Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Photothrombosis الناجم عن نقص التروية التنسيق نموذجا من اصابات الحبل الشوكي في الفئران

Published: July 16, 2015 doi: 10.3791/53161
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Bioengineering, Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri
* These authors contributed equally

Introduction

إصابات الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) هو شرط السريرية المدمرة التي تؤثر الحسية واللاإرادي وظائف SC. وغالبا ما تترك المرضى على قيد الحياة SCI مع المنهكة الشلل النصفي الذي يؤثر بشكل كبير على نشاطاتهم اليومية ونوعية الحياة 1. وكانت النماذج التجريبية SCI أداة لا غنى عنها في التحقيق العلمي لفهم الفيزيولوجيا المرضية لاصابات النخاع الشوكي وعمليات إصلاح العصبية المرتبطة بها. كما تم استخدام هذه النماذج لاختبار فعالية قبل السريرية لمختلف التدخلات اعصاب التجريبية التي تهدف إلى الانتعاش وظيفية. حاليا، معظم النماذج SCI في ممارسة توظف استخدام القوة الفظة المادية لتعطيل ميكانيكيا وتجرح SC. وتشمل هذه الأساليب كدمة، وضغط، والتفكك وtransection من SC 2. فقد قيل أنه بعد إهانة الميكانيكية الأولية لإصابة ثانوية في شكل مجموعات نقص التروية في في SC المصاب 3،4. المسببات لنقص التروية الثانوي ويشمل انحطاط واسعة الأنسجة، ونزف متني وأحيانا انسداد الأوعية الدموية بنسيج ذمة 5-7. نتيجة الإصابة الثانوية يتأثر سلامة SC أبعد من ذلك، يتم تخفيض قيمة الخلايا العصبية والخلايا الدبقية بشدة في وظيفة وقدرتها على البقاء وتمر الخلايا مما يؤدي إلى احتشاء النمو خلال المرحلة المزمنة من الإصابة، مماثلة لنمو غبش الدماغية السكتة الدماغية التالية 8،9. وقد تم الإبلاغ عن العديد من الآليات مثل التحفيز الزائدة، إنتاج الجذور الحرة، والتهاب ليكون مسؤولا عن موت الخلايا الدماغية التالية SCI 10،11. بالإضافة إلى ذلك، SC نقص التروية هو من مضاعفات خطيرة من جراحات إصلاح الأبهر الصدري البطن التي غالبا ما تؤدي إلى الشلل النصفي في المرضى 12،13. على الرغم من هذا التأثير السريري عالية تتوفر حاليا نماذج قليلة جدا من نقص التروية الحبل الشوكي مع استنساخ عالية.

الإقليم الشمالي "> Photothrombosis (PT) هو طريقة تستخدم عادة للتحريض نقص التروية التنسيق في الدماغ 14-20. هذه التقنية إلى حد ما غير الغازية، استنساخه للغاية وتنتج الآفة الدماغية التنسيق الدقيق في المنطقة المكشوفة من الدماغ 17 -21. ويتحقق ذلك عن طريق الإدارة النظامية الأصباغ متفاعل مثل روز البنغال (RB) 16-20،22 أو erythrosine B 23 تليها تشعيع المترجمة من الأوعية الدموية مع مصدر ضوء مناسب. تنشيط ضوئي من الصبغة يتسبب في توليد الجذور الحرة التي تعطيل سلامة بطانة الأوعية الدموية على نحو سلس، وتتسبب في الصفائح الدموية لتتراكم، والتي تشكل في وقت لاحق الجلطة. وإعاقة تدفق الدم من خلال نتائج خثرة في احتشاء في المنطقة التي قدمتها السفينة 24. ونظرا لسهولة السيطرة على كثافة ومدة التشعيع هذا الإجراء غلة احتشاء موحد للغاية وقابلة للتكرار. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم للحث على infarct في مختلف المواقع التشريحية تمكين المكاني (على سبيل المثال، المادة الرمادية مقابل المادة البيضاء) فهم تأثير نقص التروية.

الهدف من الدراسة الحالية هو تطوير نموذج سهل وتكرار للغاية من SC نقص التروية في الفئران. وصفنا الداخلي للنموذج PT من SC نقص التروية في الفئران. أظهرت النتائج من الأنسجة والمناعية التي يمكن أن تحفز على نحو فعال PT SC احتشاء، وفقدان الخلايا العصبية ودباق رد الفعل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: الفئران (C57BL / 6J، الذكور) الذين تتراوح أعمارهم بين واستخدمت 12 أسبوعا في هذه الدراسة - 10. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل جامعة ميسوري المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC).

1. قبل الجراحة

  1. قبل يوم واحد الأوتوكلاف الجراحة وتعقيم جميع الأدوات الجراحية. التفاف الصكوك والأوتوكلاف على 121 درجة مئوية في 15 رطل لمدة 30 دقيقة تليها 30 دقيقة من التجفيف (121 درجة مئوية، و 15 رطل، 30/30 دورة). وضع الأدوات في بيئة نظيفة ومعقمة حتى استخدامها مرة أخرى.
  2. إعداد جديدة روز البنغال (RB) الحل (20 ملغ / مل في ملحي معقم) في كل مرة قبل الجراحة. حل تماما RB، دوامة أنبوب ثم تليها صوتنة لمدة 5 دقائق في 50/60 هرتز مع انتاج الطاقة من 19 W. التفاف أنبوب في رقائق الألومنيوم وحمايته من الضوء حتى استخدامها من خلال سورجيري.
  3. إعداد خليط من الكيتامين / زيلازين في المياه المالحة عقيمة. إضافة 125 ميكرولتر من زيلازين (تركيز المخزون: 20 ملغ / مل) و 325 ميكرولتر من ketmaine (تركيز الأسهم: 100 ملغ / مل) و 550 ميكرولتر من محلول ملحي لجعل الحجم النهائي من 1 مل من مزيج مخدر.
  4. قبل تدفئة وسادة التدفئة homeothermic.
  5. قبل تدفئة مصباح معدن هاليد (مصدر الضوء لالمجهر FN1 برنامج التحصين الموسع ومضان) لمدة 30 دقيقة لتحقيق الاستقرار في الطاقة مصباح.
  6. ضبط حجم المنطقة المضاءة ليبلغ قطرها 1 مم باستخدام الهدف 10X والشبيكة عن طريق ضبط الحجاب الحاجز الميدانية في FN1 تستقيم المجهر برنامج التحصين الموسع ومضان.

2. إجراء العمليات الجراحية

  1. تخدير الفأر مع جرعة من الكيتامين (130 ملغم / كغم من وزن B..) وزيلازين (10 ملغ / كغ من وزن B.). استنادا إلى كوكتيل في 1.3 و 4 ميكرولتر غرام من وزن الفأر B. المائة. مطلوبين. تعقيم موقع الحقن مع مسحة الكحول وإدارة التخدير عن طريق البينية-peritoneal (IP) الطريق. الحرص على عدم حقن التخدير في الأوعية الدموية أو العضلات لأن هذا من شأنه أن يؤخر تحريض والانتعاش من الحيوان.
  2. تطبيق مرهم مصطنعة المسيل للدموع لكلتا العينين من الماوس لمنع جفاف ووضع الحيوان على وسادة التدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم.
  3. إعداد الحيوان
    1. تحقق من الحيوان للتخدير السليم مستوى الجراحي باستخدام استجابة قرصة أخمص قدميه.
    2. بمجرد وصول الحيوان مستوى الجراحية التخدير، مقطع الشعر على السطح الظهري حول خط الوسط للحيوان باستخدام الانتهازي الشعر الكهربائية. فرك موقع الجراحية مع الايثانول 70٪ تليها حل betadine ثلاث مرات. تغطية الموقع مع ثنى الجراحية المعقمة حتى الخطوة التالية.
  4. عملية جراحية لرقيقة العظام لفضح الحبل الشوكي
    1. ضع الماوس في وضعية الرقود على لوحة التدفئة homeothermic على منصة الجراحية (الشكل 1A). تأمين صحيح الماوسالموقف باستخدام المشبك خطم للحفاظ على منطقة الرقبة ممدود (الشكل 1A، B).
    2. إجراء شق (حوالي 1 سم) باستخدام مقص جراحي على طول ظهري منتصف الخط يمتد من T9 فقرات الصدري إلى T12. نقل جانبا الجلد لفضح منطقة العمليات الجراحية.
    3. باستخدام مشرط، امسح بعناية العضلات لفضح العمود الفقري الظهري في T9 - T12 فقرات. وقف النزيف في كل خطوة من خلال تطبيق ضغط لطيف مع مسحة القطن المعقمة. T10 منفصل - T12 فقرات من العضلات المحيطة بها وتأمينها باستخدام المشبك الفقري لتحقيق الاستقرار ومنع أي حركة (الشكل 1A، B).
    4. باستخدام الحفر بسرعة عالية مع عظم تلميع مثقاب، بعناية ورقيقة بلطف السطح الظهري للT10 T11 أو فقرة لتصور الوريد الفقري الخلفي وسفن أخرى صغيرة على السطح الظهري للSC (الشكل 1C).
    5. لمنع الضرر الحراري بسبب الحرارة المتولدة أثناء إجراء رقيق،تطبيق تيار لطيف ومستمر من المياه المالحة الطبيعية جنبا إلى جنب مع الشفط المستمر لازالة الانقاض.
    6. باستخدام مشرط سلس بعناية سطح العظم حتى السفينة الرئيسية هي واضحة للعيان. الحرص على عدم تلف الحبل الشوكي أثناء هذه العملية.
    7. بمجرد تصور الأوعية الدموية، وإدارة RB بجرعة 30 ملغ / كغ (وزن الجسم) من خلال الرجعية المدارية الجيوب الأنفية الطريق باستخدام حقنة الأنسولين.
    8. قياس تدفق الدم باستخدام مقياس الجريان الليزر دوبلر بعد 3 دقائق بعد الحقن RB إذا لزم الأمر (الشكل 2A، B). الحفاظ على عقامة خلال الإجراء بأكمله.

3. تحريض PT

  1. وضع الحيوان على مرحلة قابل للتعديل موقف XY أكثر من مختبر جاك والتي يمكن ضبط الارتفاع. ضبط الموقف من الماوس بحيث المنطقة المكشوفة من T11 الحبل الشوكي مباشرة تحت هدف 10X من المجهر FN1 برنامج التحصين الموسع ومضان (الشكل 3A).
  2. تعيين قوة لىمصدر GHT على 12٪ وأشرق المنطقة T11 التي يبلغ قطرها 0.75 مم في منتصف الحبل الشوكي ضعفت (ملاحظة: تشمل هذه المنطقة الوريد الفقري الخلفي والشعيرات الدموية الأخرى) مع الضوء الأخضر (الطول الموجي 540-580 نانومتر، وهو من جانب مكعب مرشح في المجهر) من خلال الهدف 10X لمدة 2 دقيقة تحقيقها. التقاط صور في بداية ونهاية التشعيع (الشكل 3B، C) وتسجيل الوقت من التجربة في هذه المرحلة.
  3. قياس تدفق الدم مرة أخرى لمدة 10 دقيقة إذا لزم الأمر عن طريق وضع مسبار دوبلر الليزر لنفس الموقف فوق الحبل الشوكي كما في 2.4.8 (الشكل 2A، B).
  4. بعد الاختيار التشعيع لأي نزيف، وإذا وجدت أي شروع في خياطة الحيوان. خياطة اللفافة السطحية جنبا إلى جنب مع العضلات على جانبي الحبل الشوكي باستخدام خياطة للامتصاص أو 4-0 حجم خياطة الحرير. الحرص على عدم الإضرار SC عرضة للخطر. خياطة الجلد مع 4-0 خياطة الحرير. تطبيق Betadine أو اليودإلى حواف الجلد بعد خياطة.

4. ما بعد الجراحة العناية

  1. بعد خياطة، ضع الحيوان على وسادة التدفئة لتحقيق الانتعاش. بعد الشفاء تحقق الحيوانات بحثا عن علامات على العجز العصبية من خلال مراقبة حركة كل من أطرافه الخلفية. لا تترك الحيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية.
  2. نقل الحيوانات إلى قفص المنزل. لا يعودون الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما.
  3. تحقق من الحيوانات على فترات منتظمة. في حالة العجز عصبية حادة، وتوفير الرعاية المناسبة مثل اخلاء المثانة، وإدارة المسكنات (البوبرينورفين، 0،05-،1 ملغ / كلغ). تحقق من الجفاف وإدارة طبيعي تحت الجلد المالحة في حالة شديدة. عادة، سوف تدار البوبرينورفين (0.1 ملغ / كلغ) بعد خياطة لتخفيف الألم في موقع الجراحة.
  4. إذا الحيوانات ليست على الفورالموت الرحيم بعد الجراحة، وسوف نضع كميات كبيرة من المياه النظام الغذائي المحتوي على أرضية القفص، وبالتالي فإن الحيوانات يمكن أن تصل إلى الطعام بسهولة.

5. Transcardial الإرواء، نيسل تلطيخ والمناعية

  1. يروي Transcardially الحيوان كما هو موضح سابقا 17-20.
    1. تخدير الحيوان كما هو موضح سابقا في البروتوكول ويروي transcardially مع الفوسفات عازلة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4)، تليها المثلج 4٪ لامتصاص العرق (PFA) في برنامج تلفزيوني.
    2. بعد التروية، وإزالة الحبل الشوكي (SC) وبعد إصلاحه في 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني في 4 درجات CO / N. نقل SC الثابتة في برنامج تلفزيوني مع 30٪ سكروز والاحتفاظ بها ل2-3 أيام حتى تغوص إلى قاع الأنبوب.
    3. باستخدام ناظم البرد قطع الحبل الشوكي إلى 30 ميكرون أبواب سميكة ووضعها بشكل متسلسل على الجيلاتين المغلفة الشرائح الزجاجية أو في لوحة 48-جيدا مع 0.01 M PBS.
  2. تلطيخ نيسل: لتفقد الضرر الناجم عن PT إجراء نيسل stainiنانوغرام في أقسام الحبل الشوكي كما هو موضح سابقا 17-20.
    1. لفترة وجيزة، جمع كل شريحة الخامسة الحبل الشوكي على الشرائح الزجاجية وصمة عار مع 0.25٪ الكريزيل البنفسجي. التقاط صور لأقسام الملون (الشكل 4).
  3. المناعية: كما هو موضح سابقا باستخدام العائمة القسم طريقة 17،18،20.
    1. لفترة وجيزة، وصمة عار على أقسام الحبل الشوكي التي يحتضنها O / N عند 4 درجات مئوية مع الأرنب مكافحة الدبقية ييفي الحمضية البروتين (GFAP) الأضداد بولكلونل (1: 300)، الأرنب مكافحة NeuN الأضداد (1: 300)، والأرنب المضادة الأجسام المضادة Iba1 (1: 500)، يليه حمار المضادة أرنب اليكسا 568 مترافق مفتش (1: 400) الأجسام المضادة الثانوية لمدة 4 ساعات في RT. التقاط صور مع مجهر فلوري (الشكل 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكان الهدف من هذه الدراسة لإنتاج نقص التروية الحبل الشوكي في الفئران باستخدام نموذج PT. بعد المنطقة المطلوب من العظم فوق الحبل الشوكي (T10 - T12) وضعفت، تم حقن روز البنغال خلال الرجعية المدارية الجيوب الأنفية الطريق، وكان المستحث نقص التروية قبل PT الشكل 1A، B تظهر الماوس المتمركزة في العمليات الجراحية حسب الطلب. منصة أثناء الجراحة. عقدت الماوس في المكان من قبل المشبك خطم واثنين من الفقاريات قابل للتعديل المشابك لتحقيق الاستقرار في الحبل الشوكي الشكل 1C تظهر نافذة ضعفت فوق الحبل الشوكي من T10 - T12. الأوعية الدموية الرئيسية وفروعها يمكن تصور بوضوح. لتأكيد تحريض نقص التروية، وقد تم قياس التغيرات في تدفق الدم باستخدام مقياس الجريان دوبلر الليزر قبل وبعد PT (الشكل 2A، B). للتحليل، تم احتساب انخفاض في المائة من تدفق الدم باستخدام تدفق الدم الأساسي قبل photothrombosis. انخفض تدفق الدم إلى ~ 20٪ فور الإضاءة الخفيفة بالمقارنة ثإيث المستوى القاعدي قبل الإضاءة. الشكل 3B، C معارض الصور الفلورسنت من العمود الفقري السفن دم الحبل السري في بداية ونهاية PT. الإضاءة لمدة 2 دقيقة يسببها تجلط الدم في الأوعية الدموية (الشكل 3C)، مما يشير إلى تحريض نقص التروية، بما يتفق مع قياسات مقياس الجريان دوبلر الليزر. لتفقد الخسائر الناتجة عن PT، تم التضحية الفئران 3 أيام بعد تم إجراء PT ونيسل تلطيخ. وأظهرت الصور التي التقطت بعد نيسل تلطيخ المنطقة احتشاء التي يمكن ترسيمها بوضوح من المنطقة المحيطة بها، مشيرا إلى تلف الأنسجة الحبل الشوكي وموت الخلايا بعد PT (الشكل 4). تم تنفيذ المناعية للNeuN، GFAP وIba1. فقدت NeuN + الخلايا العصبية في المادة الرمادية في قلب الدماغية (الشكل 5A)، في حين تم زيادة GFAP التعبير في حدود الأساسية الدماغية (الشكل 5B، انظر أيضا المنطقة محاصر). عرضت على الخلايا الدبقية الصغيرة Iba1 + لمور كروي الشكلphology (أي.، وهي خلايا الجسم الموسع مع عمليات أقصر وأقل، يرى المنطقة محاصر) جنبا إلى جنب مع زيادة التعبير Iba1 (الشكل 5C). بالرغم من وجود فقدان الأنسجة في المنطقة الأساسية الدماغية بسبب العائمة قسم تلطيخ، وزيادة في GFAP وIba1 التعبير في المنطقة المحيطة احتشاء كامل ويمكن ملاحظة بشكل واضح. هذه النتائج تشير إلى موت الخلايا العصبية ودباق رد الفعل في غبش بعد SC نقص التروية. من ناحية أخرى، لوحظ عجز وظيفي كبيرة في الفئران المصابين، أي تعطيل حركة هند أطرافهم بعد يوم واحد PT، مشيرا إلى شلل هند-أطرافه (انظر الفيلم).

الشكل 1
الشكل 1. الناجم عن نقص التروية PT نموذج في الحبل الشوكي. (A) صور للمنصة لعملية جراحية في الحبل الشوكي PT. أقحم: توسيع المشابك الفقري.عقدت (B) والماوس عن طريق المشبك خطم واثنين حسب الطلب المشابك الفقري على المسرح. لاحظ أن العظام وضعفت في T10 - T12 المنطقة واستخدمت اثنين من المشابك المعدنية الفقري لتحقيق الاستقرار في الحبل الشوكي (C) والتكبير في صورة تظهر المنطقة مع العظام ضعيفة فوق الحبل الشوكي في T10-11 ل تحريض PT. لاحظ الأوعية الدموية الرئيسية وفروعها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2

الشكل 2. الحبل الشوكي قياس تدفق الدم. (A) الإعداد للالشوكي سطح الحبل قياس تدفق الدم باستخدام مقياس الجريان دوبلر الليزر وجهاز التجسيمي لوضع التحقيق. (B)وقد تم قياس الحبل الشوكي تدفق الدم قبل وبعد PT. في هذه التجربة، وكان المستحث PT بواسطة إلقاء الضوء مع مصدر الضوء لمدة 2 دقيقة مع انتاج الطاقة 12٪. وكان قطر سطح المشع 0.75 ملم وكان في منتصف الحبل الشوكي. وسجلت تدفق الدم لمدة تصل إلى 5 دقائق للحصول على إشارة استقرت قبل PT وتصل إلى 10 دقيقة بعد PT. تم تطبيع البيانات من كل فأر إلى القيمة قبل الإضاءة الخفيفة. الرسم البياني يبين متوسط ​​قيمة البيانات من 3 الفئران. السهم يشير إلى بداية PT. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)

الشكل 3. PT-يسببها نقص التروية الحبل الشوكي. (A) صورة لوضع الماوس على المجهر لتحريض PT في الحبل الشوكي. ويمكن تعديل موقف الماوس في ثلاثة الأبعاد باستخدام المرحلة XY مزلق ومختبر جاك. وتركز الضوء من الهدف 10X على سطح الحبل الشوكي. (BC) صور الفلورية في الأوعية الدموية في الحبل الشوكي قبل (B) وبعد (C) إضاءة بعد حقن ارتفعت البنغال. لاحظ تجلط الدم بعد 2 دقيقة من الإشعاع (C) (انظر السهام). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. نيسل تلطيخ من الحبل الشوكي. نيسل الصور تلطيخ سلسلة من العمود الفقري المقاطع العرضية الحبل منقاري-لالذيلية التي تشمل العادية (الأقسام1 و 6) وكان مركزه PT التي يسببها (الأقسام 2-5). تمت التضحية الفئران بعد 3 أيام PT. كل قسم الحبل الشوكي هو 30 ميكرون سميكة. الفترة الفاصلة بين قسمين 750 ميكرون. خط متقطع في 3 صورة الثالثة ويعرض المنطقة احتشاء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5

الرقم 5. المناعية من NeuN، GFAP وIba1. الصور الفلورسنت من NeuN (A)، GFAP (B) وIba1 (C) تلطيخ من العادية (لوحات العليا) وPT جرح (لوحات أقل) أقسام الحبل الشوكي. وقد ضحى الماوس بجروح بعد 3 أيام PT. الخطوط المتقطعة تفصل بين المناطق احتشاء من الأنسجة الطبيعية. تظهر المناطق محاصر صور عالية الدقة من GFAP وIba1 التعبير مع شريط حجم 50ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم 1
الفيلم . PT في الحبل الشوكي التي يسببها العجز السلوكية. ويظهر الفيلم حركة طبيعية والفأر المصاب PT في قفص. لاحظ سحب كل من أطرافه-الخلفيتين من الفأرة مع الحبل الشوكي معتادين، مشيرا إلى شلل هند-أطرافه (الشلل النصفي). وقد اتخذ الفيلم 24 ساعة بعد PT في الماوس المصاب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة، وصفنا نموذجا photothrombotic من SC نقص التروية. بسبب التقدم في مجال الهندسة الوراثية وكانت هناك زيادة في الفئران المعدلة وراثيا المتاحة تجاريا التي جعلت من الممكن لدراسة تأثير جينات معينة تشارك في الفيزيولوجيا المرضية الدماغية في SC. وكان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير نموذج الفأر استنساخه من نقص التروية الحبل الشوكي. نحن هنا تكييفها نموذج PT القشرية للحث على SCI في الفئران. تعرضت بعد جراحة الوريد والشعيرات الدموية الشوكي الخلفي على الجانب الظهري من الفئران على مستوى T11 الفقرات الصدرية. ثم RB، صبغة متفاعل المتاحة تجاريا، تم حقن من خلال الرجعية المدارية الجيوب الأنفية الطريق إلى تحقيق توزيع الأوعية الدموية المطلوب. ثم المشع الأوعية الدموية كشفها بواسطة الضوء الأخضر للحث على تشكيل خثرة في وقت لاحق على احتشاء. أظهرت نتائجنا من النسيجية والمناعية الأساليب التي يسببها PT جلطة في الحبل الشوكي وreactiلقد دباق في المنطقة المحيطة احتشاء. كما لوحظ العجز العصبية مثل الشلل هند أطرافهم. وتشير هذه البيانات إلى أن PT هو نموذج مناسب لدراسة الفيزيولوجيا المرضية وآليات موت الخلايا بعد اصابات النخاع الشوكي. في خطوة حاسمة في البروتوكول هو استخدام تدريبات عالية السرعة رقيقة على سطح فقرة لرؤية الأوعية الدموية على السطح الظهري للSC. هذه الخطوة يجب أن تتم بعناية عن تطبيق الضغط الزائد قد يتسبب في الحفر للدخول تجويف الشوكي ويؤدي إلى تلف SC. من ناحية أخرى، قد يؤدي ترقق متفاوتة في الإضاءة غير لائق ويمكن أن تنتج عوائق غير النظامية. لمعالجة هذه المسألة، فمن المستحسن التفتيش المتكرر لسطح العظم تحت المجهر بعد كل خطوة قصيرة من الحفر لتقييم سماكة العظام ومواصلة تقييم استخدام الحفر. يوصى باستخدام محلول ملحي لتبييض الحطام فضلا عن التصور أفضل من السطح المعرض. الحفاظ على سلبياتعقامة الهام؛ فمنها أثناء إجراء العمليات الجراحية كامل، والرعاية بعد الجراحة السليمة للحيوان يمكن أن يحسن البقاء على قيد الحياة الحيوانية وزيادة نسبة نجاح هذه التجارب.

لا يتطلب نموذجنا الحالي للPT شراء أي أدوات باهظة الثمن، لأن أي مختبر مجهز مجهر برنامج التحصين الموسع ومضان مع مصدر الضوء (مثل مصباح الزئبق، مصباح معدن هاليد، أو ليزر من 488 نانومتر طول الموجة) يمكن تنفيذ هذا الإجراء. بالإضافة إلى ذلك، توفر هذه التقنية السيطرة على حجم احتشاء عن طريق ضبط حجم الفتحة بالمقارنة مع النماذج SC نقص التروية أخرى مثل انسداد جنبا إلى جنب من الأبهر، تحت الترقوة اليسرى والشريان الثديي الداخلي 25 وتعديلها عبر الأبهر طريقة لقط 26 التي هي معقدة وهي الغازية للغاية. في نموذجنا تم اختيار تدريبات عالية السرعة رقيقة السطح الظهري للفقرة التصور كبديل لالثقب، وطريقة اختيار العديد من المختبرات للحث على SCI.الثقب ينطوي على قطع من الفقرات التي قد تسبب النزف المفرط بسبب transection الأوعية الدموية الفقري، وهذا قد يحجب مجال للتصوير. على الرغم من بعض البروتوكولات تنصح استخدام مسحات القطن لمسح خارج النزيف خلال الثقب فإنه قد يؤدي إلى الضغط مما قد يتسبب في إصابة إضافية إلى SC. وعلاوة على ذلك السطح المعرض من الحبل الشوكي يمكن أن تأتي في اتصال مباشر مع الدم ومكوناته وكذلك الحواف الحادة للعظام قطع التي يمكن أن تضيف التقلبات غير ضروري للتجربة. باستخدام نموذج PT الحالي، يمكن أن تتولد احتشاء مع اختلاف حجم وعمق عن طريق التلاعب بسيط من شدة مصدر الضوء، ومدة التعرض ومساحة السطح المعرض. على الرغم من أن الدراسة الحالية ولدت نقص التروية في المنطقة الوسطى من T11 في SC، هذا الأسلوب يمكن أن يولد أيضا عوائق في مواقع مختلفة على طول منقاري إلى الذيلية وكذلك الاتجاه الجانبي للحبل الشوكي، والتي MIGحزب التحرير الاستفادة فهم تأثير منطقة محددة من نقص التروية على الشلل النصفي. من ناحية أخرى، على الرغم من أن للإضاءة على سطح الحبل الشوكي، ويمكن للضوء تخترق لعمق معين في الأنسجة، ويمكن أيضا أن يتسبب في الإصابة في المادة الرمادية. كما يتم توزيع روز البنغال في نظام التداول بأكمله، إذا كانت الأنواع الحيوانية هي نفسها، والعمر والوزن مماثلة، فإننا نتوقع أن تتولد الآفة ثابتة كما هو الحال في نقص التروية القشرية الناجمة عن PT.

الميزة الرئيسية الأخرى التي يسببها نقص التروية PT هي وفيات منخفضة جدا من الحيوانات. تعني انخفاض معدلات الوفيات يمكن إجراء دراسات البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل والتي قد تكون مفيدة في كشف تأثير الزمني للالإصابة الدماغية على البقاء وظيفة الحركة الانتعاش. هذا النموذج يمكن أيضا أن تساعد في فهم آليات التصليح الخلوي والتي عادة ما تحدث في وقت متأخر من المرحلة المزمنة من الإصابة 14،19،27-29. هذا النموذج تنتج أيضا العجز وظيفة الحركة الكبيرة التي يمكن بالبريد المستخدمة لتقييم فعالية وكلاء اعصاب على الانتعاش وظيفية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النموذج أيضا يسمح دراسة التغيرات المرضية بعد اصابات النخاع الشوكي مثل التنكس محور عصبي والتجديد، والعصبية ونجمي الكالسيوم 2+ الإشارات والحمولة الزائدة في الفئران الحية باستخدام اثنين من الفوتون المجهري.

مثل كل نماذج SCI أخرى، PT ليس خاليا من العيوب. مساوئ هذه التقنية مشابهة لتلك التي ظهرت في PT القشرية. عدد قليل من العيوب تشمل عدم وجود غبش الدماغية واضح تشريحيا، والذي هو الهدف من العديد من الأدوية اعصاب، وعدم وجود ضخه. ومن المعروف جيدا أن يتميز ضخه نقص التروية التالية تغييرات مثل زيادة إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية، وتسلل من الخلايا الالتهابية وزيادة إنتاج السيتوكينات 30-32. عدم وجود ضخه في PT يعني أن التغييرات المرتبطة إصابة ضخه في SC يبقى من الصعب دراسة باستخدام هذا النموذج.ومع ذلك، فإن مزايا استخدام نقص التروية PT يسببها تفوق سلبياته ويوفر هذا الأسلوب الباحثون مع وسيلة سهلة لأداء ونموذج تكرار للغاية لتوليد SCI في الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة [منحة لا. R01NS069726] وجمعية القلب الأميركية في منح المعونة منحة [منحة لا. 13GRNT17020004] إلى SD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rose Bengal Sigma-Aldrich 330000 20 mg/ml in sterile saline
C57BL/6J Jackson lab 664 22 - 25 g
Ketamine  VEDCO NDC-50989-996-06 100 mg/ml
Xylazine  VEDCO NDC-50989-234-11 100 mg/ml
Betadine solution Purdue NDC-67618-150-01 10% povidone iodine topical solution
Normal saline Abott Laboratories 04930-04-10 For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying
Artificial tears ointment  Rugby NDC-0536-6550-91 83% white petrolatum
Ethanol Decon labs.Inc 2716 70% ethanol for disinfection
Metal halide lamp EXFO, Canada X-Cite 120 PC  Set power at 12%
Spring scissors  Fine Science Tool 15000-10 for minor dissection
Scissors (angled to side) Fine Science Tool 14063-011 No. 3 handle
Standard scalpel Fine Science Tool 10003-12 for removing muscle
Scalpel blade Feather 2976 No. 10
Forceps (curved) Fine Science Tool 11150-10 for holding tissue
Forceps (straight) Fine Science Tool 11151-10 for holding tissue
Needle holder  Fine Science Tool 12002-12 for suturing
Tissue adhesive glue 3M Vetbond 1469SB to adhere to edges of the cut skin
Monofilament polypropylene  USSC Sutures VP-521 Size = 4-0 (for fascia)
Perma-hand silk Ethicon 683G Size = 4-0 (for skin)
Micro drill Roboz Surgical Instrument Co. Inc. RS-6300 with bone polishing drill bit
Laser doppler flowmeter Moor Instruments moorVMS-LDF1 for monitoring change in blood flow
Heating pad Fine Science Tool 21052-00 to prevent hypothermia
Lab-Jack Fisher scientific  14-673-50 4 x 4 in plate to adjust the height of the animal
X-Y gliding stage  Amscope GT100 for positioning the animal under microscope  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
  2. Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
  3. Young, W. Secondary injury mechanisms in acute spinal cord injury. J Emerg Med. 11, Suppl 1. 13-22 (1993).
  4. Crowe, M. J., Bresnahan, J. C., Shuman, S. L., Masters, J. N., Beattie, M. S. Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys. Nat Med. 3 (1), 73-76 (1997).
  5. Soubeyrand, M., et al. Effect of norepinephrine on spinal cord blood flow and parenchymal hemorrhage size in acute-phase experimental spinal cord injury. Eur Spine J. 23 (3), 658-665 (2014).
  6. Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (2012).
  7. Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis). Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
  8. Liu, X. Z., et al. Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cord injury. J Neurosci. 17 (14), 5395-5406 (1997).
  9. Liu, L., et al. An experimental study of cell apoptosis and correlative gene expression after tractive spinal cord injury in rats. Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 42 (23), 1434-1437 (2004).
  10. Hirose, K., et al. Activated protein C reduces the ischemia/reperfusion-induced spinal cord injury in rats by inhibiting neutrophil activation. Ann Surg. 232 (2), 272-280 (2000).
  11. Oyinbo, C. A. Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury: a nugget of this multiply cascade. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (2), 281-299 (2011).
  12. Guerit, J. M., Dion, R. A. State-of-the-art of neuromonitoring for prevention of immediate and delayed paraplegia in thoracic and thoracoabdominal aorta surgery). Ann Thorac Surg. 74 (5), S1867-S1869 (2002).
  13. Schepens, M. A., Heijmen, R. H., Ranschaert, W., Sonker, U., Morshuis, W. J. Thoracoabdominal aortic aneurysm repair: results of conventional open surgery. Eur J Vasc Endovasc Surg. 37 (6), 640-645 (2009).
  14. Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Exp Transl Stroke Med. 1, 8 (2009).
  15. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
  16. Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Busto, R., Watson, B. D. Photochemically induced cortical infarction in the rat. 1. Time course of hemodynamic consequences. J Cereb Blood Flow Metab. 6 (2), 184-194 (1986).
  17. Zhang, W., et al. Neuronal protective role of PBEF in a mouse model of cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (12), 1962-1971 (2010).
  18. Li, H., Zhang, N., Sun, G., Ding, S. Inhibition of the group I mGluRs reduces acute brain damage and improves long-term histological outcomes after photothrombosis-induced ischaemia. ASN Neuro. 5 (3), 195-207 (2013).
  19. Li, H., et al. Histological, cellular and behavioral assessments of stroke outcomes after photothrombosis-induced ischemia in adult mice. BMC Neurosci. 15, 58 (2014).
  20. Wang, T., Cui, W., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis. American Journal of Biomedical Sciences. 2 (1), 33-42 (2010).
  21. Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Non-invasive induction of focal cerebral ischemia in mice by photothrombosis of cortical microvessels: characterization of inflammatory responses. J Neurosci Methods. 117 (1), 43-49 (2002).
  22. Boquillon, M., Boquillon, J. P., Bralet, J. Photochemically induced, graded cerebral infarction in the mouse by laser irradiation evolution of brain edema. J Pharmacol Toxicol Methods. 27 (1), 1-6 (1992).
  23. Kim, G. W., Lewen, A., Copin, J., Watson, B. D., Chan, P. H. The cytosolic antioxidant, copper/zinc superoxide dismutase, attenuates blood-brain barrier disruption and oxidative cellular injury after photothrombotic cortical ischemia in mice. Neuroscience. 105 (4), 1007-1018 (2001).
  24. Schmidt, A., et al. Photochemically induced ischemic stroke in rats. Exp Transl Stroke Med. 4 (1), 13 (2012).
  25. Lang-Lazdunski, L., et al. Spinal cord ischemia. Development of a model in the mouse. Stroke. 31 (1), 208-213 (2000).
  26. Wang, Z., et al. Development of a simplified spinal cord ischemia model in mice. J Neurosci Methods. 189 (2), 246-251 (2010).
  27. Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. J Vis Exp. (76), (2013).
  28. Lu, H., et al. Induction and imaging of photothrombotic stroke in conscious and freely moving rats. J Biomed Opt. 19 (9), 96013 (2014).
  29. Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Front Neuroenergetics. 6 (1), (2014).
  30. Bell, M. T., et al. Toll-like receptor 4-dependent microglial activation mediates spinal cord ischemia-reperfusion injury. Circulation. 128 (11 Suppl 1), S152-S156 (2013).
  31. Smith, P. D., et al. The evolution of chemokine release supports a bimodal mechanism of spinal cord ischemia and reperfusion injury. Circulation. 126 (11 Suppl 1), S110-S117 (2012).
  32. Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50 (4), 264-274 (2012).

Tags

الطب، العدد 101، إصابات الحبل الشوكي، photothrombosis، روز البنغال، نقص التروية، برنامج التحصين الموسع فلوري المجهر، دباق رد الفعل، احتشاء، الشلل النصفي
Photothrombosis الناجم عن نقص التروية التنسيق نموذجا من اصابات الحبل الشوكي في الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, H., Roy Choudhury, G., Zhang,… More

Li, H., Roy Choudhury, G., Zhang, N., Ding, S. Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice. J. Vis. Exp. (101), e53161, doi:10.3791/53161 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter