Summary
Phosphoinositides signaleren lipiden waarvan de relatieve abundantie snel verandert in reactie op verschillende stimuli. Dit artikel beschrijft een methode om de overvloed aan phosphoinositides meten door metabolisch labelen van cellen met 3H-myo-inositol, gevolgd door extractie en deacylering. Geëxtraheerd glycero-inositiden omgezet worden vervolgens gescheiden door hoge-prestatie vloeistofchromatografie en gekwantificeerd door flow scintillatieteller.
Protocol
Opmerking: De tekst hieronder in detail beschrijft een methode om PtdInsPs meten in gist. Het biedt de experimentele gegevens voor de etikettering gistcellen met 3 H- myo, het extraheren en deacyleren lipiden en een HPLC-elutie protocol te fractioneren en te kwantificeren gedeacyleerde PtdInsPs. Houd er rekening mee dat de etikettering, deacylering, resolutie en kwantificering van PtdInsPs in zoogdiercellen vereisen optimalisatie en langer HPLC-elutieprofielen. Deze gegevens kunnen elders worden gevonden, hoewel we bespreken een aantal aspecten in de discussie. Kortom, de methode voor lipiden, deacyleren extract en het extract in water oplosbare Gro-InsPs uit gist wordt gegeven en is geïllustreerd in figuur 1.
1. Protocol voor de etikettering en analyseren PtdInsPs in gist
- Celcultuur en radioactief
- Kweek een 20 ml vloeibare kweek van de giststam SEY6210 bij 30 ° C onder constant schudden in volledig synthetischemedia mid-log fase of optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) van ongeveer 0,6-0,7.
Opmerking: YPD media niet gebruiken als deze 3 H- myo opname kunnen beïnvloeden. Deze cultuur maat zal voldoende materiaal voor 2-3 HPLC runs. - Pellet totaal 10-14 OD van de gistcellen (merk op dat 1 ml kweek een OD 600 = 1 bevat ~ 1x10 7 cellen) door centrifugeren bij 800 g gedurende 5 min in een 12 ml ronde bodem buis. Resuspendeer met 2 ml inositol-vrij medium (IFM) (zie tabel 1 voor samenstelling IFM).
- Herhaal centrifugeren en zuig de media. Resuspendeer de pellet met 440 pl IFM en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Voeg 60 pl 3 H- myo-inositol (1 pi = 1 uCi) aan elk monster en incubeer bij de groeitemperatuur van 30 ° C gedurende 1 tot 3 uur onder constant schudden.
Let op: 3 H- myo is een radioactief partnerrial dat na een passende opleiding moeten worden behandeld. Bovendien moeten alle verbruiksmaterialen dat contact met 3-H bevattend materiaal maakt op passende wijze aangebracht en aangeduid als radioactief afval.
Opmerking: De groeitemperatuur kunnen desgewenst worden gewijzigd zolang alle stammen te vergelijken worden gekweekt bij dezelfde temperatuur. - Breng de celsuspensie (500 ui) van een microcentrifugebuis met 500 ul van 9% perchloorzuur en 200 pl zuur gewassen glasparels. Meng door omkeren en incubeer op ijs gedurende 5 min.
- Vortex het monster op topsnelheid gedurende 10 min en de lysaten overbrengen naar een nieuwe microcentrifugebuis met een gel-lading-punt met de glaskralen voorkomen.
- Pellet het monster bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en zuig de supernatant.
- Resuspendeer de pellet door badsonicatie in 1 ml ijskoude 100 mM EDTA. Pellet opnieuw zoals hierboven beschreven.
- Kweek een 20 ml vloeibare kweek van de giststam SEY6210 bij 30 ° C onder constant schudden in volledig synthetischemedia mid-log fase of optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) van ongeveer 0,6-0,7.
- Deacylering en extractie
- Zuig het EDTA ultrasone trillingen en de pellet in 50 pl water.
- Voeg 500 ul van de deacylering reagens en ultrasone trillingen te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
- Heat lipiden gedurende 50 min bij 53 ° C in een verwarmingsblok. De monsters volledig door vacuümcentrifugatie dan 3 u of O / N.
- Ervoor te zorgen dat een chemische val is geïnstalleerd tussen de vacuüm-centrifuge en de vacuümpomp om dampen te voorkomen dat de lucht.
- Resuspendeer de pellet met 300 pl water door badsonicatie en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20 min. De monsters door vacuüm centrifugatie gedurende 3 u of O / N. Herhaal nog een keer deze stap.
- Ultrasone trillingen de pellet met 450 pl water. Dit is de waterige fase tijdens de extractie.
- Vers bereiden 10 ml van de extraction reagens door toevoeging van 8,0 ml 1-butanol, 1,6 ml ethyl ether en 0,40 ml ethylformiaat. Omkeren om te mengen.
- Voeg 300 ul van de extractie reagens aan de waterfase. Vortex het mengsel op topsnelheid gedurende 5 minuten en scheid de lagen door centrifugeren bij topsnelheid (18.000 xg) gedurende 2 min.
- Verzamel de onderste waterlaag in een nieuwe microcentrifugebuis met vermijding van de bovenste organische laag, de interface en de pellet. Herhaal de extractie van de waterige fase tweemaal met verse extractie reagens.
- Drogen van de verzamelde waterige laag door vacuümcentrifugatie. De verspreiding van de pellet in 50 ul van het water door badsonicatie.
- Voeg 2 pi van elk monster tot 4 ml scintillatievloeistof in een 6 ml polyethyleen scintillatieflesje. Bepaal het aantal tellingen (in CPM) in elk monster met vloeistofscintillatietelling met behulp van een open venster.
- Bewaar de monsters bij -20 ° C tot klaar voor HPLC.
- Bereid buffer A door het filteren van 1 liter ultrapuur water met een fles top 0,22 pm vacuüm-filter, gevolgd door ontgassen.
- Bereid buffer B door een 1 L oplossing van 1 M ammonium dibasisch (APS, MW 132,06) in water en breng de pH op 3,8 met fosforzuur. Filter de ammoniumfosfaat met een fles top 0,22 pm vacuüm-filter, gevolgd door ontgassen.
- Monteer de injectieflacon door afbouw een 2 ml flesje met een veerbelaste 250 gl klein volume insert. Laad 10 miljoen CPM en voeg water tot een totaal volume van 55 pl. Bereid een leeg flesje met 55 ul van water.
- Cap de flesjes met schroefdoppen uitgerust met een PTFE / siliconen septa (rode zijde naar de binnenkant van de flacon). Plaats elke flacon in de automatisch bemonstering tray van de HPLC, beginnend met de lege ampul.
- Gebruik een HPLC en bijbehorende software die controleert buffer flow, ontgast buffers en controles monster injectiop. Gebruik van een online stroom scintillator en de bijbehorende software om de scintillatiemiddel stroomsnelheid te regelen en de 3 H-verval signaal volgen.
- Gebruik een SAX vloeistof chromatografiekolom met afmetingen van 250 mm x 4,6 mm en met 5 urn silicahars in de HPLC. Rust de kolom met een guard kolom injectie van verontreinigingen te voorkomen.
- Installeer een 3 H-compatibele 500 pi doorstroomcel in de stroom scintillator.
OPMERKING: Fractionering kan worden uitgevoerd met een Agilent 1200 serie HPLC systeem oneindig bestuurd door Chemstation software of andere commercieel beschikbare HPLC systemen. Flow scintillatie van het HPLC eluaat kan met een β-RAM stroming scintillator bestuurd door Laura software of andere commercieel beschikbare stroom scintillator besturingskaartversie.
- Initialiseer de quaternaire pomp met een stroomsnelheid van 1,0 ml / min met 100% buffer A.
- Het opzetten van een verevening profiel op de HPLCde gradiënt van buffers A en B (noemen dit "protocol A evenwichtsinstelling") regelen: 1% buffer B gedurende 5 minuten, 1-100% B gedurende 5 min, 100% B gedurende 5 min, 100-1% B gedurende 5 min, 1% B gedurende 20 min. Stel de druk limiet bij 400 bar, 1,0 ml / min debiet en 30 min looptijd.
- Maak een elutieprofiel (figuur 2) op de HPLC om de gradiënt van buffers A en B (noemen dit "Protocol A") regelen: 1% B gedurende 5 min, 1-20% B gedurende 40 min, 20-100% B gedurende 10 min, 100% B gedurende 5 min, 100-1% B gedurende 20 min, 1% B gedurende 10 min. Stel de druk limiet bij 400 bar, 1,0 ml / min debiet, en 90 min looptijd.
- Het opzetten van een detectie-protocol op de stroom scintillator (noemen dit 'Protocol A detectie ") te lopen voor 60 min, met een scintillatievloeistof debiet van 2,5 ml / min en een 8.57 sec verblijftijd.
- Programmeer een geautomatiseerde injectie volgorde op het HPLC beginnen met de water blanco in "Protocol A evenwichtsinstelling", gevolgd door each radioactief gelabeld monster op "Protocol A". Initialiseren de volgorde als klaar.
- Terwijl de run is nog steeds op het evenwicht protocol, maakt u een batch op de stroom scintillator om alle van de monsters met het meten van "Protocol Een detectie." De injectie van elk nieuw monster wordt geïnitialiseerd "Protocol A" op de HPLC terwijl triggering de stroom scintillator te beginnen "Protocol A detectie."
- Bij de voltooiing van alle runs, spoel de HPLC kolom en de stroom scintillator met 100% buffer A gedurende 30 minuten bij 1,0 ml / min stroomsnelheid.
- Gebruik Laura-software of andere software die de chromatografie spectra kunnen kwantificeren. De stappen in dit hoofdstuk beschreven zijn weergegeven in figuur 3.
- Open de bestanden door te klikken op "File", "Open" en selecteer het ruwe data bestand voor elk monster.
- In het tabblad "chromatogrammen", Zoom in elk van de kleinere pieken (ongeveer 1000 counts [y-as]) met behoud van tijdresolutie te rekken. Inzoomen op elke individuele piek indien nodig.
- Markeer elk van de pieken voor analyse met behulp van "toevoegen ROI" tool. Identificeer pieken by tijd van elutie: Parental Gro-Ins op 10 min, Gro-Ins3P op 18 min, Gro-Ins4P op 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 op 29 min en Gro-Ins (4,5 ) P 2 32 min.
- In het tabblad "regio's tafels", noteer de "gebied (tellingen)" van elke piek. Let op de "start (mm: ss)" tijd en "end (mm: ss)" tijd van elke piek.
- Voor achtergrond aftrek Markeer een gebied grenzend aan de piek spanning evenveel tijd. Trek het aantal tellingen van de corresponderende piek.
- Normaliseren van de oppervlakte van elke piek tegen ouderlijke Gro-Ins (uitgedrukt als "% van de totale PtdIns"). Vervolgens normaliseren elk van de pieken in elke experimentele conditie tegen de controleconditie (uitgedrukt als "nvoudige toename ten opzichte van controle ").
OPMERKING: Normalisatie van elke piek kan ook tegen totaaltellingen maar omdat de parentale Gro-Ins veel overvloediger dan alle andere PtdInsPs de resultaten lijken vergelijkbaar. - De gegevens voor de chromatografen exporteren door op "Bestand", "Opslaan als ..." en kies de "CSV (comma separated)" bestandsformaat. Plot de gegevens op een spreadsheet en presenteren als nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met deze methode werden gist PtdInsPs metabolisch gelabeld met 3H-myo-inositol. Na labeling werden de fosfolipiden geprecipiteerd met perchloorzuur gevolgd door deacylering fosfolipide en extractie van de in water oplosbare Gro-InsPs (figuur 1). In deze fase is het belangrijk om de totale radioactieve signaal geassocieerd met de geëxtraheerde Gro-InsPs door vloeistofscintillatietelling gekwantificeerd voldoende signaal-ruisverhouding voor de lage abundantie PtdInsPs achtige Ptdlns waarborgen (3,5) P2; totaal 5-10 miljoen CPM worden geïnjecteerd. Aangezien gistcellen vertonen slechts vier PtdInsPs, kan resolutie worden bereikt met een 1 hr elutie werkwijze zoals beschreven (figuur 2).
Hier, wild-type, atg18 en vac14 Δ Δ gist mutanten werden gelabeld en verwerkt om veranderingen in Ptdlns (3,5) P2, th analyserene minst overvloedige van de PtdInsPs in gist 16,19,27. Zoals in figuur 4A-C, het elutieprofiel voor alle drie stammen geproduceerde 3-H geassocieerde signaalpieken. De ouderlijke Gro-Ins peak elueert eerst (8-9 min; figuur 3, maar niet in figuur 4 omdat Gro-Ins overschaduwt het signaal van de gefosforyleerde soorten), gevolgd door Gro-Ins3P (~ 18 min), Gronin- Ins4P (~ 20 min), Gro-Ins (3,5) P2 (~ 29 min) en Gro-Ins (4,5) P2 (~ 32: 00 min), die respectievelijk overeenkomt met het geacyleerde fosfolipiden PtdIns, PtdIns3P, PtdIns4P, Ptdlns (3,5) P2 en PtdIns (4,5) P2. Er zijn een paar extra kleine pieken op 4 min en een die de neiging om onmiddellijk na de ouder Gro-Ins (10 min); Deze vertegenwoordigen waarschijnlijk inositol en een niet glycerated inositide fosfaat (figuur 3). De elutiepatroon is consistent en karakteristiek, hoewel de exacte tijd kan variëren bij gebruik van een diffehuren HPLC systeem en / of een nieuwe kolom.
De piek geassocieerd met Ptdlns (3,5) P2 (Figuur 4, rode pijl) ondergaat de meest dramatische verandering tussen wild-type en vac14 atg18 Δ Δ giststammen. Ten opzichte van wild-type cellen (A), is er een zeer grote Gro-Ins (3,5) P2 geassocieerde signaal in atg18 Δ cellen en een kleinere piek in vac14 Δ gistcellen. Om het totale radioactieve signaal geassocieerd met elke piek te kwantificeren, werden de tellingen geïntegreerd onder het oppervlak van de piek (figuur 3). Bovendien, omdat absolute radioactieve signaal varieert tussen de monsters, werd het ouderlijk Gro-Ins soorten gebruikt als een interne controle door het normaliseren tegen (men kan er ook voor kiezen om te normaliseren tegen totale tellingen). Door dit te doen, de gegevens suggereren dat PtdIns (3,5) P2 vormt slechts 0,07% van de PtdIns in wild-type gistcellen, terwijl PtdIns (3,5) P 2 komt overeen met 1,2% van de ouderlijke Ptdlns in atg18 Δ cellen, of een dramatische 17-voudige toename van Ptdlns (3,5) P2 ten opzichte van wild-type cellen (figuur 4A, B en D). In vergelijking was Ptdlns (3,5) P2 niveaus slechts 0,01% van het Ptdlns signaal VAC14 -deleted gistcellen, een verlies van 85% in Ptdlns (3,5) P2 (Figuur 4C en D). Kortom, deze metingen zijn in overeenstemming met gepubliceerde resultaten blijkt dat Ptdlns (3,5) P2 is ongeveer 0,1% van Ptdlns in wild-type cellen 90% verlaagd vac14 D en 10 tot 20 maal hoger in atg18 D cellen ten opzichte van wild-type cellen 27,29.
Figuur 1. Deacylering en extractie van 3 H-Gro-INSP. Radiolabeled lipid neerslag in perchloorzuur wordt gewassen met een waterige oplossing van EDTA. Dit wordt vervolgens afgezogen en deacylering reagens toegevoegd en geïncubeerd bij 53 ° C. De deacylering reactiemengsel wordt vervolgens onder vacuüm gedroogd en tweemaal gewassen met water, gevolgd door de toevoeging van extractie reagens. Dit wordt vervolgens gevortext, gecentrifugeerd en de waterige fase wordt verzameld. De extractiestap wordt herhaald drie keer totaal organische en onoplosbare verontreinigingen te verwijderen. De in water oplosbare fractie (blauw), die 3 H-Gro-INSP omvat, wordt vervolgens onder vacuüm gedroogd en opnieuw gehydrateerd met 60 ui water. De hoeveelheid radioactiviteit wordt bepaald door vloeistofscintillatie (CPM) en gelijke tellingen over monsters worden in het HPLC geladen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
<br /> Figuur 2. Gradient ammoniumfosfaat buffer elutie van 3 H-Gro-INSP. Resolutie van Gro-INSP door sterke anion-uitwisselingschromatografie afhankelijk van de toepassing van dibasisch ammoniumfosfaat, pH 3,8 (buffer B). De keuze van de gradiënt is afhankelijk van het mengsel van Gro-INSP beschikbare species voor de scheiding. Protocol A wordt gebruikt voor gist monsters, waarvan er slechts vier PtdInsPs bezitten. Resolutie van elk van de vier pieken voldoende is met een snelle toename van (NH 4) 2 HPO 4 concentratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Begeleid instructie voor data-analyse van PtdInsP overvloed. De gegevens bestanden worden op de Laura s geladenoftware en geëvalueerd visueel met de gaschromatograaf (open standaard). Met behulp van de "zoom in" tool (a), vergroten de pieken (b). Selecteer afzonderlijke pieken op het chromatogram met de "add ROI" tool (c). In het tabblad "regio table" (d), is alle daaruit voortvloeiende informatie van de gemarkeerde gebieden van belang zijn weergegeven als een enkele tabel (e). De ruwe tellingen van elke piek (f) te exporteren en normaliseren elk PtdInsP soort tegen de ouderlijke fosfatidylinositol (g) of tegen de totale tellingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Ptdlns (3,5) P2 niveaus in wild-type en mutant gistcellen. Representatieve chromatogrammen getoond voor de stroom scintillatie van het extracted 3 H-Gro-InsPs van wild-type (A), atg18 Δ (B), en vac14Δ (C) giststammen met Protocol A. De ruwe tellingen van de regio's van belang dat overeenkomt met Gro-Ins (3,5) P 2 (pijl) worden geëxtraheerd uit de chromatograaf en de achtergrond afgetrokken. De verkregen waarden worden vergeleken met wildtype en uitgedrukt als veelvoudverandering in Gro-Ins (3,5) P 2 niveaus (D). De niveaus en veranderingen in de Gro-Ins (3,5) P2 worden geïnterpreteerd om het niveau en de veranderingen in de oorspronkelijke PtdIns (3,5) P 2 tonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Inositolvrij media (IFM) |
| 27,8 mM (NH4) 2SO4 |
| 2% glucose |
| 0,01 mM KH2PO4 |
| 1X Aminozuren |
| 1X LPSM |
| 1X Spoorelementen |
| 5X Vitaminen |
| 10X Laag fosfaat en sulfaat media (LPSM) |
| 9 mm CaCl2 |
| 17 mM NaCl |
| 67 mM KCl |
| 1000x Spoorelementen |
| 8 mm Boorzuur |
| 250 pM CuSO4 |
| 602 uM KI |
| 1,23 mmol FeCl3 |
| 2,65 mmol MnSO4 |
| 971 uM Na-molybdaat |
| 2.48 mmol ZnSO4 |
| 500X Vitaminen |
| 4 pM biotine |
| 2.27 uM Foliumzuur |
| 1,62 mmol niacine |
| 729 pM p-aminobenzoëzuur |
| 973 pM Pryidoxine-HCl |
| 266 uM riboflavine |
| 593 pM thiamine-HCl |
Tabel 1. Samenstelling van de gist-inositol-vrij medium. Gistcellen radiogelabeld met IFM als basismedium aan te vullen met 3H-myo-inositol. Bereid een oplossing van 100 ml IFM met de aangegeven oplossingen, Filter steriliseren met behulp van een fles top 0,22 pm vacuüm filter en bewaar bij kamertemperatuur. Lage fosfaat en sulfaat media (LPSM) voor te bereiden, het genereren van een oplossing van 100 ml met behulp van de aangegeven zouten, filter steriliseren met behulp van een fles top 0,22 pm vacuüm filter en bewaar bij kamertemperatuur. Los de vermelde zouten om een 1 L 1000x oplossing van sporenelementen bereiden. Meng grondig voor gebruik en / of op te slaan fracties bij -20 ° C. Los de aangegeven vitamines een 1 L 500x vitamine oplossing te bereiden. Meng goed voor gebruik en op te slaan fracties bij -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft de experimentele protocol nodig om de cellulaire niveaus van PtdnsPs kwantificeren door HPLC gekoppeld stroom scintillatie uit gist. De methodologie maakt het metabolisch merken van PtdInsPs met 3H-myo-inositol gevolgd door lipiden verwerking en extractie van in water oplosbare 3 H-Gro-InsPs HPLC fractionering en analyse. Met deze methode kan de relatieve niveaus van PtdInsPs in cellen onder verschillende omstandigheden worden gekwantificeerd, zoals getoond voor Ptdlns (3,5) P2 in wild-type vac14 D en D atg18 gistcellen (figuur 4).
Er zijn een aantal kritische stappen en de aanpassingen die gedaan kan worden om de resultaten te optimaliseren en / of lossen. Een van de belangrijkste parameters van betrouwbare kwantificering van PtdInsPs bereiken is de totale radioactieve signaalniveau. Gewoonlijk injecteren 3-5000000 tellingen in het HPLC vaak voldoende om betrouwbaar wijzigingen in de hi kwantificerengher overvloed PtdInsP soorten zoals PtdIns (4,5) P2. Echter, kan injectie tot 10 miljoen tellingen nodig kwantificatie van lage abundantie zoals Ptdlns (3,5) P2. Er zijn verschillende parameters die invloed kan het niveau van radioactieve signaal bereikt inclusief het totale aantal cellen gebruikt om het monster etikettering tijd en temperatuur, de concentratie van 3H-myo-inositol, de omloopsnelheid van PtdInsPs bereiden en de endogene synthese inositol, dat zal concurreren met de radioactief gemerkte inositol. Bijvoorbeeld radioactief gistcellen ten minste één verdubbelingstijd maakt metabole inbouw van 3H-myo- inositol in PtdInsPs, maar verlenging van de etikettering tijd voor gist mutanten die langzamer groeien of langzamere metabolische activiteit noodzakelijk zijn. Bovendien is de hier beschreven protocol gebruikt een diauxic verschuiving van de gistcultuur, waarbij cellen gekweekt tot mid-log-fase worden vervolgens geconcentreerd for etikettering meer dan een verdubbeling van de tijd. Echter, men kan de diauxic verschuiving door het labelen van cellen te verminderen tijdens de vroege en mid-log-fase en voor langere tijd, zoals eerder gedaan 32. Hierbij zij concluderen hogere Ptdlns (3) P, Ptdlns (4) P en PtdIns (4,5) P2 dan cellen die diauxic shift 32.
Evenzo kan de periode van zoogdiercellen labeling optimalisatie vereisen omdat bepaalde zoogdiercellen, zoals de macrofaag RAW 264.7 lijn verdubbelt elke 12 uur, terwijl anderen verdelen veel langzamer, of zoals in het geval van neuronen, helemaal 20,35,39. Bovendien kan men de concentratie van 3H-myo-inositol verhogen tot een ideaal radioactief signaalniveau te bereiken. Houd er echter rekening mee dat sommige 3 H- myo is verpakt in 90% ethanol, toevoegen van overmatige 3 H- myo zal de ethanol in de media te verhogen en kan een onbedoelde effe hebbenct op de cellen. Ten slotte kan verlengd radiolabeling ook verhongeren de cellen van inositol. Dit is bijzonder duidelijk in zoogdierlijke celkweek waarbij volledige DMEM bevat 40 uM myo-inositol, vergeleken met 0,5 uM 3H-myo-inositol wanneer gemerkt met 10 uCi / ml. Dus, indien nodig, eenvoudig verhogen van het aantal zoogdiercellen labeling aanbevolen.
De cellulaire lysis en lipiden bewerkingsstappen zijn ook belangrijk voor het verkrijgen van een optimaal rendement, alsmede behoud van de gezondheid van de HPLC-kolom. Lysis met perchloorzuur maakt neerslaan van lipiden en andere macromoleculen, een werkwijze eerst toegepast voor weefselkweek en later gebruikt voor gist 28,33. In vergelijking met de extractie van totale lipiden volgens de traditionele methanol / HCl / chloroform werkwijze gebruik van perchloorzuur bevordert het herstel van PtdInsPs, zoals Ptdlns (3,5) P2, met minder variatie tussen de experimenten 28. Subsequent toepassing van methylamine verbreekt esterbindingen tussen de glycerol hoofdketen en twee hydrofobe acylketens, waarbij de wateroplosbare Gro-INSP naar fase afgescheiden van vrije vetzuren en lipiden 28,34 intact zijn. Bijzondere zorg moet worden genomen om te voorkomen dat de verdere uitvoering van ongewenste organische oplosmiddelen en onoplosbaar materiaal tijdens de extractie stap. Dit kan het systeem verstoppen, veroorzaken drukpieken en / of chemisch beschadigen kolom. Bovendien moet de kolom aan het begin van elke dag bepaald door het blootstellen van de kolom een hoge concentratie ammonium- fosfaat (buffer B) voor gebruik; Aldus wordt een kort "Evenwicht" gebruikte protocol voordat u proefmonsters. Als u deze conditionering stap resulteert in een vertraagde elutieprofiel van de Gro-InsPs pieken in de eerste experimentele monster dat wordt uitgevoerd.
Er zijn een aantal belangrijke punten betrekking tot de analyse en kwantificering te beschouwen als goed. Ten eerste, de quantification zelf moet een integratie van signaal en ruimte van elke piek, niet alleen de piekhoogte zijn. Bovendien is een interne controle gewoonlijk nodig omdat de absolute signaalintegratie voor elke piek aanzienlijk kunnen verschillen tussen de monsters en experimenten zonder gevolg van een verandering in PtdInsP overvloed in een cel. De ouderlijke Gro-Ins piek wordt meestal gebruikt als de interne controle door het normaliseren van elke Gro-INSP piek tegen. De Gro-ins piek bevat kenmerkend ongeveer 90% van het radioactieve signaal en niet de neiging om tussen condities. Als alternatief kan men kiezen om normaliseren tegen totaaltellingen, vooral als men vermoedt dat de ouderlijke Ptdlns lijdt aan een significante verandering in de experimentele condities. Tot slot, voor lage overvloed PtdInsPs, wordt de achtergrond aftrekken aanbevolen door het definiëren van een nabijgelegen niet-piek met dezelfde "tijdschaal" als de piek van belang (figuur 3D).
Een laatste overweging heeft betrekking opde analyse van monsters van zoogdieren, waarvan zeven PtdInsP soorten, waaronder drie mono-gefosforyleerde en drie bis-gefosforyleerde soorten bezitten. Helaas is het moeilijk om PtdIns4P volledig oplossen van PtdIns5P en Ptdlns (3,5) P2 van Ptdlns (3,4) P2 in zoogdierlijke monsters, waardoor Siamese dubbele pieken. Er zijn verschillende methoden eerder gepubliceerd dat de resolutie van deze pieken te verhogen. Meestal gaat het wijzigen van de lengte van elutie, de beginconcentratie van ammoniumfosfaat buffer, de snelheid en de stappen die ammoniumfosfaat bufferconcentratie veranderingen tijdens het elutieprofiel en de pH van de ammonium fosfaatbuffer 33,35-38. Misschien, ontwikkelde de meest succesvolle methode Scheid Ptdlns (4) P en PtdIns (5) P werd recent beschreven door Sarkes en Rameh 39, waarop twee tandem SAX kolommen en een ammoniumfosfaat bij pH 6,0 gebruikt.
Zoals bij de meeste werkwijzen met behulp van HPLC-coupled stroom scintillatieteller PtdInsPs kwantificeren cellen heeft voor- en nadelen in vergelijking met andere beschikbare werkwijzen. Bijvoorbeeld, online stroom scintillatie gekoppeld met HPLC biedt live-detectie van Gro-InsPs maar beperkt de scintillatietelling tijd, waardoor de gevoeligheid van deze methode. Alternatief kan de HPLC eluent be-fractie opgevangen met een autosampler in plaats van het voeden van een stroom scintillator. De handleiding fracties kunnen vervolgens worden gelezen door een off-line vloeibare scintillatieteller voor langere tijd, waardoor dus een hogere gevoeligheid - echter deze aanpak is tijdrovend en arbeidsintensief en vermindert de resolutie afhankelijk van het aantal fracties verzameld 38,40 . Daarnaast analyse van hele cellen meet ondubbelzinnig de niveaus van een specifiek PtdInsP, maar het zal niet informeren over wijzigingen in de subcellulaire distributie van de PtdInsP, hoewel men kon koppel stroom scintillatieteller subcellulaire fractionering methoden Previousluwe gedaan 39. In vergelijking, FP-gebaseerde PtdInsP-bindende domeinen zijn nuttig om de locatie en de dynamiek van een PtdInsP species in een cel te onderzoeken, maar kan ook binden aan andere dan de doelstelling PtdInsP factoren. Ook de hier beschreven werkwijze vereenvoudigt de analyse van PtdInsP niveaus door het elimineren van de acylketens, die sterk verhoogt de moleculaire diversiteit van PtdInsPs. Maar om dezelfde reden is dit ook een belangrijk nadeel omdat deacylering van lipiden leidt tot verlies van structurele informatie met betrekking tot de acylketen, een ondergewaardeerde aspect van PtdInsP signalering 41,42. Indien dit van groot belang, dan vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS) worden ingezet 14,17. Het is echter momenteel moeilijk gelijktijdig analyseren van alle soorten PtdInsPs door LC-MS 43. Dus een combinatie van methoden is de beste aanpak om de locatie, dynamica, moleculaire diversiteit en niveaus van alle zeven soorten PtdInsPs onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol | Biobasic | BC1800 | Reagent grade |
| Ammonium phosphate dibasic | Bioshop | APD001 | ACS grade |
| Ammonium sulfate | Biobasic | ADB0060 | Ultra Pure grade |
| Autosampler | Agilent | G1329B | Agilent 1260 infinity series |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Boric acid | Biobasic | BB0044 | Molecular biology grade |
| Calcium Chloride | Biobasic | CT1330 | Ahydrous, industrial grade |
| Calcium pantothenate | Sigma | C8731 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma | 451657 | Anhydrous |
| D-Glucose | Biobasic | GB0219 | Anhydrous, biotech grade |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | Life | 11995-065 | With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | Acid free, ultra pure grade |
| Ethyl ether | Caledon labs | 1/10/4700 | Anhydrous, reagent grade |
| Ethyl formate | Sigma | 112682 | Reagent grade |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-450 | US origin, premium quality, heat inactivated |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed | Life | 26400044 | US origin |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Scintillation fluid for flow scintillation |
| Folic acid | Biobasic | FB0466 | USP grade |
| HEPES buffer solution | Life | 15630080 | 1 M solution |
| Inositol, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 ethanol to water |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Life | 51500056 | 100x solution |
| Iron(III) chloride | Sigma | 157740 | Reagent grade |
| Laura - Chromatography data collection and analysis software | LabLogic Systems Ltd | Version 4.2.1.18 | Flow scintillator software |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | Anhydrous |
| Manganese sulfate | Biobasic | MB0334 | Monohydrate, ACS grade |
| Methanol | Caledon labs | 6701-7-40 | HPLC Grade |
| Methylamine solution | Sigma | 426466 | 40% (v/v) |
| Monopotassium phosphate | Biobasic | PB0445 | Anhydrous, ACS grade |
| Nicotinic acid | Biobasic | NB0660 | Reagent grade |
| OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | HPLC software |
| p-aminobenzoic acid (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Free acid |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | 100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | ACS reagent, 70% |
| PhenoSpher SAX column | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm |
| Phosphoric acid | Caledon labs | 1/29/8425 | Reagent grade |
| Potassium Chloride | Biobasic | PB0440 | ACS grade |
| Potassium iodide | Biobasic | PB0443 | ACS grade |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| Quaternary pump | Agilent | G1311C | Agilent 1260 infinity series |
| Riboflavin | Bioshop | RIB333.100 | USP grade |
| Sodium Chloride | Biobasic | DB0483 | Biotech grade |
| Sodium molybdate | Sigma | 243655 | |
| Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316A | Agilent 1260 infinity series |
| Thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 | Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Scintillation coctail for liquid scintillation counting |
| Zinc sulfate | Biobasic | ZB2906 | Heptahydrate, reagent grade |
| β-RAM 4 | IN/US systems | Model 4 | Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer |
References
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Bridges, D., Saltiel, A. R.
- Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
- Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
- Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
- Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
- Lemmon, M. A.
- Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
- Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
- Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
- Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
- Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
- Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
- Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
- Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
- Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
- Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
- Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
- Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
- Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
- Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
- Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
- Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
- Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
- Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
- Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
- Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
- Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
- Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
- Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
- Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
- Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
- Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
- McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
- Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
- Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
- Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
- Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
- D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
- Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
- Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).
