Introduction
Traumática lesão medular (LM) é uma condição clínica devastador que afeta as funções sensório-motoras e autonômicas do SC. Pacientes sobreviventes SCI muitas vezes são deixados com paraplegia debilitante que afeta significativamente suas atividades diárias e qualidade de vida 1. Modelos Experimental SCI têm sido uma ferramenta indispensável na investigação científica para compreender a fisiopatologia da SCI e processos de reparação neural associados. Estes modelos também foram utilizados para testar a eficácia pré-clínica de diversas intervenções neuroprotectores experimentais que são destinadas a recuperação funcional. Atualmente, a maioria dos modelos SCI, na prática, empregar o uso da força física sem corte para perturbar e prejudicar o SC mecanicamente. Estes métodos incluem contusão, compressão, deslocamento e transecção do SC 2. Tem sido sugerido que após o insulto mecânica primária uma lesão secundária sob a forma de conjuntos de isquemia no lesada no SC 3,4. A etiologia da isquemia secundária inclui extensa degeneração do tecido, hemorragia parenquimatosa e às vezes por obstrução de vasos sanguíneos por edema do tecido 5-7. Como resultado da lesão secundária a integridade de SC é mais afectada, neurónios e células gliais são severamente prejudicada em função e viabilidade e sofrem apoptose que leva a um crescimento de infarto durante a fase crónica da lesão, análogo ao crescimento de penumbra de isquemia pós-AVC 8,9. Vários mecanismos como excitotoxicidade, produção de radicais livres, e inflamação foram relatados para ser responsável pela morte celular isquémica após uma lesão medular 10,11. Além disso, SC isquemia é uma complicação grave de cirurgias tóraco-abdominal do aneurisma da aorta, que muitas vezes levam a paraplegia nos pacientes 12,13. Apesar de tão alto impacto clínico muito poucos modelos de isquemia medular com alta reprodutibilidade estão disponíveis no momento.
nt "> Indocianina (PT) é um método vulgarmente utilizado para a indução de isquemia focal no cérebro 14-20. A técnica é relativamente não invasivo e altamente reprodutível e produz uma lesão isquémica focal exacta da área exposta do cérebro 17 -21. Isto é conseguido por administração sistémica de corantes fotoactivos como Rose Bengal (RB) ou 16-20,22 eritrosina B 23 seguido por irradiação localizada de vasos sanguíneos com fonte de luz adequada. A fotoactivação do corante faz com que a geração de radicais livres que interromper a integridade do endotélio vascular liso, e fazer com que as plaquetas se acumulam, que subsequentemente forma um trombo. A obstrução do fluxo de sangue pelos resultados do trombo em um enfarte na região fornecido pelo vaso 24. Devido à facilidade de controlo sobre o intensidade e da duração da irradiação este procedimento produz um enfarte altamente uniforme e reprodutível. Além disso, este método pode ser empregue para induzir um enfartet em várias posições anatómicas permitindo espacial (por exemplo, substância cinzenta vs matéria branca) compreensão do efeito da isquemia.O objetivo do presente estudo é desenvolver um modelo fácil e altamente reprodutível de SC isquemia em ratinhos. Nós descrevemos o procedimento de um modelo PT de SC isquemia em ratinhos. Os resultados de histologia e imunocoloração demonstrou que a PT pode efectivamente induzir enfarte do SC, perda neuronal e gliose reactiva.
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Protocol
Nota: Os ratinhos (C57BL / 6J, macho) envelhecido 10 - 12 semanas, foram utilizados neste estudo. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pela Universidade de Missouri Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).
1. Pré-Surgery
- No dia antes da cirurgia autoclave e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos. Enrole os instrumentos e autoclave a 121 ° C a 15 psi durante 30 min seguido por 30 min de secagem (121 ° C, 15 psi, 30/30 ciclo). Coloque os instrumentos em um ambiente limpo e esterilizado até à sua utilização.
- Solução fresca Rosa Bengala (RB) (20 mg / ml em solução salina estéril) toda vez que antes da cirurgia se preparar. Para dissolver completamente RB, o tubo de vórtice, em seguida, seguido por sonicação durante 5 min a 50/60 Hz, com potência de 19 W. Envoltório do tubo em folha de alumínio e proteger da luz de saída até novo utilizado durante surGery.
- Prepara-se uma mistura de cetamina / xilazina em solução salina estéril. Adicionar 125 ul de xilazina (concentração estoque: 20 mg / ml) e 325 ul de ketmaine (concentração estoque: 100 mg / ml) e 550 ul de solução salina estéril para perfazer um volume final de 1 mL de mistura de anestésicos.
- Pré-aquecer a almofada de aquecimento homeotérmicos.
- Pré-aquecer a lâmpada de iodetos metálicos (fonte de luz para FN1 epi-microscópio de fluorescência) durante 30 minutos para estabilizar a potência da lâmpada.
- Ajustar o tamanho da região iluminada a um diâmetro de 1 mm, utilizando uma objectiva 10X e retículo ajustando o diafragma de campo na vertical FN1 epi-microscópio de fluorescência.
2. Procedimento Cirúrgico
- Anestesiar o rato com uma dose de cetamina (130 mg / kg B. peso.) E xilazina (10 mg / kg B. peso.). Com base no cocktail em 1,3, 4 ul por g de rato B. peso. são precisos. Esterilizar o local da injecção com um algodão com álcool e administrar os anestésicos através do intra-peritoneal rota (IP). Tome cuidado para não injetar os anestésicos para os vasos sanguíneos do músculo ou como isso iria atrasar a indução e recuperação do animal.
- Aplicar pomada lágrima artificial para ambos os olhos do rato para evitar a secagem e colocar o animal no almofada de aquecimento para evitar a hipotermia.
- Preparação de animais
- Verifique o animal para a anestesia adequada nível cirúrgico usando a resposta toe pitada.
- Uma vez que o animal atingiu o nível cirúrgico de anestesia, cortar o cabelo na superfície dorsal em torno da linha média do animal usando um aparador de cabelo elétrico. Esfregar o local cirúrgico com etanol a 70% seguido por solução de betadine três vezes. Cubra o local com um campo cirúrgico estéril até o próximo passo.
- Procedimento cirúrgico para afinar o osso para expor a medula espinhal
- Colocar o rato em uma posição de bruços através da almofada de aquecimento homeotérmica na plataforma cirúrgica (Figura 1A). Corretamente proteger o ratopostura usando uma braçadeira de focinho para manter uma região de pescoço alongado (Figura 1A, B).
- Faça uma incisão (cerca de 1 cm de comprimento) usando tesouras cirúrgicas ao longo de meados da linha dorsal que se estende desde o T9 vértebras torácicas para T12. Afastar a pele para expor a área cirúrgica.
- Usando um bisturi, cuidadosamente limpar o músculo para expor as espinhas dorsais na T9 - T12 vértebras. Parar o sangramento em cada etapa aplicando uma pressão suave com cotonete estéril. T10 separado - T12 vértebras do músculo circunvizinho e fixá-los usando uma braçadeira vertebral para estabilizar e impedir qualquer movimento (Figura 1A, B).
- Usando uma broca de alta velocidade com osso polimento broca, com cuidado e fina suavemente a superfície dorsal da vértebra T10 ou T11 para visualizar a veia vertebral posterior e outras embarcações pequenas na superfície dorsal do SC (Figura 1C).
- Para evitar danos térmicos, devido ao calor gerado durante o processo de desbaste,aplicar uma corrente suave e constante de solução salina normal juntamente com sucção constante para remover os detritos.
- Usando um bisturi cuidadosamente alisar a superfície do osso até que o recipiente principal é claramente visível. Tome cuidado para não danificar a medula espinhal durante este processo.
- Uma vez que o vaso sanguíneo é visualizado, RB administrar a uma dose de 30 mg / kg (peso corporal) por via do seio retro-orbital usando uma seringa de insulina.
- Medir o fluxo sanguíneo através de um medidor de fluxo laser de Doppler após 3 min após a injecção, se necessário, RB (Figura 2A, B). Manter a assepsia durante o procedimento inteiro.
3. Indução de PT
- Colocar o animal numa fase ajustável posição XY ao longo de um Lab-Jack que pode ajustar a altura. Ajuste a posição do mouse para que a região exposta do T11 medula espinhal está diretamente sob a objetiva de 10x do microscópio FN1 epi-fluorescência (Figura 3A).
- Defina o poder do lifonte GHT a 12% e irradiar a região T11 com um diâmetro de 0,75 milímetros no meio da medula espinal diluído (Nota: esta região inclui a veia vertebral posterior e outros capilares) com uma luz verde (comprimento de onda de 540-580 nm, que é conseguido pelo cubo de filtro no microscópio) através da objectiva 10X durante 2 min. Captar imagens no início e no fim de irradiação (Figura 3B, C) e registar o tempo da experiência neste ponto.
- Medir o fluxo de sangue de novo durante 10 minutos, se necessário, através da colocação da sonda Doppler de laser para a mesma posição acima da medula espinhal como em 2.4.8 (Figura 2A, B).
- Após o check-irradiação para qualquer hemorragia e se nenhum encontrado proceder à sutura do animal. Sutura da fáscia superficial juntamente com os músculos de cada lado da medula espinhal do usando uma sutura absorvível ou tamanho 4-0 sutura de seda. Tome cuidado para não danificar o SC exposta. Sutura da pele com fio de seda 4-0. Aplicar Betadine ou iodopara as bordas da pele após a sutura.
4. Pós-cirurgia Cuidados
- Após a sutura, coloque o animal na almofada de aquecimento para a recuperação. Após a recuperação dos animais para verificar sinais de déficits neurológicos, observando o movimento de ambas as traseiras-membros. Não deixe o animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
- Transferir os animais para a gaiola. Não devolva o animal que foi submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
- Confira os animais em intervalos regulares. Em caso de déficits neurológicos graves, fornecer o cuidado adequado, como evacuação de bexiga, administração de analgésicos (buprenorfina, 0,05-0,1 mg / kg). Verifique se há desidratação e administrar por via subcutânea soro fisiológico normal em caso grave. Normalmente, a buprenorfina (0,1 mg / kg), será administrada após a sutura para aliviar a dor no local da cirurgia.
- Se os animais não são imediatamentesacrificados após a cirurgia, vamos colocar alto teor de água dieta no chão da gaiola, para que os animais possam alcançar o alimento facilmente.
5. transcardial Perfusão, coloração Nissl e Immunostaining
- Transcardialmente perfundir o animal, como descrito anteriormente 17-20.
- Anestesiar o animal, tal como descrito anteriormente no protocolo e perfundir transcardíaca com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4), seguido de gelado paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS.
- Após a perfusão, remover a medula espinhal (SC) e pós fixar-lo em PFA 4% em PBS a 4 ° CO / N. Transferir o SC fixo em PBS com 30% de sacarose e mantê-lo por 2 - 3 dias até que se deposita no fundo do tubo.
- Usando um criostato corte da espinal medula em 30 mm de espessura e colocá-los em série em um revestido com gelatina em lâminas de vidro ou uma placa de 48 poços com 0,01 M de PBS.
- Coloração de Nissl: Para inspecionar o prejuízo causado pela PT realizar uma Nissl staining em secções da espinal medula como descrito previamente 17-20.
- Resumidamente, recolher cada quinta fatia da medula espinhal nas lâminas de vidro e mancha com 0,25% de cresilo violeta. Tome imagens dos cortes corados (Figura 4).
- A imunocoloração: Tal como anteriormente descrito utilizando um método secção 17,18,20 flutuante.
- Resumidamente, corar as secções da espinal medula por incubação O / N a 4 ° C com anticorpo de coelho anti-glia proteína fibrilar ácida (GFAP) anticorpo policlonal (1: 300), anticorpo de coelho anti-NeuN (1: 300), e anti-coelho anticorpo Iba1 (1: 500) seguido de anti-coelho de burro conjugado com Alexa 568-IgG (1: 400) de anticorpos secundários durante 4 h à TA. Captar imagens com um microscópio de fluorescência (Figura 5).
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Representative Results
O objetivo deste estudo foi o de produzir isquemia medular em ratos usando um modelo PT. Após a região desejada do osso por cima da medula espinhal (T10 - T12) foi diluído, Rosa de Bengala foi injectado por via sinus retro-orbital, e a isquemia foi induzida pela PT A Figura 1A e B mostram o rato posicionado numa cirúrgico feito por encomenda. plataforma durante a cirurgia. O rato foi mantido no lugar por um grampo focinho e dois grampos vertebrado ajustável para estabilizar a coluna vertebral A Figura 1C mostra uma janela diluído acima da medula espinhal de T10 -. T12. O principal vaso sanguíneo e seus ramos podem ser claramente visualizados. Para confirmar a indução da isquemia, alterações no fluxo sanguíneo foi medido utilizando um medidor de fluxo laser de Doppler antes e após PT (Figura 2A, B). Para análise, a redução em% do fluxo de sangue foi calculada usando o fluxo sanguíneo da linha de base antes fototrombose. O fluxo de sangue caiu para ~ 20% imediatamente após a iluminação de luz em comparação wom o nível basal antes da iluminação. A Figura 3B, C mostra imagens de fluorescência de vasos sanguíneos da medula espinal, no início e no final da PT. Iluminação durante 2 min induzida coágulo de sangue em vasos sanguíneos (Figura 3C), o que sugere a indução de isquemia, consistente com as medições do medidor de fluxo de laser Doppler. Para inspecionar o prejuízo causado pela PT, os ratos foram sacrificados 3 dias após o PT e coloração Nissl foi realizada. Imagens tiradas após coloração Nissl mostrou região do infarto que pode ser claramente demarcados da região circundante, indicando danos no tecido da medula espinhal e morte celular após PT (Figura 4). A imunocoloração foi realizada para NeuN, GFAP e Iba1. NeuN + neurônios foram perdidos na massa cinzenta no núcleo isquêmico (Figura 5A), enquanto expressão GFAP foi aumentada na fronteira do núcleo isquêmico (Figura 5B, veja também a região caixa). Os microglia Iba1 + exibiram mor globoidephology (ie., um corpo celular ampliada com processos mais curtos e menos, ver a região encaixotado), juntamente com o aumento da expressão Iba1 (Figura 5C). Embora tenha havido uma perda de tecido na região do núcleo isquémico devido a coloração secção flutuante, um aumento na expressão de GFAP e Iba1 em toda a região peri-enfarte pode ser claramente observada. Estes resultados indicam a morte neuronal e gliose reactiva na penumbra SC após isquemia. Por outro lado, os déficits funcionais significativas foram observadas nos ratos lesionados, ou seja, deficientes movimento hind-membro um dia após o PT, indicando paralisia dos membros pélvicos (veja o vídeo).
Figura 1. modelo induzido por isquemia PT em medula espinal. (A) Fotografias da plataforma de cirurgia para a coluna vertebral PT. Detalhe: ampliada grampos vertebrais.(B) O rato foi realizada por um grampo focinho e por dois grampos vertebrais feitos sob medida no palco. Observe que o osso foi diluído em T10 -. Região T12 e duas braçadeiras de metal vertebrais foram usadas para estabilizar a medula espinhal (C) Um zoom-in imagem que mostra a região com o osso-desbaste acima da medula espinhal em T10-11 para o indução da PT. Observe os principais vasos sanguíneos e seus ramos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. medular medição do fluxo sanguíneo. (A) A configuração da medição do fluxo sanguíneo vertebral superfície cabo usando um fluxómetro laser Doppler e dispositivo estereotáxico para posicionar a sonda. (B)O fluxo de sangue da medula espinhal antes e depois de PT foi medido. Nesta experiência, a PT foi induzida pela iluminação com uma fonte de luz durante 2 min com uma potência de 12%. O diâmetro da superfície irradiada foi de 0,75 mm e estava no meio da medula espinal. O fluxo de sangue foi registada durante até 5 minutos para se obter sinal estabilizado antes PT e até 10 minutos após a PT. Os dados de cada rato foi normalizado para o valor anterior à luz de iluminação. O gráfico mostra o valor médio dos dados de três ratinhos. A seta indica o início da PT. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. PT-induzida isquemia medular. (A) A fotografia de umrato colocado no microscópio para a indução da PT na medula espinhal. A posição do mouse pode ser ajustada em três dimensões usando a fase delta XY e um Lab-Jack. A luz da objectiva 10X foi focada na superfície de medula espinhal. (BC) As imagens fluorescentes dos vasos sanguíneos na medula espinal antes (B) e depois (C) iluminação após a injecção de rosa de Bengala. Observe o coágulo sanguíneo após 2 min de irradiação (C) (ver setas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Nissl de medula espinhal. Nissl imagens de coloração de uma série de secções transversais cordão espinal-rostral-caudal a que incluem normais (secções1 e 6) e epicentro induzida por PT (seções 2-5). Os ratinhos foram sacrificados três dias após a PT. Cada secção da medula espinhal é de 30 mm de espessura. O intervalo entre as duas secções é 750 um. A linha pontilhada 3 rd imagem em delineia a região de infarto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Immunostaining de NeuN, GFAP e Iba1. As imagens fluorescentes de NeuN (A), GFAP (B) e Iba1 (C) coloração de normais (painéis superiores) e PT-ferido (painéis inferiores) secções da espinal medula. O rato ferido foi sacrificado 3 dias após PT. As linhas a tracejado separam as regiões de enfarte a partir de tecidos normais. As regiões enquadradas mostrar imagens de alta resolução de GFAP e expressão Iba1 com uma barra de escala de 50um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme . PT na medula espinal induzida défices comportamentais. O filme mostra o movimento de um normal e um rato com lesão PT em uma gaiola. Observe o arrastamento de ambas as traseiras-membros do rato com medula espinhal inured, indicando paralisia dos membros traseiros-(paraplegia). O filme foi tomada 24 horas após a PT no rato lesionado.
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Discussion
Neste estudo, descrevemos um modelo photothrombotic de SC isquemia. Devido aos avanços na engenharia genética, tem havido uma onda de camundongos transgênicos comercialmente disponível que tornou possível estudar o impacto de genes específicos envolvidos na fisiopatologia isquêmico no SC. O objectivo do estudo foi o de desenvolver um modelo reprodutível rato de isquemia medular. Aqui nós adaptamos um modelo cortical PT para induzir SCI em camundongos. No seguimento da cirurgia da coluna vertebral e a veia capilares posterior no dorso de ratinhos no nível de T11 vértebra torácica foram expostos. Em seguida, RB, um corante fotoactivo disponível comercialmente, foi injectado por via do seio retro-orbital para atingir distribuição vascular desejado. O vaso sanguíneo exposto foi então irradiada com uma luz verde para induzir a formação de trombos e, mais tarde, um enfarte. Nossos resultados de métodos histológicos e imunocoloração mostrou que a PT induzido um infarto da medula espinhal e Reactive gliosis na região peri-infarto. Também foram observados déficits neurológicos, como paralisia dos membros posteriores. Estes dados sugerem que a PT é um modelo adequado para estudar a fisiopatologia e mecanismos de morte celular após SCI. O passo crítico no protocolo é a utilização de uma broca de alta velocidade para diluir a superfície de vértebra para a visualização dos vasos sanguíneos na superfície dorsal do SC. Este passo deve ser realizado cuidadosamente para a aplicação de um excesso de pressão pode fazer com que a broca a entrar cavidade espinal e danificar o SC. Por outro lado, adelgaçamento desigual pode resultar numa iluminação inadequada e podem produzir infartos irregulares. Para resolver este problema, a inspecção frequente da superfície do osso ao microscópio após cada etapa curta de perfuração é recomendada para avaliar a espessura do osso e a avaliar ainda mais a utilização da broca. Recomenda-se o uso de uma solução salina estéril à lavagem dos detritos, bem como para a melhor visualização da superfície exposta. Manter contrasassepsia tant durante todo o procedimento cirúrgico, atendimento pós-cirúrgico adequado do animal pode melhorar a capacidade de sobrevivência dos animais e aumentar a taxa de sucesso dos experimentos.
O nosso modelo atual de PT não requer a compra de quaisquer instrumentos caros, como qualquer laboratório que está equipado com um microscópio epi-fluorescência com uma fonte de luz (como lâmpada de mercúrio, lâmpadas de iodetos metálicos, ou laser de 488 nm de comprimento de onda) pode executar este procedimento. Além disso, esta técnica fornece controlo sobre o tamanho do enfarte, ajustando o tamanho da abertura, em comparação com outros modelos de isquemia SC, como combinado de oclusão da aorta, subclávia esquerda e artéria mamaria interna 25 e método modificado de aperto da crossa da aorta 26 que são complicados e são extremamente invasivo. No nosso modelo, uma broca de alta velocidade para diluir a superfície dorsal da vértebra para visualização foi escolhida como uma alternativa a laminectomia, o método de escolha por muitos laboratórios para induzir a SCI.Laminectomia envolve corte das vértebras que pode causar hemorragia excessiva devido a um corte transversal dos vasos sanguíneos vertebrais e este pode obscurecer o campo para imagiologia. Mesmo que alguns protocolos de aconselhar o uso de cotonetes para limpar o sangramento excessivo durante a laminectomia pode resultar em compressão que pode causar lesões adicionais ao SC. Além disso, a superfície exposta da medula espinal podem entrar em contacto directo com o sangue e seus componentes, bem como as arestas de corte de ossos que pode adicionar variabilidade desnecessária para o experimento. Usando o modelo PT actual, enfarte com diferente tamanho e profundidade pode ser gerado através de uma simples manipulação da intensidade da fonte luminosa, a duração da exposição e a área da superfície exposta. Embora o estudo corrente gerada isquemia na região central de T11 na SC, este método também pode gerar infartos em diferentes locais ao longo rostral-caudal para assim como direcção transversal da medula espinal, que might beneficiar a compreensão do efeito específico da região de isquemia em paraplegia. Por outro lado, embora a iluminação é na superfície da medula espinal, a luz pode penetrar a certa profundidade no tecido e a lesão também pode ser induzida na matéria cinzenta. Como Rosa Bengala é distribuído em todo o sistema de circulação, se as espécies animais são os mesmos, e a idade e peso são semelhantes, espera-se consistente lesão vai ser gerado como em isquemia cortical induzido pela PT.
A outra grande vantagem de isquemia induzida pelo PT é muito baixa mortalidade dos animais. Baixa mortalidade significa estudos de sobrevivência a longo prazo pode ser transportada os quais podem ser úteis para desvendar o efeito temporal da lesão isquêmica na sobrevivência e função motora recuperação. Este modelo também pode auxiliar na compreensão dos mecanismos de reparação celular que ocorrem geralmente no final da fase crônica da lesão 14,19,27-29. Este modelo também produz déficits consideráveis função motora que pode be utilizado para avaliar a eficácia de agentes neuroprotectores na recuperação funcional. Além disso, este modelo também permitirá o estudo de alterações patológicas após SCI como a degeneração axonal e regeneração, neuronal e astrocytic sinalização de Ca2 + e sobrecarga em camundongos vivos por meio de microscopia de dois fótons.
Como todos os outros modelos de SCI, a PT não é desprovida de inconvenientes. As desvantagens desta técnica são similares aos observados na PT cortical. Algumas das deficiências incluem a falta de uma penumbra isquémica anatomicamente claro, que é o alvo de muitas drogas neuroprotectoras, e a ausência de reperfusão. É bem sabido que a reperfusão após isquemia é caracterizada por alterações como o aumento da produção de espécies reactivas de oxigénio, a infiltração de células inflamatórias e aumento da produção de citocinas 30-32. Falta de reperfusão em PT significa que as mudanças associadas com a lesão de reperfusão em SC continuará a ser difícil para estudar usando este modelo.No entanto, as vantagens da utilização de isquemia PT induzidas superam as desvantagens e esta técnica fornece os investigadores com um fácil de executar e modelo altamente reprodutível de geração de SCI em ratinhos.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health [Grant não. R01NS069726] e da Associação Americana do Coração, em Grant Grant Aid [Grant não. 13GRNT17020004] para SD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000 | 20 mg/ml in sterile saline |
| C57BL/6J | Jackson lab | 664 | 22 - 25 g |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/ml |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 100 mg/ml |
| Betadine solution | Purdue | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline | Abott Laboratories | 04930-04-10 | For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Ethanol | Decon labs.Inc | 2716 | 70% ethanol for disinfection |
| Metal halide lamp | EXFO, Canada | X-Cite 120 PC | Set power at 12% |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Standard scalpel | Fine Science Tool | 10003-12 | for removing muscle |
| Scalpel blade | Feather | 2976 | No. 10 |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Tissue adhesive glue | 3M Vetbond | 1469SB | to adhere to edges of the cut skin |
| Monofilament polypropylene | USSC Sutures | VP-521 | Size = 4-0 (for fascia) |
| Perma-hand silk | Ethicon | 683G | Size = 4-0 (for skin) |
| Micro drill | Roboz Surgical Instrument Co. Inc. | RS-6300 | with bone polishing drill bit |
| Laser doppler flowmeter | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | for monitoring change in blood flow |
| Heating pad | Fine Science Tool | 21052-00 | to prevent hypothermia |
| Lab-Jack | Fisher scientific | 14-673-50 | 4 x 4 in plate to adjust the height of the animal |
| X-Y gliding stage | Amscope | GT100 | for positioning the animal under microscope |
References
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