Introduction
Traumatisch ruggenmergletsel (SCI) is een verwoestende klinische aandoening van de sensomotorische en autonome functies van de SC. Patiënten overleven SCI worden vaak achter met slopende dwarslaesie die een aanzienlijke invloed op hun dagelijkse activiteiten en de kwaliteit van het leven 1. Experimentele SCI modellen zijn een onmisbaar instrument in het wetenschappelijk onderzoek naar de pathofysiologie van SCI en bijbehorende neurale herstelprocessen begrijpen geweest. Deze modellen zijn ook gebruikt om de preklinische effectiviteit van verschillende experimentele neuroprotectieve interventies die zijn gericht op functioneel herstel testen. Momenteel is de meerderheid van de SCI-modellen in de praktijk in dienst van het gebruik van fysieke stomp mechanisch verstoren en verwonden van de SC. Deze werkwijzen omvatten kneuzing, compressie, dislocatie en doorsnijding van de SC 2. Gesuggereerd is dat na de primaire mechanische insult secundaire beschadiging in de vorm van ischemie sets in de gewonde SC 3,4. De etiologie van secundaire ischemie bevat uitgebreide weefsel degeneratie, parenchymale bloedingen en soms door verstopping van bloedvaten door weefseloedeem 5-7. Door de secundaire schade de integriteit van SC wordt verder beïnvloed worden neuronen en gliacellen ernstig verminderde functie en levensvatbaarheid en apoptose ondergaan die leidt tot groei infarct in de chronische fase van letsel, analoog aan de groei van ischemische penumbra na beroerte 8,9. Verschillende mechanismen als excitotoxiciteit, vrije radicalen en ontstekingen zijn gerapporteerd verantwoordelijk voor ischemische celdood na SCI 10,11 te zijn. Bovendien, SC ischemie is een ernstige complicatie van thoraco-abdominale aorta aneurysma chirurgie die vaak leiden tot paraplegie bij de patiënten 12,13. Ondanks deze grote klinische effect weinig modellen van ruggemerg ischemie hoge reproduceerbaarheid beschikbaar.
nt "> Photothrombosis (PT) is een algemeen gebruikte werkwijze voor de inductie van focale ischemie in de hersenen 14-20. De techniek is tamelijk non-invasieve, uiterst reproduceerbaar en levert een nauwkeurige focale ischemische laesie op het blootgestelde oppervlak van de hersenen 17 -21. Dit wordt bereikt door de systemische toediening van de fotoactieve kleurstoffen zoals Rose Bengal (RB) 16-20,22 of erythrosine B 23 gevolgd door lokale bestraling van bloedvaten met de juiste lichtbron. Fotoactivatie van de kleurstof zorgt ervoor dat de vorming van vrije radicalen die verstoort de integriteit van de gladde vasculaire endotheel, waardoor de bloedplaatjes te verzamelen, die vervolgens vormt een thrombus. De obstructie van de bloedstroom door de thrombus resulteert in een infarct in de door het vat 24 toegevoerd regio. wegens gemak van controle van de intensiteit en duur van de bestraling procedure levert een zeer gelijkmatige en reproduceerbare infarct. Bovendien kan deze methode worden toegepast om een infarc inducerent op verschillende anatomische locaties waardoor ruimtelijke (bv grijze stof versus witte stof) inzicht in het effect van ischemie.Het doel van dit onderzoek is het eenvoudig en zeer reproduceerbaar model van SC ischemie in muizen ontwikkelen. We beschreven procedure van een PT model SC ischemie in muizen. Resultaten van histologie en immunokleuring aangetoond dat PT effectief induceren SC infarct, neuronaal verlies en reactieve gliosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Muizen (C57BL / 6J, man) leeftijd 10-12 weken werden gebruikt in deze studie. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Universiteit van Missouri Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).
1. Pre-Surgery
- De dag voor de operatie autoclaaf en steriliseren van alle chirurgische instrumenten. Wikkel de instrumenten en de autoclaaf bij 121 ° C bij 15 psi gedurende 30 min gevolgd door 30 min drogen (121 o C, 15 psi, 30/30 cyclus). Plaats de instrumenten in een schone en steriele omgeving tot verder gebruik.
- Bereid verse Rose Bengal (RB) oplossing (20 mg / ml in steriele zoutoplossing) elke keer voor de operatie. Om volledig op te lossen RB, vortex de buis gevolgd door sonicatie gedurende 5 min bij 50/60 Hz bij een uitgangsvermogen van 19 W. Wikkel de buis in aluminiumfolie en bescherming tegen licht tot nader gebruikt tijdens surgery.
- Maak een mengsel van ketamine / xylazine in steriele zoutoplossing. Voeg 125 ul van xylazine (voorraadconcentratie: 20 mg / ml) en 325 gl ketmaine (voorraadconcentratie: 100 mg / ml) en 550 ul steriele zoutoplossing tot een eindvolume van 1 ml anesthesiemengsels maken.
- Pre-warm de homeothermic verwarming pad.
- Pre-warm de metaalhalogenide lamp (lichtbron voor FN1 epi-fluorescentie microscoop) gedurende 30 minuten om de lamp macht stabiliseren.
- De grootte van het verlichte gebied een diameter van 1 mm met behulp 10X objectief en een reticule door het aanpassen van het velddiafragma in verticale FN1 epi-fluorescentie microscoop.
2. Chirurgische Procedure
- Verdoven van de muis met een dosis van ketamine (130 mg / kg B. gew.) En xylazine (10 mg / kg B. gew.). Op basis van de cocktail in 1,3, 4 pl per gram muis B. gew. nodig. Steriliseer de injectieplaats met een alcoholdoekje en het beheer van de verdoving door de intra-peritoneal (IP) route. Zorg ervoor dat u de verdoving injecteren in de bloedvaten of spier omdat dit zou de inductie en het herstel van het dier te vertragen.
- Pas kunstmatige traan zalf beide ogen van de muis om uitdroging te voorkomen en plaats het dier op het verwarmingselement om onderkoeling te voorkomen.
- Bereiding van dierlijke
- Controleer het dier voor een goede chirurgische niveau verdoving met behulp van de teen knijpen respons.
- Zodra het dier chirurgische mate van anesthesie is bereikt, clip het haar op het dorsale oppervlak rond middellijn van het dier met een elektrische tondeuse. Scrub de operatieplaats met 70% ethanol, gevolgd door betadine oplossing driemaal. Bedek de plaats met een steriele chirurgische doek tot de volgende stap.
- Chirurgische ingreep om dunne het bot aan het ruggenmerg blootstellen
- Plaats de muis in een liggende positie over de homeothermic verwarming pad op de chirurgische platform (Figuur 1A). Goed te beveiligen met de muishouding met een snuit klem aan een langgerekte halsgebied (Figuur 1A, B) te behouden.
- Maak een insnijding (ongeveer 1 cm lang) met behulp van chirurgische schaar langs de dorsale midden lijn die van de thoracale wervels T9 naar T12. Leg opzij de huid chirurgische gebied bloot te leggen.
- Met behulp van een scalpel voorzichtig duidelijk de spier aan de dorsale stekels bloot aan T9 - T12 wervels. Het bloeden te stoppen in elke stap door het toepassen van lichte druk met steriele wattenstaafje. Aparte T10 - T12 wervels uit de omliggende spieren en zet ze vast met behulp van een wervel klem te stabiliseren en te voorkomen dat elke beweging (Figuur 1A, B).
- Met behulp van een hoge snelheid boor met bot polijsten boor, zorgvuldig en voorzichtig dunne het dorsale oppervlak van T10 en T11 wervel aan het achterste spinale ader en andere kleine schepen op het dorsale oppervlak van de SC (figuur 1C) te visualiseren.
- Om thermische schade door warmte die tijdens de procedure dunner voorkomen,het toepassen van een zachte en constante stroom van normale zoutoplossing, samen met een constante zuigkracht om het puin te verwijderen.
- Met behulp van een scalpel zorgvuldig glad het botoppervlak totdat het hoofdvat duidelijk zichtbaar. Zorg ervoor dat u het ruggenmerg beschadigd raken tijdens dit proces.
- Nadat het bloedvat wordt gevisualiseerd, RB toedienen in een dosis van 30 mg / kg (lichaamsgewicht) met retro-orbitale sinus route met behulp van een insulinespuit.
- Meet bloedstroom met behulp van een laser Doppler flowmeter na 3 min na RB injectie indien nodig (Figuur 2A, B). Handhaaf asepsis gedurende gehele procedure.
3. Inductie van PT
- Leg het dier op een XY positie verstelbare podium over een Lab-Jack die de hoogte kan aanpassen. Pas de positie van de muis, zodat het blootgestelde gebied van T11 ruggenmerg is direct onder het 10x objectief van de FN1 epi-fluorescentie microscoop (Figuur 3A).
- Stel de kracht van de liGHT bron bij 12% en bestralen gebied T11 met een diameter van 0,75 mm in het midden van verdunde ruggenmerg (Opmerking: deze regio omvat de postérieure spinale ader en andere capillairen) met een groen licht (golflengte 540-580 nm, wat bereikt door het filter kubus de microscoop) door de 10X doelstelling 2 min. Neem afbeeldingen aan het begin en einde van bestraling (Figuur 3B, C) en neem het tijdstip van het experiment op dit punt.
- Meet bloedstroming opnieuw voor 10 min eventueel door plaatsing van de laser Doppler sonde naar dezelfde positie boven het ruggemerg zoals in 2.4.8 (figuur 2A, B).
- Na bestraling check voor elke bloeding en als geen gevonden overgaan tot het hechten van het dier. Hecht de oppervlakkige fascia samen met de spieren aan de weerszijden van het ruggenmerg gebruik van een absorbeerbaar hechtmateriaal of een 4-0 zijden hechtdraad de grootte. Zorg ervoor dat u de blootgestelde SC beschadigen. Hechtdraad de huid met 4-0 zijden hechtdraad. Breng Betadine of jodiumop de randen van de huid na hechten.
4. Post-operatie Care
- Na het hechten, plaats het dier op de verwarming pad voor herstel. Na herstel controleren de dieren op tekenen van neurologische tekorten door het observeren van de beweging van beide achterpoten-ledematen. Laat het dier niet onbeheerd verlaten totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging behouden.
- Breng de dieren naar hun kooi. Laat het dier dat een operatie heeft ondergaan om het bedrijf van de andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug.
- Controleer de dieren regelmatig. In geval van ernstige neurologische tekorten, bieden goede zorg als de evacuatie van de blaas, de toediening van analgetica (buprenorfine, 0,05-0,1 mg / kg). Controleer voor uitdroging en beheren fysiologische zoutoplossing subcutaan in ernstig geval. Meestal zal buprenorfine (0,1 mg / kg) wordt toegediend na hechten om pijn in de operatieplaats.
- Wanneer dieren niet directgedood na de operatie, zullen we hoog watergehalte dieet gezet op de kooi vloer, zodat de dieren het voedsel gemakkelijk kunt bereiken.
5. transcardial perfusie, Nissl kleuring en Immunokleuring
- Transcardially perfuseren het dier zoals eerder 17-20 beschreven.
- Verdoven het dier zoals eerder in het protocol en transcardially perfuseren met fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS, pH 7,4), gevolgd door ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS.
- Na perfusie, verwijder het ruggenmerg (SC) en post-fix it in 4% PFA in PBS bij 4 ° CO / N. Breng de vaste v in PBS met 30% sucrose en houdt deze gedurende 2-3 dagen totdat deze zakt naar de bodem van de buis.
- Met behulp van een cryostaat gesneden het ruggenmerg in 30 urn dikke secties en plaats ze serieel op met gelatine beklede glasplaatjes of in een 48-well plaat met 0,01 M PBS.
- Nissl vlekken: om de schade veroorzaakt door PT inspecteren uitvoeren van een Nissl staining on ruggemerg zoals eerder beschreven 17-20.
- Kort gezegd, het verzamelen van elke vijfde ruggenmerg slice op het glas dia's en vlek met 0,25% cresylviolet. Neem beelden van de gekleurde secties (figuur 4).
- Immunokleuring: Zoals eerder beschreven met behulp van een drijvende gedeelte methode 17,18,20.
- In het kort, de vlek ruggemerg door het incuberen O / N bij 4 ° C met konijn anti-glia fibrillair zuur eiwit (GFAP) polyklonaal antilichaam (1: 300), konijn anti-NeuN antilichaam (1: 300) en konijn anti- Iba1 antilichaam (1: 500) gevolgd door ezel anti- konijn Alexa 568-geconjugeerde IgG (1: 400) secundaire antilichamen gedurende 4 uur bij kamertemperatuur. Neem beelden met een fluorescentiemicroscoop (Figuur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van deze studie was het ruggemerg ischemie in muizen met een model PT produceren. Na het gewenste gebied van het bot boven het ruggenmerg (T10 - T12) werd uitgedund, werd Bengaals geïnjecteerd door retro-orbitale sinus route, en ischemie werd geïnduceerd door PT Figuur 1A, B tonen de muis geplaatst in een op maat gemaakte chirurgische. platform tijdens de operatie. De muis werd op zijn plaats gehouden door een klem snuit en twee verstelbare gewervelde klemmen om het ruggenmerg stabiliseren Figuur 1C een verdunde raam boven het ruggenmerg van T10 -. T12. De belangrijkste bloedvat en haar filialen kan duidelijk worden gevisualiseerd. Om de inductie van ischemie bevestigen, veranderingen in de bloedstroom werd gemeten met een laser Doppler flowmeter before and after PT (Figuur 2A, B). Voor de analyse, de afname% van de bloedstroming werd berekend met de basislijn bloedstroming voor photothrombosis. Bloedtoevoer gedaald tot ~ 20% direct na licht verlichting vergeleken wet de basale niveau van voor de verlichting. Figuur 3B toont C fluorescentiebeelden van ruggenmerg bloedvaten aan het begin en het einde van PT. Verlichting gedurende 2 min veroorzaakte bloedstolsel in de bloedvaten (Figuur 3C), wat suggereert dat de inductie van ischemie, in overeenstemming met de afmetingen van de laser Doppler flowmeter. Om de schade veroorzaakt door PT inspecteren, werden muizen opgeofferd 3 dagen na PT en Nissl kleuring werd uitgevoerd. Beelden genomen na Nissl kleuring toonde het infarct gebied dat duidelijk kan worden afgebakend van de omliggende regio, met vermelding van het ruggenmerg weefselbeschadiging en celdood na PT (figuur 4). Immunokleuring werd uitgevoerd voor Neun, GFAP en Iba1. Neun + neuronen werden verloren in de grijze stof in de ischemische kern (figuur 5A), terwijl GFAP expressie werd verhoogd in de grens van ischemische kern (figuur 5B, zie ook de boxed regio). De Iba1 + microglia vertoonden een globoid morphology (bijv., een vergrote cel lichaam met kortere en minder processen, zie de boxed regio), samen met een verhoogde Iba1 expressie (figuur 5C). Hoewel er een weefselverlies in het ischemische kerngebied vanwege drijvende sectie kleuring, kan een toename van GFAP en Iba1 expressie in het gehele peri-infarct duidelijk worden waargenomen. Deze resultaten geven aan neuronale dood en reactieve gliose in de penumbra na subcutane ischemie. Aan de andere kant werden aanzienlijke functionele tekorten waargenomen in de gewonde muizen, dat wil zeggen, gehandicapte achterpoot-beweging van de ledematen een dag na PT, met vermelding van verlamming van de achterste ledematen (zie de film).
Figuur 1. PT-geïnduceerde ischemie model in het ruggenmerg. (A) Foto's van de operatie platform voor het ruggenmerg PT. Inzet: vergroot wervel klemmen.(B) De muis werd gehouden door een snuit klem en twee op maat gemaakte wervel klemmen op het podium. Merk op dat het bot werd verdund in T10 -. T12 regio en twee metalen klemmen vertebrale werden gebruikt om het ruggenmerg te stabiliseren (C) A ingezoomde beeld dat de regio met de verdunde-bone boven het ruggenmerg bij de T10-11 inductie van PT. De belangrijkste bloedvaten en zijn takken merken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. ruggenmerg bloedstroom meting. (A) De opzet van het ruggenmerg oppervlaktebloed stroommeting met een laser Doppler flowmeter en stereotaxische apparaat om de probe te positioneren. (B)Ruggenmerg bloedstroom voor en na de PT werd gemeten. In dit experiment werd PT geïnduceerd door belichten met een lichtbron gedurende 2 min met 12% vermogen. De diameter van het bestraalde oppervlak was 0,75 mm en in het midden van het ruggenmerg. Bloedstroom opgenomen worden gedurende 5 min gestabiliseerde signaal te verkrijgen voor PT en tot 10 min na PT. Gegevens van elke muis werd genormaliseerd tot de waarde vóór lichtilluminatie. De grafiek toont de gemiddelde waarde van de data van 3 muizen. De pijl geeft de start van PT. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. PT-geïnduceerde ruggemerg ischemie. (A) Foto van eenmuis geplaatst op de microscoop voor inductie PT ruggenmerg. De positie van de muis kan worden aangepast in drie dimensies met behulp van de XY zweefvliegen podium en een Lab-Jack. Licht van de 10X objectief was gericht op het oppervlak van het ruggenmerg. (BC) Fluorescerende beelden van de bloedvaten in het ruggenmerg voor (B) en na (C) belichting na de injectie van Bengaals roze. Let op de bloedstolsel na 2 min van bestraling (C) (zie pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Nissl-kleuring van het ruggenmerg. Nissl-kleuring beelden van een reeks rostrale-caudale tot ruggenmerg dwarsdoorsneden die de normale (deel omvat1 en 6) en PT-geïnduceerde epicentrum (hoofdstukken 2-5). De muizen werden 3 dagen na PT. Elke ruggenmerg sectie is 30 micrometer dik. Het interval tussen twee secties is 750 micrometer. De gestippelde lijn 3 image rd in schetst de infarct regio. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Immunokleuring van Neun, GFAP en Iba1. Fluorescentie afbeeldingen NeuN (A), GFAP (B) en Iba1 (C) kleuring van normale (bovenste panelen) en PT-verwonde (onderste panelen) ruggemerg. De gewonde muis werd geofferd 3 dagen na PT. De stippellijnen scheiden de infarct gebieden van normale weefsels. De boxed regio's tonen hoge resolutie beelden van GFAP en Iba1 expressie met een schaal van 50 barum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Movie . PT ruggenmerg geïnduceerde gedragsgebreken. De film geeft het verloop van een normale en een PT-verwonde muis in een kooi. Let op het slepen van beide achterste ledematen van de muis met inured ruggenmerg, met vermelding van verlamming van de achterste ledematen (dwarslaesie). De film werd genomen 24 uur na PT in de gewonde muis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie, beschreven we een fototrombotisch model van SC ischemie. Door de vooruitgang in gentechnologie is er een uitgesproken in de handel verkrijgbare transgene muizen die het mogelijk heeft gemaakt om het effect van specifieke genen die betrokken zijn bij de pathofysiologie van ischemische SC kunnen bestuderen. Het doel van de studie was om een reproduceerbaar muismodel van ruggemerg ischemie ontwikkelen. Hier aangepast we een corticale PT model aan SCI induceren in muizen. Na de operatie posterior spinale ader en haarvaten op de dorsale zijde van muizen op het niveau van T11 borstwervel werden blootgesteld. Vervolgens RB, een commercieel verkrijgbare foto-kleurstof, werd geïnjecteerd door retro-orbitale sinus route om de gewenste vasculaire distributie te bereiken. De blootgestelde bloedvat werd dan bestraald door een groen licht voor de vorming van trombus en later een infarct veroorzaken. Onze resultaten van histologische en immunokleuring werkwijzen bleek dat PT veroorzaakte een infarct in het ruggenmerg en reactive gliosis in de peri-infarct regio. Neurologische stoornissen, zoals verlamming werden ook waargenomen. Deze gegevens suggereren dat PT is een geschikt model voor de studie pathofysiologie en mechanismen van celdood na SCI. De kritische stap in het protocol is het gebruik van een high speed boor verdunnen oppervlak van wervel voor visualisatie van het bloedvat op het dorsale oppervlak van de SC. Deze stap moet zorgvuldig worden uitgevoerd, zoals de toepassing van overdruk kunnen veroorzaken de boor om spinale holte voeren en schade aan de SC. Aan de andere kant kan ongelijkmatig verdunnen tot slechte verlichting en kunnen onregelmatige infarcten veroorzaken. Om dit probleem wordt frequente controle van het oppervlak van het bot onder de microscoop na elke kleine stap van het boren aanbevolen de dikte van het bot te evalueren en het gebruik van de boor verder te beoordelen. Het gebruik van steriele zoutoplossing wordt aanbevolen om de afgespoeld vuil en voor een betere visualisatie van het blootgestelde oppervlak. Handhaving van constant asepsis tijdens de gehele chirurgische procedure, goede post-operatieve verzorging van het dier kan dier overlevingskansen verbeteren en slagingspercentage van de experimenten.
Ons huidige model van PT ofwel de aankoop van dure instrumenten, zoals elke laboratorium is uitgerust met een epi-fluorescentie microscoop met een lichtbron vereisen (zoals kwiklamp, metaalhalogenide lamp of laser van 488 nm golflengte) kan het uitvoeren van deze procedure. Bovendien verschaft deze techniek controle over de grootte van het infarct door aanpassing van de lensopening vergelijking met andere SC ischemie modellen zoals gecombineerd occlusie van de aorta, linker subclavia en interne mammaire arterie 25 gewijzigde aorta kruis klemtechniek 26 die gecompliceerd zijn en die zeer invasieve. In ons model een snelle boor verdunnen dorsale oppervlak van wervel voor het zichtbaar werd gekozen als alternatief voor laminectomie, voorkeursmethode door veel laboratoria SCI induceren.Laminectomie bestaat uit het verdelen van de wervels die ernstige bloedingen kan veroorzaken door doorsnijden van de wervels bloedvaten en dit kan het gebied verhullen voor beeldvorming. Hoewel sommige protocollen adviseren het gebruik van wattenstaafjes om duidelijk uit de buitensporig bloeden tijdens laminectomie kan resulteren in een compressie die kan extra schade aan de SC veroorzaken. Verder het blootgestelde oppervlak van het ruggenmerg kan in direct contact met bloed en de bestanddelen en scherpe randen van de snede bot dat onnodig variabiliteit aan het experiment. De huidige PT model kunnen infarct met verschillende grootte en diepte worden door eenvoudige manipulatie van de intensiteit van de lichtbron, blootstellingsduur en oppervlak van het blootgestelde oppervlak. Hoewel de huidige studie opgewekte ischemie op het centrale gebied van T11 in de SC kan deze werkwijze ook infarcten op verschillende plaatsen langs rostraal naar caudaal en breedterichting van het ruggenmerg, die mig genererenht profiteren begrijpen van de regio-specifieke effect van ischemie op dwarslaesie. Anderzijds, hoewel de verlichting op het oppervlak van het ruggenmerg, kan het licht doordringen bepaalde diepte in het weefsel en het letsel kan ook veroorzaakt worden in de grijze materie. Als Rose Bengal wordt verdeeld gehele circulatiesysteem, indien de diersoort zijn hetzelfde, en de leeftijd en gewicht vergelijkbaar verwachten we consequent laesie worden gegenereerd zoals in corticale ischemie geïnduceerd door PT.
De andere grote voordeel van PT ischemie zeer lage sterfte onder de dieren. Lage sterfte betekent lange termijn overleving studies kunnen worden uitgevoerd, die nuttig zijn bij het ontrafelen van de werking van ischemische letsel op de overleving en de motorische functie herstel zou kunnen zijn. Dit model kan ook helpen bij het begrijpen van de cellulaire herstelmechanismen die gewoonlijk later tijdens de chronische fase van letsel 14,19,27-29. Dit model produceert ook aanzienlijke motorische functie tekorten die kunnen be gebruikt om de werkzaamheid van neurobeschermende middelen op functioneel herstel te evalueren. Bovendien zal dit model ook de studie van pathologische veranderingen na SCI zoals axonale degeneratie en regeneratie, neuronale en astrocytische Ca2 + signalering en overbelasting in levende muizen met behulp van twee-foton microscopie mogelijk.
Net als alle andere SCI modellen, PT is niet zonder nadelen. De nadelen van deze techniek is vergelijkbaar met die bij corticale PT. Enkele van de tekortkomingen omvatten ontbreken van een duidelijk anatomisch ischemische penumbra, die het voorwerp van vele neuroprotectieve drugs, en de afwezigheid van reperfusie. Het is bekend dat na ischemie reperfusie wordt gekenmerkt door veranderingen zoals verhoogde productie van reactieve zuurstof species, infiltratie van ontstekingscellen en verhoogde cytokineproductie 30-32. Gebrek aan reperfusie in PT betekent dat de veranderingen die gepaard gaan met reperfusie letsel bij SC zal moeilijk blijven om te bestuderen met behulp van dit model.De voordelen van het gebruik PT ischemie tegen de nadelen en deze techniek de onderzoekers een gemakkelijk uit te voeren en zeer reproduceerbaar model genereren SCI bij muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health [Grant niet. R01NS069726] en de American Heart Association Grant in Aid Grant [Grant niet. 13GRNT17020004] naar SD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000 | 20 mg/ml in sterile saline |
| C57BL/6J | Jackson lab | 664 | 22 - 25 g |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/ml |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 100 mg/ml |
| Betadine solution | Purdue | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline | Abott Laboratories | 04930-04-10 | For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Ethanol | Decon labs.Inc | 2716 | 70% ethanol for disinfection |
| Metal halide lamp | EXFO, Canada | X-Cite 120 PC | Set power at 12% |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Standard scalpel | Fine Science Tool | 10003-12 | for removing muscle |
| Scalpel blade | Feather | 2976 | No. 10 |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Tissue adhesive glue | 3M Vetbond | 1469SB | to adhere to edges of the cut skin |
| Monofilament polypropylene | USSC Sutures | VP-521 | Size = 4-0 (for fascia) |
| Perma-hand silk | Ethicon | 683G | Size = 4-0 (for skin) |
| Micro drill | Roboz Surgical Instrument Co. Inc. | RS-6300 | with bone polishing drill bit |
| Laser doppler flowmeter | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | for monitoring change in blood flow |
| Heating pad | Fine Science Tool | 21052-00 | to prevent hypothermia |
| Lab-Jack | Fisher scientific | 14-673-50 | 4 x 4 in plate to adjust the height of the animal |
| X-Y gliding stage | Amscope | GT100 | for positioning the animal under microscope |
References
- Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Young, W. Secondary injury mechanisms in acute spinal cord injury. J Emerg Med. 11, Suppl 1. 13-22 (1993).
- Crowe, M. J., Bresnahan, J. C., Shuman, S. L., Masters, J. N., Beattie, M. S. Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys. Nat Med. 3 (1), 73-76 (1997).
- Soubeyrand, M., et al. Effect of norepinephrine on spinal cord blood flow and parenchymal hemorrhage size in acute-phase experimental spinal cord injury. Eur Spine J. 23 (3), 658-665 (2014).
- Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (2012).
- Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis). Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
- Liu, X. Z., et al. Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cord injury. J Neurosci. 17 (14), 5395-5406 (1997).
- Liu, L., et al. An experimental study of cell apoptosis and correlative gene expression after tractive spinal cord injury in rats. Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 42 (23), 1434-1437 (2004).
- Hirose, K., et al. Activated protein C reduces the ischemia/reperfusion-induced spinal cord injury in rats by inhibiting neutrophil activation. Ann Surg. 232 (2), 272-280 (2000).
- Oyinbo, C. A. Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury: a nugget of this multiply cascade. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (2), 281-299 (2011).
- Guerit, J. M., Dion, R. A. State-of-the-art of neuromonitoring for prevention of immediate and delayed paraplegia in thoracic and thoracoabdominal aorta surgery). Ann Thorac Surg. 74 (5), S1867-S1869 (2002).
- Schepens, M. A., Heijmen, R. H., Ranschaert, W., Sonker, U., Morshuis, W. J. Thoracoabdominal aortic aneurysm repair: results of conventional open surgery. Eur J Vasc Endovasc Surg. 37 (6), 640-645 (2009).
- Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Exp Transl Stroke Med. 1, 8 (2009).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Busto, R., Watson, B. D. Photochemically induced cortical infarction in the rat. 1. Time course of hemodynamic consequences. J Cereb Blood Flow Metab. 6 (2), 184-194 (1986).
- Zhang, W., et al. Neuronal protective role of PBEF in a mouse model of cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (12), 1962-1971 (2010).
- Li, H., Zhang, N., Sun, G., Ding, S. Inhibition of the group I mGluRs reduces acute brain damage and improves long-term histological outcomes after photothrombosis-induced ischaemia. ASN Neuro. 5 (3), 195-207 (2013).
- Li, H., et al. Histological, cellular and behavioral assessments of stroke outcomes after photothrombosis-induced ischemia in adult mice. BMC Neurosci. 15, 58 (2014).
- Wang, T., Cui, W., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis. American Journal of Biomedical Sciences. 2 (1), 33-42 (2010).
- Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Non-invasive induction of focal cerebral ischemia in mice by photothrombosis of cortical microvessels: characterization of inflammatory responses. J Neurosci Methods. 117 (1), 43-49 (2002).
- Boquillon, M., Boquillon, J. P., Bralet, J. Photochemically induced, graded cerebral infarction in the mouse by laser irradiation evolution of brain edema. J Pharmacol Toxicol Methods. 27 (1), 1-6 (1992).
- Kim, G. W., Lewen, A., Copin, J., Watson, B. D., Chan, P. H. The cytosolic antioxidant, copper/zinc superoxide dismutase, attenuates blood-brain barrier disruption and oxidative cellular injury after photothrombotic cortical ischemia in mice. Neuroscience. 105 (4), 1007-1018 (2001).
- Schmidt, A., et al. Photochemically induced ischemic stroke in rats. Exp Transl Stroke Med. 4 (1), 13 (2012).
- Lang-Lazdunski, L., et al. Spinal cord ischemia. Development of a model in the mouse. Stroke. 31 (1), 208-213 (2000).
- Wang, Z., et al. Development of a simplified spinal cord ischemia model in mice. J Neurosci Methods. 189 (2), 246-251 (2010).
- Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. J Vis Exp. (76), (2013).
- Lu, H., et al. Induction and imaging of photothrombotic stroke in conscious and freely moving rats. J Biomed Opt. 19 (9), 96013 (2014).
- Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Front Neuroenergetics. 6 (1), (2014).
- Bell, M. T., et al. Toll-like receptor 4-dependent microglial activation mediates spinal cord ischemia-reperfusion injury. Circulation. 128 (11 Suppl 1), S152-S156 (2013).
- Smith, P. D., et al. The evolution of chemokine release supports a bimodal mechanism of spinal cord ischemia and reperfusion injury. Circulation. 126 (11 Suppl 1), S110-S117 (2012).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50 (4), 264-274 (2012).
