Introduction
외상성 척수 손상 (SCI)는 SC의 감각 및 자율 신경계 기능에 영향을 미치는 치명적인 임상 조건이다. SCI 생존 환자는 종종 크게 일상 생활과 삶 (1)의 품질에 영향을 마비 쇠약으로 남아 있습니다. 실험 SCI 모델은 SCI의 병태 생리 및 관련 신경 복구 프로세스를 이해하는 과학적인 조사에 필수적인 도구왔다. 이러한 모델은 기능 회복 겨냥한 다양한 실험 신경 중재 전임상 효능을 테스트하기 위해 사용되어왔다. 현재, 실제로 SCI 모델의 대부분은 기계적으로 혼란과 SC를 손상하는 물리적 둔기의 사용을 사용합니다. 이러한 방법은 SC 2의 타박상, 압축, 전위와 절개를 포함한다. 이 제안되었음을 차 기계적 모독 부상 SC에서의 허혈 세트의 형태로 보조 손상 후 3,4. 차 허혈의 원인은 조직의 부종 5-7으로 혈관의 폐색에 의해 때때로 광범위한 조직 변성, 실질 출혈 등이 포함됩니다. SC의 무결성이 더욱 영향 이차 손상의 결과로서, 뉴런 및 신경 교세포 심각 기능과 생존에 손상되고, 허혈성 주변부 다음 스트로크 성장 유사한 손상의 만성 단계에서 성장 경색에 이르게 아폽토시스를 거칠 8,9. 흥분 독성, 자유 라디칼을 생산하고, 염증과 같은 몇몇 메커니즘 SCI 10,11 다음 허혈성 세포사에 대한 책임이있는 것으로보고되었다. 또한, SC 허혈은 종종 환자 12, 13에서 하반신 마비로 이어질 흉 복부 대 동맥류 수리 수술의 심각한 합병증이다. 높은 임상 적 영향에도 불구하고 높은 재현성과 척수 허혈의 거의 모델은 현재 사용할 수 있습니다.
NT는 "> Photothrombosis (PT)이 기술은 높은 재현성 상당히 비 침습적이다. 뇌 14-20에서 국소 허혈의 유도를위한 일반적으로 사용되는 방법이며, 뇌 (17)의 노출 된 영역에서 정확한 초점 허혈성 병소를 생산 -21.이 장미 벵골 (RB) 16-20,22 또는 에리트로 B 등의 광활성 염료의 전신 투여에 의해 달성된다는 적절한 광원과 혈관의 지역화 조사 하였다 (23). 염료의 Photoactivation이 활성 산소의 생성을 일으키는 매끄러운 혈관 내피 세포의 무결성을 파괴하고, 혈소판이어서 용기 (24)에 의해 공급 부위에서 경색에 혈전 결과로. 혈류 폐색 혈전을 형성하는, 축적시킬. 인해가 온 제어 완화 강도와 조사 기간이 절차는 매우 균일하고 재현성 경색을 산출한다. 또한,이 방법은 infarc을 유도하기 위해 사용될 수있다허혈 효과의 공간 (예를 들면, 대 백질 회백질) 이해할 수 있도록 다양한 해부학 적 위치에서 t.현재의 연구는 마우스에 SC 허혈 쉽고 높은 재현성 모델을 개발하는 것이다. 우리는 마우스에서 SC 허혈의 모델 PT의 절차를 설명했다. 조직학 및 면역 염색 결과는 PT 효과적으로 사우스 캐롤라이나 경색, 신경 세포의 손실 및 반응성 신경교 증을 유도 할 수 있음을 보여 주었다.
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Protocol
참고 : 마우스 (C57BL / 6J, 남성) 세 10-12주이 연구에 사용되었다. 모든 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 수행하고 미주리 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 사전 수술
- 수술 오토 클레이브 전날 모든 수술기구를 소독. (121 O를 C, 15 PSI, 30/30 사이클) 건조 30 분 뒤에 30 분 15 psi에서 121 ℃로 악기와 오토 클레이브를 감 쌉니다. 더 사용할 때까지 깨끗하고 무균 환경에서 악기를 놓습니다.
- 신선한 장미 벵골 (RB) 솔루션 (멸균 식염수에 20 ㎎ / ㎖) 수술 전 모든 시간을 준비합니다. 상기 SUR 중에 사용까지 완전히 RB, 와류 후 19 W. 랩 알루미늄 호일 튜브 빛으로부터 보호의 출력 전력과 50 Hz에서 5 분 동안 초음파 처리 한 다음 튜브를 용해GERY.
- 멸균 식염수에 케타민 / 자일 라진의 혼합물을 준비합니다. 마취 혼합물 1 ㎖의 최종 부피를 만들기 위해 멸균 생리 식염수 550 μL : 및 ketmaine 325 μL (100 ㎎ / ㎖ 재고 농도) : 자일 라진의 125 μL (20 ㎎ / ㎖ 재고 농도)를 추가합니다.
- homeothermic 가열 패드를 미리 따뜻하게.
- 램프 전력을 안정화하기 위해 30 분 동안 메탈 할라이드 램프 (FN1 에피 형광 현미경 용의 광원)을 미리 가온.
- 10X 대물 렌즈 및 직립 FN1 에피 형광 현미경 필드 조리개를 조절함으로써 레티클을 사용하여 1mm의 직경으로 조명 된 영역의 크기를 조정한다.
2. 수술
- 케타민 (130 ㎎ / ㎏ B의 중량.)과 자일 라진의 용량으로 마우스를 마취 (10 ㎎ / ㎏ B의 중량.). 1.3 칵테일 바탕 B. 마우스 (WT)의 g 당 4 μL. 필요하다. 알콜 면봉으로 주사 부위를 소독 인트라 통해 마취제를 투여-peritoneal (IP) 경로. 동물의 유도와 회복을 지연 할이 같은 혈관 또는 근육에 마취제를 주입하지 않도록주의하십시오.
- 건조 방지 및 저체온증 방지 가열 패드 위에 동물을 배치 마우스의 양쪽 눈에 인공 눈물 연고를 적용한다.
- 동물의 준비
- 발가락 핀치 응답을 사용하여 적절한 수술 수준의 마취의 동물을 확인합니다.
- 동물이 마취 수술 레벨에 도달하면, 전기 머리 트리머를 이용하여 동물의 중심선 주위의 등쪽 표면에 머리카락 클립. betadine 용액 세 번이어서 70 % 에탄올과 수술 부위를 스크럽. 다음 단계까지 무균 수술 드레이프와 사이트를 커버.
- 얇은 뼈 수술은 척수를 노출시키기
- 수술 플랫폼 (그림 1A)에 homeothermic 가열 패드에 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 놓습니다. 마우스를 적절히 확보주둥이 클램프를 사용하여 자세는 가늘고 긴 목 부분 (그림 1A, B)를 유지한다.
- T12에 대한 흉부 척추 T9에서 연장 등의 중간 선을 따라 수술 가위를 사용하여 (약 1cm 길이) 절개를합니다. 수술 영역을 노출 피부를 옆으로 이동합니다.
- 메스를 사용하여 조심스럽게 T9에서 지느러미 쪽을 노출 근육을 취소 - T12 척추를. 멸균 면봉으로 부드럽게 압력을 적용하여 각 단계에서 출혈을 중지합니다. 별도 T10 - T12 주변 근육에서 척추 안정 임의 이동을 방지하기 위해 척추 클램프를 사용하여 고정 (도 1A, B).
- 조심스럽게 부드럽게 얇은, T10이나 T11 척추의 지느러미 표면을 뼈 연마 드릴 비트와 고속 드릴을 사용하면 SC (그림 1C)의 등쪽 표면에 후방 척추 정맥 및 기타 소형 선박을 시각화합니다.
- 인해 씨닝 절차 동안 발생 된 열을 열 손상을 방지하기 위해,파편을 제거하기 위해 일정한 흡입과 함께 생리 식염수의 부드러운 일정한 스트림을 적용합니다.
- 주요 선박이 명확하게 보일 때까지 메스를 사용하여 조심스럽게 뼈의 표면을 부드럽게. 이 과정에서 척수 손상되지 않도록주의하십시오.
- 혈관이 가시화되면, 인슐린 주사기를 사용하여 레트로 궤도 동 경로를 통해 30 mg / kg (체중)의 투여 량을 투여 RB.
- RB 다음 주입 3 분 후, 레이저 도플러 유량계를 사용하여 혈액의 흐름을 측정하고 필요한 경우 (도 2A, B). 전체 절차를 수행하는 동안 무균을 유지한다.
PT 3. 유도
- 높이를 조절할 수있는 실험실 - 잭을 통해 XY 위치 조정 단계에서 동물을 놓습니다. T11 척수의 노출 영역이 FN1의 에피 형광 현미경 (그림 3A)의 10 배 목표 바로 아래에 있도록 마우스의 위치를 조정합니다.
- 리튬의 힘을 설정12 %에서 GHT 소스와는 얇은 척수의 중간에 0.75 mm의 직경 T11 영역을 조사 - 인 580 nm의 녹색 빛 (파장 540와 (주이 지역은 후방 척추 정맥과 다른 모세 혈관을 포함한다) 2 분 동안 10 배 대물 통해 현미경 필터 큐브)에 의해 달성. 시작과 조사의 끝 (그림 3B, C)에서 이미지를 가지고이 시점에서 실험 시간을 기록한다.
- 2.4.8와 같이 척수 상기와 동일한 위치에 레이저 도플러 프로브를 배치하여 10 분 동안 다시 필요한 경우 혈류를 측정 (도 2A, B).
- 어떤 출혈 및 경우 조사 확인 후 아무도 발견은 동물을 봉합를 진행하지 않습니다. 흡수성 봉합사 또는 크기 4-0 실크 봉합사를 이용하여 척추의 어느 한쪽에 따라 근육 근막 피상적 봉합사. 노출 된 SC 손상되지 않도록주의하십시오. 4-0 실크 봉합사로 피부를 봉합. Betadine 또는 요오드 적용봉합 후에 피부의 가장자리.
4. 수술 후 케어
- 봉합 후, 복구를 위해 가열 패드에 동물을 배치합니다. 복구 후 두 뒷다리 - 사지의 움직임을 관찰하여 신경 학적 결손의 징후 동물을 확인합니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 방치하지 마십시오.
- 홈 케이지에 동물을 전송합니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다.
- 정기적으로 동물을 확인합니다. 심각한 신경 학적 결손 경우, 방광의 배출, 진통제의 투여 (- 0.1 ㎎ / ㎏ 부 프레 노르 핀, 0.05)과 같은 적절한 치료를 제공합니다. 탈수를 확인하고 심한 경우에는 생리 식염수를 피하을 관리 할 수 있습니다. 일반적으로, 부 프레 노르 핀은 (0.1 ㎎ / ㎏) 수술 부위의 통증을 완화하기 위해 봉합 한 후 투여한다.
- 동물이 아닌 경우 바로동물이 쉽게 음식에 도달 할 수 있도록 수술 후 안락사, 우리는 케이지 바닥에 높은 수분 함량 다이어트를 넣어 것입니다.
5. Transcardial 관류, Nissl 염색 및 면역 염색
- 앞서 설명한 바와 같이 17-20로 transcardially 동물 관류.
- 프로토콜의 앞부분에서 설명한로 transcardially 얼음처럼 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 PBS에서 (PFA) 다음 인산염 완충 식염수 (PBS, pH를 7.4)로 관류로 동물을 마취.
- 관류 후, 척수 (SC)를 제거하고 4 ° CO / N에서 PBS에 4 % PFA에서 그것을 포스트 - 수정. 30 % 자당에 PBS에 고정 SC를 전송하고 2 유지 - 그것은 튜브의 바닥에 침몰 할 때까지 3 일.
- 저온 유지 장치를 사용하여 30 μm의 두께 부분으로 척수를 절단하고 젤라틴 코팅 유리 슬라이드에 0.01 M PBS로 48 웰 플레이트에 직렬로 배치합니다.
- Nissl 염색 : Nissl staini을 수행 PT에 의한 손상을 검사하려면척수 부분에 NG는 이전에 17-20을 설명했다.
- 간단히, 0.25 %의 크레 실 바이올렛과 모든 다섯 번째 척수 유리 슬라이드에 슬라이스와 얼룩을 수집합니다. 스테인드 섹션 (그림 4)의 이미지를 가져 가라.
- 면역 염색 : 이전 섹션 플로팅 방식 17,18,20를 사용하여 설명 된 바와 같이.
- , 토끼 항 NeuN 항체 (1 : 300), 토끼 항 - : 간단히, 토끼 항 신경교 원 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) 폴리 클로 날 항체 (300 1)와 함께 4 ℃에서 O / N 항온 처리하여 척수 부분 얼룩 Iba1 항체 (1 : 500) 당나귀 항 토끼 알렉사 568 공역의 IgG (1 : 400)에 의해 이어 RT에서 4 시간 동안 이차 항체. 형광 현미경 (그림 5)와 이미지를 가져 가라.
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Representative Results
본 연구의 목적은 PT 모델을 사용하여 생쥐의 척수 허혈을 제조 하였다. 척수 (T10 - T12) 위의 뼈의 원하는 영역 후 얇게하고, 로즈 벵갈 복고풍 궤도 동 경로를 통해 주입하고, 허혈은 PT에 의해 유도 된 그림 1A가, B는에 위치 마우스를 보여 맞춤 수술. 수술 중 플랫폼입니다. 마우스가 주둥이 클램프로 고정 된 두 개의 조정 가능한 척추 동물은 척추를 안정화 클램프 그림 1C는 T10의 척수 위의 얇은 창을 보여 -. T12을. 주 혈관과 분지 명확하게 가시화 될 수있다. 허혈의 유도를 확인하기 위해, 혈류량의 변화 전과 후에 PT 레이저 도플러 유량계를 사용하여 측정 하였다 (도 2A, B). 분석을 위해, 혈액 흐름의 %의 감소 photothrombosis 전에 기저선 혈류량을 이용하여 계산 하였다. 와트에 비해 혈액 흐름은 빛 조명 직후 20 % ~로 떨어졌다종래의 조명에 기초 레벨 i 번째.도 3b는, C는 PT의 시작과 끝에서 척수 혈관의 형광 화상을 도시한다. 레이저 도플러 유량계의 측정 값과 일치 허혈 유도를 제안 혈관 (도 3c)에서 2 분 유도 혈병위한 조명. PT와 Nissl 염색을 수행 한 후 PT에 의한 부상을 검사하려면 마우스는 3 일 희생되었다. Nissl 염색 다음 촬영 화상이 선명 PT 후 척수 조직 손상 및 세포 사멸을 나타내는, 주변 지역에서 경계가 될 수 경색 영역 (그림 4)을 보여 주었다. 면역 염색은 NeuN, GFAP 및 Iba1에 대해 수행되었다. GFAP 발현 (또한 박스 영역을 참조, 그림 5B) 허혈성 코어의 경계에서 증가하는 동안 NeuN + 뉴런은 허혈성 코어 (그림 5A)의 회색 문제에 분실되었다. Iba1 +의 미세 아교 세포는 globoid의 MOR을 전시phology 증가 Iba1 표현 (그림 5C)와 함께 (예., 짧고 적은 프로세스와 확대 세포체는 박스 영역을 참조). 인해 부동 부 염색 허혈성 코어 영역에서 조직 손실 있었지만, 전체 경색 주변 영역과 Iba1 GFAP 발현에서의 증가는 분명히 관찰 될 수있다. 이러한 결과는 SC 허혈 후 주변부의 신경 세포 죽음과 반응성 신경교 증을 나타냅니다. 반면에, 실질적인 기능 적자는 뒷다리 - 사지의 마비 (동영상 참조) 표시, PT 후 즉, 장애인 뒷다리 - 사지 운동 일일, 부상 마우스에서 관찰되었다.
척수도 1 PT 유도 허혈 모델. (A) 척수 수술 용 PT 플랫폼의 사진. 삽입 된 : 척추 클램프를 확대.(B) 마우스는 주둥이 클램프에 의해 무대에 두 맞춤형 척추 클램프에 의해 개최되었다. 뼈가 T10에서 박막화되었음을 통지 -. T12 영역과 두 개의 금속 척추 클램프 척추를 안정화하는 데 사용 하였다 (C) 줌인 영상 용 T10-11에서 척수 상기 시닝 뼈 영역을 도시 PT의 유도. 주요 혈관과 그 가지를 알 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 척수 혈류 측정. (A)는 프로브의 위치를 레이저 도플러 유량계 및 정위 장치를 이용하여 척수 표면 혈류 측정 셋업. (B)PT 전후 척수 혈류를 측정 하였다. 이 실험에서는, PT는 12 %의 전력 출력과 2 분 동안 광원과 조명에 의해 유도 하였다. 피조 사면의 직경은 0.75 mm이었고, 척수의 중앙에 있었다. 혈액 흐름은 PT 전에 안정화 신호를 구하는 5 분까지과 PT 다음 10 분까지 기록했다. 각 마우스의 데이터는 이전에 빛 조명에 값을 표준화했다. 그래프 3은 쥐에서의 데이터의 평균 값을 나타낸다. 화살표 PT의 시작을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 척수 허혈을 PT가 유도. (A) 사진마우스 척수 유도 PT에 대한 현미경에 배치합니다. 마우스의 위치는 XY 치수 글라이딩 단계 및 - 랩 잭을 이용하여 세 조정될 수있다. 10X 대물 렌즈의 광은 척수의 표면에 집중 하였다. (BC)의 주입을 이하의 (C), 조명 (B) 전후 척수 혈관의 형광 이미지 벵갈 로즈. 조사 (C)의 2 분 (화살표 참조) 후 혈액 응고를 알 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
척수도 4 Nissl 염색. 정상 (섹션을 포함 입쪽 대 꼬리 척수 횡 방향 섹션의 일련의 Nissl 염색 이미지1, 6) 및 PT-유도 진원지 (섹션 2-5). 마우스 3 일 후 희생시켰다 PT. 각 척수 부 30 μm의 두께이다. 두 섹션 사이의 간격은 750 μm의입니다. 3 번째 이미지에 점선이 경색 영역을 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
NeuN, GFAP 및 Iba1 그림 5. 면역 염색. NeuN (A)의 형광 화상은, 통상 GFAP (상부 패널)에서 (B) 및 Iba1 (C) 및 염색 (하부 패널) 척수 부분은 PT-부상. 부상 마우스 3 일 PT 후 희생되었다. 점선은 정상 조직에서 경색 영역을 분리한다. 박스 영역 (50)의 스케일 바 GFAP 및 Iba1 발현의 높은 해상도 이미지를 보여μm의는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 . 척수에서 PT는 행동 적자를 유도.이 영화는 정상 및 케이지 PT-부상 마우스의 움직임을 보여줍니다. 뒷다리 - 사지 (하반신 마비)의 마비를 나타내는 단련 척수와 마우스의 양쪽 뒷다리 - 사지의 드래그를 알 수 있습니다. 영화는 부상 마우스에 PT 후 24 시간을 촬영했다.
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Discussion
본 연구에서는 SC 허혈의 photothrombotic 모델을 설명했다. 때문에 발전에 유전 공학이 가능 SC의 허혈성 병태 생리에 관여하는 특정 유전자의 영향을 연구하기 위해 만든 시판되는 형질 전환 마우스가 급증되고있다. 연구의 목적은 척수 허혈 재현성 마우스 모델을 개발하는 것이었다. 여기에서 우리는 생쥐에서 SCI를 유도하는 대뇌 피질의 PT 모델을 적용. 수술에게 T11 흉부 척추의 수준에서 마우스의 등쪽면에 후방 척추 정맥 및 모세 혈관을 따라하는 것은 노출되었다. 이어서 RB, 시판 광활성 염료, 원하는 혈관 분포를 달성하는 레트로 궤도 동 경로를 통해 주입 하였다. 노출 된 혈관이어서 혈전 이후에 경색 형성을 유도하는 녹색 빛이 조사되었다. 조직 학적 및 면역 염색 방법에서 우리의 결과는 PT가 척수를 Reacti의 경색을 유도 것을 보여 주었다경색 주변 지역에서 신경교 증을했습니다. 뒷다리 마비와 같은 신경 학적 결손도 관찰되었다. 이러한 데이터는 PT가 SCI 후 병태 생리 및 세포 죽음의 메커니즘을 연구에 적합한 모델입니다 것이 좋습니다. 프로토콜의 중요한 단계 SC의 등 표면에 혈관의 시각화 척추골의 얇은 표면에 고속 드릴의 사용이다. 이 단계는주의 깊게 드릴 척추 캐비티를 입력하고 SC가 손상 될 수 있습니다 초과 압력의 응용 프로그램으로 수행되어야한다. 한편, 요철 씨닝 부적절한 조명을 초래할 수도 불규칙한 경색을 생성 할 수있다. 이 문제를 해결하기 위해, 각각의 짧은 드릴링 공정 후에 현미경으로 뼈의 표면을 자주 검사는 뼈의 두께를 평가하고, 상기 드릴의 사용을 평가하기 위해 추천된다. 멸균 식염수의 사용은 노출 된 표면의 더 나은 시각화뿐만 아니라 이물질 세척 할 것을 권장한다. 단점을 유지전체 수술 중 중대장 무균, 동물의 적절한 수술 치료는 동물의 생존을 개선하고 실험의 성공률을 높일 수 있습니다.
PT의 우리의 현재 모델은 수 (예를 들면 수은 램프, 메탈 할라이드 램프, 또는 488 nm의 파장의 레이저와 같은) 광원 에피 형광 현미경이 장착되어있는 실험실과 같은 고가의 장비의 구입을 요구하지 않는다 이 절차를 수행합니다. 또한,이 기술은 복잡하고있다 대동맥의 결합 폐색, 좌측 쇄골 및 내유 동맥 (25) 및 개질 대동맥 방법 (26)과 같은 다른 SC 허혈 모델에 비하여 개구의 크기를 조절함으로써 경색의 크기에 대한 제어를 제공한다 매우 침습적. 우리의 모델에서 시각화를위한 척추의 얇은 지느러미 표면에 고속 드릴 SCI를 유도하기 위해 많은 실험실에서 후궁 절제술 대안 선택의 방법으로 선택되었다.후궁 절제술 인해 척추 혈관 절개 과도한 출혈을 일으킬 수 있으며, 이는 이미징에 대한 필드를 보이지 않을 척추의 절단을 포함한다. 일부 프로토콜은 압축 될 수 있습니다 후궁 절제술시 과도한 출혈을 취소 면봉의 사용을 권고에도 불구하고있는 SC에 추가 부상의 원인이 될 수 있습니다. 또한 척수의 노출 된 표면은 혈액의 구성 성분과 직접 접촉뿐만 아니라 실험에 불필요한 변동성을 추가 할 수 있습니다 절단 뼈의 날카로운 모서리에 올 수 있습니다. PT 전류 모델을 사용하여, 서로 다른 크기와 깊이가 경색 광원, 노출면의 노출 면적과 기간의 강도의 간단한 조작에 의해 생성 될 수있다. 현재의 연구는 SC에서 T11의 중앙 영역에 허혈을 생성하지만,이 방법은 입쪽 대 꼬리를 따라 상이한 위치에서 경색뿐만 아니라 척수, MIG의 좌우 방향을 생성 할 수있다HT 하반신 마비에 허혈의 영역 별 효과를 이해하는 혜택을 누릴 수 있습니다. 조명은 척수의 표면 상에 있지만, 다른 한편으로, 광은 조직의 특정 깊이까지 침투 수 있고 부상도 회백질로 유도 될 수있다. 로즈 벵골 순환 시스템 전체에 분포 된 바와 같이 동물 종은 동일하며, 연령과 체중이 유사하면, 우리는 일관된 병변 PT에 의해 유도 된 대뇌 피질의 허혈에서와 같이 생성 될 것으로 예상된다.
PT의 허혈 - 유도 된 다른 주요 장점은 동물의 매우 낮은 치사율이다. 낮은 치사율 장기 생존 연구는 생존 및 운동 기능 회복에 허혈 손상 시간의 영향을 해명하는데 유용 할 수도있는 실시 될 수 있다는 것을 의미한다. 이 모델은 또한 일반적으로 부상 14,19,27-29의 만성기에 늦게 발생 셀룰러 복구 메커니즘을 이해하는데 도움이 될 수있다. 이 모델은 또한 수 b 상당한 운동 기능 적자를 생산E는 기능 회복에 신경 보호제의 효능을 평가하기 위해 사용된다. 또한,이 모델은 또한 축삭 변성 및 재생, 신경 세포 및 성상 세포 칼슘 시그널링 및 이광자 현미경을 사용하여 살아있는 마우스에서 과부하로서 SCI 후의 병리학 적 변화의 조사를 허용한다.
다른 모든 SCI 모델과 마찬가지로, PT는 단점이없는 없습니다. 이 기술의 단점은 대뇌 피질의 PT에서 본 것과 유사하다. 몇몇 단점은 많은 신경 약물의 표적 인 해부학 맑은 허혈성 주변부의 부족, 재관류의 부재를 포함한다. 그것은 또한 다음 허혈 재관류가 증가 활성 산소 종의 생산, 염증 세포 침윤 및 사이토 카인 생성 증가 30-32 같은 변경을 특징으로하는 것으로 알려져있다. PT에서 재관류의 부족은 사우스 캐롤라이나에서 재관류 손상과 관련된 변경 사항이 모델을 이용하여 연구하기 어려운 남아 것을 의미합니다.그러나, 허혈 유도 PT를 사용하는 장점은 단점을 능가하고이 기술은 수행하기 쉽고 마우스에서 SCI를 생성하는 높은 재현성 모델 연구를 제공한다.
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Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원 (National Institutes of Health) [그랜트 없음에 의해 지원되었다. R01NS069726] 원조 부여에서 미국 심장 협회 (American Heart Association) 그랜트 [그랜트 없음. 13GRNT17020004] SD에.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000 | 20 mg/ml in sterile saline |
| C57BL/6J | Jackson lab | 664 | 22 - 25 g |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/ml |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 100 mg/ml |
| Betadine solution | Purdue | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline | Abott Laboratories | 04930-04-10 | For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Ethanol | Decon labs.Inc | 2716 | 70% ethanol for disinfection |
| Metal halide lamp | EXFO, Canada | X-Cite 120 PC | Set power at 12% |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Standard scalpel | Fine Science Tool | 10003-12 | for removing muscle |
| Scalpel blade | Feather | 2976 | No. 10 |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Tissue adhesive glue | 3M Vetbond | 1469SB | to adhere to edges of the cut skin |
| Monofilament polypropylene | USSC Sutures | VP-521 | Size = 4-0 (for fascia) |
| Perma-hand silk | Ethicon | 683G | Size = 4-0 (for skin) |
| Micro drill | Roboz Surgical Instrument Co. Inc. | RS-6300 | with bone polishing drill bit |
| Laser doppler flowmeter | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | for monitoring change in blood flow |
| Heating pad | Fine Science Tool | 21052-00 | to prevent hypothermia |
| Lab-Jack | Fisher scientific | 14-673-50 | 4 x 4 in plate to adjust the height of the animal |
| X-Y gliding stage | Amscope | GT100 | for positioning the animal under microscope |
References
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