Summary
Фосфоинозитиды сигнализируют липиды, чья относительная численность быстро меняется в ответ на различные раздражители. Эта статья описывает метод измерения обилие фосфоинозитидов метаболически нумерующих клеток с 3 H-мио -inositol с последующей экстракцией и деацилирования. Извлеченные глицеро-inositides затем разделяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и количественно с помощью проточной сцинтилляции.
Protocol
Примечание: Приведенный ниже текст подробно описывает метод измерения PtdInsPs в дрожжах. Она обеспечивает экспериментальные данные для маркировки клеток дрожжей с 3 H-мио -inositol, добывающих и deacylating липидов и протокола ВЭЖХ-элюции для фракционирования и количественно деацилированный PtdInsPs. Пожалуйста, обратите внимание, что маркировка, деацилирования, разрешение и количественное PtdInsPs в клетках млекопитающих требуют оптимизации и длинные профили ВЭЖХ-элюирования. Эти детали могут быть найдены в других местах, хотя мы обсудим некоторые аспектов в обсуждении. В целом, методика для извлечения липидов, deacylate и извлечь водорастворимые GRO-InsPs из дрожжевого дается и показано на фиг.1.
1. Протокол для маркировки и Анализ PtdInsPs в дрожжах
- Клеточная культура и радиоактивной
- Выращивают жидкой культуральной 20 мл дрожжевого штамма SEY6210 при 30 ° С с постоянном встряхивании в полном синтетическихСМИ середины логарифмической фазы или оптической плотности при 600 нм (OD 600) приблизительно 0,6-0,7 с.
Примечание: Не используйте YPD СМИ, так как это может повлиять на 3 Н мио -inositol включение. Этот размер культура должна обеспечить достаточный материал для 2-3 ВЭЖХ трасс. - Гранул в общей сложности 10-14 OD дрожжевых клеток (обратите внимание, что 1 мл культуры с OD 600 = 1 содержит около 1x10 7 клеток) центрифугированием при 800 х г в течение 5 мин в 12 мл с круглым дном трубки. Ресуспендируют с 2 мл инозитол-среды, свободной (IFM) (см таблицу 1 для IFM состава).
- Повторите центрифугирования и аспирации средства массовой информации. Ресуспендируют гранул с 440 мкл IFM и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Добавить 60 мкл 3 H-мио -inositol (1 мкл = 1 мкКи) к каждому образцу и инкубировать при растущей температуре 30 ° С в течение от 1 до 3 ч с постоянном встряхивании.
Внимание: 3 Н мио -inositol является радиоактивным помощникриала, который должен быть обработан после соответствующей подготовки. Кроме того, все расходные материалы, которые делают контакт с 3 H-материал, содержащий должны быть утилизированы надлежащим образом и обозначается как радиоактивных отходов.
Примечание: Температура роста может быть изменен в соответствии с требованиями тех пор, пока все штаммы в сравнении выращивают при той же температуре. - Передача клеточной суспензии (500 мкл) в микроцентрифужных пробирку, содержащую 500 мкл 9% хлорной кислоты и 200 мкл кислоты промывали стеклянные шарики. Смешайте инверсии и инкубировать на льду в течение 5 мин.
- Vortex образца при максимальной скорости в течение 10 мин и передачи лизатов к новому трубки микроцентрифужных использованием гель-наливного наконечника, чтобы избежать стеклянные шарики.
- Гранул образца при 12000 х г в течение 10 мин при 4 ° С и аспирата супернатант.
- Ресуспендируют гранул путем обработки ультразвуком ванны в 1 мл охлажденного льдом 100 мМ EDTA. Гранул снова, как и прежде.
- Выращивают жидкой культуральной 20 мл дрожжевого штамма SEY6210 при 30 ° С с постоянном встряхивании в полном синтетическихСМИ середины логарифмической фазы или оптической плотности при 600 нм (OD 600) приблизительно 0,6-0,7 с.
- Деацилирование и добыча
- Аспирируйте ЭДТА и разрушать ультразвуком осадок в 50 мкл воды.
- Добавить 500 мкл реагента деацилирования и разрушать ультразвуком перемешать. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Тепловые липидов в течение 50 мин при 53 ° С в нагревательный блок. Сушат образцы полностью вакуумным центрифугированием в течение 3 ч или O / N.
- Убедитесь, что химическая ловушка устанавливается между вакуумной центрифуге-и вакуумным насосом, чтобы предотвратить попадание паров в воздухе.
- Ресуспендируют гранул с 300 мкл воды ванны ультразвуком и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин. Высушите образцы от вакуумного центрифугирования в течение 3 ч или O / N. Повторите этот шаг еще раз.
- Разрушать ультразвуком осадок с 450 мкл воды. Это водную фазу в процессе экстракции.
- Свежий подготовить 10 мл extractioп реагента добавлением 8,0 мл 1-бутанола, 1,6 мл этилового эфира и 0,40 мл этилового эфира муравьиной кислоты. Обратить перемешать.
- Добавить 300 мкл экстракционного реагента в водной фазе. Вихревой смесь на максимальной скорости в течение 5 мин и слои разделяют центрифугированием при максимальной скорости (18000 х г) в течение 2 мин.
- Собирают нижнюю водную фазу в новую пробирке, избегая при этом верхний органический слой, интерфейс и осадок. Повторите экстракцию водной фазы в два раза больше свежей экстракционной реагента.
- Полностью высушите собранную водный слой путем вакуумной центрифугирования. Дисперсные осадок в 50 мкл воды ванны ультразвуком.
- Добавьте 2 мкл каждого образца 4 мл сцинтилляционной жидкости в сцинтилляционный флакон 6 мл полиэтиленовую. Определить количество отсчетов (в КФМ) в каждом образце жидкой фазе, используя открытое окно.
- Не хранить образцы при -20 ° С до готовности для ВЭЖХ.
- Получают буфер A путем фильтрации 1 л воды высшей степени очистки с бутылкой сверху 0,22 мкм вакуум-фильтре с последующим дегазации.
- Получают буфер B, сделав 1 л раствора 1 М двухосновного фосфата аммония (APS, МВт 132,06) в воде и доведения рН до 3,8 с помощью фосфорной кислоты. Фильтр фосфат аммония с бутылкой сверху 0,22 мкм вакуум-фильтре с последующим дегазации.
- Соберите пузырек впрыска по оснащению 2 мл флакон с пружинным 250 мкл малого объема вставки. Загрузите 10 млн CPM и добавьте воду при общем объеме 55 мкл. Приготовьте чистый флакон с 55 мкл воды.
- Крышка флаконы с винтовой крышкой оборудованных с ПТФЭ / силиконовой перегородками (красный лицевой стороной внутрь флакона). Поместите каждый флакон в автоматической выборки лоток ВЭЖХ, начиная с пустой флакон.
- Используйте ВЭЖХ и соответствующее программное обеспечение, которое управляет буфера потока, дегазирует буферы и контролирует образец injectiна. Используйте онлайн сцинтиллятор потока и его соответствующее программное обеспечение для регулирования скорости потока искрящийся и контролировать сигнал на 3 Н-распада.
- Использование SAX жидкого хроматографическую колонку с размерами 250 мм х 4,6 мм и содержащую 5 мкм кремнезема смолы в ВЭЖХ. Экипировка столбец с колонки охранника, чтобы предотвратить введение примесей.
- Установите 3 Н-совместимого мобильного 500 мкл потока в сцинтиллятора потока.
Примечание: Фракционирование может быть сделано с Agilent 1200 серии бесконечности ВЭЖХ системы контролируемого программного обеспечения Chemstation или с другими коммерчески доступных систем ВЭЖХ. Поток мерцание ВЭЖХ элюента может быть сделано с сцинтиллятора β-RAM потока контролируемой с помощью программного обеспечения или другого Лаура коммерчески доступного сцинтиллятора потока или совместимого программного обеспечения.
- Инициализировать четвертичного насоса, при скорости потока 1,0 мл / мин с 100% -ным буфером А.
- Настройка профиля уравновешивания на ВЭЖХконтролировать градиент буферов А и В (называем это "Протокол равновесия"): 1% буфера В в течение 5 мин, 1-100% B в течение 5 мин, 100% B в течение 5 мин, 100-1% B в течение 5 мин, 1% B в течение 20 мин. Установите предел давления в 400 бар, 1,0 мл / мин скорости потока, и 30 мин во время выполнения.
- Настройте профиль элюции (рисунок 2) на ВЭЖХ контролировать градиент буферов А и Б (называют это "Протокол"): 1% B в течение 5 мин, 1-20% B в течение 40 мин, 20-100% В течение 10 мин, 100% B в течение 5 мин, 100-1% B в течение 20 мин, 1% B в течение 10 мин. Установите предел давления в 400 бар, 1,0 мл / мин скорости потока, и 90 мин во время выполнения.
- Настройка протокола обнаружения на сцинтиллятора потока (называем это "протокол обнаружения"), чтобы запустить в течение 60 мин при скорости потока текучей среды сцинтилляционного 2,5 мл / мин и времени выдержки 8,57 сек.
- Программирование автоматизированной последовательности впрыска на ВЭЖХ начать с воды заготовки на "Протокол для уравновешивания", а затем по электроннойACH радиоактивным изотопом пробы на "Протокол". Инициализировать последовательность, когда будете готовы.
- В то время как вращение сохраняется в протоколе уравновешивания создать партию на сцинтиллятора для измерения расхода всех образцах с "Протокол обнаружения." Инъекция каждого нового образца будет инициализировать "Протокол" на ВЭЖХ, а запуск сцинтиллятор потока, чтобы начать "Протокол обнаружения."
- По завершении всех трасс, промыть ВЭЖХ, колонка и сцинтиллятор течь со 100% буфера А в течение 30 мин при 1,0 мл / мин скорости потока.
- Используйте программное обеспечение Laura или любое другое программное обеспечение, которое может количественно спектры хроматографии. Шаги, описанные в этом разделе показаны на рисунке 3.
- Откройте файлы, нажав кнопку "Файл", "Открыть" и выберите файл исходных данных для каждого образца.
- На вкладке "хроматограммы", зоом, чтобы растянуть каждый из меньших пиков (около 1000 на счету [у-ось]), сохраняя разрешение по времени. Осмотрите каждого пика, если необходимо.
- Выделите каждый из пиков для анализа с помощью "Добавить ROI" инструмент. Определить пики по времени элюирования: Родительский GRO-Ins в 10 мин, Гро-Ins3P на 18 мин, Гро-Ins4P на 20 мин, Гро-Ins (3,5) P 2 на 29 мин и Гру-Ins (4,5 ) Р 2 при 32 мин.
- На вкладке "Регионы" таблицы, записывать "площадь (графов)» каждого пика. Обратите внимание на "Старт (мм: сс)" время и "конец (мм: сс)" времени каждого пика.
- Для вычитания фона, выделить области, примыкающей к вершине, охватывающей такое же количество времени. Вычитание число отсчетов из соответствующего пика.
- Нормализовать площадь каждого пика против родителей Гру-Ins (в виде "% от общего объема PtdIns"). Затем, нормализуют каждую из вершин в каждой экспериментальной состоянии по отношению к контрольной группы (в виде "п-кратно увеличение по сравнению с контролем ").
ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация каждого пика может быть сделано в отношении общего счета, но так как родительский Гру-Ins гораздо более обильные, чем всех других PtdInsPs результаты, как правило, похожи. - Экспорт данных для хроматографов, нажав кнопку "Файл", "Сохранить как ..." и выберите "CSV (разделенные запятой)" формат файла. Участок данных в электронной таблице и представить по мере необходимости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот метод, дрожжи PtdInsPs были метаболически метили с 3 H-мио -inositol. После маркировки, фосфолипиды осаждают хлорной кислотой, а затем фосфолипидов деацилирования и извлечения водорастворимого Gro-InsPs (фиг.1). На этом этапе важно, чтобы определить общую радиоактивный сигнал, связанный с извлеченной Гру-InsPs в жидкой фазе, чтобы обеспечить достаточное отношение сигнал-шум для очень низкой численности PtdInsPs как PtdIns (3,5) P 2; в общей сложности 5-10 млн тысячу показов следует вводить. Так дрожжевые клетки обладают только четыре PtdInsPs, разрешение может быть достигнуто с помощью способа элюирования 1 ч, как описано (рисунок 2).
Здесь дикого типа, atg18 А и vac14 А дрожжевые мутанты были помечены и обработаны для анализа изменений в PtdIns (3,5) P 2, THе мере в изобилии из PtdInsPs в дрожжевой 16,19,27. Как было отмечено на фиг.4А-С, профиле элюции для всех трех штаммов, полученных 3Н-ассоциированной пиков сигнала. Родительский пик Gro-Ins элюируется первой (8-9 мин; показанный на рисунке 3, но не на фиг.4, поскольку Gro-Ins затмевает сигнал фосфорилированных видов), затем GRO-Ins3P (~ 18 мин), тированных Ins4P (~ 20 мин), Гро-Ins (3,5) P 2 (~ 29 мин) и Гро-Ins (4,5) P 2 (~ 32: 00 мин), которые, соответственно, соответствует ацилированных фосфолипидов PtdIns, PtdIns3P, PtdIns4P, PtdIns (3,5) P 2 и PtdIns (4,5) P 2. Есть пара дополнительных незначительных пиков на 4 мин и один, который имеет тенденцию следовать сразу за родителей Гру-Ins (10 мин); это, вероятно, представляют инозит и не-glycerated инозитидного фосфатов (рисунок 3). Картина элюирования согласуется и характеристика, хотя точное время может варьироваться при использовании в сиситемахаренда систему ВЭЖХ и / или новый столбец.
Пик, связанный с PtdIns (3,5) P 2 (рис 4, красная стрелка) подвергается наиболее драматические изменения между дикого типа, atg18 А и дрожжевых штаммов vac14 б. По отношению к клеткам дикого типа (а), существует очень большой Gro-Ins (3,5) P 2 -associated сигнала в atg18 А клеток и меньшим пик vac14 А дрожжевых клеток. Для того, чтобы определить общую радиоактивный сигнал, связанный с каждым пиком, графы были объединены под площади пика (рис 3). Кроме того, поскольку абсолютное радиоактивного сигнала изменяется между образцами, родительских видов Gro модули использовали в качестве внутреннего контроля путем нормализации от него (можно также выбрать, чтобы нормализовать против общего счета). Делая это, данные показывают, что PtdIns (3,5) P 2 составляет лишь 0,07% от PtdIns в диких дрожжевых клеток типа, в то время как PtdIns (3,5) Р 2 соответствует 1,2% от родительских PtdIns в atg18 А клетки, или драматической 17-кратным увеличением PtdIns (3,5) P 2 по отношению к клеток дикого типа (рис 4А, Б и Г). Для сравнения, PtdIns (3,5) P 2 уровня был только 0,01% от сигнала PtdIns в VAC14 -deleted дрожжевые клетки, убыток в PtdIns (3,5) P 2 (рис 4C и D) 85%. В целом, эти измерения согласуются с опубликованными результатами, показывающими, что PtdIns (3,5) P 2 составляет около 0,1% от PtdIns в клетках дикого типа, 90% снижается в vac14 D, и от 10 до 20 раз выше в atg18 D клеток по отношению к клеток дикого типа 27,29.
Рисунок 1. Деацилирование и добыча 3 H-Gro-ИНСп. Радиоактивной липид осадок в хлорной кислоты промывают водным раствором ЭДТА. Это затем отсасывали и добавили деацилирование реагента и инкубировали при 53 ° С. Реакционную смесь деацилирование затем сушат в вакууме и промывали водой два раза, с последующим добавлением реагента экстракции. Это затем перемешивали, центрифугировали, и водную фазу собирают. Стадию экстракции повторяется три раза всего для удаления органических и нерастворимые примеси. Водорастворимый фракция (синий), которая включает в себя 3 H-Gro-ИНСп, затем высушивают в вакууме в регидратации и 60 мкл воды. Количество радиоактивности определяется в жидкой фазе (ПСК) и равные счету через образцов загружаются в ВЭЖХ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
<бр /> Рисунок 2. Градиент аммония фосфатного буфера для элюции 3 Н-Gro-InsP. постановлением GRO-ИНСп сильным анионообменной хроматографии зависит от применения фосфата аммония двухосновный рН 3,8 (Буфер В). Выбор градиента зависит от вида смеси Gro-ИНСп, доступных для разделения. Протокол используется для пробах дрожжей, которые обладают только четыре PtdInsPs. Разрешение каждого из четырех пиков достаточно с быстрым ростом (NH 4) 2 HPO 4 концентрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Руководствуясь инструкцией для анализа данных PtdInsP изобилии. Данные файлы загружаются на Лаура сoftware и оценивают визуально с помощью хроматографа (открытый по умолчанию). Использование "зума в" инструмент (а), увеличьте пиков (б). Выберите различные пики на хроматографе с использованием "добавить ROI" инструмент (с). На вкладке "область" стол (г), в результате чего все сведения из выделенных регионов интереса отображается как в одной таблице (е). Экспорт необработанных счетчиков каждого пика (F) и нормализовать каждый вид PtdInsP против родителей фосфатидилинозита (г) или против общего счета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. PtdIns (3,5) P 2 уровня в дикого типа и мутантных клеток дрожжей. Представительства хроматографы, показанные для потока мерцания экстрактаизд: 3 Н-Гро-InsPs от дикого типа (А), atg18 А (В), и vac14Δ (C) с использованием дрожжей штаммы Протокол. Исходным счету из регионов интереса, соответствующих GRO-Ins (3,5) Р 2 (стрелка) извлекаются из хроматографа и фона вычитается. Полученные значения сравниваются с дикого типа и выражается как кратное-изменения Gro-Ins (3,5) Р 2 уровня (D). Уровни и изменения в Гро-Ins (3,5) P 2 интерпретируются, чтобы показать уровни и изменения в исходных PtdIns (3,5) P 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Инозитол-свободные средства массовой информации (IFM) |
| 27,8 мМ (NH4) 2SO4 |
| 2% глюкозы |
| 0,01 мМ КН2РО4 |
| 1X Аминокислоты |
| 1X LPSM |
| 1X Микроэлементы |
| 5X Витамины |
| 10X Низкие фосфатные и сульфатные средства массовой информации (LPSM) |
| 9 мМ CaCl2 |
| 17 мм NaCl |
| 67 мМ КСl |
| Элементы 1,000X трассировки |
| 8 мМ борной кислоты |
| 250 мкМ CuSO4 |
| 602 мкМ К.И. |
| 1.23 мМ FeCl 3 |
| 2.65 мМ MnSO4 |
| 971 мкМ Na-молибдат |
| 2.48 мМ ZnSO4 |
| 500X Витамины |
| 4 мкМ биотин |
| 2.27 мкМ фолиевой кислоты |
| 1.62 мМ Ниацин |
| 729 мкМ п-аминобензойной кислоты |
| 973 мкМ Pryidoxine-HCl, |
| 266 мкМ рибофлавин |
| 593 мкМ тиамина-HCl, |
Таблица 1. Состав дрожжи инозитол-свободные средства массовой информации. Дрожжевые клетки метили с IFM, как базовые средства массовой информации должны быть дополнены с 3 Н- мио -inositol. Приготовьте 100 мл раствора IFM с использованием решений, указанную, Стерилизуйте фильтр, используя бутылку верхней вакуум-фильтра 0,22 мкм и магазин в РТ. Для подготовки низкой фосфат и сульфат СМИ (LPSM), генерировать решение 100 мл, используя указанные соли, фильтр стерилизации с использованием бутылку сверху вакуумного фильтра 0,22 мкм и магазин в РТ. Растворите указанные соли приготовить 1 л раствора 1,000x микроэлементов. Тщательно перемешать перед использованием и / или хранения аликвот при -20 ° С. Растворите указанные витамины подготовить 1 л 500x раствор витаминов. Тщательно перемешать перед использованием и хранить аликвоты при -20 ° С.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта статья подробно описывает экспериментальный протокол, необходимый для количественного клеточные уровни PtdnsPs с помощью ВЭЖХ связью потока мерцаний от дрожжей. Методика дает возможность обмена веществ маркировки PtdInsPs с 3 H-мио -inositol с последующей обработкой липидов и извлечения водорастворимого 3 Н-Gro-InsPs, ВЭЖХ фракционирование и анализа. Использование этого метода, относительные уровни PtdInsPs в клетках при различных условиях может быть количественно, как показано на PtdIns (3,5) P 2 дикого типа, vac14 D и D atg18 дрожжевых клеток (рисунок 4).
Есть ряд важных шагов и модификаций, которые могут быть сделаны, чтобы оптимизировать результаты и / или устранить. Одним из наиболее важных параметров для достижения надежной количественной оценки PtdInsPs это общее радиоактивных уровень сигнала. Как правило, инъекции 3-5 миллионов счетчиков в ВЭЖХ часто достаточно надежно количественно изменения в HiGher обилие видов PtdInsP, такие как PtdIns (4,5) P 2. Тем не менее, введение до 10 млн отсчетов может быть необходимо для количественного определения низших видов, таких как численности PtdIns (3,5) P 2. Есть различные параметры, которые могут повлиять на уровень радиоактивного сигнала достигается в том числе от общего числа клеток, используемых для приготовления образца, время маркировки и температуры, концентрации 3 Н-мио -inositol, скорость оборота PtdInsPs и эндогенного синтеза инозитол, который будет конкурировать с меченого инозит. Например, радиоактивной дрожжевые клетки для по крайней мере один раз в два раза позволяет метаболического включения 3 Н мио инозита в PtdInsPs, но расширение времени для маркировки мутантах дрожжей, которые растут медленнее или имеют более медленный метаболической активности может быть необходимо. Кроме того, протокол, описанный здесь использует диауксической реакции дрожжевой культуры, где клетки, выращенные в середины логарифмической фазы затем концентрируют FOг маркировка в течение одного времени удвоения. Тем не менее, можно уменьшить диауксической реакции путем маркировки клеток во время раннего и середины логарифмической фазы и более периодов времени, как это делалось раньше 32. При этом, эти авторы наблюдали более высокие уровни PtdIns (3) P, PtdIns (4) P и PtdIns (4,5) P 2, чем клеток, подвергающихся диауксической реакции 32.
Кроме того, маркировка период клетках млекопитающих может потребовать оптимизации, так как некоторые клетки млекопитающих, такие как RAW 264.7 макрофагов линии удваивает каждые 12 ч, в то время как другие могут разделить гораздо медленнее, или как в случае нейронов, вообще не 20,35,39. Кроме того, можно увеличить концентрацию 3 H-мио -inositol достичь идеального радиоактивный уровень сигнала. Тем не менее, обратите внимание, что некоторые 3 Н мио -inositol упакован в 90% -ном этаноле; добавление чрезмерного 3 Н мио -inositol будет увеличить содержание этанола в средствах массовой информации и может иметь непреднамеренные EffeКТ на клетки. Наконец, длительное радиоактивной может также голодать клетки инозит. Это особенно очевидно в культуре клеток млекопитающих, где полная DMEM, содержащей 40 мкМ мио -inositol, по сравнению с 0,5 мкМ 3 H-мио -inositol, когда помечены 10 мкКи / мл. Таким образом, в случае необходимости, простым увеличением числа клеток млекопитающих в ходе маркировки рекомендуется.
Клеточные лизиса и обработки липидов шаги также имеют важное значение для получения оптимального выхода, а также поддержания здоровья колонке ВЭЖХ. Лизис хлорной кислотой позволяет осаждения липидов и других макромолекул, метод впервые применен для культуры ткани, а затем используется для дрожжей 28,33. По сравнению с экстракцией общих липидов с использованием традиционного метанол / HCl / способ хлороформ, использование хлорной кислоты повышает восстановление PtdInsPs, в том числе PtdIns (3,5) P 2, с меньшим изменением между экспериментами 28. Субсеквенции применение метиламина разбивает эфирных связей между глицеринового остова и двух гидрофобных цепей ацил, оставляя водорастворимого Gro-ИНСп чтобы подвергнуть разделению фаз из свободных жирных кислот и липидов интактных 28,34. Особое внимание должно быть принято, чтобы избежать нежелательных Перенос органических растворителей и нерастворимого материала во время стадии экстракции. Это может засорить систему, вызывают скачков давления и / или химически повредить колонки. Кроме того, столбец должен быть выдержаны при начале каждого дня, подвергая столбца в высокой концентрации фосфата аммония (буфер B) перед использованием; Таким образом, короткий протокол "Уравновешивание" используется перед запуском экспериментальных образцов. Отказ сделать этот шаг, кондиционирования результаты с задержкой профиль элюции пиков Гру-InsPs в первом экспериментальном образце, который запускается.
Есть несколько ключевых моментов, связанных с анализом и количественной рассмотреть, как хорошо. Во-первых, дuantification сам должен быть интеграция сигнала и площади каждого пика, а не только высота пика. Кроме того, внутренний контроль, как правило, необходимо, потому что абсолютное интеграция сигнала для каждого пика могут существенно различаться между образцами и экспериментов без отражает изменение PtdInsP изобилии в клетке. Родительский пик Гру-Ins, как правило, используется в качестве внутреннего контроля по нормализации каждый пик Гру-ИНСп против него. Пик Гру-Ins, как правило, имеет почти 90% радиоактивного сигнала и не меняются между условиями. Кроме того, можно выбрать, чтобы нормализовать против общего счета, особенно если подозревает, что родительские PtdIns страдает значительное изменение в экспериментальных условиях. Наконец, для малых PtdInsPs численности, вычитание фона рекомендуется определяя рядом не-пиковый область с тем же "масштабе времени" как пик интереса (рис 3D).
Один окончательного рассмотрения относится канализ образцов млекопитающих, которые обладают семь видов PtdInsP, в том числе три моно-фосфорилированных и три бис-фосфорилированные видов. К сожалению, трудно полностью решить PtdIns4P от PtdIns5P и PtdIns (3,5) P 2 PtdIns из (3,4) P 2 в образцах млекопитающих, в результате сиамских двойных вершин. Есть несколько методов ранее опубликованные, которые увеличивают разрешение этих пиков. Как правило, это связано с изменением длины элюирования, исходной концентрации фосфата аммония буфера, скорость и шаги, с помощью которых фосфат аммония изменения концентрации буфера в течение профиле элюции и рН буфера фосфата аммония 33,35-38. Возможно, самый успешный метод, разработанный для отдельных PtdIns (4) P и PtdIns (5) Р недавно описан Sarkes и Rameh 39, на которых занято два тандемных колонки SAX и аммониевую фосфатного буфера при рН 6,0.
Как и в большинстве методов, с помощью ВЭЖХ-сoupled течь мерцаний для количественного PtdInsPs в клетках имеет свои преимущества и недостатки по сравнению с другими существующими методами. Например, на сайте мерцаний поток в сочетании ВЭЖХ предлагает живую-обнаружение GRO-InsPs но ограничивает время сцинтилляционного, уменьшая чувствительность этого метода. В качестве альтернативы, ВЭЖХ элюент может быть фракции собирали с-автоматической пипетки вместо подачи в сцинтиллятора потока. Ручные фракции затем могут быть считаны с помощью жидкостном сцинтилляционном счетчике офф-лайн в течение более длительных периодов времени, таким образом, предлагают более высокую чувствительность - тем не менее, этот подход требует много больше времени и затрат труда и снижает разрешение в зависимости от количества собранных фракций 38,40 , Кроме того, анализ целых клеток однозначно измеряет уровни конкретного PtdInsP, но это не будет информировать об изменениях в субклеточном распределении этой PtdInsP, хотя можно было бы пара поток мерцаний в субклеточных методов фракционирования как Previouпотихоньку делается 39. Для сравнения, на основе FP-PtdInsP-связывающие домены могут быть использованы, чтобы исследовать расположение и динамика видов PtdInsP в клетке, но также может связываться с другими, чем целевой PtdInsP факторов. Кроме того, способ, описанный здесь, упрощает анализ уровней PtdInsP, устраняя ацильные цепи, что значительно увеличивает молекулярную разнообразие PtdInsPs. Но по той же причине, что это также является ключевым недостатком, так как деацилирование липидов приводит к потере структурной информации о ацильной цепи, недооцененным аспектом PtdInsP сигнализации 41,42. Если это вызывает большую озабоченность, то жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ЖХ-МС) следует использовать 14,17. Тем не менее, в настоящее время трудно одновременно анализировать все виды PtdInsPs ЖХ-МС 43. Таким образом, сочетание методов является лучшим подходом для того, чтобы исследовать местоположения, динамику, молекулярное разнообразие и уровень всех семи PtdInsPs видов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol | Biobasic | BC1800 | Reagent grade |
| Ammonium phosphate dibasic | Bioshop | APD001 | ACS grade |
| Ammonium sulfate | Biobasic | ADB0060 | Ultra Pure grade |
| Autosampler | Agilent | G1329B | Agilent 1260 infinity series |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Boric acid | Biobasic | BB0044 | Molecular biology grade |
| Calcium Chloride | Biobasic | CT1330 | Ahydrous, industrial grade |
| Calcium pantothenate | Sigma | C8731 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma | 451657 | Anhydrous |
| D-Glucose | Biobasic | GB0219 | Anhydrous, biotech grade |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | Life | 11995-065 | With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | Acid free, ultra pure grade |
| Ethyl ether | Caledon labs | 1/10/4700 | Anhydrous, reagent grade |
| Ethyl formate | Sigma | 112682 | Reagent grade |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-450 | US origin, premium quality, heat inactivated |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed | Life | 26400044 | US origin |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Scintillation fluid for flow scintillation |
| Folic acid | Biobasic | FB0466 | USP grade |
| HEPES buffer solution | Life | 15630080 | 1 M solution |
| Inositol, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 ethanol to water |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Life | 51500056 | 100x solution |
| Iron(III) chloride | Sigma | 157740 | Reagent grade |
| Laura - Chromatography data collection and analysis software | LabLogic Systems Ltd | Version 4.2.1.18 | Flow scintillator software |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | Anhydrous |
| Manganese sulfate | Biobasic | MB0334 | Monohydrate, ACS grade |
| Methanol | Caledon labs | 6701-7-40 | HPLC Grade |
| Methylamine solution | Sigma | 426466 | 40% (v/v) |
| Monopotassium phosphate | Biobasic | PB0445 | Anhydrous, ACS grade |
| Nicotinic acid | Biobasic | NB0660 | Reagent grade |
| OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | HPLC software |
| p-aminobenzoic acid (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Free acid |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | 100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | ACS reagent, 70% |
| PhenoSpher SAX column | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm |
| Phosphoric acid | Caledon labs | 1/29/8425 | Reagent grade |
| Potassium Chloride | Biobasic | PB0440 | ACS grade |
| Potassium iodide | Biobasic | PB0443 | ACS grade |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| Quaternary pump | Agilent | G1311C | Agilent 1260 infinity series |
| Riboflavin | Bioshop | RIB333.100 | USP grade |
| Sodium Chloride | Biobasic | DB0483 | Biotech grade |
| Sodium molybdate | Sigma | 243655 | |
| Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316A | Agilent 1260 infinity series |
| Thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 | Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Scintillation coctail for liquid scintillation counting |
| Zinc sulfate | Biobasic | ZB2906 | Heptahydrate, reagent grade |
| β-RAM 4 | IN/US systems | Model 4 | Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer |
References
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Bridges, D., Saltiel, A. R.
- Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
- Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
- Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
- Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
- Lemmon, M. A.
- Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
- Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
- Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
- Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
- Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
- Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
- Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
- Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
- Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
- Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
- Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
- Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
- Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
- Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
- Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
- Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
- Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
- Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
- Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
- Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
- Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
- Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
- Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
- Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
- Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
- Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
- McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
- Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
- Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
- Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
- Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
- D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
- Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
- Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).
