Summary
Fosfoinosititler nispi bolluk hızlıca, çeşitli uyarılara cevap olarak değişen lipidleri işaret ediyor. Bu makalede, ekstre etme ve Deaçillendirme ardından 3 H, miyo -inositol ile metabolik etiketlenmesi hücreleri tarafından fosfoinositidlerde bolluğunu ölçmek için bir yöntem tarif edilir. Çıkarılan glisero-inositides daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayrılmıştır ve akış sintilasyon ile nicelendirilir.
Protocol
Not: Metin aşağıda ayrıntılı olarak mayada PtdInsPs ölçmek için bir yöntem tarif edilir. Bu etiketleme maya 3 H myo -inositol ile hücrelerin ayıklanması ve deacylating lipit ve damıtmak ve asillendirilmemiş PtdInsPs ölçmek için HPLC-elüsyon protokolü için deneysel ayrıntıları sağlar. Optimizasyonu ve uzun HPLC-elüsyon profilleri gerektiren memeli hücrelerinde PtdInsPs bu etiketleme, deasılasyonunu, çözünürlük ve miktarının unutmayınız. Biz Tartışma yönlerini bazı tartışmak rağmen bu detaylar, başka bir yerde bulunabilir. Genel olarak, yöntem yağ, deasilize özü ve maya verilmiş ve Şekil 1 'de gösterilmiş olup, suda çözünür Gro-InsPs çıkartma özelliğine sahiptir.
Maya Etiketleme ve Analiz PtdInsPs 1. Protokol
- Hücre kültürü ve Radyoetiketleme
- Sabit tam bir sentetik içinde sallanarak 30 ° C 'de, maya soyu SEY6210 bir 20 ml sıvı kültür büyütünorta log fazı veya yaklaşık 0.6-0.7, 600 nm (OD 600) de optik bir yoğunluğa kadar ortam.
Not: Bu 3 H myo -inositol dahil edilmesini etkileyebilir olarak YPD ortamları kullanmayın. Bu kültür boyutu 2-3 HPLC çalışmaları için yeterli malzeme temin etmelidir. - Maya hücrelerinin 10-14 OD toplam pelet 12 ml 5 dakika yuvarlak tabanlı tüp 800 x g'de santrifüj ile (OD 600 = 1 olan 1 ml kültür ~ 1x10 7 hücreleri ihtiva etmesi gerekir). Inositolsüz ortama (IFM) 2 ml yeniden süspanse edin (IFM bileşim için tablo 1 e bakınız).
- Santrifüj tekrarlayın ve medya aspire. IFM 440 ul ile pelet yeniden süspanse edin ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- Her bir örnek için 3 H, miyo -inositol (1 ul = 1 uCi) 60 ul ekle ve sürekli çalkalanarak 1 ila 3 saat boyunca 30 ° C'de artan sıcaklığında inkübe edin.
Dikkat: 3 H myo -inositol radyoaktif bir arkadaşıUygun eğitimden sonra ele alınmalıdır riyali. Buna ek olarak, 3H-içeren malzeme ile temas tüm sarf uygun şekilde atılmalıdır ve radyoaktif atık madde olarak belirlenmiş.
Not: büyüme sıcaklığı değiştirilebilir olduğu sürece, tüm suşlar aynı sıcaklıkta büyütülür karşılaştırılabilir şekilde gerektiği gibi. - % 9 perklorik asit 500 ul ve asit 200 ul içeren bir mikrosantrifüj tüp hücre süspansiyonu (500 ul) aktarın cam boncuk yıkanır. Ters çevirme ile karıştırın ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- 10 dakika boyunca en yüksek hızda örnek Vortex ve cam boncuk önlemek için bir jel yükleme ucunu kullanarak yeni bir mikrosantrifüj tüpüne lizatları aktarın.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de örnek Pelet ve süpernatan aspire.
- Buz soğukluğunda 100 mM EDTA, 1 ml banyo sonikasyon ile pelletini. Daha önce olduğu gibi yine pelet.
- Sabit tam bir sentetik içinde sallanarak 30 ° C 'de, maya soyu SEY6210 bir 20 ml sıvı kültür büyütünorta log fazı veya yaklaşık 0.6-0.7, 600 nm (OD 600) de optik bir yoğunluğa kadar ortam.
- Deaçillendirme ve çıkarma
- EDTA aspire su 50 ul pelet sonikasyon.
- Deasilasyon reaktif 500 ul ekleyin ve karıştırın ses dalgalarına maruz. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Isı bloğu 53 ° C'de 50 dakika boyunca ısı lipidleri bulunmaktadır. 3 saat ya da O / N üzerinde vakum santrifüj tamamen örnekleri kurulayın.
- Kimyasal tuzak vakum santrifüj ve havanın girmesini buharları engellemek için vakum pompası arasına yüklü olduğundan emin olun.
- Banyo sonikasyon ile suyun 300 ul ile pelet yeniden süspanse edin ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. 3 saat ya da O / N vakum santrifüj örnekleri kurulayın. Bir kez daha bu adımı yineleyin.
- Su 450 ul ile pelet sonikasyon. Bu ekstraksiyon sırasında sulu bir fazdır.
- Taze extractio 10 ml hazırlamak8,0 etil eter 1-bütanol ml, 1.6 ml etil format içinde 0,40 ml ekleyerek n reajanı. Karıştırmak için ters çevirin.
- Sulu faza ekstre edici reaktif 300 ul ekle. Vorteks 5 dakika boyunca en yüksek hızda karışım, ve 2 dakika boyunca en yüksek hızda (18,000 xg) santrifüj ile tabakalar ayrılır.
- Üst organik katman, arayüz ve pelet kaçınarak yeni bir mikrofüj tüpü içine alttaki sulu tabakayı toplayın. Taze bir ekstraksiyon reaktifi ile, iki kez daha sulu fazın ekstraksiyonu tekrarlayın.
- Tamamen vakum santrifüj ile toplanır, sulu tabaka kurutulur. Banyo sonikasyon ile su 50 ul pelet dağıtılır.
- Bir 6 ml polietilen parıldamalı cam şişe içine sintilasyon sıvısı 4 ml Her numunenin 2 ul ekleyin. Açık bir pencere kullanılarak sıvı titreşimi ile her bir numunede (CPM olarak) sayımının sayısını belirler.
- HPLC için hazır olana kadar -20 ° C'de örnekleri saklayın.
- Gaz alma, ardından bir şişe en 0,22 um vakum filtresi ile ultra saf su 1 L filtre edilerek A tamponu hazırlayın.
- Su içinde 1 M amonyum fosfat dibazik (APS, MW 132,06) içindeki bir 1 L çözelti yaparak tampon B hazırlayın ve fosforik asit ile 3.8 pH ayarlamak. Gaz alma tarafından izlenen bir şişe üst 0.22 mikron vakum filtresi ile amonyum fosfat Filtre.
- Yaylı 250 ul küçük hacimli eki Şişeyi ml bir 2 donatım enjeksiyon flakon birleştirin. 10000000 'yi yükleyin ve 55 ul toplam hacim su ilave edilir. Su 55 ul boş şişe hazırlayın.
- PTFE / silikon septa ile donatılmış vidalı kapaklı şişeleri (kırmızı yan şişenin içine bakan) Cap. Boş flakon ile başlayan HPLC otomatik örnekleme tepsiye her flakon yerleştirin.
- Tampon akışını kontrol tamponlar ve kontroller numune Injecti gazı giderildi bir HPLC ve ilgili yazılımını kullanınüzerinde. Scintillant akış hızını düzenleyen bir çevrimiçi akış sintilatör ve ilişkili yazılımı kullanın ve 3 H-çürüme sinyalini izlemek için.
- 250 mm x 4,6 mm boyutlarında ve HPLC 5 um silika reçine ihtiva eden bir SAX sıvı kromatografi sütunu kullanın. Kirleticilerin enjeksiyon önlemek için bir sütun bekçi ile sütun kıyafeti.
- Akış sintilatör bir 3 'H-uyumlu bir 500 ul akış hücresi takın.
Not: Fraksiyonasyon Chemstation yazılımı ile ya da başka ticari olarak temin edilebilir HPLC sistemi ile kontrol edilen bir Agilent 1200 serisi HPLC sistemi sonsuz ile yapılabilir. HPLC yıkama sıvısı akışı sintilasyon Laura yazılım veya başka bir ticari olarak kullanılabilir akış sintilatör veya uyumlu yazılımı tarafından kontrol edilen bir β-RAM akış sintilatör ile yapılabilir.
- % 100 tampon A ile 1.0 ml / dk'lık bir akış oranında, kuaterner pompa başlatma
- HPLC bir dengeleme profili kurmak5 için 5 dakika, 100-1% B için 5 dakika,% 100 B için 5 dakika, 1-100% B% 1 Tampon B: Tampon A ve B degrade ("A dengeleme Protokolü" diyorlar) kontrol etmek için dk, 20 dakika boyunca,% 1 B. 400 bar, 1.0 ml / dk bir akış oranında, 30 dakika çalışma süresi basınç limiti ayarlayın.
- Tamponlar A ve B degrade (bu "Protokol A" diyoruz) kontrol etmek için HPLC üzerinde bir elüsyon profili (Şekil 2) ayarlayın: 40 dakika 5 dakika,% 1-20 B için% 1 B,% 20-100 10 dakika boyunca 20 dakikada, 1% B 5 dakika,% B 100-1 10 dakika% 100 B B. 400 bar, 1.0 ml / dk bir akış oranında, 90 dakika çalışma süresi basınç limiti ayarlayın.
- Akış sintilatör bir algılama protokol 2.5 ml / dk'lık bir akış oranında sintilasyon sıvısı ve 8,57 saniye bekleme süresi ile, 60 dakika boyunca çalışması için (bu "Protokolü bir tarama" olarak adlandırır) ayarlayın.
- E, ardından su boş "Protokolün Bir denge" ile başlayan HPLC üzerinde otomatik bir enjeksiyon dizisi Programıach "Protokol A" konulu örneği radiolabelled. Hazır olduğunuzda dizisi başlatılamıyor.
- Çalışma dengeleme protokolü hala iken, numunelerin ölçmek için akış sintilatöre bir toplu oluşturmak "Protokolün A algılama." Başlamak için akış sintilatör tetikleme yaparken her yeni numune enjeksiyon HPLC "Protokol A" başlatmak olacaktır "Bir algılama Protokolü."
- Bütün çalışmalarda tamamlanmasından sonra, HPLC, kolon temizleme ve 1.0 ml / dk bir akış oranında 30 dakika boyunca% 100 Tampon A ile sintilatör akar.
- Laura yazılımı veya kromatografi spektrumları ölçmek için başka bir yazılım kullanın. Bu bölümde tarif edilen adım, Şekil 3 'de gösterilmiştir.
- "Dosya", "Aç" tıklayarak dosyaları açmak ve her numune için ham veri dosyasını seçin.
- "Kromatogramları" sekmesinde, zoom de daha az zirveleri (1000 sayımı [y ekseni]) saat çözünürlüğü koruyarak her germek için. Gerekirse, her bir zirve içine büyüt.
- "Yatırım getirisi Ekle" aracını kullanarak analiz zirvelerin her vurgulayın. (4,5 29 dakika ile 20 dakika, Gro-Ins (3,5) P 2 18 dakika, Gro-Ins4P 10 dakika, Gro-Ins3P de Ebeveyn Gro-ins ve Gro-In: elüsyon zaman doruklarına tespit 32 dk) P 2.
- "Bölgeler tabloları" sekmesinde, her tepe "alanına (sayar)" kaydedin. Zamanı ve "end (mm: ss)" Her tepe zamanı: "(ss mm) başlatın" unutmayın.
- Arka plan çıkarma için aynı süreyi kapsayan zirveye bitişik bir bölge vurgulayın. Karşılık gelen tepe noktasından sayıyı çıkarın.
- ("Toplam PtdIns% 'si" olarak ifade edilen) ebeveyn Gro-Ins karşı her tepe alanını Normale. Ardından, "n olarak ifade kontrolü duruma karşı her deneysel koşul (piklerin her normalleştirmekkat artış) "kontrol grubuna göre.
Not: her bir tepe noktasının normalizasyonu aynı zamanda toplam sayısı ile de yapılabilir, ancak ebeveyn Gro-Ins çok daha bol diğer PtdInsPs daha çünkü benzer sonuçlar elde olma eğilimindedir. - "... Olarak kaydet", "Dosya" düğmesine basarak kromatografları için veri ihracat ve tercih dosya biçimi "CSV (virgülle ayrılmış)". Bir tablo üzerinde veri arsa ve gerektiğinde sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntemi kullanarak, maya PtdInsPs metabolik 3H-miyo -inositol ile etiketlenmiştir. Etiketlemeden sonra, fosfolipid fosfolipid Deaçillendirme ve suda çözülebilen Gro-InsPs (Şekil 1) ekstre, perklorik asit ile çöktürülmüştür. Bu aşamada, bu PtdIns gibi, çok düşük yoğunluklu PtdInsPs için yeterli bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için sıvı skintilasyonu ile ekstre Gro-InsPs ile ilişkili toplam radyoaktif sinyal ölçmek için önemlidir (3,5) P2; 5-10.000.000 BGBM'lere toplam enjekte edilmelidir. Maya hücreleri sadece dört PtdInsPs sergilemediğinden (Şekil 2) tarif edildiği gibi, çözünürlüğü 1 saat elüsyon yöntemi ile elde edilebilir.
Δ ve vac14 Δ maya mutantları, etiketlenmiş ve işlenmiştir atg18 Burada, vahşi tipli, PtdIns değişiklikleri (3,5) P 2, th analize maya 16,19,27 içinde PtdInsPs en bol. Şekil 4A-C, 3 'H-bağlantılı sinyal pikleri üretilen her üç suşlar için elüsyon profiline gözlendiği gibi. Ebeveyn Gro-Ins pik önce süzüldü (8-9 dakika; Şekil 3'te gösterildiği gibi, ancak Gro-Ins fosforile türlerin sinyali gölgeleyen yana Şekil 4'te) Gro-Ins3P (~ 18 dakika), GRO, ardından sırası ile asile fosfolipidler PtdIns karşılık gelir: (00 dak ~ 32), Ins4P (~ 20 dakika), Gro-In (3,5) P2 (~ 29 dakika) ve Gro-In (4,5) P2 PtdIns3P, PtdIns4P, PtdIns (3,5) P2 ve PtdIns (4,5) P2. 4 dakika ve hemen üst Gro-Ins (10 dk) takip etme eğilimi bir ek küçük zirveleri bir çift vardır; Bu büyük olasılıkla inositol ve olmayan glycerated fosfatların inositide (Şekil 3) temsil etmektedir. Elüsyon desen farklılık sorumluluk yönün kullanıldığında tam zamanı değişebilir olsa tutarlı ve karakteristikHPLC sistemi ve / veya yeni bir sütun kira.
PtdIns (3,5) P2 (Şekil 4, kırmızı ok) ile ilişkili pik ö ve vac14 Δ maya suşları atg18 yabani tip arasındaki en dramatik bir değişime uğrar. Yabani tip hücrelerin (A) ile karşılaştırıldığında, çok büyük bir Gro-In (3,5) P2 atg18 Δ hücrelerinde -associated sinyali ve vac14 Δ maya hücrelerinde daha küçük bir tepe vardır. Her bir zirve ile ilişkili toplam radyoaktif sinyal ölçmek için, sayım tepe (Şekil 3) alanı altında entegre edilmiştir. Mutlak radyoaktif sinyal numuneleri arasındaki farklılık İlave olarak, ebeveyn Gro-In türleri (bir de toplam sayım karşı normalize seçebilir) karşı normalize ederek, bir iç kontrol olarak kullanıldı. Bu şekilde, veriler, PtdIns (3,5) P2, yabani tip maya hücrelerinde PtdIns sadece% 0.07 oranında teşkil düşündürmektedir PtdIns ise (3,5) P 2 atg18 Δ hücrelerinde ebeveyn PtdIns veya PtdIns dramatik bir 17-kat bir artış (3,5) P vahşi tür hücrelerinde (Şekil 4A, B ve D) 2 göre% 1.2 tekabül etmektedir. Buna karşılık, PtdIns (3,5) P2 seviyeleri VAC14 bölgesindeki PtdIns sinyalinin sadece% 0.01 maya hücreleri, PtdIns (3,5) P2 (Şekil 4C, D) 'de bir% 85 kayıp -silinmesi idi. Genel olarak, bu ölçümlerin PtdIns (3,5) P2, vahşi tür hücrelerinde PtdIns yaklaşık% 0.1 olduğunu gösteren yayınlanan sonuçlarla uyum içindedir,% 90 vac14 D azalır ve atg18 D hücrelerinde yüksek 10-20 misli vahşi tür hücrelerinde 27,29 göre.
Şekil 1. Açılsızleştınne ve 3 H-Gro-INSP çıkarma. Radyoaktif lipiperklorik asit d Çökelti EDTA sulu çözeltisi ile yıkanır. Bu, daha sonra aspire edildi ve deasilasyon reaktifi ilave edildi ve 53 ° C'de inkübe edilir. Ara ürünü elde edilir, reaksiyon karışımı, ekstraksiyon reaktifi ilave edilir, daha sonra vakum altında kurutularak ve iki kere su ile yıkanmıştır. Bu, daha sonra, girdaplanır santrifüjlenmiş ve sulu faz toplanır edilir. Ekstraksiyon adımı üç kez organik ve çözünmeyen kirlilikleri uzaklaştırmak için toplam tekrarlanır. 3H-Gro-Insp içeren suda çözünür bir kesri (mavi), daha sonra da kurutulmuş ve suda 60 ul ile yeniden ıslatılmıştır, vakum altında. Radyoaktivite miktarı sıvı sintilasyonuyla (CPM) ve numunelerin arasında eşit sayar HPLC yüklenir tarafından belirlenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
<kuvvetli anyon değiştirme kromatografisi ile br /> Şekil Gro-Insp 3 'H-Gro-İNSPİRASYON. Çözünürlük elüsyon için amonyum fosfat tampon 2. Eğim amonyum fosfat dibazik, pH 3.8 (Tampon B) uygulanmasına bağlıdır. Gradyan seçimi ayırma işlemi için Gro-İNSPİRASYON türün karışımının bağlıdır. Protokol A dört PtdInsPs sahip maya örnekleri için kullanılır. Dört doruklarına her Çözünürlük hızlı bir artışa (NH 4) 2 HPO 4 konsantrasyonu ile yeterlidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. PtdInsP bolluğu veri analizi için talimat Rehberli. Veri dosyaları Laura s yükleniroftware ve görsel kromatograf (varsayılan olarak açık) kullanılarak değerlendirildi. Aracı "zoom kullanma" (a), zirveleri büyütmek (b). "Yatırım getirisi eklemek" aracını (c) kullanarak kromatografıyla farklı doruklarına seçin. "Bölge tablosu" sekmesinde (d), faiz vurgulanan bölgelerden ortaya çıkan bilgiler, tek bir tablo (e) olarak görüntülenir. Her tepe (f) ham sayımları İhracat ve ebeveyn fosfatidilinozitol karşı her PtdInsP türleri (g) normalize veya toplam sayısı karşısında. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. PtdIns (3,5) P, vahşi tip ve mutant maya hücrelerinde 2 kat. Örnek kromatograflar özü akış sintilasyon gösterilmektedirProtokol A kullanılarak ed 3 yabani tip H-Gro-InsPs (A), ö atg18 (B) ve vac14Δ (C) maya cinsleri. Gro-Ins karşılık gelen ilgi bölgelerinden ham sayımları (3,5) P 2 (ok) çıkarılır kromatografa ve arka plan çıkarılır. Ortaya çıkan değerler, yabani tip ile karşılaştırıldığında ve kat-değişim Gro-Ins (3,5) P 2 düzeyleri (D) olarak ifade edilmiştir. Düzeyleri ve değişiklikler Gro-Ins (3,5) P 2 orijinal PtdIns (3,5) P 2 seviyeleri ve değişiklikleri göstermek için yorumlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Inositol-ücretsiz medya (IFM) |
| 27,8 mM (NH4) 2SO4 |
| % 2 Glukoz |
| 0.01 mM KH2PO4 |
| 1X Amino asitler |
| 1X LPSM |
| 1X İz elementler |
| 5X Vitaminler |
| 10X düşük fosfat ve sülfat ortam (LPSM) |
| 9 mM CaCl2 |
| 17 mMNaCl |
| 67 mM KCI |
| 1,000X Eser elementler |
| 8 mM Borik asit |
| 250 uM CUSO4 |
| 602 uM KI |
| 1.23 mM FeCl3 |
| 2.65 mM MnSO4 |
| 971 uM Na-molibdat |
| 2.48 mM ZnSO4 |
| 500X Vitaminler |
| 4 uM Biotin |
| 2.27 uM Folik asit, |
| 1.62 mM Niasin |
| 729 uM p-aminobenzoik asit |
| 973 uM Pryidoxine-HCl |
| 266 uM Riboflavin |
| 593 uM Tiamin-HCl |
Baz medya 3'ün H myo -inositol ile takviye edilecek şekilde maya inositol-ücretsiz medya. Maya hücreleri Tablo 1. Bileşimi IFM ile radyo vardır. Belirtilen çözeltiler kullanılarak IFM 100 ml'lik bir çözelti hazırlayınFiltre oda sıcaklığında bir şişe üst 0.22 mikron vakum filtresi ve mağaza kullanarak sterilize edin. Düşük fosfat ve sülfat ortamı (LPSM) hazırlamak için, gösterilen tuzları kullanılarak 100 ml'lik bir çözelti oluşturmak filtre oda sıcaklığında bir şişe en 0,22 um, vakum filtresi ve deposunu kullanan sterilize edin. Eser elementlerin, bir 1 L'lik 1,000x solüsyonu hazırlamak için belirtilen tuzlar çözülür. -20 ° C'de kullanımı ve / veya mağaza alikotları önce iyice karıştırınız. 1 L'lik bir 500x vitamini solüsyonu hazırlamak için belirtilen vitaminler çözülür. -20 ° C'de kullanımı ve mağaza alikotları önce iyice karıştırınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makale mayadan HPLC-birleştiğinde akış skintilasyonu ile PtdnsPs hücresel seviyelerini ölçmek için gerekli olan deneysel protokol ayrıntıları. Yöntem, lipid işleme ve suda-çözünür, 3H-Gro-InsPs, HPLC ile ayrılması ve analiz ekstre 3H-miyo -inositol sahip PtdInsPs, metabolik etiketleme sağlar. PtdIns (3,5), yabani tip, vac14 D ve D atg18 Maya hücreleri (Şekil 4) 'de p 2 için gösterildiği gibi, bu yöntem kullanılarak, çeşitli koşullar altında hücrelerde PtdInsPs görece seviyeleri, ölçülebilir.
Sonuçları optimize etmek ve / veya gidermek için yapılabilir kritik adımlar ve değişiklikler vardır. PtdInsPs güvenilir ölçümü elde etmek için en önemli parametrelerinden biri toplam radyoaktif sinyal seviyesidir. Tipik olarak, HPLC içine 3-5.000.000 sayar enjekte güvenilir hi değişiklikleri ölçmek için genellikle yeterli olurBöyle PtdIns (4,5) P 2 olarak Gher bolluk PtdInsP türleri. Bununla birlikte, en fazla 10000000 sayımı Enjeksiyon, bu PtdIns (3,5) P2 gibi düşük bolluğu türlerinin miktarının tayini için gerekli olabilir. Radyoaktif sinyalin seviyesi örneği, etiketleme süresi ve sıcaklık, 3 H, miyo -inositol konsantrasyonunun, PtdInsPs devir oranını hazırlamak için kullanılan toplam hücre sayısına ve endojen sentezinin dahil olmak üzere elde etkileyebilecek çeşitli parametreler vardır inositol, hangi radyo etiketli inositolün ile yarışacak. Örneğin, en az bir kez ikiye katlanması için, radyo-etiketleme maya hücrelerinin metabolik PtdInsPs halinde 3 H miyo inositol dahil, ama daha yavaş büyür ve gerekebilir yavaş metabolik etkinliğe sahip maya mutantlar etiketleme zaman süresinin uzatılması için izin verir. Buna ek olarak, burada açıklanan protokol hücreler daha sonra fo konsantre edilir, orta log fazına büyüdükten maya kültürünün, bir diauxic kaymasını kullanırtek katlama zamanla r etiketleme. Daha önce 32 yapılır Ancak, bir zamanlar uzun-dönem erken ve orta-log fazı sırasında ve etiketleme için hücreler tarafından diauxic vardiya azaltabilir. Bunu yaparken, bu yazarlar PtdIns (3) P, PtdIns (4) p ve diauxic kayması 32 uygulanan hücrelere göre PtdIns (4,5) P2 ve yüksek seviyelerde gözlenmiştir.
RAW 264.7 makrofaj çizgisi gibi memeli hücreleri, her 12 saat iki katına yana bazıları ise hiç 20,35,39, nöronların durumunda olduğu gibi çok daha yavaş bölmek veya oysa Benzer şekilde, memeli hücrelerinin etiketlenmesi süresi, optimizasyon gerektirebilir. Buna ek olarak, tek bir ideal radyoaktif sinyal seviyesini elde etmek için 3 H, miyo -inositol konsantrasyonunu arttırır. Ancak, bazı 3 H myo -inositol% 90 etanol içinde paketlenmiş lütfen unutmayın; ekleyerek aşırı 3 H myo -inositol medyada etanol içeriği artacak ve istenmeyen bir effe olabilirhücreler üzerindeki ct. Son olarak, uzun süreli, radyo-etiketleme de inositol hücreleri açlıktan öldürmek olabilir. Bu tam bir DMEM 10 uCi / ml işaretlenerek 0.5 uM 3H-miyo -inositol göre, 40 uM miyo -inositol içeren memeli hücre kültüründe, özellikle belirgindir. Bu nedenle, gerekirse, sadece etiketleme sırasında memeli hücrelerinin sayısını arttırmak tavsiye edilir.
Hücre lizizi sağlandı ve lipid işlem adımları, aynı zamanda optimal verim elde edilmesi, yanı sıra HPLC sütunu sağlığını korumak için önemlidir. Perklorik asit ile Lizis lipid ve diğer makro moleküllerinden oluşan çökelmesini sağlar ilk doku kültürü için kullanılan ve daha sonra maya 28,33 için kullanılan bir yönteme ilişkindir. Geleneksel metanol kullanılarak toplam lipidlerin ekstre karşılaştırıldığında / HCI / kloroform yöntem olup, perklorik asit kullanımı deneyler 28 arasında daha az varyasyonla PtdIns (3,5) P2, aşağıdakileri içeren, PtdInsPs kurtarma artırır. Altmetilamin izleyen uygulama faz ayrılmış serbest yağ asitleri ve sağlam lipidler 28,34 uzak olmak suda çözünür Gro-Insp bırakarak, gliserol omurgası ve iki hidrofobik asil zincirleri arasındaki ester bağları keser. Özellikle bakım çıkarma aşamasında ileri istenmeyen organik çözücüler ve çözünmeyen malzeme taşıyan önlemek için alınmalıdır. Bu, sistem yapışmasına basınç ani neden olabilir ve / veya kimyasal sütun zarar verebilir. Buna ek olarak kolon kullanılmadan önce amonyum fosfat (tampon B) yüksek konsantrasyonda sütun maruz bırakılmasıyla her gün başında klimalı olmalıdır; Böylece, kısa bir "Dengeleme" protokol deneysel örnekleri çalıştırmadan önce kullanılır. Çalıştırılan ilk deneysel numunede Gro-InsPs zirveleri gecikmeli elüsyon profilinde bu şartlandırma adımı sonuçlarını yapmamak.
De dikkate analiz ve ölçümü ile ilgili birkaç önemli nokta vardır. İlk olarak, quantification kendisi sinyal ve her bir tepe noktasının alanının bir entegrasyon, sadece pik yüksekliği olmalıdır. Her zirve için mutlak sinyal entegrasyonu bir hücrede PtdInsP bolca bir değişiklik yansıtan olmadan örnekleri ve deneyler arasında önemli ölçüde değişebilir çünkü Ayrıca, iç kontrol, genellikle gereklidir. Ebeveyn Gro-Ins zirve tipik buna karşı her Gro-Insp tepe normalize ederek iç kontrol olarak kullanılır. Gro-Ins zirve tipik radyoaktif sinyalin yaklaşık% 90 tutar ve koşulları arasında geçiş eğilimi yok. Alternatif olarak, tek tek ebeveyn PtdIns deneysel koşullarda önemli bir değişiklik uğrar şüphelenirse, özellikle toplam sayım karşı normalleştirmek için seçebilirsiniz. Son olarak, düşük bolluk PtdInsPs için, arka plan çıkarma ilgi zirve (Şekil 3D) aynı "zaman ölçeği" ile yakındaki olmayan pik alanı tanımlayarak tarafından tavsiye edilmektedir.
Bir son düşünce ile ilgilidirÜç mono-fosforlu ve üç bis-fosforile türler de dahil olmak üzere yedi PtdInsP türleri, sahip memeli örneklerinin, analizi. Ne yazık ki, tam PtdIns5P gelen PtdIns4P çözmek için zordur ve PtdIns (3,5) yapışık çift tepe elde memeli numunelerindeki PtdIns (3,4) P2, P 2. Bu zirvelerin çözünürlüğünü artırmak, daha önce yayınlanmış çeşitli yöntemler vardır. Tipik haliyle, bu elüsyon uzunluğunu değiştirme içerir, amonyum fosfat tampon maddesi başlangıç konsantrasyonu, hızı ve adım hangi elüsyon profiline esnasında amonyum fosfat tampon konsantrasyonu değişiklikleri ve amonyum fosfat tampon 33,35-38 pH. Belki de en başarılı yöntem, ayrı PtdIns için geliştirilmiştir (4) p ve PtdIns (5) son zamanlarda P, iki ardışık SAX sütun ve pH 6.0'da bir amonyum fosfat tamponu kullanılır Sarkes ve Rameh 39, tarafından tarif edilmiştir.
En yöntemlerinde olduğu gibi, HPLC-c kullanarakhücrelerde PtdInsPs ölçmek için sintilasyon akış oupled mevcut diğer yöntemlere kıyasla avantajları ve dezavantajları vardır. Örneğin, HPLC bağlanmış çevrimiçi akış parıldama Gro-InsPs canlı algılama sunuyor ancak bu yöntemin duyarlılığını azaltarak, sintilasyon sayma süresini sınırlar. Alternatif olarak, HPLC yıkama sıvısı kesir toplanan yerine bir akış sintilatöre besleyen bir otomatik numune ile olabilir. Kılavuzu fraksiyonlar daha sonra bu şekilde daha yüksek bir hassasiyet sunan uzun zaman süreleri için bir hat-dışı sıvı sintilasyon sayacı tarafından okunabilir - yine de, bu yaklaşım fraksiyonların sayısına bağlı olarak, yoğun fazla vakit alıcı ve emek ve çözünürlüğü azaltmaktadır 38,40 toplanan . Ayrıca, bütün hücrelerin analizi açıkça belirli bir PtdInsP düzeylerini ölçer, ama bu, o PtdInsP hücre içi dağıtım değişiklikler hakkında bilgilendirmek olsa kimse olabilir Previou gibi alt-hücresel fraksiyon yöntemlerine çift akış parıldamasinsi 39 yapılır. Buna karşılık, PtdInsP bağlama alanları, bir hücrede bir PtdInsP türlerinin konumu ve dinamiğini incelemek için yararlı olan FP bazlı, aynı zamanda bir hedef PtdInsP dışındaki faktörler bağlanabilir. Ayrıca, burada açıklanan yöntem büyük ölçüde PtdInsPs moleküler çeşitliliği artar asil zincirleri, ortadan kaldırarak PtdInsP düzeylerinin analizi kolaylaştırır. Lipidlerin deasilasyon asil zincirinin, PtdInsP 41,42 sinyal bir underappreciated yönü ile ilgili yapısal bilgi kaybına yol açar Fakat aynı şekilde, bu da önemli bir dezavantajdır. Bu büyük bir endişe ise, daha sonra sıvı kromatografi kütle spektrometrisi (LC-MS) 14,17 uygulanmalıdır bağlanmış. Ancak, aynı anda LC-MS 43 Tüm PtdInsPs tür analiz etmek şu anda zor. Böylece, yöntemlerin bir arada yedi PtdInsPs türlerin yeri, dinamiklerini, moleküler çeşitlilik ve düzeylerini araştırmak amacıyla en iyi yaklaşımdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol | Biobasic | BC1800 | Reagent grade |
| Ammonium phosphate dibasic | Bioshop | APD001 | ACS grade |
| Ammonium sulfate | Biobasic | ADB0060 | Ultra Pure grade |
| Autosampler | Agilent | G1329B | Agilent 1260 infinity series |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Boric acid | Biobasic | BB0044 | Molecular biology grade |
| Calcium Chloride | Biobasic | CT1330 | Ahydrous, industrial grade |
| Calcium pantothenate | Sigma | C8731 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma | 451657 | Anhydrous |
| D-Glucose | Biobasic | GB0219 | Anhydrous, biotech grade |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | Life | 11995-065 | With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | Acid free, ultra pure grade |
| Ethyl ether | Caledon labs | 1/10/4700 | Anhydrous, reagent grade |
| Ethyl formate | Sigma | 112682 | Reagent grade |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-450 | US origin, premium quality, heat inactivated |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed | Life | 26400044 | US origin |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Scintillation fluid for flow scintillation |
| Folic acid | Biobasic | FB0466 | USP grade |
| HEPES buffer solution | Life | 15630080 | 1 M solution |
| Inositol, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 ethanol to water |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Life | 51500056 | 100x solution |
| Iron(III) chloride | Sigma | 157740 | Reagent grade |
| Laura - Chromatography data collection and analysis software | LabLogic Systems Ltd | Version 4.2.1.18 | Flow scintillator software |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | Anhydrous |
| Manganese sulfate | Biobasic | MB0334 | Monohydrate, ACS grade |
| Methanol | Caledon labs | 6701-7-40 | HPLC Grade |
| Methylamine solution | Sigma | 426466 | 40% (v/v) |
| Monopotassium phosphate | Biobasic | PB0445 | Anhydrous, ACS grade |
| Nicotinic acid | Biobasic | NB0660 | Reagent grade |
| OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | HPLC software |
| p-aminobenzoic acid (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Free acid |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | 100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | ACS reagent, 70% |
| PhenoSpher SAX column | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm |
| Phosphoric acid | Caledon labs | 1/29/8425 | Reagent grade |
| Potassium Chloride | Biobasic | PB0440 | ACS grade |
| Potassium iodide | Biobasic | PB0443 | ACS grade |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| Quaternary pump | Agilent | G1311C | Agilent 1260 infinity series |
| Riboflavin | Bioshop | RIB333.100 | USP grade |
| Sodium Chloride | Biobasic | DB0483 | Biotech grade |
| Sodium molybdate | Sigma | 243655 | |
| Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316A | Agilent 1260 infinity series |
| Thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 | Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Scintillation coctail for liquid scintillation counting |
| Zinc sulfate | Biobasic | ZB2906 | Heptahydrate, reagent grade |
| β-RAM 4 | IN/US systems | Model 4 | Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer |
References
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Bridges, D., Saltiel, A. R.
- Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
- Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
- Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
- Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
- Lemmon, M. A.
- Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
- Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
- Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
- Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
- Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
- Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
- Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
- Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
- Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
- Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
- Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
- Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
- Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
- Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
- Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
- Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
- Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
- Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
- Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
- Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
- Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
- Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
- Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
- Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
- Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
- Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
- McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
- Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
- Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
- Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
- Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
- D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
- Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
- Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).
