממה שכבר השיג בעבר. עם שיקולים לגורמים לעיל ועם ניסויי בקרה נאותים, BiFC-PALM צריך להיות כלי שימושי לחקר PPIs במגוון רחב של הגדרות ביולוגיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope frame Nikon Ti-U
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA Nikon CFI Apo TIRF 60x H
EMCCD camera Andor iXon Ultra 897
561 nm laser Opto Engine MGL-FN-561
405 nm laser Coherent CUBE-405 50mW
561 nm dichroic mirror Semrock  Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nm filter Semrock FF01-525/45-25
405/561 nm notch filter Semrock NF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stage Tokai Hit INUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS Addgene 60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS Addgene 60546
pcDNA3.2-DEST Life Technologies 12489-019
pLenti-DEST Addgene http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Scientific F-531
In-Fusion HD Cloning Clontech 639649
LR Clonase Life Technologies 11791
Vira Power Lentivirus Packaging Life Technologies K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent Roche 13873800
Lab-Tek II Chambered Coverglass Thermo Scientific 155409 #1.5 glass bottom dishes
U2OS cells ATCC HTB-96
293T/17 cells ATCC CRL-11268
DMEM with phenol red Life Technologies 11995
DMEM no phenol red Life Technologies 21063
Fetal bovine serum Life Technologies 10082
Leibovit's L-15, no phenol red Life Technologies 21083-027
Reduced serum medium Life Technologies 31985
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14040
Syringe BD Biosciences 309604
Syringe filter Millipore SLHV033RB
Lentiviral concentrator Clontech 631231
Retroviral concentrator Clontech 631455
10 cm culture dish BD Biosciences 353003
6-well culture plate BD Biosciences 353046
Polybrene Sigma 107689
Puromycin Life Technologies A11138
G-418 Calbiochem 345812 Neomycin
Doxycyline Fisher BP2653
Tris base Fisher BP152
EDTA Sigma EDS
Sodium Hydroxide Sigma S5881
Paraformaldehyde Sigma 158127
Glutaraldehyde Sigma G6257
PIPES Sigma P6757
HEPES Sigma H4034
EGTA Sigma 3777
Magnesium Sulfate Sigma M2643
Potassium Hydroxide Sigma 221473
Sodium chloride Fisher BP358
Magnesium chloride Fisher M33
100 nm gold particles BBI Solutions EM.GC100
Molecular grade water Life Technologies 10977
Dpn1 New England Biolabs R0176
PCR purification kit Qiagen 28104
Miniprep kit Qiagen 27104
Midiprep kit Macherey-Nagel 740410
0.6 ml microcentrifuge tubes Fisher 05-408-120
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher 05-408-137
15 ml tubes Fisher 05-539-12
5 ml polypropylene round-bottom tubes BD Biosciences 352063
14 ml polypropylene round-bottom tubes BD Biosciences 352059
50 ml tube BD Biosciences 352070
PCR tube GeneMate C-3328-1
SOC medium Life Technologies 15544
LB broth BD Biosciences 244610
Kanamycin sulfate Fisher BP906
Competent cells Life Technologies C4040
Matlab Mathworks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
  2. Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
  3. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
  4. Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
  5. Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
  6. Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
  7. Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
  8. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  9. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  10. Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589 (2014).
  11. Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
  12. Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
  13. Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
  14. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  15. Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171 (2013).
  16. Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
  17. Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
  18. Seidman, C. E., Struhl, K., et al. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Coligan, J. E., et al. Appendix 4, 4D (2001).
  19. Morrison, S. L. Preparing frozen bacterial stocks. Curr. Protoc. Immunol. Coligan, J. E., et al. Appendix 3, Appendix 3M (2001).
  20. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529 (2009).
  21. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
  22. Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
  23. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
  24. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
  25. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  26. Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
  27. Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 106 אינטראקציה בין חלבונים מיקרוסקופיה superresolution מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivated שלמת הקרינה bimolecular מעקב מולקולה בודד PAmCherry אשכולות חלבון vbSPT
Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית עם bimolecular פלואורסצנטי השלמה (BiFC-PALM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nickerson, A., Huang, T., Lin, L.… More

Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM). J. Vis. Exp. (106), e53154, doi:10.3791/53154 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter